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HPLC
Conteúdo
1. Introdução
2. Histórico
3. Áreas de aplicação / vantagens
4. Modos de separação / tipos de HPLC
5. Características cromatograma /
eficiência coluna
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Versão do FarmaBio
Conteúdo (cont.)
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Versão do FarmaBio
Conteúdo (cont.)
1. Desenvolvimento de metodologias
2. Validação de metodologias
2. Aplicações
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Versão do FarmaBio
Parte I
FUNDAMENTOS
HPLC
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Versão do FarmaBio
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Versão do FarmaBio
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Versão do FarmaBio
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Versão do FarmaBio
Introdução
CROMATOGRAFIA = método físico de
separação no qual os constituintes de
uma amostra a serem separados são
distribuídos entre 2 fases:
• estacionária:
estacionária geralmente de grande área,
sólida ou líquida
• móvel: um fluido insolúvel que percola
através da primeira
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FASE MÓVEL
Fase
estacionária
injeção separação eluição
DETECTOR
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FASE MÓVEL:
• Líquido ⇒ HPLC
• Gás ⇒ GC
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CROMATOGRAFIA
SFC LC GC
Cromatografia a Cromatografia a Cromatografia a
Fluido Supercrítico Líquido Gás
LC LC
Planar Coluna
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Histórico
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Cromatografia Líquida
Versão do FarmaBio
Clássica
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HPLC Moderna*
Precoluna
Bomba HPLC
Coluna Analitica
Sistema de Tratamento
Detector
de Dados
Filtro em linha Scavenger
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Versão do FarmaBio
Áreas aplicação / vantagens
HPLC x GC
Analitos
Técnica
Pré-requisito Interação
GC Voláteis e termicamente Fase estacionária
estáveis (nas consições de
operação)
HPLC Solúveis na fase móvel Fase estacionária e
fase móvel
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Substâncias não analisáveis por GC:
• compostos iônicos
• sais inorgânicos e orgânicos
• aminoácidos puros
• compostos polares de alto PM
• polímeros
• compostos termicamente instáveis
• corantes salinos
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Aplicações HPLC
Substâncias químicas
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Versão do FarmaBio Aplicações HPLC
Áreas
CONTROLE QUALIDADE
• Garantia pureza de materiais brutos
• Teste in process para controle e otimização de processos de
produção
• Ensaios quantitativos de produtos finais (garantia
especificações)
• Avaliação estabilidade de produto e monitorização degradação
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Aplicações HPLC
Áreas
CONTROLE AMBIENTAL
• Análise de poluentes do ar e água
• Monitorização materiais perigosos - Saúde ocupacional
• Monitorização níveis agrotóxicos no ambiente
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FONTE: BIDLINGMEYER, 1993.
Vantagens da HPLC
Versão do FarmaBio
FASE MÓVEL
FASE ESTACIONÁRIA
(sólida)
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Adsorção
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Fase Estacionária
• Sólida
• Apresenta na superfície cargas iônicas
ou polares.
Exemplos:
– Sílica gel
– Alumina
– Florisil
– Carvão
– Carbonato de cálcio
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Fase Móvel
• Hexano
• Isooctano
• Cloreto de butila
• Clorofórmio
• Diclorometano
• Tetraidrofurano
• Acetonitrila
• Iso e n-propanol
• Metanol
• Água
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Cromatografia de partição
(líquido- líquido)
• PARTIÇÃO = distribuição de uma substância entre
2 fases heterogêneas fluidas, imiscíveis entre si.
Por exemplo: um gás e um líquido, ou 2 líquidos
imiscíveis
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Cromatografia de partição
clássica
FASE ESTACIONÁRIA
• Fina camada de líquido que cobre as partículas de
um suporte sólido
• Este líquido pode ser:
– polar: polietilenoglicol, ODPN (β, β
´-oxidipropionitrila)
– apolar: hexano
FASE MÓVEL
• Sempre de polaridade contrária
• Baixa
Disponível emestabilidade
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FASE ESTACIONÁRIA
• Líquido é quimicamente ligado ao suporte
sólido.
FASE MÓVEL
• Sempre de polaridade contrária
• Alta estabilidade
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Aplicações
Portanto..........
GERALMENTE:
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Cromatografia de troca iônica
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Cromatografia
Versão do FarmaBio por exclusão de
tamanho
Gel
Poro
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Aplicações
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Versão do FarmaBio
Escolha do sistema
cromatográfico
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Amostra
PM < 1.000
Insolúvel Solúvel
água água
Solúvel Solúvel
PM > 1.000 hexano metanol Não-iônica Iônica
Amostra Amostra
não-aquosa aquosa
Biopolímeros
solúveis água
Condições
Polímeros Condições
desnaturantes
insolúveis água não-desnaturantes
(separação analítica)
Preparativa
Preparativa
Informação tamanho
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Versão do FarmaBio
Características cromatograma /
eficiência coluna
Parte II
INSTRUMENTAÇÃO /
FUNCIONAMENTO HPLC
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Reservatórios para
Injetor os solventes
Precoluna
Bomba HPLC
Coluna Analitica
Sistema de Tratamento
Detector
de Dados
Filtro em linha Scavenger
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1. Colunas
• Velocidade fluxo
– 0,1-3,0 mL/mim para colunas analíticas
– > 5,0 mL/min para colunas preparativas
• Pressão operação
– 500-2000 psi para colunas analíticas
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Eluição Isocrática /
Gradiente
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Eluição
Gradiente
Passo Solvente A Solvente B Tempo
1 30 % 70 % 3 min
2 50 % 50% 2 min
3 50 % 50 % 3 min
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Versão do FarmaBio
Injeção da Amostra
• INJETOR MANUAL
Da
Da
bomba
bomba
Amostra
da seringa
Para
Para coluna
coluna
Descarte
Loop
Loop
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Injeção da Amostra
• AUTOSAMPLER
Corpo Solvente
da
Seringa
Amostragem
da Seringa
Válvula de
injeção
Vials na bandeja
Frasco de lavagem
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Detectores
• Equipamento com uma pequena célula
de fluxo conectado na saída da coluna e
que monitora a concentração dos
analitos.
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Versão do FarmaBio
Detectores UV/Vis e Rede de Diodos
(DAD)
Detectores
• SENSIBILIDADE
– Fluorescência: 1.000 vezes mais sensível
que UV-Vis
– UV-Vis: 1.000 vezes mais sensível que IR
• ESPECIFICIDADE
– Aumenta com a sensibilidade
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• Integradores
• Software / Computador
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Versão do FarmaBio
Analgésicos Comprimidos
Fluxo: 2 mL/min
Detecção: UV a 240 nm
Identificação Picos
1.Acetaminofeno
2. Cafeína
3. Salicilamida
4. Ácido Acetilsalicílico
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LC Application Note LCPH-1.
Versão do FarmaBio
Teofilina
Identificação Picos:
1. Teobromina
2. Teofilina
3. -OH-etilteofillina
4. Cafeína
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LC Application Note LCCL-7.
Prednisona Comprimidos
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2.5 mg Standards
Deltasone
Coluna: Pecosphere 3 C18
(3-µm, 83 x 4.6 mm Tablet
i.d.)
Fase Móvel: 50% metanol em
água
Fluxo: 2.0 mL/min
Detecção: UV a 254 nm
Identificação Picos
1. Acetanilida
2. Prednisona