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CLONAGGIO e

TECNOLOGIA DEL DNA RICOMBINANTE

Clonaggio o clonazione
Ottenere una copia (di un organismo o di un molecola di DNA)

Sir Ian Wilmut with Dolly the sheep.

Tecnologia del DNA ricombinante


Permette di ottenere una molecola di DNA ibrida da molecole di DNA di origine differente
CLONAGGIO e
TECNOLOGIA DEL DNA RICOMBINANTE

Due mondi così lontani possono incontrarsi


Elementi di
base per il clonaggio: la storia

Independent strands
of DNA were first Isolation of the Isolation of
found in bacterial cells DNA Ligase Restriction Enzymes

1940 1950 1960 1970 TODAY

Joshua Lederberg proposed the the first eukaryotic gene


catch-all term “plasmid” as “a generic was cloned
term for any extrachromosomal The steps and the enzymes for the gene
hereditary determinant”. cloning are currently used in common
practice of a molecular biology lab to
have new genetic material
The genetic engineering is a formidable
example of how different pieces of
knowledge can be combined to create a
new and powerful tool
Applicazioni del clonaggio:
qualche esempio

- Ottenere maggiori quantità di una sequenza specifica di interesse


(rendendone più agevole lo studio)
- Permette di progettare approcci sperimentali specifici per lo studio della
sequenza di interesse (ad esempio studiare i territori di espressione di un
gene mediante la realizzazione di sonde)
- Permette analisi di collezioni di sequenze (ad esempio mediante la
generazione di una libreria genomico o di una cDNAteca)
- Esprimere il prodotto proteico con finalità di studio e/o terapeutiche
Elementi di
base per il clonaggio

- Frammento di DNA di interesse


- Vettore (es. Plasmide)
- Enzimi di restrizione
- DNA ligase
- Batteri
Elementi di
base per il clonaggio

DNA RNA
(cDNA)

Frammento di DNA di interesse


Elementi di
base per il clonaggio

Vettore: I plasmidi

DNA genomico circolare

Principalmente presenti nel mondo procariotico, possono conferire vantaggi come la


resistenza ad antibiotici, sono in grado di replicare autonomamente all’interno del batterio

I plasmidi usati in laboratorio sono stati opportunamente ingegnerizzati per ottimizzarne


l’utilizzo nel clonaggio e permettere il trasferimento di materiale genetico da un organismo
ad un altro (vettore)

https://blog.addgene.org/plasmids-101-what-is-a-plasmid
Elementi di
base per il clonaggio

Vettore: caratteristiche base dei plasmidi

- Origine di replicazione (ori)

- Gene per la resistenza ad antibiotico (es. ampicillina


(AmpR))

- Polylinker (MCS)
MCS (Multiple
Cloning Site)
Elementi di
base per il clonaggio

Generalmente si usano enzimi che


tagliano specifiche sequenze di DNA

Enzimi di restrizione
e la ligase nel
processo di taglia e
cuci (CUT & PASTE)
Elementi di
base per il clonaggio
Enzimi di restrizione (RE, Restriction Enzyme): da dove vengono.
Sono endonucleasi, quindi enzimi in grado di tagliare il DNA (generare rotture nei filamenti
di DNA). Sono naturalmente presenti nei batteri e fanno parte del sistema di restrizione-
modificazione dei batteri. Derivano il nome dalla scoperta del fenomeno a cui sono legati.
Quando un batteriofago (virus dei batteri) viene isolato da un ceppo batterico e viene usato
per infettare un altro ceppo, quest’ultimo è in grado di (restringere) prevenire la
propagazione del virus. Questo è reso possible perchè il batterio produce l’enzima di
restrizione che taglia il DNA virale e gli impedisce di
Distruggono il genoma dei funzionare. Il DNA della cellula ospite sfugge all’azione
batteriofagi dell’enzima di restrizione perchè risulta modificato
(mediante metilazione).
Classificazione degli
enzimi di restrizione

Vengono suddivisi in diverse classi (in alcuni casi se ne


identificano 4 o 5) in base alla struttura, sequenza riconosciuta,
posizione del sito di taglio, richiesta di cofattori.

Quelli principamente impiegati nella tecnologia del


DNA ricombinante sono quelli di tipo II
COME TAGLIANO
gli enzimi di restrizione

- Gli enzimi di tipo II tagliano a livello delle sequenze che


riconoscono (generalmente tali sequenze possono essere
lunghe 4-6 basi).
- La maggior parte delle sequenze riconosciute è palindromica.
- A seconda della disposizione dei siti di taglio sui 2 filamenti a
livello della sequenza riconosciuta si possono generare due tipi
di estremità:
1. Piatte (blunt ends)
2. Sporgenti (protruding ends, sticky ends)
Introduzione di DNA
all’interno dei batteri (E.coli)
Introduzione di DNA
all’interno dei batteri (E.coli)

42°C
Introduzione di DNA
all’interno dei batteri (E.coli)

Terreno di coltura prima Terreno di coltura dopo


della crescita batterica crescita batterica O.N.
Panoramica di un
esperimento di clonaggio
Simuliamo un esperimento:
Un collega ci ha fornito un costrutto in cui è presente un frammento di DNA di interesse (ad esempio la sequenza codificante una proteina
che stiamo studiando). Il vettore A in cui è presente non permette l’espressione della sequenza di interesse, ma solo la sua amplificazione.
Per gli scopi della nostra ricerca vogliamo produrre la proteina e quindi vogliamo esprimere la sequenza di interesse. A tal proposito,
dobbiamo “spostare” il frammento di DNA in un vettore opportuno (B) che è dotato di una serie di elementi che permettono l’espressione
della proteina in cellule eurocariotiche.

1 3 Reazione di ligazione 6 Amplificazione della


colonia batterica

Inserto nel Vettore di


+
vettore A espressione B

2 Digestione con enzima di restrizione 4

7
Trasformazione batterica

5 X
Vettore A linearizzato Vettore B linearizzato

Crescita e selezione in piastra


Estrazione del DNA
(LB + agar + antibiotico)
plasmidico
Analisi del DNA plasmidico

Minipreparazione di DNA plasmidico

Mappa di restrizione del plasmide


Diversi tipi di vettori

Permettono di clonare frammenti più lunghi con vantaggi per alcune applicazioni
come per esempio la costruzione di librerie di sequenze

- PLASMIDI (fino a ~ 10.000 cb)

- FAGI (fino a ~ 20.000 cb)

- COSMIDI (fino a ~ 45.000 cb)

- BAC (Bacterial Artificial Chromosome, fino a ~ 100.000 cb)

- YAC (Yeast Artificial Chromosome, (fino a ~ 1.000.000 cb)

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