Procedimiento Normalizado de Trabajo

Análisis de la viabilidad celular en células que

crecen adheridas a superficie

ELABORADO: REVISADO : APROBADO:

Susana Hernández García

INDICE

1. OBJETO
2. ALCANCE
3. REFERENCIAS
4. NORMAS DE SEGURIDAD
5. RECURSOS HUMANOS
6. MATERIAL, EQUIPOS Y REACTIVOS
6.1. MATERIAL

6.2. EQUIPOS

6.3. REACTIVOS

7. PROCEDIMIENTO
1. OBJETO

Describir el procedimiento para la determinación de la viabilidad celular mediante el

ensayo de MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-dipheniltetrazolium bromide) también
llamado test de inhibición de la Succinato Deshidrogenasa que es un método
colorimétrico que mide cuantitativamente la actividad metabólica de las células viables
y que se basa en la capacidad que tienen las deshidrogenasas mitocondriales de las
células metabólicamente activas de reducir la sal de tetrazolium (MTT), de color
amarillo e hidrofílica, a un compuesto hidrofóbico (formazán), de color azul oscuro.
Tras la captación del MTT, las células se rompen y se solubiliza el formazán con
DMSO. La absorbancia de cada muestra es directamente proporcional al número de
células viables.

2. ALCANCE

Este método es aplicable para la determinación de la viabilidad celular en células que

crecen adheridas a superficie.

3. REFERENCIAS

4. NORMAS DE SEGURIDAD

En general, habrá que tomar las precauciones indicadas en las Fichas de Seguridad de
cada producto al que se le aplique este método de análisis.
Trabajar siempre en condiciones de esterilidad, en cabina de flujo laminar para evitar la
contaminación de los cultivos celulares. El ensayo bioquímico puede realizarse en
condiciones de ausencia de esterilidad.

5. RECURSOS HUMANOS

La determinación debe ser realizada por el personal cualificado para su uso.

6. MATERIAL, EQUIPOS Y REACTIVOS

6.1. Material

• Micropipetas de rangos adecuados.

• Pipetas de vidrio de rangos adecuados.

• Placas de 6, 12, 24,48 o de 96 pocillos.

• Como material vivo líneas celulares tumorales.

6.2. Equipos

• Incubadora a 37ºC,5%CO2, 95% de aire y a 1 atm de presión.

• Lector de placas a 570nm.

• Microscopio de contraste de fases invertido.

6.3. Reactivos

• Fármacos a estudiar (reconstituidos según fabricante con DMSO,etanol, etc.).

• DMEM con 10% de FBS, 1% Penicilina / Streptomicina y 1%Glutamina.

• 0.25% Tripsina con EDTA 1X conservada a 4ºC.

• MTT Sigma(Referencia: M2128) 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-dipheniltetrazolium

bromide 5mg/ml disuelto en PBS 1x Na+/K+ y conservado a 4ºC protegido de la luz, así
se puede mantener hasta 2 semanas (congelado a 0ºC se puede mantener hasta 6 meses).

• Solución de DMSO.

7.PROCEDIMIENTO DE ANÁLISIS

7.1 Preparación y sembrado

• Tener en cuenta a lo largo del procedimiento que no se deben tocar superficies y se

debe mantener la mayor esterilidad posible.

• Observar al microscopio la línea celular que se va a utilizar, para ver como es su tasa
de crecimiento, y si están creciendo bien (adheridas a superficie, como ocurre con las
células mesenquimales y las líneas celulares de tumores sólidos).
• Tripsinizar las células para romper las uniones entre células y de células con el
soporte:

- Dejar la tripsina a temperatura ambiente (nunca calentar en baño

a 37ºC).La tripsina tiene su actividad optima a 37ºC pero a esa
temperatura también se inactiva luego no calentar a 37ºC en
baño maría porque va perdiendo actividad en cada uso.
- Aspirar al vacío el medio DMEM de las células adheridas en el
fondo de la placa.
- Lavar las placas con 2 ml-10 ml de PBS 1X Na+/K+ (tampón de
fosfato y cloruro de sodio a pH 7.4).
- Aspirar al vacío el PBS de las células. Con esto conseguimos
eliminar el medio DMEM porque tiene inhibidores de proteasas
como son el Ca2+ y el Mg2+ en el suero.
- Añadir 0,5 ml-3 ml de la solución de tripsina/EDTA estéril. La
concentración de tripsina puede ser 1X o diluida 1:4 con PBS,
según la sensibilidad a la proteasa de la línea celular con la que
se trabaje.

Se añade el volumen necesario para cubrir las células y se mueve

circularmente la placa hasta que quede bien empapada de
tripsina. Dejar sólo unos segundos y retirar la tripsina. Dejar
actuar a la tripsina residual, de este modo se evita provocar un
mayor daño a las células.

- Seguir con el microscopio el proceso para comprobar la

liberación de las células. También se puede visualizar a ojo que
al inclinar la placa se observa un grumo de células que se
desplazan con el líquido residual de tripsina.
- Dejar 5-10 minutos las placas en la incubadora a 37ºC en el caso
de que las células sean más difíciles de despegar.
- Añadir 5 ml-10 ml del medio DMEM.
• Preparar placas de 24 pocillos con el número de células adecuado por pocillo en un
volumen de 1ml (usar el método de recuento en cámara NEUBAUER para hacer los
cálculos).El personal de laboratorio debe calcular la curva de crecimiento que
asegure un crecimiento exponencial (la curva ha de ser lineal) para testar el número
de células adecuado según la línea celular y su tasa de crecimiento, si las células
crecen muy rápido se añadirá una menor cantidad por pocillo y viceversa. Por
ejemplo, en tumores sólidos de mama la línea celular MCF-7 tiene un crecimiento no
excesivamente rápido y se ha testado en 20.000 células por pocillo en placas de 24
pocillos.

• Añadir el control que son las células con el medio DMEM a razón de 1ml por pocillo
en placas de 24 pocillos. Siempre tener en cuenta los experimentos por
cuadruplicado.

• Añadir el blanco ,1ml por pocillo de medio DMEM sin células, en placas 24 pocillos.

7.2 Estudio de la acción del fármaco.

• Añadir las diferentes concentraciones de fármacos (excepto en el control y el medio)

en distintos tiempos de reacción, si se desea. Tener siempre en cuenta que la
concentración del DMSO y etanol debe ser a lo sumo 0.1%, concentración no tóxica.

• Dejar incubando a 37ºC 5%CO2 95% de aire y a 1 atm de presión, el tiempo que se
estime el experimento, 48 horas normalmente.

• Comprobar que el MTT está en buenas condiciones, sin precipitación de cristales ni

oscurecido, porque indicaría que el producto está deteriorado.

• Agitar la solución de MTT arriba y abajo un par de veces.

• Añadir 110 µl de MTT en cada pocillo, en placas de 24 pocillos. Así el MTT queda
diluido 10 veces.

• Incubar a 37ºC, 5% CO2, 95% de aire y a 1 atm de presión durante 1 hora. Tener
siempre en cuenta la densidad celular y la actividad metabólica de la línea a tratar.
• Añadir 500 µl DMSO. Con esto se redisuelven los cristales de formazán que se han
producido por la reducción del tetrazolio a la vez que se lisan las células.

• Mantener las placas en agitación durante 10 minutos a temperatura ambiente y en

oscuridad.

• Observar la placa, un color azulado en los pocillos indicaría que las células son
viables.

• Medir la absorbancia en Lector de placas a 570nm.

• Tratar los datos con el programa Microsoft Office Excel, se tiene en cuenta la media ±
la desviación standard de cuadruplicados.

• Calcular el índice de citotoxicidad IC50, tener en cuenta que en el programa Microsoft

Office Excel se calcula sólo si la relación tasa de supervivencia y dosis es lineal, luego
se aconseja calcularla a mano en papel milimetrado; en el eje de la x se representan las
concentraciones de los fármacos y en el de la y la tasa de supervivencia.