Los polimorfismos de ADN amplificados por cebadores arbitrarios son útiles como

marcadores genéticos

RESUMEN

Los mapas genéticos moleculares se construyen comúnmente analizando la segregación de

polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (RFLP) entre la progenie de un cruce
sexual. Aquí describimos un nuevo ensayo de polimorfismo de ADN basado en la amplificación
de segmentos de ADN aleatorios con cebadores únicos de secuencia de nucleótidos arbitraria.
Estos polimorfismos, simplemente detectados como segmentos de ADN que se amplifican de
uno de los padres pero no del otro, se heredan de manera mendeliana y se pueden usar para
construir mapas genéticos en una variedad de especies. Sugerimos que estos polimorfismos se
denominen marcadores RAPD, por ADN polimórfico amplificado aleatorio.

INTRODUCCIÓN

Los mapas genéticos que comprenden marcadores de ADN estrechamente espaciados son
útiles para el análisis del genoma. Los marcadores de ADN que se ha demostrado que están
genéticamente ligados a un rasgo de interés se pueden utilizar para la clonación de genes, el
diagnóstico médico y para la introgresión de rasgos en programas de reproducción de plantas
y animales (1, 2). En muchos organismos, sin embargo, no se dispone de mapas genéticos
saturados. Los marcadores de ADN más utilizados son los polimorfismos de longitud de los
fragmentos de restricción (RFLP, 3). Los clones genómicos anónimos de bajo número de copias
se utilizan con frecuencia para visualizar polimorfismos. La detección de RFLP mediante
hibridaciones de transferencia Southern es laboriosa e incompatible con el alto rendimiento
analítico requerido para muchas aplicaciones (4). Otros ensayos de polimorfismo (5) que se
basan en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) requieren información de la secuencia
de ADN diana para el diseño de cebadores de amplificación. El tiempo y el costo de obtener
esta información de secuencia es prohibitivo para muchas aplicaciones de mapeo genético a
gran escala. Aquí describimos un proceso simple, distinto del proceso de PCR, que se basa en la
amplificación de ADN genómico con cebadores únicos de secuencia de nucleótidos arbitraria.
Estos cebadores detectan polimorfismos en ausencia de información de secuencia de
nucleótidos específica, y los polimorfismos funcionan como marcadores genéticos y se pueden
usar para construir mapas genéticos.

MATERIALES Y MÉTODOS

Síntesis de cebadores

Los cebadores de oligodesoxinucleótidos se sintetizaron mediante química estándar de

fosforamidato en un sintetizador de ADN DuPont Coder 300. Después de eliminar los grupos
protectores en hidróxido de amonio al 30% a 550ºC durante 5 h, las muestras se secaron al
vacío, se disolvieron en 200 \ mu l de agua y se purificaron mediante filtración en gel sobre
Sephadex G25 (columnas desechables NAP-5, Pharmacia).

Fuentes de ADN genómico Humano

Se obtuvieron muestras de ADN de individuos anónimos de los Dres. John Gilbert y Allen Roses
del Duke Medical Center, Duke University. Se aisló ADN de soja (6) de los cultivares
endogámicos Glycine max variedad Bonus y de la accesión Glycine soja PI 81762, y de 88
individuos F2 que se segregaron de un cruce de estos dos padres obtenido del Dr. Theodore
Hymowitz, Universidad de Illinois. Se aisló (7) ADN de maíz de las líneas CM37 y T232 de Zea
mays obtenidas del Dr. Ben Burr, Brookhaven National Laboratory. Se aislaron muestras de
ADN de Neurospora crassa de las cepas Oak Ridge FGSC 4488 y Mauriceville FGSC 2225 (8),
obtenidas del Dr. R.L. Metzenberg, Universidad de Wisconsin. Las muestras de ADN bacteriano
se obtuvieron del Dr. John Webster, DuPont Co.

Condiciones de amplificación

Las reacciones de amplificación se realizaron en volúmenes de 25 A1 que contenían Tris-Cl 10

mM, pH 8,3, KCl 50 mM, MgCl2 2 mM, gelatina al 0,001%, 100, 4 M cada uno de dATP, dCTP,
dGTP y TTP (Pharmacia), cebador 0,2 liM, 25 ng de ADN genómico y 0,5 unidades de ADN
polimerasa Taq (Perkin Elmer Cetus). La amplificación se realizó en un termociclador de ADN
Perkin Elmer Cetus programado para 45 ciclos de 1 min a 940, 1 min a 360, 2 min a 720,
utilizando las transiciones más rápidas disponibles entre cada temperatura. Los productos de
amplificación se analizaron mediante electroforesis en geles de agarosa al 1,4% y se
detectaron mediante tinción con bromuro de etidio. Las temperaturas de recocido por encima
de 400ºC en el perfil de ciclos térmicos impidieron la amplificación por muchos de los
oligonucleótidos de 10 bases probados (datos no mostrados). Con algunas combinaciones de
cebador y plantilla de ADN genómico, un rango de tamaño no discreto de productos de
amplificación, que aparece como un 'frotis' como se visualiza en un gel, podría convertirse en
bandas de tamaño discreto reduciendo la concentración de la polimerasa o del ADN genómico.
.

Análisis genético de polimorfismos de ADN amplificado.

Los fragmentos de ADN polimórficos amplificados y RFLP se mapearon en el contexto de un

mapa RFLP de 436 marcadores de soja (manuscrito en preparación), un mapa RFLP de 110
marcadores de maíz (9) o un mapa RFLP de 80 marcadores de N. crassa (10), puntuando la
segregación de marcadores en las respectivas poblaciones utilizadas para crear estos mapas.
Los mapas multipunto y las puntuaciones LOD se calcularon utilizando el programa Mapmaker
(1).

Uso de segmentos amplificados como sondas RFLP

Segmentos de ADN polimórfico AP3. 1 y API la. 1, amplificados (como se describió

anteriormente) a partir de las semillas de soja Bonus y PI 81762 respectivamente, se
resolvieron mediante electroforesis en un gel de agarosa al 1,4% y se escindieron del gel. Se
añadió una rodaja de 5 µl de gel que contenía ADN a una mezcla de reacción de 100 µl y se
amplificó en las condiciones descritas anteriormente, utilizando los cebadores AP3 y API la,
respectivamente. Las muestras de ADN reamplificadas se marcaron con 32p (BRL Random
Primers DNA Labeling System, Life Technologies, Inc.) y se utilizaron como sondas de
hibridación (12) para detectar RFLP con las enzimas de restricción Pst 1 para AP3. 1 y Bcl II para
APl la. 1. Estos RFLP se mapearon en soja como se describe anteriormente.
RESULTADOS

Polimorfismo y especificidad de secuencia.

La Figura 1A muestra los resultados de un experimento en el que se usaron cebadores únicos

para amplificar segmentos de ADN genómico de humanos, maíz, soja y N. crassa. Los
cebadores se diseñaron en ausencia de información sobre la secuencia de nucleótidos de las
especies probadas. La secuencia de nucleótidos de cada cebador se eligió dentro de las
limitaciones de que el cebador tenía 9 o 10 nucleótidos de longitud, entre 50 y 80% de G + C en
composición y no contenía secuencias palindrómicas (4). Se amplificaron varios segmentos de
ADN en cada muestra. Si bien la mayoría de estos segmentos eran comunes a ambos
individuos de una especie determinada, algunos segmentos se amplificaron de un individuo
pero no del otro. Por ejemplo, un segmento de ADN de 1,4 kb fue amplificado por el cebador
AP9 de una muestra humana pero no de la otra (Figura IA, carriles 1 y 2, respectivamente). Al
menos uno de esos polimorfismos fue aparente en cada una de las especies examinadas. Para
confirmar que las bandas observadas eran ADN genómico amplificado y no artefactos del
cebador (13), se omitió el ADN genómico de las reacciones de control para cada cebador. No
se observaron productos de amplificación para ningún cebador excepto para el cebador AP12h
(Figura 1, carril 9); este artefacto no es significativo, sin embargo, ya que no se produce cuando
se incluye ADN genómico en la mezcla de reacción (Fig. 1, carriles 7-8). Estos resultados
muestran que se pueden usar cebadores únicos de secuencia arbitraria para amplificar
segmentos de ADN genómico y que se pueden detectar polimorfismos entre los productos de
amplificación de diferentes individuos. También se analizaron varias muestras de ADN
bacteriano para determinar si estos cebadores cortos podrían usarse para amplificar
segmentos de ADN de pequeños genomas. Los resultados que se muestran en la Figura 1B
indican que los genomas tan pequeños como E. coli (4 x 103 kpb) apoyarán la amplificación y
que las bacterias pueden distinguirse según los patrones de bandas de su ADN en un gel de
agarosa. Se sintetizó un conjunto de once oligonucleótidos de 10-meros relacionados para
determinar la contribución de cada nucleótido a la especificidad de la reacción de
amplificación. Cada cebador se diferenciaba del oligonucleótido 10-mer, 5'-TGGTCACTGA, por
la sustitución de un solo nucleótido en una posición sucesiva en la secuencia. El contenido de G
+ C de todos los cebadores se mantuvo al 50%, y cada cebador se usó para amplificar el ADN
de dos especies diferentes de soja, Glycine max y Glycine soja. Después de la amplificación, las
muestras de ADN se analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa (Figura 2). Se
amplificaron varios segmentos de ADN en cada muestra y los polimorfismos fueron evidentes
para muchos de los cebadores (por ejemplo, una banda de 0,65 kb está presente en la Figura
2, carril 21, pero ausente en el carril 22). En este experimento, la mayoría de las sustituciones
de nucleótidos en el cebador provocaron un cambio completo en el patrón de ADN
amplificado en comparación con el cebador original, y en muchos casos revelaron nuevos
polimorfismos. Por ejemplo, el patrón obtenido con el cebador 5'-TGGTCACTGA (Figura 1,
carriles 1 y 2) difiere del que lleva la sustitución G-a-C 5'-TGCTCACTGA (Figura 2, carriles 7 y 8).
Se observan diferencias menos dramáticas en los patrones para las sustituciones en la posición
más 5 '(Figura 2, carriles 1-4). Estos resultados muestran que un oligonucleótido 10-mer puede
actuar como cebador en la reacción de amplificación del ADN, que se pueden detectar
polimorfismos entre los productos de amplificación y que los cambios de nucleótidos en el
cebador (y por inferencia, el molde) determinan si un ADN dado Se amplificará el segmento.

Figura la. Amplificación de ADN eucariota. Se amplificó el ADN de una variedad de especies
utilizando cebadores de secuencia de nucleótidos arbitraria (Materiales y métodos). Los
productos de amplificación se resolvieron mediante electroforesis en un gel de agarosa al 1,4%
que se tiñó con bromuro de etidio y se fotografió. Los marcadores de peso molecular
(kilopares de bases, kpb) son los indicados. Carril 1 y 2, ADN humano Hu2 y Hu3,
respectivamente, amplificado con el cebador 5'-ACGGTACACT. Carriles 4 y 5, maíz CM37 y
T232, respectivamente, amplificados con GCAAGTAGCT. Carriles 7 y 8, soja G. max y G. soja,
respectivamente, amplificados con CGGCCCCTGT. Carriles 10 y 11, N. crassa Oakridge y
Mauriceville, respectivamente, amplificados con CACATGCTTC. Se omitió el ADN genómico en
las reacciones de control (carriles 3, 6, 9 y 12) para determinar si alguna de las bandas
observadas con el ADN genómico son en realidad artefactos de cebadores. Figura lb.
Amplificación de ADN procariótico. Carriles 1-3, Escherichia coli (cepas 037, 641, 642,
respectivamente). Carril 4, Listeria monocytogenes (cepa 681). Carril 5, Staphylococcus aureus
(cepa 684). Carril 6, Salmonella typhimurium (cepa 706). Todas las muestras de ADN genómico
se amplificaron con el cebador 5'-TCACGATGCA

Figura 2. El efecto de las sustituciones de nucleótidos en el cebador sobre la amplificación. Se

amplificó ADN genómico de soja G. max ('M') y G. soja ('S') con los cebadores indicados. Los
cuadrados indican sustituciones de nucleótidos con respecto al cebador 5'-TGGTCACTGA
(carriles 1-2). La flecha apunta a una banda polimórfica de 0.65 kb (ver Resultados).

Segregación genética
Para saber si estos polimorfismos de amplificación son útiles como marcadores genéticos y
para evaluar si el ensayo es reproducible, se mapearon 11 polimorfismos generados con varios
cebadores en soja, utilizando 66 individuos F2 segregantes. Cada polimorfismo se puntuó
como marcador dominante y se correlacionó con los datos de segregación para 430
marcadores RFLP de soja, derivados de los mismos 66 individuos (manuscrito en preparación).
Segregación de la API la. 1 se muestra el polimorfismo para 16 de estos individuos F2 en la
figura 3A. El análisis de los datos (11) indica que API la. 1 se asigna al grupo de enlace 5 en la
posición que se muestra en la Figura 4. La probabilidad de que el marcador esté en la posición
indicada es 1016,8 veces mayor que la probabilidad de que AP lla. 1 no está vinculado, lo que
indica la certeza de la asignación del mapa. Esto también muestra que el ensayo es robusto, lo
que permite una puntuación fiable de un polimorfismo en una población en segregación. Las
posiciones y probabilidades del mapa para otros 10 marcadores se indican en la Figura 4. Los
cebadores AP4c y APlOb revelaron cada uno dos polimorfismos diferentes y no vinculados
(marcadores AP4c. 1 y AP4c.2, y AP10b. 1 y AP1Ob.2, respectivamente), lo que demuestra que
se pueden usar cebadores simples para amplificar ADN de loci polimórficos dispersos. Los
marcadores RAPD mapeados (Figura 4) aumentaron la saturación del mapa de la soja al
completar algunos espacios (por ejemplo, los marcadores AP4 y AP12h1 en LG27) y al extender
el mapa en la dirección telomérica (marcadores AP5a2 en LG21b, AP4c3 en LG 3a , vea la
Figura 4). Se utilizaron muchos cebadores de secuencia aleatoria diferentes para evaluar la
calidad y frecuencia de los polimorfismos en maíz, soja y N. crassa (datos no mostrados). Esto
se logró determinando qué porcentaje de cebadores podría usarse para detectar
polimorfismos que podrían mapearse con confianza (es decir, puntuaciones LOD en apoyo de
la vinculación mayores que 4,0). Las frecuencias de detección de polimorfismo fue de 1 por
cebador para maíz (número de cebadores probados, p = 34), 0.5 por cebador para soja (p = 45)
y 2.5 por cebador para N. crassa (p = 88).

Figura 3. panel A. Segregación de un polimorfismo de amplificación en soja. Las muestras de

ADN genómico de la progenie 66 F2 se amplificaron con el cebador API la (5'-
ACCTCGAGCACTGTCT). Se muestran los productos de amplificación de los padres G. max y G.
soja (carriles 1 y 2, respectivamente) y dieciséis individuos F2. La flecha 'a' apunta a una banda
polimórfica de segregación que es clara para puntuar, mientras que la flecha 'b' apunta a una
banda que parece ser polimórfica en los padres, pero que no se puede puntuar con seguridad
entre la progenie (ver Discusión). Panel B. Segregación de un RFLP detectado por una sonda de
ADN amplificado polimórfico. El AP lla. 1 polimorfismo amplificado en G. soja (Figura 3a, banda
2 banda 'a') se utilizó como sonda de hibridación para detectar un RFLP de Bcl II. El panel B
muestra la hibridación de esta sonda con una transferencia Southern de ADN genómico
digerido con Bcl II de los mismos individuos mostrados en el panel A. Las puntuaciones de
segregación para el polimorfismo de amplificación y el RFLP se muestran arriba del panel A y B,
respectivamente. Las puntuaciones se interpretan de la siguiente manera: 'A' = genotipo del
padre A (carril 1), 'B' = genotipo del padre B (carril 2), 'a' = A o heterocigoto, 'b' = B o un
heterocigoto, 'm' = datos faltantes. 'M' identifica los marcadores de peso molecular.

Comparación con RFLP

Se utilizó el análisis RFLP para confirmar las posiciones del mapa de los marcadores RAPD.
Varios segmentos de ADN polimórfico amplificado que habían sido mapeados previamente se
escindieron de un gel de agarosa, se marcaron con 32p y se usaron como sondas de
hibridación para detectar RFLP. Se encontraron dos RFLP utilizando los segmentos de ADN
amplificados AP3.1 y AP1la. 1. Co-segregación de RFLP API la.2-RF y su polimorfismo de
amplificación afín API la. 1 es evidente a partir del examen de 16 individuos F2, como se
muestra en las Figuras 3A y 3B. Los datos de segregación de los 66 individuos F2 confirmaron
que los loci RFLP APIla.2-RF y AP3. Mapa de 1-RF a las mismas posiciones que sus sondas
amplificadas afines (Figura 4). Al realizar este experimento, se observó que varios de los
segmentos de ADN polimórfico amplificados no eran adecuados como sondas RFLP debido a la
hibridación con ADN repetitivo. De las 11 sondas amplificadas probadas, 6 hibridaron con ADN
de copia única (Figura 5A), 3 hibridadas con ADN repetitivo medio (Figura SB) y 2 hibridadas
con ADN altamente repetitivo en el genoma de la soja (Figura SC). Esto indica que los
polimorfismos de amplificación pueden proporcionar marcadores de ADN en regiones
genómicas que no son accesibles al análisis RFLP debido a la presencia de secuencias de ADN
repetitivas.

Figura 4. Mapa genético de loci polimórficos detectados por amplificación. Los polimorfismos
de amplificación (negrita) y RFLP identificados mediante sondas derivadas de segmentos de
ADN polimórfico amplificado (tipo negrita, sufijo '-RF') se mapearon en el genoma de la soja en
los grupos de ligamiento indicados en relación con los marcadores RFLP clásicos (tipo simple)
como se describe en Resultados. Para cada marcador, la probabilidad de la posición indicada
en el mapa es la siguiente: AP3. 1 es 1010 ° 1; AP3.2-RF 1OI2 AP4, 1068; AP4c.2, 10111;
AP4c.3, 106,3; AP5a.2, 103-; AP8, 10'5; AP10b.l, 1 & O-4; AP10b.2, 105-4; APIla.l, 1016,8;
APla.2-RF, 10168; AP12h, 104-3; AP13, 1012,8. Las secuencias del cebador son AP3 (5'-
TCGTAGCCAA), AP4 (TCACGATGCA), AP4c (TCTCGATGCA), AP5a (CTGTTGCTAC), AP8
(TGGTCACTGA), APlOb (GGAAGTAGTG), API la (ACCTCGAGCACTTGTCTGCC), APC12h
(CGGAGCACTTCCTGCC) ).

Figura 5. Complejidad de secuencias de ADN genómico amplificadas con cebadores arbitrarios.

Se utilizaron fragmentos de ADN amplificados polimórficos como sondas de hibridación en
transferencias Southern de ADN genómico digerido con Eco RI de la soja Bonus (carril),
P181762 (carril 2), P1416937 (carril 3), N85-2176 (carril 4), PI153293 (carril 5 ) y P1230970
(carril 6). El panel A muestra la hibridación de un locus polimórfico, amplificado por el cebador
AP8j (TGGTCACTGT), con ADN de "copia única". El panel B muestra la hibridación de un locus
polimórfico, amplificado por el cebador AP4 (TCACGATGCA), con ADN "repetitivo medio". El
panel C muestra la hibridación de un locus polimórfico, amplificado por el cebador AP13
(ATTGCGTCCA), a ADN "altamente repetitivo".

Figura 6. Efecto del contenido del cebador G + C sobre la amplificación. Se utilizaron cebadores
de diferente contenido de G + C para amplificar el ADN genómico de la soja G. max ('M') y G.
soja ('S'). El contenido de G + C y la secuencia de nucleótidos de cada cebador es: 0% (5'-
TAATTATTAT), 10 (TAATTATTGT), 20 (TAATTACTGT), 30 (TAATCACTGT), 40 (TAGTCACTGT), 50
(TGGTCACTGT), 60 (CGGTCACTGT ), 70 (CGGCCACTGT), 80 (CGGCCCCTGT), 90 (CGGCCCCGGT),
100 (CGGCCCCGGC).

Composición y longitud de la base de imprimación

Para determinar las limitaciones en la composición de base del cebador, se sintetizó un
conjunto de 10-meros de oligonucleótidos relacionados que variaban del 0% al 100% en
contenido de G + C. Cada cebador se relacionó con los cebadores del contenido de G + C
siguiente inferior y siguiente superior mediante cambios de una sola base. Cada cebador se
utilizó para amplificar el ADN de soja. Los resultados indicaron que el contenido de G + C en un
oligonucleótido 10-mer debería ser del 40% o más para generar niveles detectables de
productos de amplificación (Figura 6). Este experimento también apoyó la conclusión de que
los cambios de una sola base pueden causar un cambio completo en el conjunto de segmentos
de ADN amplificados. Para determinar la longitud mínima del cebador, se diseñó un conjunto
de cebadores de 10 a 6 bases de longitud eliminando nucleótidos sucesivos del extremo 5 'del
oligonucleótido 10-mer 5'-ATTGCGTCCA. Todos los cebadores contenían 5 G + C. Los
resultados sugirieron que la longitud mínima útil del cebador es un oligonucleótido de nueve
bases (Figura 7). Si bien estas restricciones sobre la composición y la longitud de la base de
imprimación se determinaron a una temperatura de recocido de 360 ° en el perfil del ciclo
térmico, se encontró que las mismas restricciones se aplicaban a una temperatura de recocido
de 150 ° C (datos no mostrados).

Figura 7. Efecto de la longitud del cebador sobre la amplificación. Se usaron cebadores de

longitud decreciente para amplificar el ADN genómico de las semillas de soja G. max ('M') y G.
soja ('S'). La longitud y la secuencia de nucleótidos de cada cebador es: 10 (ATTGCGTCCA), 9
(TTGCGTCCA), 8 (TGCGTCCA), 7 (GCGTCCA), 6 (CGCCCA).

DISCUSIÓN

Este estudio demuestra que se pueden usar cebadores cortos de secuencia de nucleótidos
arbitraria para amplificar de manera reproducible segmentos de ADN genómico de una amplia
variedad de especies. Los polimorfismos entre los productos de amplificación se detectan con
frecuencia, son útiles como marcadores genéticos y pueden detectarse mediante el examen de
un gel de agarosa teñido con bromuro de etidio. Dado que el proceso descrito aquí utiliza
cebadores de secuencia de nucleótidos arbitraria para acceder a segmentos aleatorios de ADN
genómico para revelar polimorfismos, proponemos llamar a estos marcadores marcadores
RAPD (pronunciado 'rápido', para ADN polimórfico amplificado aleatorio) para distinguirlos de
ASP (secuencia amplificada Polimorfismos) descritos previamente para segmentos de ADN de
secuencia conocida (5). Creemos que el ensayo RAPD puede, en algunos casos, detectar
cambios de una sola base en el ADN genómico. La mayoría de los cambios de un solo
nucleótido en una secuencia de cebador provocaron un cambio completo en el patrón de los
segmentos de ADN amplificados (Figuras 1 y 6). Efectivamente, al hacer un cambio en el
cebador, estos experimentos introdujeron desajustes únicos en el dúplex cebador-ADN
genómico en ambos sitios que definen un segmento de ADN, y se evitó la amplificación
detectable. Por inferencia, un cambio de una sola base en el genoma también puede prevenir
la amplificación al introducir un desajuste en un solo extremo de un segmento de ADN. Debe
enfatizarse que estos resultados no implican que todas las amplificaciones sean el resultado de
un apareamiento perfecto entre el cebador y la plantilla de ADN. El número de segmentos de
ADN amplificados a partir de muestras bacterianas con genomas mucho más pequeños (ver
Figura 1b) solo se puede explicar sobre la base de la falta de coincidencia entre el cebador y la
plantilla de ADN. Otras fuentes de polimorfismos pueden incluir deleciones de un sitio de
cebado, inserciones que hacen que los sitios de cebado sean demasiado distantes para admitir
la amplificación o inserciones que cambian el tamaño de un segmento de ADN sin evitar su
amplificación. Al igual que con cualquier otro marcador genético, algunos polimorfismos son
claros y fáciles de puntuar (p. Ej., API la. 1, flecha A en la Figura 3A), otros parecen ambiguos y
no son útiles como marcadores genéticos (consulte la flecha B en la Figura 3A). Los
polimorfismos ambiguos pueden resultar de una mala discriminación por un cebador entre
sitios de cebado alternativos de secuencias de nucleótidos ligeramente diferentes. Casi todos
los marcadores RAPD son dominantes, ya que los segmentos de ADN de la misma longitud se
amplifican de un individuo pero no de otro. No es posible distinguir si un segmento de ADN se
amplifica de un locus que es heterocigoto (1 copia) u homocigoto (2 copias) con un marcador
RAPD dominante. Los marcadores de RAPD codominantes, observados como segmentos de
ADN de diferentes tamaños amplificados del mismo locus, se detectan sólo en raras ocasiones.
Por ejemplo, recientemente hemos construido un mapa genético de N. crassa que comprende
88 marcadores RAPD; 84 de los marcadores fueron dominantes y solo 4 fueron codominantes
(Kubelik et al., En preparación). Los marcadores dominantes son aceptables para el mapeo
genético usando padres homocigotos consanguíneos. (por ejemplo, Figura 3). En muchos casos
en los que es importante distinguir heterocigotos de homocigotos, los marcadores de RAPD
estrechamente ligados, cada diagnóstico para un genotipo parental diferente, podrían usarse
en pares para evaluar el genotipo de la región cromosómica. La confianza con la que se
podrían identificar los heterocigotos dependería de qué tan estrechamente vinculados estén
los marcadores emparejados. En general, el uso de marcadores dominantes emparejados para
detectar heterocigotos requerirá el doble de marcadores de los que se necesitarían utilizando
marcadores codominantes. Los polimorfismos dentro de los fragmentos de ADN amplificados
también podrían descubrirse mediante digestión con enzimas de restricción o análisis de
secuencia de nucleótidos para extender la utilidad de loci no polimórficos o mapeados
previamente. Los marcadores RAPD son muy adecuados para el mapeo genético, para
aplicaciones de reproducción de plantas y animales y para la toma de huellas dactilares de
ADN, con una utilidad particular para estudios de genética de poblaciones. Los marcadores
RAPD también pueden proporcionar un ensayo eficaz de polimorfismos, lo que debería
permitir una rápida identificación y aislamiento de fragmentos de ADN específicos de
cromosomas. Las líneas celulares híbridas o las reservas genéticas que portan deleciones o
adiciones de grandes segmentos cromosómicos podrían cribarse en relación con los controles
apropiados, para identificar la región del genoma que lleva la deleción o adición. Como la
mayoría de los marcadores moleculares, el contenido de información de un marcador RAPD
individual es muy bajo. Sólo cuando muchos de estos marcadores anónimos se utilizan para
definir un genoma empiezan a tener utilidad. Los mapas genéticos de alta densidad
compuestos por marcadores moleculares han llevado a la identificación de varios loci de
importancia biológica no identificados previamente (2). Los marcadores RAPD son
prometedores para la automatización del mapeo del genoma, extendiendo el poder del
análisis genético a organismos que carecen de una gran cantidad de marcadores fenotípicos
para describir completamente su genoma. El mapeo genético usando marcadores RAPD tiene
varias ventajas sobre otros métodos: (i) se puede usar un conjunto universal de cebadores
para análisis genómico en una amplia variedad de especies (ii) sin trabajo preliminar, como
aislamiento de sondas de ADN clonadas, preparación de filtros para las hibridaciones, o
secuenciación de nucleótidos, se requiere (iii) cada marcador RAPD es el equivalente de un
sitio marcado con secuencia (14), que puede simplificar enormemente la transferencia de
información en programas de investigación colaborativa. Quizás la ventaja más significativa de
este método es que la determinación del genotipo puede automatizarse. Los mapas genéticos
que constan de marcadores RAPD se pueden obtener de manera más eficiente y con una
mayor densidad de marcadores que mediante RFLP o métodos basados en PCR dirigida. J.
Welsh y M.McClelland, en el artículo adjunto de este volumen, han demostrado de forma
independiente, utilizando una metodología similar, que se pueden utilizar cebadores de
secuencia arbitraria para la toma de huellas genómicas.