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BIOCHIMICA

MERCOLEDì 03/11/2010

10.30-11.30

PROF.SSA MEUCCI

Michael Ambrosi

Regolazione della glicolisi

Ieri ci siamo lasciati con il fruttosio2,6bisfosfato che abbiamo trovato essere un importantissimo regolatore
allosterico positivo per quanto riguarda la glicolisi. Avevamo identificato due attività, una chinasica per il
passaggio da fruttosio-6-fosfato a fruttosio-2,6-bisfosfato, ed un’altra fosfatasica ad opera di una fruttosio-
2,6-bisfosfato fosfatasi che poteva far ritrasformare il fruttosio-2,6-bisfosfato in fruttosio-6-fosfato togliendo di
mezzo questo attivatore glicolitico. Noi possediamo un unico enzima con entrambe le attività, sia chinasica
che fosfatasica, ovviamente in parti diverse della molecola proteica, in domini diversi. Abbiamo iniziato ad
analizzare le caratteristiche dell’isoenzima di questo enzima, che è presente a livello epatico, dove la parte
chinasica è sostanzialmente posizionata al livello dell’estremo ammino-terminale, viceversa la parte
fosfatasica a livello dell’estremo carbossi-terminale. La parte chinasica presenta un sito fosforilabile. Ciò ci
dice che questa molecola proteica è uno dei tanti enzimi che possono subire una modifica covalente post-
traduzionale reversibile.
COVALENTE poiché abbiamo creato un legame covalente, ovvero il legame estere tra un gruppo -OH di un
residuo aminoacidico (serina,treonina,tirosina) e un gruppo fosfato.
POST-TRADUZIONALE poiché è un qualcosa che interviene in tempi ben lontani dal momento in cui si è
originata per traduzione la proteina.
REVERSIBILE poiché come esistono delle chinasi che favoriscono questa fosforilazione ci saranno delle
fosfatasi che andranno a reversibilizzare questa fosforilazione.
Avete notato che io sto parlando al plurale, ovvero dico “le” chinasi, “le” fosfatasi; alcune di queste
cominciano ad essere ben conosciute, altre invece sono conosciute da tempo memorabile, altre stanno
ancora sorgendo, ciò ad indicare che questa problematica ha ancora bisogno di essere sicuramente chiarita,
però noi già sappiamo che se ci sono tante chinasi e tante fosfatasi, ciò vorrà dire che dietro a loro ci sono
molti fattori che andranno ad influenzarle e quindi ecco che l’aspetto di regolazione si fa sempre più
interessante anche se ovviamente abbastanza complicato.
Torniamo a vedere per la prima volta l’effetto di una modifica covalente post-traduzionale. La fosforilazione,
quella che noi incontreremo principalmente, anche se ci sono svariate altre modifiche, sempre covalenti e
sempre reversibili, che possono influenzare l’attività enzimatica, ma questa è decisamente la più gettonata
biologicamente, e di questa noi andiamo a parlare.
In questo caso l’isoenzima ha un sito di fosforilazione posizionato sull’attività chinasica, quindi l’enzima può
essere presente o in forma non fosforilata oppure in forma fosforilata . Quando è presente in forma non
fosforilata, l’attività chinasica prevale normalmente sull’attività fosfatasica, quindi, globalmente parlando,
l’isoenzima è in grado di andare sostanzialmente a procurare una consistente concentrazione di fruttosio-
2,6-bisfosfato. Quando però abbiamo la fosforilazione, la fosforilazione va ad influenzare l’attività chinasica
inibendola e allora la conseguenza diretta di questa fosforilazione è un aumento dell’attività fosfatasica, è un
bilancio tra le due. Se non si ha la fosforilazione il bilancio è a favore dell’attività chinasica, se si ha
fosforilazione si blocca l’attività chinasica o si riduce fortemente e il bilancio è a favore dell’attività
fosfatasica, come risultato diminuisce la concentrazione di fruttosio-2,6-bisfosfato e quindi diminuisce
l’attivatore glicolitico.
A indurre la fosforilazione attraverso una prima importante chinasi che stiamo conoscendo si chiamerà la
protein-chinasi A (PKA), troviamo il glucagone. Ieri qualcuno ha avuto dell’incertezza ad individuare questo
messaggero ormonale importante per noi in questo primo momento; quindi questa fosforilazione potremmo
vederla indotta dal glucagone e attraverso l’utilizzo di una chinasi che è la proteinchinasi A. Viceversa dietro
a questa defosforilazione di cui abbiamo parlato, che è necessaria ovviamente per riattivare l’attività
chinasica se questa modifica covalente è reversibile capite il vantaggio di questa reversibilità noi riusciamo
attraverso l’azione di chinasi e fosfatasi a rendere la proteina bisfunzionale come l’abbiamo chiamata la più
idonea per quel contesto. Vogliamo che in quel momento sia la glicolisi ad essere pienamente attiva allora
dobbiamo avere l’enzima defosforilato e chi meglio dell’insulina potrebbe inviare, tra i suoi altri vari
messaggi, questo messaggio. L’insulina sta portando il messaggio che la disponibilità di glucosio ematico è
elevata, dunque anche nel contesto epatico dove ci siamo posizionati questo è il momento in cui il fegato
può usufruire di tutto questo glucosio. Chiaramente la glicolisi dà l’ATP necessario e il piruvato necessario
per poi continuare quel che di bello si può fare con la disponibilità di glucosio in questo contesto. Il
glucagone ovviamente sta esattamente portando il messaggio contrario, stiamo andando verso una scarsa
disponibilità plasmatica di glucosio quindi ci sono le cellule che più dipendono da glucosio che sono
fortemente a rischio dunque dobbiamo correre ai ripari cercando di scongiurare un ulteriore abbassamento di
glucosio ematico e quindi che scosa può fare il fegato? Il fegato intanto può fare sicuramente
gluconeogenesi che è incompatibile con la glicolisi e dunque sia quel AMP che andava ad attivare la
fosfofruttochinasi e contemporaneamente ad inibire la fruttosio-2,6-bisfosfato fosfatasi, sia quel fruttosio-2,6
bisfosfato hanno quel ruolo di fare quella duplice correlazione e integrazione fra queste regolazioni in modo
tale che se si spinge la gluconeogenesi, la glicolisi deve necessariamente, contemporaneamente, essere
estremamente bloccata.
Se io parto da un enzima, vedete qui è indicata l’attività chinasica, qui l’attività fosfatasica del nostro enzima
bisfunzionale, questo -OH sta a significare che il sito di fosforilazione è defosforilato, e la parte attiva è la
parte chinasica, quindi inattiva risulterà la fosfatasica. Quando arriva il glucagone nella cellula epatica, deve
trovare sulla membrana dell’epatocita, essendo una molecola polare incapace di entrare nella membrana, un
recettore. Legandosi a questo recettore ne determina un cambio conformazionale. Questo cambio
conformazionale innesca una serie di processi che coinvologono le cosiddette proteine G, ovvero proteine
che legano la base guanina. Queste in seguito al cambio conformazionale del recettore vengono anche loro
in qualche modo modificate. Due delle subunità della G, (che è un eterotrimero alfa,beta e gamma), beta e
gamma si staccano e alfa prosegue la trasduzione del segnale venendo attivata implicando la sostituzione di
un GDP con un GTP, che essa lega. A questo punto abbiamo questa G attiva, e la trasduzione del segnale
va avanti fino ad arrivare ad un effettore, cioè un enzima che sia attivabile da questa proteina G attivata.
Quello che in questo momento stiamo tirando in ballo è l’adenilato ciclasi, cioè quell’enzima che può
catalizzare la trasformazione di ATP in AMP ciclico; dunque l’arrivo del glucagone determina un aumento di
AMP ciclico citosolico.
Quella PROTEINCHINASI A che abbiamo rammentato prima non è altro che una delle più importanti chinasi
chiamata così poiché è una proteinchinasi AMP ciclico-dipendente, ovvero una proteina che è normalmente
presente a livello citosolico ma scarsamente attiva se le concentrazioni di AMP ciclico sono modeste come
quando la situazione era precedente all’arrivo del glucagone; quando invece abbiamo l’aumento dell’AMP
ciclico l’attività chinasica di questo enzima si fa sentire, si va ad influenzare la parte chinasica dell’isoenzima
bifunzionale epatico e quello che ci ritroviamo è questa situazione, cioè la fosforilazione ci va ad inibire la
parte chinasica aumentando la parte fosfatasica, il risultato è la diminuzione del fruttosio-2,6 bisfosfato quindi
inibizione della glicolisi e stimolazione della gluconeogenesi. A rimuovere questo dobbiamo vedere l’insulina,
poiché questa attraverso una cascata di eventi abbastanza difficili da comprendere, andrà ad attivare una
delle possibili fosfatasi che andranno a reversibilizzare la nostra modifica, e l’azione dell’insulina si
trasformerà di nuovo in un enzima bifunzionale non fosforilato che dunque stimola la glicolisi e va ad inibire
la gluconeogenesi. Tutto ciò è perfetto per il fegato, ovvero una delle poche sedi dove oltre a farsi glicolisi si
fa anche gluconeogenesi.
Immaginiamo che cosa accadrebbe in un muscolo e magari anche in quello cardiaco se la fosforilazione
fosse su questa proteina, come nel caso del fegato, inibitoria dell’attività chinasica. Allora la glicolisi si
bloccherebbe e per il cardiomiocita sarebbe un vero problema. Ciò non accade e per comprenderne il motivo
andiamo a vedere l’isoenzima cardiaco. In questo caso il numero di amminoacidi è diverso da quello
dell’isoenzima epatico. Anche qui esiste una attività chinasica sempre ammino-terminale ed una fosfatasica
carbossi-terminale. Questa volta però il sito di fosforilazione lo vediamo posizionato a livello dell’attività
fosfatasica. Siccome vale sempre il concetto che laddove si va a fosforilare quella è l’attività inibita, questa
volta quando andiamo a fosforilare l’isoenzima cardiaco otteniamo la inattivazione del sito fosfatasico e
ovviamente il bilancio andrà a favore dell’attività chinasica che verrà automaticamente attivata. Ed allora chi
vediamo dietro a questa fosforilazione? Intanto ci dobbiamo vedere la possibilità attraverso la stessa PKA,
cioè AMP ciclico-dipendente a cui abbiamo fatto riferimento poco fa; questa volta come attivatori adeguati
possiamo metterci ATTIVATORI ADRENERGICI, per esempio ADRENALINA oppure NORADRENALINA; in
questo caso il glucagone non è il segnalatore opportuno, qui infatti stiamo segnalando alla cellula la
necessità di lavorare molto di più in un paricolare contesto, in maniera stressante, proprio tramite questi
attivatori adrenergici. È importante anche un’altra fosforilazione da parte di un’altra chinasi che è una un
proteinchinasi questa volta AMP-dipendente, non AMPciclico-dipendente come la PKA. Infatti l’AMPciclico vi
mette sempre in correlazione con gli ormoni, mentre questa proteinchinasi AMP-dipendente mette in
correlazione con la concentrazione dell’AMP. Avevamo detto che l’AMP è un attivatore allosterico soprattutto
attivo a livello muscolare, questo è uno dei motivi per cui questo AMP è particolarmente importante come
modulatore.
Qui (figura del Lenhinger) sta, anche attraverso l’induzione della fosforilazione dell’isoenzima cardiaco,
andando a procurare un’attivazione della glicolisi, infatti non era solo un’attivazione diretta allosterica sulla
fosfoftuttochinasi-1, ma diventa anche un’attivazione per andare a fornire un maggior sito chinasico attivo
all’isoenzima cardiaco della proteina bifunzionale quindi per aumentare quel fruttosio-2,6bisfosfato che andrà
ad aiutare l’AMP nell’attivazione della fosfofruttochinasi-1. Quindi ecco che la fosforilazione in questo caso
adrenalina-dipendente deve indurre un’accelerazione della glicolisi a questo livello, infatti sarebbe
controproducente se la fosforilazione facesse qui ciò che fa a livello del fegato.
Dunque il problema della regolazione va visto in gran parte in maniera tessuto-specifica. Qui (immagine)
vediamo la nostra adrenalina, qui c’è il recettore, qui è indicata in maniera grossolana l’attivazione delle
proteine G, qui l’attivazione dell’adenilato ciclasi, dunque l’ATP che passa ad AMPciclico e va a favorire
l’attività della proteinchinasi AMPciclico-dipendente. Ora l’enzima bifunzionale non fosforilato passa
all’enzima bifunzionale fosforilato. In tutto ciò poiché abbiamo delle chinasi abbiamo anche un consumo di
ATP che passa ad ADP che è il vero fornitore del gruppo fosfato che noi ritroviamo nell’enzima bifunzionale
fosforilato. Ora l’enzima bifunzionale fosforilato è pronto per l’isoenzima presente in questo livello a darci una
maggiore una maggiore concentrazione di fruttosio-2,6bisfosfato e quindi ad andare ad attivare la
fosfofruttochinasi-1. A questo punto abbiamo la possibilità di andare ad attivare anche in maniera efficiente la
glicolisi a livello cardiaco. Una riflessione per spostarci verso il contesto medico: attenzione all’eccesivo
lattato prodotto tramite l’aumento dell’AMP in caso di infarto.
Facendo un passo indietro noi abbiamo identificato in un aumento dell’AMP un opportuno segnalatore della
necessità di aumentare la velocità glicolitica, lo abbiamo visto in questo contesto. Se noi abbiamo un infarto
in una certa zona si verifica una condizione di ipossia, e questa si trasferisce presto nella possibiltà di
effettuare una scarsissima fosforilazione ossidativa. Quindi in questo contesto è molto facile che l’ATP in
poco tempo diminuisca in concentrazione e che l’ADP e l’AMP aumentino in concentrazione. Per quanto
visto, in questo contesto l’AMP è colui che riesce a modulare la velocità della glicolisi tentando, con questa
glicolisi così aumentata, di compensare la difficoltà della fosforilazione ossidativa. Quindi se non si raggiunge
l’obbiettivo di avere un ATP sufficiente attraverso la fosforilazione ossidativa quindi attraverso gli eventi
mitocondriali, bisogna darci molto più da fare con la glicolisi e ricordate che per avere una stessa quantità di
ATP abbiamo necessità di far passare per la glicolisi un flusso di glucosio molto più elevato. Proprio grazie
alla mancanza della disponibilità di ossigeno noi sappiamo che il prodotto della glicolisi che è il piruvato è
destinato ad essere trasformato in lattato cioè la sua forma ridotta. Vi ricordate che il problema era far
ritornare il NADH a NAD+ ,e ciò lo si fa attraverso l’azione della lattato deidrogenasi. Quindi in caso di infarto
questa eccessiva spinta verso la glicolisi vi potrebbe portare a una eccessiva produzione di lattato, quindi ci
sono delle problematiche, infatti manca ossigeno per la fosforilazione ossidativa mitocondriale della zona
infartuata, diminuisce la concentrazione di ATP, aumenta la concentrazione di AMP attivatore della
fosfofruttochinasi-1, e della proteinchinasi AMP-dipendente con conseguente aumento della glicolisi
anaerobica. Il problema sorge perché normalmente la rimozione di lattato è lenta, ovvero laddove si produce
lattato questo lattato normalmente non viene utilizzato, ciò vale per globulo rosso, muscolo e muscolo
cardiaco e quindi questo lattato è destinato a fuoriuscire dalla cellula ma questo è un processo lungo, quindi
poiché la sua rimozione è lenta, quando si produce molto lattato per un aumento della velocità glicolitica alla
fine si può avere anche una diminuzione del Ph intracellulare. Ciò perché il lattato è un acido e quindi se il
lattato è prodotto ad una velocità troppo intensa per cui inevitabilmente si ha un forte accumulo, i tamponi
intracellulari non ce la fanno a contrastare una inevitabile variazione di Ph, e questo si traduce in una
inibizione della glicolisi, infatti la fosfofruttochinasi-1 risente della attività del Ph e quindi di una variazione del
Ph quindi una maggiore acidità nel contesto citosolico sfavorisce l’attività dell’enzima.quindi una inibizione
che potrebbe diventare anche abbastanza spinta a questo livello vi porterebbe in realtà ad una mancata
compensazione della impossibilità da fosforilazione ossidativa.
Abbiamo parlato della capacità che molte delle cellule cancerose hanno di glicolizzare in maniera
eccezionale e avevamo parlato di un isoenzima dell’esochinasi con delle caratteristiche speciali in queste
cellule. A questo possiamo chiederci se questo enzima bifunzionale ha delle particolarità in questo contesto
neoplastico. Molte cellule neoplastiche esprimono un isoenzima di questa proteina bifunzionale con
caratteristiche particolari. È caratterizzato da una attività chinasica largamente in eccesso rispetto a quella
fosfatasica. Questo “largamente in eccesso” è da sottolineare poiché prima vi ho detto che gli isoenzimi
precedenti come quello epatico, in assenza di fosforilazione hanno attività chinasica prevalente rispetto alla
fosfatasica. In questo caso invece l’isoenzima, ovvero questa forma indotta dall’ipossia che va a
caratterizzare l’esordio dell’attività neoplastica, in questo contesto abbiamo una forte attività chinasica, quindi
uno sbilanciamento a favore dell’attività chinasica ben superiore ai normali isoenzimi. Inoltre diversamente
da quanto abbiamo visto accadere nel fegato, la fosforilazione di questo isoenzima di questa forma che è
una forma indotta dall’ipossia da parte di un AMPchinasi, una chinasi attivata dall’aumento di AMP, causa un
ulteriore aumento dell’attività chinasica rispetto alla fosfatasica. Quindi con questa seconda particolarità ci
riportiamo sicuramente più vicini al caso dell’isoenzima muscolare. Quindi il risultato di queste due
caratteristiche presenti nell’isoenzima bifunzionale presente in queste cellule sarà che in queste cellule
troviamo una concentrazione di frtuttosio-2,6bisfosfato particolarmente elevata, quindi in gran parte
responsabile della velocità così elevata della via glicolitica caratteristica dei tumori in rapida crescita.

A questo punto siamo pronti per il terzo sito di regolazione del meccanismo glucidico, quello della PIRUVATO
CHINASI. La reazione della piruvato chinasi va dal PEP (fosfoenolpiruvato) al piruvato.oltre alla reazione
catalizzata dalla piruvato chinasi vediamo una freccia che ci dice che quel PEP si è originato da un fruttosio-
1,6bisfosfato attraverso sei tappe glicolitiche. Qui vediamo invece raffigurata la piruvato chinasi e sotto di
essa c’è scritto L(liver) ed M(muscle), dunque capiamo che ci sono vari isoenzimi. Questa parte della
regolazione è inclusa sicuramente nel fegato dove si ha essenzialmente una regolazione di tipo allosterico.
Però che in tutti i tessuti che fanno glicolisi ci sia la valenza da parte di queste molecole di andare a
modificare l’attività della piruvato chinasi sicuramente è questionabile. Quindi io vi sottolineo il fegato mentre
il fatto che tutti i tessuti abbiano questo tipo di regolazione non tornerà nemmeno a voi. In questa figura
abbiamo delle molecole che hanno un significato inibitorio, tra queste riconosciamo l’ATP, poi abbiamo in
altre due molecole considerate inibitorie, una si chiama ACETILCOA, e gli altri sono ACIDI GRASSI A
CATENA LUNGA. FINE!!!