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Spettrofotometria.

Lo studio dell’interazione fra le radiazioni luminose e la materia è un ottimo


strumento per conoscere la composizione della materia stessa, in particolare
molte conoscenze sono state acquisite studiando come le sostanze assorbono e/o
trasmettono la radiazione luminosa.

Osservando 2 bicchieri di vetro dentro ai quali è stata disciolta in acqua la


stessa sostanza, ma in quantità diverse, siamo naturalmente portati a dedurre
che nel bicchiere che presenta un colore più intenso vi sia una concentrazione
di sostanza più elevata che nell’altro.

In effetti l’intensità del colore in qualche modo corrisponde alla quantità di


sostanza disciolta nella soluzione.

Un altro aspetto molto importante da considerare è che le sostanza assorbono


oppure trasmettono determinate lunghezze d’onda (colori), dalla sorgente di
radiazioni che le investe ma non altre, ad esempio lo sciroppo di amarena ci
appare rosso perché esso assorbe tutte le lunghezze d’onda a parte quella del
rosso, che invece di essere assorbita ci viene trasmessa.

Affinchè un fotone venga assorbito da un atomo di una certa sostanza esso deve
avere una ben determinata energia, che corrisponde a quella necessaria a
determinare una transizione elettronica dallo stato energetico fondamentale ad
uno di quelli ad energia più elevata.

Affinchè un fotone venga emesso da un atomo di una certa sostanza si deve


verificare una transizione da uno egli stati elettronici ad energia più elevata
a quello fondamentale, in questo caso si verifica quindi l’emissione di
radiazione elettromagnetica.

Siccome solo certi fotoni, caratterizzati da una certa lunghezza d’onda, possono
soddisfare queste condizioni, studiando quali lunghezze d’onda vengono assorbite
o trasmesse possiamo ricavare utili informazioni circa la composizione chimica
della sostanza in oggetto.

https://it.wikipedia.org/wiki/Spettro_visibile
Vediamo di seguito una rappresentazione più specifica riportante, oltre alle
lunghezze d’onda delle radiazioni, anche l’energia che le contraddistingue.

https://it.wikibooks.org/wiki/Fisica_classica/Spettro_delle_onde_elettromagnetic
he

Fra le tante tipologie di radiazione elettromagnetiche che ci circondano,


rappresentate nella figura precedente in ordine di lunghezza d’onda crescente
(ed energia decrescente),l’occhio umano è sensibile solo alle radiazioni
elettromagnetiche con lunghezza d’onda compresa fra 400 nm e 700 nm, il
cosiddetto spettro visibile. Ad esempio le api sono sensibili alle radiazioni di
lunghezza d’onda compresa fra 300 e 650 nm, ecco che essene vedono un po’ meno
bene degli umani nella regione del rosso, ma sono in grado di percepire
radiazioni nella regione dell’ultravioletto.

 Violetto:   400 - 420 nm 


 Indaco:   420 - 440 nm 
 Blu:   440 - 490 nm 
 Verde:   490 - 570 nm 
 Giallo:   570 - 585 nm 
 Arancione:   585 - 620 nm 
 Rosso:   620 - 780 nm

http://organicavirtuale.altervista.org/VirtualText/Spectrpy/UV-Vis/spectrum.html
Legge di Lamber-Beer, trasmittanza e assorbanza.

Definiamo trasmittanza il rapporto fra l’intensità della radiazione trasmessa da


una sostanza e la radiazione incidente la sostanza.

I 0= intensità della radiazione incidente

I 1= intensità della radiazione trasmessa

I1
trasmittanza T= (eq.1)
I0

Il valore della trasmittanza può variare fra 0 e 1.

I 0 viene completamente assorbita dalla


T=0 significa che la radiazione incidente
sostanza sotto esame che non trasmette nulla. La radiazione trasmessa I 1 è
quindi completamente nulla.

T=1 significa che la radiazione incidente I 0 viene completamente trasmessa dalla


sostanza sotto esame che non assorbe nulla. La radiazione trasmessa I 1 è quindi
pari alla radiazione incidente I o.

Definiamo assorbanza come il negativo del logaritmo naturale della trasmittanza.


I0 1
A=log =log (eq.2)
I1 T

In presenza di 2 soluzioni colorate possiamo naturalmente dedurre che la


soluzione più scura è tale perché essa assorbe più luce di quella più chiara,
allo stesso modo possiamo dire che la soluzione più scura è più concentrata di
quella più chiara. Abbiamo quindi osservato che assorbanza e concentrazione sono
fra loro direttamente proporzionali, all’aumentare di una aumenta anche l’altra.

Risulta perciò evidente che questo tipo di correlazione fra assorbanza e


concentrazione si determina in modo evidente se la lunghezza d’onda della
radiazione incidente è una di quelle che vengono assorbite dalla sostanza, e non
trasmesse.
La legge di Lamber-Beer descrive la relazione appena citata :

I0 1
A=log =log =ε ∙ l ∙C (eq.3), con,
I1 T

mol
C = concentrazione della soluzione, espressa in termini di molarità [ ]
litro
l = spessore della soluzione o cammino ottico [cm]

ε = assorbività molare, indica la capacità di un elemento chimico di assorbire


radiazioni ad una certa lunghezza d’onda. [mol−1 ∙ l∙ cm−1]

Il coefficiente di assorbività molare ε dipende dalla lunghezza d’onda (e dalla


temperatura), è pertanto fondamentale scegliere la lunghezza d’onda più indicata
per effettuare le misure.

Spettro di assorbimento

Come già citato in precedenza l’assorbività molare ε (o coefficiente di


estinzione)dipende dalla lunghezza d’onda impiegata per effettuare l’analisi
spettrometrica, questo implica che l’assorbanza varierà in funzione della
frequenza.

Ciò è dovuto al fatto che, come già ricordato, solo i fotoni che hanno una
energia tale da eguagliare il salto energetico esistente tra il livello
fondamentale ed uno di quelli eccitati possono essere assorbiti, ecco che quindi
l’assorbimento dipenderà dalla lunghezza d’onda della radiazione ovvero dalla
sua energia.

Nella figura seguente a titolo di esempio vengono riportati gli spettri di


assorbimento dell’acqua, dell’emoglobina non ossigenata e dell’emoglobina
ossigenta.
http://www.nature.com/icb/journal/v88/n4/fig_tab/icb2009116f1.html

Dal punto di vista teorico la scelta della lunghezza d’onda con la quale
effettuare l’analisi spettrometrica sarebbe indifferente, tuttavia proprio
perché vogliamo avere misure sensibili anche a piccole variazioni nella
concentrazione della sostanza, le misure vanno effettuate scegliendo la
radiazione che abbia lunghezza d’onda per la quale vi verifica il massimo
assorbimento, nel caso della figura precedente se consideriamo l’acqua si deve
scegliere una lunghezza d’onda di poco inferiore ai 1000 nm, laddove si osserva
il picco di assorbimento.