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• Affymetrix microarrays
A C G
T C T C T
G G T
A C C G T A A
T A G G C
• oligonucleotide array T
A
A T
G
A C
A
G C
A
A
• photolithography
• 25 mer
• high density (100,000 features/1.26 cm2)
• Spotted Array
• cDNA or oligo array
• pin based / inkjet technology
sequential deposition of cDNA (PCR product) or
oligos (up to 80 mer)
• Moderately high density
(25,000 features/glass slide)
Analisi
comparativa
• da campioni di due categorie
viene estratto RNA
• l’mRNA di ciascuna categoria
viene marcato con un colorante
diverso (rosso e verde)
• quantità uguali dei due RNA
marcati vengono ibridate su uno
stesso vetrino.
Diversi tessuti sono formati da cellule che si
comportano in modo diverso
Espressione Differenziale
( Protein folding)
RNA
T7
2nd strand
dscDNA
cDNA purification
In vitro transcription(amplification)
TTTTTT
TTTTTT
TTTTTTAntisense RNA(aRNA)
TTTTTT
aRNA purification
Isolate RNA
120
110
50
100
45
90
40
80
35
70
60 30
50 25
Fluorescence
Fluorescence
40 20
30 15
20 10
10
5
0
18S
28S
18S
28S
19 24 29 34 39 44 49 54 59 64 69
Time (seconds) 19 24 29 34 39 44 49 54 59 64 69
Time (seconds)
labeling
Cy5 (probe) Cy3
Microarray Overview
Biology
Data Analysis
Mix
Hybridize
Scan “Chip”
Sul vetrino ibridato:
•gialli (espressi in
entrambe)
cDNA cDNA
SNP microarray
utilizza polimorfismi nei singoli
nucleotidi (SNPs). Approccio
utilizzato originariamente
in studi medici (predisposizioni
allo sviluppo di tumori o
differenti suscettibilità a farmaci) ed ora utilizzato per
l’analisi di SNPs in taxa il cui genoma è conosciuto in
dettaglio.
affymetrix.com illumina.com
Affymetrix Genotyping
Affymetrix Microarray Overview
(Biotin-UTP
Biotin-CTP) B B B B
RNA
cDNA
T7-dT
Fragment
(heat, Mg2+)
Hybridize
B
Scan Wash & Stain (16 hours) B
Fragmented cRNA
Illumina Genotyping
• Costruzione di un’area
locale intorno ad ogni
spot
• Calcolo dell’intensità di
ogni singolo spot
identificazione
dei geni
coinvolti nel
carattere
analizzato
plants 20%
viruses and bacteria 16%
invertebrates 8%
vertebrates 3%
human 35%
rodents 17%
livestock 3%
Ma se non si lavora coi topi?
4. GENERARE CUSTOM
MICROARRAY USANDO LE
SEQUENZE DISPONIBILI NEI
DATABASE PUBBLICI
Redundancy
filter
annotation
Hybridization
In situ
oligo generation
design
un microarray per Ovis aries