ACIDOS NUCLEICOS

Determinación de ARN Y ADN

los ácidos nucleicos juegan un papel clave en la transmisión de la información genética, los
métodos generales para el estudio de los ácidos nucleicos se basan en la separación de estas
moléculas del resto de las biomoléculas, por eso es necesario recurrir a las propiedades
diferenciales del ADN y del ARN respecto del resto de biomoléculas, Su cuantificación
general se fundamenta en que presentan una capacidad importante de absorción de
radiación electromagnética debido a la presencia de las bases nitrogenadas. [ CITATION
Roc03 \l 10250 ]
 Comparación de las principales ventajas y desventajas de los diferentes métodos de
identificación de agentes causantes de ETAS.
Método de Ventajas Desventajas
identificación
Los métodos basados en Alto poder de Requiere de equipos
el análisis de ácidos discriminación, con especializados, reactivos
nucleicos (muy usados de posibilidades para costosos, personal
manera complementaria) determinar el subtipo. altamente entrenado. Los
como los métodos Robustos, reproducibles métodos son
moleculares con PCR. y confiables, son rápidos considerados indirectos y
( proteína c-reactiva). y se pueden estandarizar, todavía de limitada
permiten la alta aprobación por las
exactitud, entidades regulatorias.
automatización, y rápida
detección posibilitando
los ensayos cuantitativos.
Fuente: [ CITATION Glo10 \l 10250 ]
PROPIEDADES:
I. Solubilidad.
El agua es un gran disolvente debido a su naturaleza dipolar.
1. FUNDAMENTOS DE LOS METODOS:
La extracción y purificación de ADN obtenido a partir de células de mamífero es requerida
para una gran variedad de aplicaciones en biología molecular, como el diagnóstico molecular, el
análisis forense, la terapia génica, la clonación de genes, la genotipificación, la secuenciación de
genes y genomas, la identificación de mutaciones y polimorfismos de un solo nucleótido (SNP), el
análisis de metilación de ADN y los modelos de animales knock out. Constituye el punto de
inicio para importantes aná lisis genéticos y genó micos enfocados en resolver
problemas biomédicos, así como para investigació n farmacoló gica y
biotecnoló gica, entre otras. El ADN puede ser aislado directamente de tejidos
preservados, tejidos vivos só lidos o líquidos, fluidos y cultivos celulares in vitro,
tanto de cultivos primarios como de líneas celulares establecidas (Ausubel et
al., 2003).
Experimentalmente, el ADN ha sido la biomolécula má s utilizada para diversas
técnicas de biología molecular que van desde la reacció n en cadena de
la polimerasa (PCR), digestió n con endonucleasas de restricció n, polimorfismo
de longitud en los fragmentos de restricció n (RFLP),
Southern blot, inmunoprecipitació n de la cromatina (ChIP) y librerías genó micas,
hasta las técnicas de aná lisis masivos como secuenciació n masiva y microarreglos
2. EQUIPOS Y MATERIALES:

• Solució n de lisis para eritrocitos

• PBS
• Etanol absoluto
• Etanol al 70% (v/v) en agua Milli-Q TM

• Proteinasa K (20 mg/mL)

• ARNasa A (100 mg/mL), opcional.
• SDS al 10% (p/v)
• Fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (25:24:1)
• Cloroformo
• Acetato de sodio 0.2 M, pH 5.2
• Amortiguador Tris EDTA (TE)
• Agua Milli-Q TM

•
• Kit DNeasy Blood & Tissue (Qiagen) con las
siguientes soluciones:
 -Amortiguador AL
 -Amortiguador AW1
 -Amortiguador AW2
 -Amortiguador AE
 Centrífuga clínica
 Microcentrífuga
 Vó rtex
 Microtubos de 1.6 mL, nuevos y estériles
 Rejilla para microtubos
 Guantes de lá tex o nitrilo
 Incubadora a 55 °C
  Campana de extracció n
 Hielo/contenedor
 Micropipetas y puntasde 200 µL y 1,000 µL estériles
 Congelador a -20 °C
3. PROCEDIMIENTOS:
1. Centrifugar los 5 mL de sangre a 2,000 rpm durante
2 min.
2. Eliminar el plasma con la ayuda de una
micropipeta.
3. Resuspender la pastilla en 3 mL de solució n
de lisis para eritrocitos y mezclar 5
veces por inversió n.
4. Centrifugar a 2,000 rpm durante 2 min y eliminar
el sobrenadante.
5. Repetir de 5 a 8 veces los pasos 3 y 4,
hasta que la pastilla esté de color blanco.
6. Resuspender la pastilla en 2 mL de PBS y
centrifugar a 1,500 rpm durante 5 min.
7. Eliminar completamente el PBS con la ayuda de
una pipeta.
8. Resuspender la pastilla en 1 mL de acetato
de sodio 0.2 M, pH 5.2.
9. Adicionar 125 µL de SDS al 10% y 10 µL
de proteinasa K.
10. Mezclar e incubar a 55 °C durante 1 h.
11. En campana de extracció n adicionar 600 µL de
fenol/cloroformo/alcohol
isoamílico (25:24:1) y mezclar durante 10 min.
12. Centrifugar a 3,500 rpm durante 5 min.
13. Recuperar la fase acuosa(superior) en un microtubo.

13
Manual de prácticas de laboratorio de Biología
Molecular

14. En campana de extracció n adicionar 600 µL de

cloroformo.
15. Centrifugar a 3,500 rpm durante 5 min.
16. Recuperar la fase acuosa(superior) en otro microtubo.
 17. Adicionar 2 volú menes de etanol absoluto frío (-20
°C).
18. Después de la adició n del etanol, la fibra
de ADN será visible en el tubo. La fibra
debe enrollarse con la ayuda de una punta de 1 mL y
colocarlo en otro microtubo.
19. Adicionar 1.2 mL de etanol al 70% frío y mezclar
por inversió n 5 veces.
20. Centrifugar a 12,000rpm durante 2 min.
21. Eliminar completamente el etanol con micropipeta.
22. Secar la pastilla a 55 °C o a temperatura
ambiente en un lugar sin flujo de aire
(aproximadamente 5 min).
23. Resuspender en 100 µL de TE e incubar a
55 °C durante 1 h.
24. Almacenar el ADN a -20 °C
 La concentració n y purezadel ADN obtenido será
evaluada por espectrofotometría
y electroforesis en gel de agarosa, como se explica
en las prá cticas 8 y 9,
respectivamente.
4. RECOMENDACIONES:
solubles en agua.
Extracción y parificación del ADN
los métodos de extracción permiten obtener ácidos nucleicos purificados a
partir de diversas fuentes para después realizar análisis específicos de
modificaciones genéticas mediante la reacción en cadena de la polimerasa
(PCR).
Cromatografía:
Insolubles en solventes orgánicos.

II. Estabilidad.
1. FUNDAMENTOS DE LOS METODOS:
SEPARACIÓN DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS DE LAS PROTEÍNAS
La desnaturalización de proteínas ocasiona:
• Disminución en la solubilidad de las proteínas
• Pérdida de actividad biológica
 • Una digestión con proteasas más eficiente
• Liberación de ADN genómico de los complejos nucleoproteicos
AGENTES DESNATURALIZANTES
• Detergentes iónicos como el SDS se unen a los residuos de los aminoácidos
causando cambios en la conformación de la proteína.
• Agentes caotrópicas como la urea y guanidinio destruyen los enlaces puente
hidrógeno.
• Agentes reductores como el DTT o β-mercaptoetanol rompen los enlaces
disulfuro.
• Algunos métodos de purificación de ADN utilizan proteasas como la proteinasa
K para digerir proteínas.
 MÉTODOS DE SEPARACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS DE LAS
PROTEÍNAS.
1. Extracción orgánica
2. Salting out
3. Unión selectiva del ADN o ARN a soportes sólidos.
1.- SEPARACIÓN POR EXTRACCIÓN ORGÁNICA.
Ácidos nucleicos: son polares (grupos fosfatos con carga negativa) y por eso son
insolubles en solventes orgánicos y solubles en solventes polares como el H2O.
Proteínas: en solución acuosa los residuos no polares se encuentran en el interior
de la proteína, pero en un solvente menos polar pasan hacia el exterior
(desnaturalización) y pasan a ser más solubles en la fase orgánica.
1. EQUIPOS Y MATERIALES:
Solventes orgánicos
 FENOL
 Purificación de ARN: fenol saturado en buffer ácido.
 Purificación de ADN: fenol saturado en buffer levemente básico.
 Solubilidad en agua: 7%; facilita el proceso de desnaturalización y
extracción de proteínas.
Es muy corrosivo y puede causar quemaduras severas (usar guantes).
 CLOROFORMO
 • Menor capacidad para desnaturalizar proteínas.
• Solubilidad en agua: 0,8 %; ayuda a eliminar el fenol remanente en la fase
acuosa.
• Favorece en la separación de la fase acuosa y la orgánica y reduce la
interfase entre las mismas.

2.- SEPARACIÓN POR SALTING OUT

• A concentraciones salinas altas, las sales se asocian con los grupos cargados
de las proteínas, éstas se deshidratan, pierden solubilidad y precipitan. Se
utiliza NaCl, KAc o NH4Ac.
• Las proteínas precipitadas son eliminadas por centrifugación.
• Los AN quedan en el sobrenadante.
3.- UNIÓN SELECTIVA DEL ADN/ARN A SOPORTES SÓLIDOS
Soportes sólidos
• Silica
• Matriz con oligo dT unido (ARNm)
SILICA
 Los AN se unen a la silica en presencia de concentraciones altas de sales
caotrópicas
 (ej. cloruro de guanidinio).
 Purificar ADN: tratamiento con ARNasa.
 Purificar ARN: tratamiento con ARNasa.
 Las proteínas no se unen bajo estas condiciones.
 Las membranas de silica con el ADN/ARN unido se lavan para eliminar las
sales.
 El ADN/ARN se eluye de la membrana utilizando buffers de baja fuerza
iónica (TE) o agua.
 SILICA

Ventajas:

 Es más rápido.
  No se utilizan solventes orgánicos.
 Permite la automatización y trabajar con un gran número de muestras a la vez.
 No hay pasos de precipitación.

Desventaja:

 Costos más elevados

 MATRIZ DE OLIGO(dT)
 Oligonucleótidos que se unen a las colas de polyA de los ARNm de eucariotas.
 Los otros ARNs se eliminan lavando la matriz.
 El ARNm puro se eluye de la columna con H2O o buffer de baja fuerza iónica.
De esta manera se logra purificar el ARNm de otros ARNs.

PRECIPITACIÓN CON ALCOHOL DEL ADN/ARN

o Luego de eliminar las proteínas por el método de extracción orgánica o salting out,
el ADN/ARN queda en la fase acuosa.
o El ADN/ARN precipita en presencia de etanol o isopropanol y cationes que
neutralizan las cargas negativas de los grupos fosfatos.
o La precipitación del ADN/ARN es más eficiente a bajas temperaturas y altas
concentraciones de AN.
Etanol vs isopropanol isopropanol

Los AN son menos solubles en isopropanol que en etanol y por eso van a precipitar más
rápido y a menores concentraciones, pero las sales también van a precipitar mejor en este
solvente.

ETANOL

 El ADN/ARN en solución se precipita agregando 2-2,5 volúmenes de etanol, 4 °C.

 Se utiliza cuando es necesario incubar a bajas temperaturas y por tiempo
prolongado, por ej para precipitar moléculas pequeñas o que están en baja
concentración.

ISOPROPANOL
-El ADN/ARN en solución se precipita agregando 1 volumen de isopropanol a temperatura
ambiente (menor volumen para centrifugar).

-La precipitación a temperatura ambiente y por tiempos cortos favorece la precipitación de

moléculas grandes.

-El isopropanol es menos volátil que el etanol y es más difícil de eliminar. Las sales como
el NaCl coprecipitan más fácilmente.

En ambos casos, las sales se eliminan lavando el pellet de ADN/ARN con Etanol 70%. El
30% de agua solubiliza las sales contaminantes mientras que el 70% de etanol mantiene los
AN precipitados.

Fuente: [ CITATION Pet18 \l 10250 ]

 Esquema de aislamiento de ADN total utilizando un método de extracción con

Fenol: cloroformo
Fuente: [ CITATION Roc03 \l 10250 ]

 MÉTODO DE EXTRACCIÓN CON CTAB (Bromuro de Cetil trimetil

amonio)
El protocolo del método del bromuro de cetil-trimetil amonio (CTAB) fue
elaborado por Murray y Thompson en 1980, El método es adecuado para extraer y
purificar ADN de vegetales y alimentos derivados de vegetales y está especialmente
 indicado para eliminar los polisacáridos y los compuestos polifenólicos, que, de otro
modo, alterarían la pureza del ADN y, por tanto, su calidad.

Principios del método del CTAB: lisis, extracción y precipitación.

Las células vegetales pueden lisarse con el detergente iónico bromuro de cetiltrimetil
amonio (CTAB), que forma un complejo insoluble con los ácidos nucléicos en medio
hiposalino. De ese modo, los polisacáridos, los compuestos fenólicos y los demás
contaminantes permanecen en el sobrenadante y pueden eliminarse por lavado. El
complejo de ADN se solubiliza aumentando la concentración salina y se precipita con
etanol o isopropanol. En esta sección se describirán los principios de las tres etapas
principales: la lisis de la membrana celular, la extracción del ADN genómico y su
precipitación.

 Miniextracción CTAB, partiendo de 100 mg de tejido

Baño de incubación o termoblock
• Microcentrífuga que pueda ser programada a 14,000 rpm
• Vortex
• Balanza analítica
• Potenciómetro
• Agitador termo-magnético
• Campana de extracción
• Ultracongelador
• Concentrador de vacío
• Espectrofotómetro
• Cámara de electroforesis
 Material
• Termo o cuba para nitrógeno líquido
• Morteros y pistilos
• Espátulas
• Tijeras o bisturí
• Tubos de microcentrifuga de 1.5 ml estériles
• Micropipetas de 2, 10, 200 y 1 000 uL
• Puntas para micropipeta de 10, 200 y 1 000 uL con filtro
• Gradilla para tubos de 1.5 o 2 ml
• Espátulas
• Guantes
• Hielo
• Termómetro
 • Marcadores para etiquetar tubos
• Bata de laboratorio
• Toallas de papel
• Contenedores de desechos líquidos
• Contenedores de puntas utilizadas
 Reactivos
• 2-ß-Mercaptoethanol (CAS Nº 60-24-2)
• Acetato de amonio (CAS Nº 631-61-8)
• Ácido bórico (CAS Nº 10043-35-3)
• Ácido clorhídrico (CAS Nº 7647-01-0)
• Agarosa (CAS Nº 9012-36-6)
• Agua destilada estéril libre de DNasas y RNasas
• Alcohol isoamílico (CAS Nº 123-51-3)
• Cloroformo (CAS Nº 67-66-3)
• Cloruro de sodio (CAS Nº 7647-14-5)
• CTAB, Bromuro de hexadecil trimetil amonio (CAS Nº 57-09-0)
• EDTA Ácido etileno diamino tetracético di sódico (CAS Nº 6381-92-6)
• Etanol grado biología molecular (CAS Nº 64-17-5)
• Fenol (CAS Nº 108-95-2)
• Marcador de peso molecular de 1 Kb
• Nitrógeno líquido (CAS Nº 7727-37-9)
• Proteinasa K (CAS Nº 39450-01-6)
• RNAsa A (CAS Nº 9001-99-4)
• TBE (Tris base, EDTA, ácido bórico)
• Tris base (CAS Nº 77-86-1)
• Tris-Hidrochloride (CAS Nº 1185-53-1)
PROCEDIMIENTOS:

Antes de empezar: Preparar con anticipación todas las soluciones que se utilizarán y mantenerlas a
la temperatura solicitada. Esterilizar morteros y pistilos, tubos para microcentrífuga y puntas para
micropipetas. Rotular los tubos y tener a la mano marcadores de punto fino indelebles. En lo
posible, utilice agua libre de DNasas y RNasas para preparar las soluciones. Encender el o los
termobaños para que se encuentren a la temperatura requerida.

Buffer Tris-HCl 100 mM pH 8

Dentro de la campana de extracción, disolver en 65 ml de agua desionizada 0.605 g de Tris-HCl.

Agregar HCl al 0.1 N, agitando constantemente hasta ajustar el pH a 8. Aforar a un volumen de 100
ml con agua desionizada. Mantener a temperatura ambiente.

Buffer de extracción CTAB 2X

1.4 M de NaCl (8.181 g) 20 mM de EDTA (0.744 g), 2 % P/V de CTAB (2 g). Disolver lo anterior en 75
ml de buffer Tris-HCl 100 mM pH 8 en un agitador termomagnético hasta que las sustancias se
disuelvan completamente. Agregar 300 µl de 2-β-mercaptoetanol en la campana de extracción ya
que este compuesto es muy volátil y tóxico. Finalmente, aforar a un volumen de 100 ml con la
solución de Tris-HCl previamente utilizada. Mantener a temperatura ambiente y antes de iniciar el
proceso caliente a 55 °C.

Solución Fenol: Cloroformo: isoamílico 25:24:1

Mezclar en la campana de extracción 50 ml de fenol, 48 ml de cloroformo y 2 ml de alcohol

isoamílico. Mantener almacenado a -20°C.

Acetato de amonio 10 M

Disolver en 5 ml de agua desionizada, 7.71 g de acetato de amonio y aforar a 10 ml con agua

desionizada. Mantener a temperatura ambiente.

Etanol al 70 %

Por cada 70 ml de etanol absoluto, agregar 30 ml de agua desionizada y mezclar. Mantener la

solución a -20°C.

 METODOLOGÍA.

Protocolo CTAB

1. Mezclar 100 mg de tejido previamente pulverizado con nitrógeno líquido con 1 ml de

CTAB 2X, precalentado a 55 ºC, en un tubo para microcentrífuga de 1.5 ml.
2. Mezclar por inversión e incubar 5 min. a temperatura ambiente.
3. Incubar 5 min. en hielo.
4. Agregar 20 µl de RNAsa A, mezclar por inversión e incubar por 20 min. a 37 ºC. Durante la
incubación invertir los tubos dos o tres veces.
5. Agregar 10 µl de proteinasa K, mezclar por inversión e incubar a 60 ºC por 20 min. Durante
la incubación invertir los tubos dos o tres veces.
6. Incubar 5 min en hielo.
7. Agregar 600 µl de fenol:cloroformo:isoamílico (25:24:1) y agitar por inversión.
8. Centrifugar a 10,000 rpm a 8 ºC, por 12 min.
9. Recuperar con cuidado 200 µl del sobrenadante y ponerlo en un tubo para
microcentrífuga nuevo de 1.5 ml. Nota: Si el sobrenadante se encuentra turbio, será
necesario repetir los pasos del siete al nueve.
10. Agregar 50 µl de acetato de amonio 10 M y mezclar por inversión varias veces.
11. Agregar 500 µl de isopropanol frío (a -20 ºC) y mezclar por inversión varias veces.
12. Mantener la mezcla a -20ºC durante 2 hrs, para favorecer la precipitación de ADN.
13. Centrifugar a 10,500 rpm a 8 ºC, por 5 min.
14. Eliminar cuidadosamente el sobrenadante.
15. Agregar 1 ml de etanol al 70 % frío (a -20 ºC).
16. Mezclar por inversión hasta observar que el botón se desprende del microtubo.
17. Dejar reposar 5 min. a temperatura ambiente.
18. Centrifugar a 10,000 rpm a 8 ºC, por 5 min.
19. Eliminar el sobrenadante cuidando no desprender el botón de ADN.
 20. Colocar los tubos para microcentrífuga de 1.5 ml en el concentrador de vacío a 500 atm a
55ºC por 10 min para secar el ADN. Si no se cuenta con un concentrador de vacío se
pueden dejar los tubos abiertos hasta que se evapore el etanol; cubrirlos con una toalla de
papel para que no se contaminen.
21. Revisar que el botón de ADN se encuentra completamente seco; en caso de no estarlo
repetir el paso 20 durante el tiempo que sea necesario
22. Rehidratar el ADN en 200 µl de buffer TE 1X o agua inyectable. Si el botón de ADN es
pequeño se puede hidratar con 50 o 100 µl.
Fuente: [ CITATION Alesf \l 10250 ]
2. RECOMENDACIONES:

 resultados deseados (rendimiento, pureza, tiempo que requiere la purificación);

 uso posterior (PCR, clonación, etiquetado, transferencia, RT-PCR, síntesis de
ADNc, etc.