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Roteiros de Técnicas Parasitológicas

NORMAS DE BIOSSEGURANÇA EM LABORATÓRIO DE PARASITOLOGIA

O padrão para a redução da exposição do trabalhador a patógenos baseia-se na adoção


de precauções gerais como um método de controle de infecção:
a) devem ser usadas luvas e uma cobertura protetora ou avental quando se
manipulam fezes ou outras amostras;
b) as mão devem ser lavadas com sabão desinfectante ao entrar no laboratório e
após a retirada das luvas;
c) as vestes de laboratório jamais devem ser usadas fora dele;
d) nada deve ser levado à boca quando se está no laboratório;
e) evitar tocar o rosto com as mãos, e não colocar objetos de uso pessoal, como
óculos ou livros, sobre a bancada de trabalho;
f) deve-se tomar cuidado para deixar toda a área de trabalho limpa e desimpedida.
A bancada de trabalho deve ser limpada com desinfetante ou uma solução de
hipoclorito a 50% antes e depois do trabalho;
g) todos os materiais contaminados devem ser imediatamente colocados em
desinfetante ou recipiente adequado para descarte;
h) derramamentos devem ser cobertos com desinfetante ou solução de hipoclorito a
50% e toalhas absorventes ou areia. Após 10 minutos, recolher o material
contaminado em um saco plástico ou outro recipiente adequado.

MICROSCÓPIO

O microscópio é usado em muitos setores dos laboratórios clínicos para visualizar


estruturas ou células pequenas demais para serem vistas a olho nu.
Devido ao fato do microscópio ser um instrumento delicado e caro, cuidados especiais
devem ser tomados com o seu uso, limpeza e armazenamento.
Partes de um microscópio:
Ajuste grosseiro ou macrométrico - o controle que ajusta a posição das objetivas do
microscópio; usado para o focar inicialmente o microscópio.
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Ajuste fino ou micrométrico – o controle que ajusta a posição das objetivas; usado
para o foco preciso do objeto depois de ter sido focado com o micrométrico.
Ocular - lente de aumento que está mais próxima do olho do examinador. O aumento
usual é de 10 vezes (10 x).
Objetiva - lente de aumento que está mais próxima do objeto a ser examinado no
microscópio. A objetiva pode ser de pequeno aumento (10 x), objetiva de grande
aumento (40,43 ou 45 x) e a objetiva de imersão a óleo (95, 97 ou 100 x).
Condensador – aparelho localizado abaixo da platina do microscópio que direciona a
luz para a objetiva se for baixado ou elevado. Baixando o condensador vai haver um
aumento de espécimes não corados.
Diafragma – aparelho que regula a quantidade de luz que chega ao espécime
examinado no microscópio.
Distância de trabalho - é a distãncia entre a objetiva e a lâmina quando o objeto está
em foco bem nítido. Quanto maior o aumento, menor a distância. O macrométrico não
deve ser usado quando se usa o maior aumento, para evitar que a objetiva
acidentalmente bata na lâmina e esta seja danificada.

Precauções
• Use o ajuste macrométrico somente com objetivas de pequeno aumento.
• Use o óleo de imersão sempre que usar a lente de imersão.
• Use o óleo de imersão somente com lente de imersão.
• Limpe as oculares e objetivas após o uso.
• Sempre baixar a luz antes de desligar o microscópio.
• Para carregar o microscópio, segure com uma mão o braço do microscópio e
com outra a base.
• Evite vibrações e batidas no microscópio.
• Guarde o microscópio coberto com uma capa para protege-lo do pó.

O EXAME DE FEZES

As considerações gerais para um exame de fezes de rotina no laboratório clínico


incluem os seguintes procedimentos:
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1. Fezes naturalmente evacuadas são preferidas para exame. As amostras podem


ser evacuadas em um recipiente de boca larga, estéril e colhidas isentas de urina.
Após a coleta, anotar identificação e data.

2. Para um trabalho rotineiro em parasitologia, recomenda-se que os pacientes


sejam submetidos a duas evacuações normais. Geralmente UMA ou DUAS
amostras (com intervalo de 3 dias entre as coletas) são suficientes para a
pesquisa e identificação parasitológica.

3. Um exame de amostras frescas deve ser realizado de acordo com a seguinte


orientação:
Amostras líquidas: Não esperar mais que 30 minutos
Amostras semi-sólidas: Não esperar mais que 01 hora
Amostras formadas: Não esperar mais que 24 horas

4. Se o exame demorar mais que 24 horas, a amostra deverá estar preservada em


álcool polivinílico (PVA), MIF (mertiolato-iodo-formaldeído) ou formol. Os
ovos de Ancilostomídeos maturam e se rompem se forem deixados à temperatura
ambiente, e podem ser confundidos com larvas de Strongyloides, a não ser que
sejam cuidadosamente observados.

5. Todas as amostras para estudo parasitológico devem ser coletadas antes de


iniciar tratamento com antibióticos visto que os antibióticos afetam a flora
intestinal normal e freqüentemente causam diminuição ou ausência dos parasitas
nas fezes, porém, se o antibiótico tiver sido administrado, novas coletas fecais
serão necessárias após o tratamento, pelo menos duas semanas após o término da
antibióticoterapia.

6. Amostras múltiplas: a possibilidade de encontrar organismos aumenta pelo


exame de amostras múltiplas, em razão: a) da intermitência da passagem de
certos parasitos a partir do hospedeiro; b) da distribuição não uniforme dos ovos
dos helmintos; c) dos estagio dos protozoários e d) das limitações das técnicas
de diagnóstico.
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1. O EXAME MACROSCÓPICO
Demonstra a presença de vermes adultos e de proglotes, determina a consistência, o
odor, a presença ou ausência de sangue e/ou muco, de proglotes e de vermes
adultos, nas fezes.
Para esta etapa observar rigorosamente os seguintes itens:
1. Observar a CONSISTÊNCIA da amostra (anotar F para fezes formadas, P
para pastosas, M para moles e L para liquefeitas);
2. Examinar a SUPERFÍCIE da amostra à procura de parasitas ou parte deles:
proglotes de Taenias, Enterobius adultos e outros helmintos. Muitas vezes a
amostra necessitará de tamização, para garantir recuperação de partes do
verme adulto (escólex);
3. Examinar a amostra quanto à presença de sangue e/ou muco;
A. Sangue fresco (vermelho vivo) indica hemorragia aguda do trato
intestinal inferior;
B. Muco sanguinolento sugere ulcerações, e uma porção desse material
deve de preferência, ser pesquisado para trofozoítas.
Os trofozoítos são usualmente encontrados nas fezes liquidas, nas pastosas ou nas
mucossanguinolentas, ao passo que os cistos são diagnosticados nas fezes formadas ou
semiformadas e os ovos e larvas de helmintos podem estar presentes em todos os tipos
de amostras.

2. O EXAME MICROSCÓPICO
O exame rotineiro de amostras de fezes para “ovos e parasitas” consiste de três
procedimentos distintos:
. Exame direto à fresco;
. Uma técnica de concentração de fezes;
. Um esfregaço de fezes com coloração permanente.

3. O CONTROLE DE QUALIDADE
Esse tipo de exame exige um cuidado muito especial:
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1. Verifique SEMANALMENTE se a solução de lugol está pronta para uso, na sua


cor CASTANHO-ESCURA de chá forte e isenta de contaminação por bactérias
ou fungos;
2. Pode-se preparar um padrão de controle positivo, adicionando células humanas
com creme leucocitário fixadas a amostras de fezes negativas. O citoplasma das
células brancas do sangue deverá apresentar coloração AMARELO-OURO,
semelhante à dos trofozoítas de protozoários. Uma amostra de fezes sabidamente
positiva também pode ser utilizada para o controle de qualidade e ser examinada
TRIMESTRALMENTE, ou sempre que se preparar um novo estoque de
corante.

4. AS TÉCNICAS
4.1 MÉTODO DIRETO: Avaliar a carga parasitária dos pacientes infectados
proporcionando um diagnóstico rápido dos espécimes nas infecções maciças,
permitindo observar os trofozoítos vivos dos protozoários
Retirar um pouco das fezes com um palito de dente e misturar com uma gota de solução
fisiológica;
 Fazer 02 suspensões com solução salina, em uma só lâmina do mesmo material;
 Em uma delas, colocar uma gota de lugol diluído a 1:5 (1 parte de lugol em 4
partes de água);
 Cobrir as suspensões com lamínula;
 Observar ao M.O. com objetiva de 10x com luz reduzida, para localização tanto
de trofozoítos como de cistos;
 Encontrado o parasita, utilizar objetivas de 40x ou 100x, para observação de
maiores detalhes.

4.2 TÉCNICAS DE CONCENTRAÇÃO DE FEZES


É um processo que aumenta a possibilidade de detectar parasitas presentes em
pequena quantidade nas fezes, e constitui uma etapa rotineira de procedimentos clínicos.
(Os três principais objetivos dessas técnicas são: a) aumentar o numero de cistos,
oocistos, ovos ou larvas na preparação; b) eliminar a maioria dos detritos fecais; c)
apresentar os organismos em um estado inalterado, facilitando sua identificação
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Utilizam-se dois tipos gerais de métodos: SEDIMENTAÇÃO e


FLUTUAÇÃO.

4.2.1 HOFFMANN, PONS & JANER::

Fundamentação: sedimentação espontânea, em água sendo eficiente para ovos,


cistos e larvas. Método indicado para a pesquisa de ovos pesados (ex: ovos de
Ascaris, S. mansoni ,Taenia sp )

 Colocar 3 a 4g de fezes num recipiente (copo plástico de café);


 Fazer uma suspensão em cerca de meio copo de água destilada, utilizando um
palito;
 Pegar o cálice de sedimentação e colocar uma peneira com gaze dobrada quatro
vezes;
 Coar a suspensão;
 Completar a água até cerca de 200 mL;
 Deixar o cálice em repouso pornô min 60 minutos;
 Com um canudo, colher a amostra do sedimento;
 Observar ao M.O. entre lâmina e lamínula, com uma gota de lugol, em aumento
médio.
4.3 Expressão dos Resultados no Exame Parasitológico das Fezes
O resultado do exame parasitológico das fezes tem como objetivo cinco propósitos
principais: fornecer informações úteis ao diagnóstico; servir como guia para o
tratamento; acompanhar e determinar a eficiência do tratamento; trazer informações
para estudos epidemiológicos e fornecer informações básicas para programas de
profilaxia do meio ambiente. Todos os parasitos patogênicos ou não-patogênicos
deverão se escritos com seus nomes científicos, dando ênfase ao estágio de
diagnóstico identificado. Exemplo: Ovos de Ascaris lumbricoides
Quando não forem encontrados parasitos no exame, o exame devera ser referido como:
Não foram vistos ovos, larvas e cistos de parasitas

1. MÉTODO DE SEDIMENTAÇÃO (RICHIE)

 Fundamentação: centrifugo-sedimentação pelo formol – éter


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Baseia-se na centrifugo - sedimentação de cistos e ooscistos, ovos e larvas em


sistema formol-éter. É considerado um método de sedimentação forçada e
técnica de concentração muito eficiente para identificar ovos pesados como por
ex: Ascaris lumbricóides.
• Dissolver cerca de 2g de fezes em 10ml de água;
• Filtrar com gaze dobrada em quatro vezes para um tubo cônico de
centrifuga de 15ml ou colocar 10 ou 12ml do filtrado do método de
Hoffman, antes de completar o volume do cálice
• Centrifugar por 1min em 2500rpm. Decantar o sobrenadante e
ressuspender o sedimento
• Repetir a lavagem do sedimento até que o sobrenadante apresente-se
relativamente claro
• Decantar o sobrenadante da ultima lavagem, ressuspender o sedimento
com 3 a 5ml de formalina a 10%, agitar e deixar em repouso por 5 a
10ml;
• Adicionar 3ml de éter fechar o tubo e agitar bem, por um minuto (utilizar
filme plástico para vedar a boca do tubo);
• Centrifugar o tubo a 1500 rpm por 1 minutos. Observar a formação de 4
camadas, então soltar a película com uma espátula e remover as gorduras
fecais.
• Decantar todo o sobrenadante e o anel formado por gorduras e resíduos,
ficando somente o sedimento formado no fundo do tubo e acrescentar
uma gota de lugol, pescando uma pequena alíquota para observar ao
microscópio entre lâmina e lamínula.
RESULTADO
Relatar todas as formas parasitárias encontradas dentro da regra de nomenclatura,
exemplo:
Presença de cistos de Entamoeba coli (+) ou
Presença de cistos de Entamoeba coli em pequena quantidade.

2. MÉTODO DE FLUTUAÇÃO (FAUST)

 Fundamentação: flutuação pela ação do sulfato de zinco


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A técnica de Faust foi o primeiro procedimento desenvolvido para o diagnóstico


de cistos de protozoários e de ovos e larvas de helmintos. A prática da flutuação
permite a separação de cistos de protozoários e certos ovos de helmintos do
excesso de artefatos mediante o uso de solução de densidade elevada. A
densidade da solução de sulfato de zinco deve ser 1,2g/ml.
Ovos grandes de trematódeos, de cestóides e inférteis de Ascaris, não são
concentrados com esta técnica.
1. Diluir a porção de material fecal em 10ml de água;
2. Filtrar em gaze dobrada em 4 vezes, para um tubo cônico (15ml) colocar 10
ou 12ml do filtrado do método de Hoffman, antes de completar o volume do
cálice;
3. Centrifugar á 2000 rpm por 1 minuto;
4. Desprezar o sobrenadante e acrescentar mais água para nova centrifugação;
5. Realizar centrifugações necessárias até que o líquido esteja límpido e
transparente;
6. Ressuspender e misturar o sedimento, completando o volume total do tubo
com solução de sulfato de zinco à 33% (d= 1,180g/ml);
7. Centrifugar novamente;
8. Colher o material com auxilio de uma alça de platina ou arame na película
superficial, adicionando uma gota de lugol, observar em microscopia.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

COELHO, C.; CARVALHO, A. Manual de parasitologia humana, 2ª ed. Canoas,


RS: ULBRA, 2005.

WORLD HEALTH ORGANIZATION. Procedimentos laboratoriais em


parasitologia médica, 2ª ed. São Paulo ,SP: SANTOS, 1999.

DE CARLI, Geraldo Attilio. Parasitologia clinica: seleção de métodos e técnicas de


laboratório para o diagnóstico das parasitoses humanas, 2° Ed. São Paulo; Atheneu,
2007