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I. Procedimientos de Seguridad
A. Químicos
Estas sustancias no son dañinas si se utilizan adecuadamente: use siempre guantes cuando se
utilizan productos químicos potencialmente peligrosos y nunca pipeteé con la boca alguno
de ellos. Si accidentalmente derrama cualquiera de estos productos químicos en la piel,
inmediatamente enjuague el área completamente con agua e informe al instructor. Desechar
los residuos en contenedores adecuados.
B. Luz Ultravioleta
La exposición a la luz ultravioleta puede causar irritación ocular aguda. Dado que la retina no puede
detectar la luz ultravioleta, puede tener lesiones oculares graves y no se dan cuenta hasta 30 minutos a
24 horas después de la exposición. Por lo tanto, use siempre protección ocular adecuada cuando se
utilizan lámparas de rayos ultravioleta.
C. Electricidad
Las tensiones para la electroforesis son suficientes para causar electrocución. Cubrir los embalses de
amortiguación durante la electroforesis. Siempre apague la fuente de alimentación y desenchufe los
cables antes de quitar un gel.
D. Limpieza general
Todas las áreas comunes deben estar libres de desorden y de utensilios sucios, equipo de electroforesis,
etc. deben ser tratados adecuadamente. Dado que usted tiene sólo una cantidad limitada de espacio para
llamarla propia, es a su ventaja de mantener su propia área limpia. Dado que va a utilizar las instalaciones
comunes, todas las soluciones y todo lo almacenado en una incubadora, nevera, etc deben estar
etiquetados. A fin de limitar la confusión, cada persona debe utilizar sus iniciales o de la denominación
única para el etiquetado de otros platos, etc material sin etiqueta en los refrigeradores, incubadoras, o
congeladores que pueden ser destruidos. Siempre se marca la parte posterior de las placas con sus
iniciales, la fecha y los datos experimentales relevantes, por ejemplo, los números de cepa.
Recientemente, un método basado en tierras diatomeas (19-22) fue usado para aislar
DNA plásmido o cósmido de un lisado celular. El crecimiento celular, lisis, y
clarificado del lisado son pasos son pasos efectuados como se describe arriba, pero
siguiendo la precipitación delDNA por polietilenglicol, el DNA es resuspendido en
buffer RNasa y tratado con RNasa A y T1. El tratamiento de la nucleasa es necesario
para remover el RNA por digestion ya que el RNA compite con el DNA para el vínculo
con la tierra diatomea. Después del tratamiento con RNasa, el DNA conteniendo
supernadadnte es vinculado a la tierra ditomea en un buffer caotrópico de hidrocloruro
de guanidina por incubación a temperatura del cuarto. El DNA asociado a la tierra
diatomea es entonces recolectado por centrifugación, lavado varias veces con buffer de
etanol y acetona, secado, y después resuspendido en buffer. El DNA es eluído durante
incubación a 65° C y el DNA conteniendo supernadante es recolectado después de
centrifugación y separación de las partículas de tierra diatomea. El DNA recuperado es
medido mediante la toma de lecturas de absorbancia a 260 nanómetros. Después de la
concentración por precipitación con etanol, el DNA es ensayado por digestión
restrictiva.
Protocolo
1. Tome una colonia bacteriana que albergue el DNA plásmido o cósmido de interés y
colóquela en un tubo Falcon de 12 X 75 mm conteniendo 2 ml de medio LB
suplementado con el antibiótico apropiado (comúnmente ampicilina a 100 ug/ml) e
incube a 37° C por 8-10 horas con agitación a 250 rpm. Transfiera el cultivo a un
matraz Ehrlenmeyer flask conteniendo 50 ml de un medio similar, e incube por otras 8-
10 horas. Transfiera 12.5 ml del cultivo a cada uno de los 4 litros de mdio similar, e
incube por unas 8-10 horas adicionales.
2. Albergue las células por centrifugación a 7000 rpm por 20 minutos en frascos de 500
ml en el RC5-B usando el rotor GS3. Resuspenda las placas de células en medio Viejo y
transfiera a dos frascos, centrifuge como antes, y decante el medio. Las placas de
células pueden ser congeladas a -70°C en este punto.
4. Agregue un total de 140 ml de solución lisis alcalina (70 ml por cada frasco), y
mezcle cuidadosamente, e incube por 5min en un baño de hielo-agua.
5. Añada 105 ml de 3M NaOAc, pH 4.8 (52.5 ml por cada frasco), tape bien, mezcle
gentilmente invirtiendo el frasco algunas veces, e incube en un baño de hielo-agua por
30-60 minutos.
8a. Colecte el DNA precipitado por el PEG por centrifugación en frascos de 250 ml a
7000 rpm por 20 minutos a 4°C en el RC5-B usando el rotor GSA.
10a. Transfiera la muestra a tubos de polialómero para centrífuga de 35 ml, remueva las
burbujas de aire, selle con tapones de goma y asegure adecuadamente.
13a. Para remover el bromuro de etidio, cargue la muestra de DNA en una columna
equilibrada Dowex 1.5 ml, y colecte fracciones de 0.5 ml. Equilibre la resina Dowex
AG (BioRad) por centrifugación sucesiva, resuspensión, y decantando con 1M NaOH,
agua, y después HCL-Tris 1M, pH 7.6 hasta que la solución Dowex tenga un pH de 7.6.
14a. Reúna fracciones con un A260 de 1.00 o mayor en tubos de vidrio Corex de 35 ml,
añada un volumen de ddH2O, y precipite con etanol por adición de 2.5 volumenes de
etanol frío al 95%. Incube al menos 2 hours a -20°C, centrifuge a 10,000 rpm por 45
minutos en el RC5-B usando el rotor SS-34. Decante con cuidado el supernadante,
añada 80% de etanol, centrifugue como antes, decante, y seque la placa de DNA en un
horno a vacío.
7b. Reúna los supernadantes del paso 6 en frascos de 500 ml y agregue RNasa A libre
de DNasa y RNasa T1 de tal forma que la concentración final de RNasa A sea 40 ug/ml
y de RNase T1 sea 40 U/ml. Incube en un baño de agua a 37°C por 30 minutos.
13b. Resuspenda la placa en 20 ml de buffer TE 10:1 TE, y eluir el DNA envolvente por
incubación a 65°C por 10 minutos con mezclado intermitente.
14b. Remueva la tierra diatomea por centrifugación a 9,000 rpm por 10 minutos en el
RC5-B usando el rotor GS3. Repita si es necesario.
15b. Combine los supernadantes que contienen DNA y precipite el DNA en tubos de
vridrio Corex de 35 ml agragando 2.5 volumenes de 95% de etanol frío/acetona.
16b. Resuspenda la placa seca de DNA en 2 ml de buffer TE 10:0.1 y ensaye por
concentración para lecturas de absorbancia a 260 nm o por electroforesis de gel de
agarosa.
Protocolo
1. Tome una colonia de bacteria que albergue el DNA plásmido de interés y colóquela
en un rubo Falcon de 12 X 75 mm conteniendo 3 ml de medio 2xTY suplementado con
el antibiótico apropiado (comúnmente ampicilina a 100 ug/ml) e incube a 37° C de 8-10
horas con agitación a 250 rpm. Transfiera el cultivo a un matraz Ehrlenmeyer
conteniendo 50 ml de un medio similar, e incube por otras 11-14 horas.
2. Junte las células por centrifugación a 3000 rpm por 5 minutos en tubos cónicos de 50
ml en la centrífuga de mesa Beckman GPR y decante el supernadante. Las plascas de
células pueden congelarse a -70°C en este punto.
11. Resuspenda la placa en 0.6 ml de buffer TE 10:1, y eluír DNA aprisionado por
incubación a 65°C por 10 minutos con mezclado intermitente.
12. Remueva la tierra diatomea por centrifugación a 3,000 rpm por 5 minutos en la
centrífuga de mesa Beckman GPR.
Nota: Esta es una típica mini-prep hasta el paso 7, donde en el paso 7a se debe
precipitar la muestra y usarla para el ciclo secuenciado de Taq con los tapaporos
rotulados, o en el paso 7b proceder con la purificación de la tierra diatomea para
reacciones de ciclo secuenciado para Taq con terminador rotulado. Para reacciones de
de secuenciado para Sequenase terminador rotulado use el procedimiento Midi-prep
detallado anteriormente.
Protocolo
1. Tome una colonia que albergue el DNA plásmido de interés y colóquelo en un tubo
Falcon de 17 X 100 mm conteniendo 6 ml de metió TB suplementado con el antibiótico
apropiado (comúnmente ampicilina a 100 ug/ml) e incube a 37° C de 16-18 horas con
agitación a 250 rpm.
2. Colecte las células por centrifugación a 3000 rpm por 5 minutos en un centrífuga de
mesa Beckman GPR y decante el supernadante. Las placas celulares pueden ser
congeladas a -70°C en este punto.
7a. Precipite el DNA por adición de 1 ml de etanol 95%, y resuspenda la placa de DNA
seca en 100-200 ul de buffer TE 10:0.1. Electroforise una alícuota de la muestra de
DNA en un gel de agasora al 0.7% para determinar en crudo la concentración y pureza.
8b. Encienda la bomba de vacío y ajuste el nivel de vacío a 8 in. Hg, deje secar la
membrana por 1 minuto, y entonces cese el vacío.
9b. Derrame las muestras bien mezcladas dentro de los pozos del colector Prep-A-Gene
y filtre a 8 in. Hg hasta que el líquido haya pasado a través del filtro.
10b. Lave las muestras cuatro veces con 250 ul de buffer de lavado de tierra diatomea,
usando una pipeta de repetición, permitiendo que todo el el líquido sea filtrado entre los
lavados.
11b. Reduzca el vacío a 5 in. Hg antes de cesar el vacío en la llave de paso. Sin
desmontar las abrazaderas negras, retire las abrazaderas blancas y coloque el estante de
recolección con tubos de rosca de 1.5 ml en el colector. Sujete el colector con las
abrazaderas blancas, y aplique 300 ul de buffer TE 10:1 calentado a 65°C y jale el DNA
eluido a 5 in. Hg. Después de que el líquido ha sido filtrado, aumente el vacío a 10-12
in. Hg, y deje la membrana secarse por 1 minuto.
12b. Cese el vacío en la llave de paso y remueva el estante de recolección que contiene
los tubos. Precipite el DNa con etanol y resuspenda la placa de DNA secado en 30 ul de
buffer TE 10:0.1.
Protocolo
2. Colecte las células por centrifugación a 7000 rpm por 20 minutos en frascos de 500
ml en el RC5-B usando el rotor GS3. Resuspenda las places celulares en medio fresco
2xTY para remover fago extracelular contaminante y transfiera a dos frascos,
centrifugue como antes, y decante el medio. Las placas celulares pueden se congeladas
a -70°C en este punto.
3. Resuspenda las placas celulares en un total de 120 ml (30 ml por cada frasco) de
buffer STB 1X removiendo suavemente la placa con una espátula. Añada un total de 24
ml solución de lisozima (6 ml por cada frasco), mezcle con cuidado, e incube por 5
minutos en un baño de hielo-agua.
4. Añada 48 ml de buffer TTE 50:2:10 (12 ml por por cada frasco) y 2 ml de RNasa A
(10 mg/ml) (0.5 ml por por cada frasco), mezcle gentilmente, e incube en un baño de
hielo-agua por 5 minutos.
9. Visualice el DNA teñido con el bromuro de etidio bajo luz UV de longitud de onda
larga, remueva la banda inferior de DNA usando una jeringa de 5cc y una aguja de
calibre 25. (Sería adecuado remover y descartar la banda superior primero).
10. Para remover el bromuro de etidio, cargue la muestra de DNA en una columna de
1.5 ml Dowex AG (BioRad), equilibrada como antes, y colecte fracciones de 0.5 ml.
11. Junte las fracciones con un A260 de 1.00 o mayor en tubos de vidrio Corex de 35
ml, añada un volumen de ddH2O, y precipite con etanol agregando volúmenes de 2.5 de
etanol frío al 95%. Incube por lo menos 2 horas a -20°C, centrifugue a 10,000 rpm por
45 minutos en el RC5-B usando el rotor SS-34. Decante con cuidado el supernadante,
añada etanol al 80%, centrifugue, decante, y seque la placa de DNA en un horno a
vacío.
Protocolo
4. Centrifugue por 15 minutos a 12,000 rpm a 4°C para recolectar el fago precipitado.
Decante el supernadante y remueva el PEG residual supernadante por succión dos
veces.
6. Extraer el DNA con fenol y dos veces con éter, como se discutió anteriormente, y
después precipite con etanol.
Protocolo
3. Separe las células bacterianas del supernadante conteniendo viral por centrifugación a
12,000 rpm por 15 minutos a 4°C. Abra cuidadosamente los tubos y coloque en la
tableta Biomek.
11. Precipite con etanol el DNA agregando 500 ul etanol/acetato a cada tubo, como se
describió anteriormente.
Protocolo
7. Remueva con cuidado 200 ul del supernadante de cada pozo en el bloque de 96 pozos
con la pipeta de 12 canales y transfiéralos a una placa de microtitulación de fondo en V,
siendo cuidadoso de no transferir ninguna célula de desecho.
2. Colecte las células por centrifugación a 1800 rpm por 7 min. Drene el supernadante y
permita que las placas se drenen invertidas. Las placas celulares pueden ser congeladas
en este punto si es necesario.
7. Siguiente, el Biomek añadirá 100 ml de solución lisis alcalina a los pozos con la
placa de filtro.
9. El Biomek añadirá 100 ml 3M KOAc, pH 4.8 a los pozos de la placa filtro y mezclará
al los lados de los pozos. Algunos escogen colocar la placa filtro a -20°C por 5 minutos
en este punto. Transfiera la placa filtro al QiaVac Vacuum Manifold 96 y filter usando
agua de vacío solamente (no force la filtración ya que las placas son frágiles y podrían
perder su sello). Esto comúnmente toma menos de 20 minutos.
11. Centrifugue por 25 minutos a 3000 rpm en una centrífuga enfriada Beckman GPR.
12. Decante y lave con 500 ml de etanol al 80% y centrifugue por 5 minutos adicionales
a 3000 rpm.
13. Decante el supernadante, drene invertido en una toalla de papel. Seque a vacío.
2. Enjuague las muestras congeladas, y a cada muestra de 1 ml, añada 0.8 ml de buffer
1X SSC, y mezcle. Centrifugue por 1 minuto a 12,000 rpm en una microcentrífuga.
13. Resuspenda el emplacado adicionando 200 ul de buffer TE 10:1 TE. Incube por la
noche a 55°C, agitando periódicamente para disolver el DNA genómico. Almacene las
muestras a -20°C.
Extracción de DNA
Ésta es una modificación de un procedimiento de salado como es descrito por Miller et
al., (1988), evaluado en el Laboratorio de DNA, Escuela Médica, Malta. Cuando se
analizó por espectrofotmetría >95% del DNA genómico extraído dió un promedio de
pureza de DNA a proteínas en un rango de 1.7 - 1.9 y una concentración de 100ng/ml.
PROCEDIMIENTO:
Procedimiento
1. Tome el matraz con el cultivo celular y transfiera el contenido a un
tubo de centrifuga de 15 o 50 ml.
Centrifugue los cultivos celulares por 10 min a 1200 rpm. Lave el
emplacado celular dos veces con 10 ml 1X PBS, centrifugando entre
lavados.
2. Remueva el supernadante, lave las células dos veces con 10 ml de
buffer DNA y resuspenda en 10 ml de buffer DNA; incube por 10 min
en hielo.
3. Centrifugue por 10 min a 1200 rpm y remueva el supernadante.
Añada 3 ml de buffer DNA; resuspenda el emplacado. Agregue 100 μl
de Proteinasa K (10 mg/ml) y 400 μl de 10% SDS. Agite suvemente e
incube a 45°C en unbaño de agua por la noche.
4. Añada 3.6 ml de fenol. Agite a mano por 10 min (RT); centrifugue
por 10 min a 10°C a 3000 rpm.
5. Transfiera el supernadante a un tubo nuevo de 50 ml. Añada 1.8 ml
de fenol y 1.8 ml de cloroformo/alcohol isoamílico (24:1), agite a
mano por 10 min (RT); centrifugue por 5 min a 10°C (3000 rpm).
6. Transfiera el supernadante a un tubo nuevo de 50 ml. Añada 3.6 ml
de cloroformo/alcohol isoamílico y agite a mano por 10 min (RT);
centrifugue por 5 min a 10°C (3000 rpm).
7. Transfiera el supernadante a un tubo nuevo de 50 ml. Añada 36 μl
(1/10) de acetato de sodio 3 M (pH 5.2), mezlce suavemente, y
agregue 3 volumenes de etanol al 100%; agite suavemente hasta que
el DNA se precipite.
8. Use una pipeta de vidrio estéril para transferir el DNA precipitado a
un tubo de 30 ml de 70%. Coloque en un estante de invertido e
invierta por 2 hr para enjuagar a fondo. Transfiera el DNA a un tubo
eppendorf estéril.
9. Centrifugue por 20 min a 14,000 rpm. Seque el emplacado en un
speed vac por 5 min. Disuelva el DNA en 300 l agua estéril y
coloque en un agitador rotativo por la noche a 4°C.
10. Mida la concentración de DNA y corra de 1-5 l
(aproximadamente 200 ng)
por electroforesis en gel de agarosa (1%) en buffer 1X TAE.
Reactivos:
1) Buffer Lisis
0.32 M Sucrosa
10mM Tris-HCl (pH 7.5)
5 mM MgCl2
1% v/v Triton X-100
2) PBND (PCR Buffer con detergentes no iónicos)*
50 mM KCl
10 mM Tris-HCl (pH 8.3)
2.5 mM MgCl2
0.1 mg/ml gelatina
0.45% (v/v) Nonidet P40
0.45% (v/v) Tween 20
Autoclave para esterilizar y disolver la gelatina
Almacene en congelación
La gran variedad de adsorbentes de vidrio se ha reportado los últimos años para ser
usados en la extracción de DNA desde varias fuentes, conteniendo ácidos nucleicos.
Para referencia, el aislamiento de fragmentos de DNA de gel de agarosa (4), DNA
plásmido de E.coli (3) y DNa genómico de células eucariótidas o procariótidas (1)
podría ser traida. Sin embargo, la sangre entera representa una cierta dificultad para la
extracción de DNA inmediata debido a la presencia de grandes cantidades de protein en
la muestra. Asi, fue la razón de que extractos de DNA aparecieron contaminados por
material rojo, inhibiendo la amplificación de PCR, cuando intentamos aplicar
procedimientos de aislamiento de DNA basados en vidrio disponible directamente a la
sangre entera.
Reactivos
• La composición de la solución de guanidina fue: 6 M GuSCN, 20 mM EDTA,
10 mM Tris-HCl (pH 6.5), 40 g/l Triton X-100 y 10 g/l DTT.
• La mezcla ligadora fue preparada por resuspendido de 4 g de silica gel (Aldrich,
#28,851-9) en 100 ml de solución de guanidina.
• El lavado de propanol contenido de 25% iso-propanol, 25% etanol, 100 mM
NaCl y 10 mM Tris-HCl (pH 8.0). todos los reactivos pueden ser almacenados a
la temperatura del cuarto.
Procedimiento
1. Mezcle en un tubo de minicentrifugación de 2.2 ml 0.5 ml de sangre entera
(conteniendo 50 mM de EDTA como anticoagulante) con 1.0 ml de mezcla
ligadora.
2. Incube a la temperatura del cuarto por 3 min.
3. Colecte silica gel por giro corto (3 seg, 5000 g).
4. Resuspenda el emplacado en 1.0 ml de solución de guanidina por
arremolinamiento.
5. Peletice el adsorbente por giro corto (a 5000 g).
6. Repita el lavado de la silica gel con la solución de guanidina.
7. Después, lave la silica gel con propanol de lavado (dos veces) y etanol puro (una
vez) de la misma forma.
8. Remueva a fondo el etanol y seque la silica gel a vacío aplicando calor.
9. Resuspenda la silica gel en 100 ul de buffer TE. Eluya DNA a 65oC por 3 min.
10. Resuspenda mezcla otra vez, centrifugue por 10 seg, tome el supernadante.