La conformazione a poro aperto di canali di potassio

Youxing Jiang, Alice Lee, Jiayun Chen, Martine Cadene, Brian T. Chait e Roderick
MacKinnon

Howard Hughes Medical Institute, Laboratorio di neurobiologia molecolare e biofisica e

laboratorio di spettrometria di massa e chimica degli ioni gassosi, Rockefeller University,
1230 York Avenue, New York, New York 10021, USA
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Le cellule viventi regolano l'attività dei loro canali ionici attraverso un processo noto come
gating. Per aprire il poro, devono avvenire cambiamenti conformazionali proteici all'interno
del percorso ionico che attraversa la membrana del canale. KcsA e MthK, i canali K1 chiusi
e aperti, rispettivamente, rivelano come si verificano tali transizioni di gate. Le eliche
"interne" che rivestono i pori contengono una "cerniera di chiusura" che si piega di circa 308.
In una conformazione diritta quattro eliche interne formano un fascio, chiudendo il poro
vicino alla sua superficie intracellulare. In una configurazione piegata le eliche interne si
aprono creando un ampio ingresso (12 A ̊). La conservazione della sequenza aminoacidica
suggerisce una base strutturale comune per il gate in una vasta gamma di canali K1, sia con
legante che con voltaggio. La conformazione aperta favorisce l'elevata conduzione
comprimendo il campo della membrana al filtro di selettività e consente anche a grandi
cationi organici e peptidi di inattivazione di entrare nel poro dalla soluzione intracellulare.

Il potassio e altri canali ionici sono proteine ​allosteriche che si alternano tra conformazioni
chiuse e aperte in risposta a uno stimolo esterno in un processo noto come gating. A
seconda del tipo di canale, lo stimolo di gating può essere il legame di un ligando, il campo
elettrico della membrana o entrambi. Un problema centrale nella biofisica del canale ionico
riguarda la natura dei cambiamenti conformazionali dei pori che accompagnano il gate del
canale. Che aspetto hanno le strutture aperte e chiuse del poro? In generale, si sa poco sui
cambiamenti conformazionali proteici nelle proteine ​di membrana, eppure per i canali ionici
questi cambiamenti sono cruciali per ogni aspetto della loro funzione: conduzione ionica,
gating e farmacologia. Qui, affrontiamo le seguenti domande riguardanti queste tre aree
della funzione del canale ionico. Per il meccanismo di conduzione dei canali Kþ, quando il
poro si apre, quanto diventa largo, in che modo l'apertura cambia il campo elettrico
attraverso il poro e quanto è accessibile il filtro di selettività Kþ alla soluzione intracellulare?
Per il meccanismo del gate, quali sono i meccanismi dell'apertura dei pori, i cambiamenti di
configurazione all'interno della membrana sono grandi o piccoli? Infine, per la farmacologia
del canale Kþ, quali superfici proteiche vengono esposte quando il poro si apre e come
potrebbero interagire gli agenti farmacologici con lo stato chiuso rispetto a quello aperto del
canale?

Esperimenti mutazionali di numerosi laboratori hanno posto importanti vincoli strutturali al

gate del canale Kþ. In particolare, gli studi mutazionali del canale Kþ1,2 dipendente dalla
tensione dello Shaker — interpretato nel contesto della struttura del canale KcsA Kþ3 —
hanno identificato quella che è probabilmente la porta del poro. Nella struttura KcsA quattro
a-eliche (eliche interne) allineano la metà intracellulare del poro, formando un fascio di mano
destra (fascio di elica interna) vicino all'apertura intracellulare (Fig. 1) 3,4. Il fascio interno di
elica segna il punto in cui il poro di Shaker diventa inaccessibile ai composti tiolo-reattivi e
agli ioni metallici applicati al lato citoplasmatico del canale quando il canale è chiuso1,5.
Pertanto, sembrerebbe che la metà extracellulare del poro, dove si trova il filtro di selettività,
sia dedicata alla funzione di selettività Kþ, e che la metà intracellulare, dove il poro è rivestito
da eliche interne, sia dedicata al gate.

Nella struttura KcsA il poro è molto ampio (circa 12 A ̊ di diametro) al centro della membrana
in quella che viene chiamata cavità centrale, ma più vicino all'apertura intracellulare, a livello
del fascio interno dell'elica, il diametro dei pori si restringe a circa 4,0 A ̊ (la separazione tra
le superfici di atomi proteici di van der Waals) (Fig. 1). In questo segmento stretto, le catene
laterali idrofobiche dalle eliche interne rivestono il poro, creando quello che sembrerebbe un
ambiente inospitale per uno ione Kþ. Il cancello è chiuso nella struttura di cristallo KcsA? Le
misurazioni funzionali offrono la migliore comprensione del probabile stato conformazionale.
Nelle membrane, il canale KcsA Kþ ha una probabilità di apertura molto bassa anche nelle
condizioni di pH acido note per aprire il canale6,7. Quando gli aminoacidi carbossilici 35
terminali intracellulari vengono troncati da KcsA, la probabilità di apertura è ancora più
bassa, rimanendo effettivamente vicino allo zero (C. Miller, comunicazione personale). Le
strutture cristalline (Fig. 1) sono del canale KcsA Kþ troncato3,4; se la struttura corrisponde
alla funzione, il canale KcsA Kþ troncato ha un gate chiuso.

Come si muovono esattamente le eliche interne per aprire il poro? Questa è stata una
domanda difficile a cui rispondere in assenza di misurazioni dirette di strutture di canali
chiuse e aperte. Un tentativo, usando la risonanza paramagnetica elettronica (EPR) con i
canali KcsA marcati con spin, ha suggerito che le eliche interne ruotano e si traducono
(rispetto alla struttura cristallina KcsA), causando un aumento del diametro molto sottile nel
fascio interno dell'elica (Dati sulle proteine Codice bancario 1JQ1) 8,9. Tuttavia, un diverso
approccio che utilizza la cristallografia a raggi X implica che il poro potrebbe aprirsi ad un
diametro molto più ampio10. Lo studio cristallografico ha mostrato che lo ione
tetrabutilammonio (TBA) bloccante il canale K si lega nella cavità centrale. Nella struttura le
eliche interne sono rimaste nella loro conformazione apparentemente chiusa, ma devono
aver aperto molto per consentire l'ingresso di TBA (diametro 10-12 A ̊).

Meccanica del poro gating

Il canale MthK di Methanobacterium thermoautotrophicum insieme al canale KcsA fornisce
preziose informazioni sui cambiamenti conformazionali che apparentemente sono alla base
del gating del canale Kþ. La struttura del canale MthK include il suo meccanismo di gating
(l'anello di gating) e contiene un ligando legato (uno ione Ca2þ) che apre il canale in
membrane11 (codice PDB 1LNQ). La Figura 2 mostra la struttura dei pori del canale MthK
accanto al canale KcsA Kþ (codice PDB 1K4C). Il confronto tra queste due strutture ha
rivelato innanzitutto che la struttura che circonda il filtro di selettività è abbastanza simile in
entrambi i canali, a parte le differenze nella lunghezza dei circuiti extracellulari a "torretta". In
secondo luogo, ci sono differenze strutturali molto grandi che coinvolgono le eliche interne:
in KcsA le eliche interne sono quasi diritte e formano un fascio vicino alla soluzione
intracellulare, mentre in MthK le eliche interne sono piegate e aperte (Fig. 2a-c). In terzo
luogo, la curva (circa 308) nelle eliche interne MthK si verifica in un punto di cerniera - una
cerniera di gate - che si trova in profondità all'interno della membrana, appena sotto il filtro di
selettività. La cerniera del cancello corrisponde a Gly 83 in MthK e Gly 99 in KcsA (Fig. 3).
La glicina è unica nella sua capacità di adottare una vasta gamma di angoli diedri della
catena principale e conferisce flessibilità in punti specifici delle strutture proteiche. La
presenza di una glicina sulla cerniera del gating consente le differenze strutturali osservate
tra i canali KcsA e MthK. In quarto luogo, per convertire la struttura KcsA (poro chiuso) nella
struttura MthK (poro aperto), sembra che si debba semplicemente esercitare una forza
laterale (radiale-esterna) sull'estensione del terminale C (intracellulare) dell'interno eliche;
tale forza importerebbe una coppia sulla cerniera del gating (Fig. 2c, d). Nella conformazione
aperta l'area di contatto tra l'elica interna ed esterna è ridotta, specialmente vicino alla
superficie intracellulare. Questo probabilmente spiega il raddrizzamento delle eliche esterne
in MthK. Infine, il poro aperto è molto ampio, circa 12 A ̊ nel suo punto più stretto (Ala 88,
Fig. 3), in modo che la cavità centrale diventa essenzialmente continua con la soluzione
intracellulare. La struttura può essere visualizzata nelle Informazioni supplementari come
film.

Il meccanismo di gate è conservato

È ragionevole confrontare due diversi canali Kþ, KcsA e MthK, per inferire i cambiamenti
conformazionali che sono alla base del gate? L'allineamento della sequenza basato sulla
struttura usando una vasta gamma di canali Kþ suggerisce che lo è, e che i cambiamenti
conformazionali inferiti probabilmente si verificano nella maggior parte dei canali Kþ (Fig.
3a). Le sequenze dei canali Kþ mostrate in Fig. 3a coprono l'ampia gamma presente in
natura: procariotici, eucariotici, canali con due e sei segmenti di membrana per subunità,
con legante e voltaggio. Perfino i canali ciclici nucleotidici (CNG), che non sono selettivi per
Kþ ma sono correlati ai canali Kþ, apparentemente mostrano simili cambiamenti
conformazionali12. L'osservazione principale nell'allineamento della sequenza è una forte
conservazione degli aminoacidi in due posizioni nell'elica interna (Fig. 3a, b). La prima
posizione è la cerniera del cancello, conservata come glicina (rossa in Fig. 3a);
apparentemente tutti questi canali hanno una cerniera gating. La seconda posizione è
costituita da cinque amminoacidi C-terminali rispetto alla cerniera del cancello, conservati
come alanina o glicina (verde). L'importanza di avere un amminoacido con una piccola
catena laterale in questa seconda posizione è evidente all'ispezione della struttura del
canale MthK: questo amminoacido punta la sua catena laterale verso il poro, una grande
catena laterale tende a tappare il poro e interferire con conduzione ionica. Pertanto, la
struttura MthK rivela il significato di un residuo di glicina, per consentire una cerniera di
gating flessibile e un residuo di alanina, per garantire un ampio percorso affinché gli ioni
raggiungano il filtro di selettività. La conservazione di questi residui implica un cambiamento
conformazionale dei pori conservato. Per questo motivo proponiamo che le strutture KcsA e
MthK rappresentino gli stati chiusi e aperti della maggior parte dei canali Kþ, con legante e
voltaggio, nonché i canali CNG.

La meccanica dell'apertura dei pori può essere conservata in diversi canali Kþ, ma strutture
molto diverse, come i sensori di tensione di membrana integrati13,14 e i domini di legame
del ligando intracellulare15, devono adattarsi meccanicamente al poro in modo da poter
esercitare una forza laterale sul eliche interne. Pertanto, l'estremità C-terminale delle eliche
interne deve variare nella struttura da un canale all'altro, a seconda del dominio di gate
associato. Nel canale MthK non siamo in grado di risolvere completamente la connessione
tra il poro e il suo dominio gating, ma l'elica interna punta sul suo sito di attacco come se la
connessione fosse quasi diritta11. Quando il poro si chiude, affinché le eliche interne
formino un fascio - simile alla struttura osservata in KcsA (Fig. 2) - la connessione dovrebbe
sviluppare una curva. A questo proposito, gran parte del lavoro si è concentrato sulla
sequenza Pro-Val-Pro vicino al fascio di elica interna in alcuni canali Kþ dipendenti dalla
tensione1. Il suggerimento che questa sequenza possa rendere una curva sembra
ragionevole, poiché una curva dirigerebbe la parte inferiore dell'elica interna verso il dominio
del sensore di tensione.

Gating farmacologico e di inattivazione

L'ampio diametro della porta aperta (12 A ̊) è del tutto coerente con gli esperimenti di
Armstrong, dimostrando che grandi cationi organici bloccano l'ingresso intracellulare dei
canali Kþ16,17 (Fig. 4). La porta aperta è abbastanza ampia in modo che i composti organici
possano entrare dal citoplasma e raggiungere il centro della membrana (la cavità) prima di
alloggiare appena sotto il filtro di selettività10. È interessante vedere che la chiusura del
cancello (la chiusura del fascio interno dell'elica) si verifica mantenendo le dimensioni della
cavità (Fig. 2). Questa caratteristica strutturale del gate del canale Kþ è coerente con il
fenomeno del "trapping" funzionale dei cationi organici dietro il cancello, in profondità nel
poro16–18. La struttura del poro aperto si basa sulla nostra comprensione della suscettibilità
dei canali Kþ a bloccarsi da cationi organici, inclusi molti agenti farmacologici comunemente
prescritti19. Sul lato intracellulare del filtro di selettività il poro è idrofobo3, il catione è
attraente (grazie alle eliche orientate dei pori) 20 e largo (Fig. 4). Queste proprietà dei canali
Kþ sono senza dubbio alla base di alcune anomalie della conduzione cardiaca indotte da
farmaci come la sindrome acquisita con QT lungo19.

La struttura del poro aperto ci aiuta a comprendere ulteriormente una forma di gate del
canale Kþ nota come inattivazione. I canali K di tipo A come il canale Shaker Kþ si aprono in
risposta alla depolarizzazione della membrana, ma pochi millisecondi dopo smettono di
condurre ioni perché una porta di inattivazione blocca il poro sul lato intracellulare21,22.
Circa trenta anni fa fu proposto un meccanismo a "palla a catena" per un processo simile nei
canali Naþ23,24. Dieci anni fa, la porta di inattivazione "a sfera e catena" dei canali K di tipo
A ha mostrato di essere formata dal proprio ammino-terminale 21,22 del canale o dal
terminale-N di una subunità b associata25. Recentemente, sulla base di uno studio
mutazionale, è stato proposto che una porta di inattivazione N-terminale blocchi la
conduzione ionica entrando nel poro come un peptide esteso, raggiungendo la cavità10. I
dati mutazionali erano convincenti, ma, dato lo stretto poro interno di KcsA, la proposta
sembrava incredibile da un punto di vista strutturale. La struttura del canale aperto di MthK,
tuttavia, dà un'impressione diversa e razionalizza i risultati mutazionali (Fig. 4). Il poro aperto
è abbastanza largo in modo che un peptide esteso possa inserire il suo N terminale
(cationico) nella cavità.

Potenziale di membrana attraverso il poro aperto

La conformazione dei pori aperti ha importanti implicazioni per la conduzione degli ioni, in
parte perché il campo elettrico sperimentato da uno ione nel poro dipende dalla forma del
poro, tra gli altri fattori. Per ottenere un apprezzamento qualitativo per l'effetto della forma
dei pori, abbiamo calcolato il potenziale elettrostatico per i pori KcsA e MthK, i canali Kþ
chiusi e aperti, incorporati in una membrana risolvendo l'equazione di Poisson a differenza
finita. La costante dielettrica per la proteina e la membrana era fissata a 2.0, e per l'acqua al
di fuori della membrana e nei pori, 80. Per concentrarsi sull'effetto della forma dei pori sul
potenziale di membrana applicato, la proteina era scarica. I risultati sono mostrati sotto
forma di grafici di contorni elettrostatici (Fig. 5). Nella conformazione aperta la cavità ha lo
stesso potenziale di membrana della soluzione interna. Questo calcolo di Poisson fornisce il
potenziale in equilibrio, quando gli ioni non si muovono attraverso il poro. Il risultato
qualitativo è impressionante: un canale Kþ aperto assottiglia efficacemente la membrana per
uno ione Kþ diffondente a circa la lunghezza di 12 A ̊ del filtro di selettività. Cioè, la
resistenza di accesso per uno ione Kþ che si diffonde tra il citoplasma e il filtro di selettività è
bassa. Questa caratteristica dei canali Kþ contribuisce indubbiamente alla loro elevata
conduttanza.

Discussione
Sulla base del canale MthK aperto, del canale KcsA chiuso e dell'analisi della sequenza
aminoacidica, proponiamo una base strutturale per le transizioni di gate nel poro
transmembrana dei canali Kþ. Le quattro eliche interne possono esistere in una
conformazione diritta (apparentemente rilassata) nel qual caso formano un fascio che chiude
il poro vicino alla sua apertura intracellulare. In alternativa, le eliche interne possono
piegarsi, provocando l'apertura del fascio ad un diametro di circa 12 A ̊. La principale
caratteristica strutturale del cambiamento conformazionale del gate è la presenza di una
cerniera del gate situata in profondità all'interno della membrana, conservata come residuo
di glicina nella maggior parte dei canali Kþ. I cambiamenti conformazionali del gate
all'interno della membrana sono molto ampi, ma sono principalmente limitati alla metà
intracellulare del canale. Basandoci sulla conservazione della sequenza aminoacidica,
proponiamo che diversi canali K,, con legante e voltaggio, nonché con canali ciclici
nucleotidici, subiscano simili cambiamenti conformazionali dei pori. UN

metodi
Calcolo elettrostatico
Il potenziale elettrostatico è stato calcolato risolvendo l'equazione di Poisson a differenza
finita usando un programma scritto in Fortran 77 che implementava un algoritmo di
rilassamento Jacobi26,27. I pori KcsA e MthK sono stati mappati su una griglia cubica di 70
£ 70 £ 90 A with con spaziature di 1,0 A ̊. Catene laterali sono state aggiunte alla struttura
dei pori MthK per definire la regione di spazio delimitata dal canale. I canali sono stati
collocati in una lastra spessa 34 A of di costante dielettrica 2.0 utilizzata per modellare la
membrana. Alla regione proteica è stata assegnata una costante dielettrica di 2,0 utilizzando
i raggi atomici Pauling standard; se un atomo intersecava un elemento griglia, all'elemento
veniva assegnata una costante dielettrica 2.0. Non abbiamo usato cariche proteiche nel
calcolo. Alla soluzione che circonda la membrana e nel poro è stata assegnata una costante
dielettrica di 80. La forza ionica all'esterno della membrana ha avuto solo un piccolo effetto
sul potenziale all'interno della membrana e quindi è stata mantenuta a 0 per produrre la Fig.
5.
Ricevuto il 22 marzo; accettato il 22 aprile 2002.