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Figura 5: Método de hibridación de Southern. a. Inclusión del ADN en el gel de agarosa. b. las moléculas de ADN
migran a través del gel dependiendo de su tamaño y forma, c. transferencia de las moléculas de ADN del gel a una
membrana por capilaridad (S. Solución tampón, M: mecha, A gel de agarosa, N: membrana de nitrocelulosa, P:
papel de filtro y peso), d. incorporación de la sonda e hibridación con las moléculas de ADN, f: detección por
autorradiografía, contacto de la membrana con el filme autorradiográfico, g: revelado de la autorradiografía,
observación de las bandas hibridadas. (Modificado de Micklos et al., 1990).
Figura 7: Clonado de ADNc de doble cadena en un fago. a) Para ello se le deben adicionar hebras de cadena
simple complementarias a los sitios de restricción del ADN del fago. El ADN del fago se prepara cortando con una
enzima de restricción, en este caso EcoRI, y se purifican los dos brazos del fago. Mientras tanto se adicionan al ADNc
los adaptadores que llevan sitios EcoRI. Para ello se utiliza una ligasa. Previamente, el ADN se trata con una metilasa,
que metila los sitios de reconocimiento de la enzima de restricción, a fin de protegerlo de la acción de la enzima. Los
adaptadores se cortan con la enizma de manera de generar extremos cohesivos que puedan acoplarse con el ADN
del fago, cortado con la misma enzima. Se genera así una serie de moléculas recombinantes dispuestas en tandem,
flanquedas por los sitios cos. Este ADN recombinante se empaqueta formando partículas infecciosas del fago, que
se utilizarán para infectar un césped de bacterias. Esto se visualizará como placas o calvas. Cada placa surge de una
molécula recombinante individual, que se propaga ahora como un fago. b) Una vez construída la genoteca puede
localizarse un gen en la misma por hibridación con una sonda marcada apropiadamente (Modificado de Watson et
al., 1992).
Figura 8: Búsqueda de imágenes en una genoteca genómica. Utilización de la reacción en cadena de la polimerasa
para buscar un gen específico en una genoteca de BACs. Las 180 placas de cultivo, de 96 pocillos, contienen un
genoma vegetal completo. Estas placas se replican, de a 4, en filtros o membranas. Todos los clones de un mismo
filtro son juntados y varios de estos conjuntos de clones son agrupados para preparar agrupaciones de conjuntos.
El ADN de estos conjuntos se aisla y se amplifica por PCR utilizando primers específicos para el gen de interés. Como
control positivo se utiliza un ADN vegetal, también amplificado por PCR. La reacción se analiza sobre un gel de
agarosa. Un resultado positivo indica la presencia del gen en el ADN genómico del vegetal y también en uno de los
clones. En este caso en el conjunto que contenía los filtros 1-3. Cuando se chequean los conjuntos individuales se
encuentra que el clon positivo pertenece al filtro 1. El producto de PCR se hibrida luego con este filtro y esto nos dará
la posición exacta en la placa de 96 pocillos donde se encuentra el gen de interés (Modificado de Watson et al.,
1992).