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Giusiano/Giambrone 3.

Virologia (Landolfo) 11/10/2019

Replicazione virale (seconda parte)

Baltimore suddivise i virus in 7 classi, in base al tipo di materiale genetico in essi contenuto. Ovvia-
mente ognuna di queste classi di virus ha come obiettivo fondamentale arrivare alla trascrizione di
RNA, il punto centrale del ciclo replicativo di ogni virus.
Virus a DNA a singola elica (ssDNA)
I ssDNA comprendono due
famiglie che sono parvoviri-
dae (responsabili, a livello
pediatrico, della quinta ma-
lattia/eritema infettivo) e cir-
coviridae (non associati a
patologie).
Parvoviridae
Hanno una singola elica in-
completa e agli estremi 5’ e
3’ è presente una struttura
detta “forcina”, che condi-
ziona la replicazione di que-
sti virus.
Subito dopo l’infezione il vi-
rus ha un problema: deve
esclusivamente traslocare
nel nucleo di cellule in fase
S, in quanto tra i virus a DNA i parvoviridae sono gli unici che non riescono a sintetizzare la DNA
polimerasi e quindi la prendono in prestito dal macchinario di sintesi della cellula ospite in attiva
replicazione. Infettano soprattutto eritroblasti. La replicazione in generale si svolge in questo modo:
- La prima tappa della replicazione è il completamento della singola elica con un’elica ad essa
complementare e questo avviene ad opera appunto della DNA polimerasi.
- Segue poi un taglio esattamente sovrapposto al terminale 3’ dell’elica neoformata ad opera
di proteine virus specifiche.
- Dopodiché si completano le estremità fiancheggianti e le due eliche complementari danno
poi origine a due eliche singole, che vanno poi ad essere impacchettate all’interno di proteine
strutturali di origine virale.
Le fasi più in dettaglio:
Si parte del genoma parentale monocatenario, poi entrano in azione due enzimi importanti che sono
entrambi di origine cellulare: la DNA polimerasi che completa la singola elica in doppia elica e la
RNA polimerasi cellulare che trascrive su una delle due eliche (la trascrizione può avvenire solo se
l’acido nucleico si trova in doppio filamento in quanto un ssDNA non può essere trascritto).
I messaggeri che vengono trascritti danno origine a proteine non strutturali, che sono quelle che
servono a formare il genoma progenie monocatenario (generano due catene singole effettuando il
taglio). Sempre da questi messaggeri avranno origine proteine virus specifiche che andranno in-
vece a completare la struttura del capside del virus. Il processo terminerà con l’assemblaggio dei
singoli filamenti, assemblati in queste proteine di origine virale. È importante notare che nei virioni si
ritroveranno, per ragioni stocastiche, o DNA a polarità positiva o DNA a polarità negativa, ma le
modalità replicative non cambiano.
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Giusiano/Giambrone 3. Virologia (Landolfo) 11/10/2019

Genomi a RNA
Per la trascrizione e la replicazione degli enzimi a RNA è necessario un enzima fondamentale che
è la RNA polimerasi RNA-dipendente (RDRP). La cellula non è in grado di sintetizzare questo
enzima, quindi il virus se lo porta dietro oppure lo codifica. Il compito di questo enzima è sia di
produrre il genoma virale sia di trascrivere i messaggeri per la sintesi delle proteine strutturali. Que-
ste sono le due tappe fondamentali, che possono subire varianti a seconda che i genomi siano a
singola elica, positiva o negativa, o a doppia elica.
Virus a RNA a doppia elica (dsRNA)

I virus di questo tipo com-


prendono i reoviridae, la
cui famiglia più importante
è quella dei rotavirus, re-
sponsabili di severe ga-
stroenteriti a livello pedia-
trico. Hanno un doppio
filamento a polarità positiva
e negativa, che nel caso dei
reovirus è segmentato (10
o 12 frammenti lineari).
Questi virus possiedono
due capsidi, uno interno e
uno esterno, di cui solo
quello interno entra all’in-
terno del citoplasma.

La replicazione avviene in questo modo:


- c’è una trascrizione primaria dell’RNA a doppia elica quando il genoma è ancora all’interno
del capside interno, ad opera della RNA polimerasi RNA-dipendente che il virus si porta die-
tro. Tale trascrizione dà origine a due tipi di RNA: RNA subgenomici (mRNA) oppure a RNA
pregenomici (o genomici), che serviranno come template (filamenti stampo) per la trascri-
zione di future particelle. La trascrizione avviene sull’elica positiva.
- A questo punto c’è un primo assemblaggio di virioni immaturi con singolo capside che deriva
sia dalle proteine sintetizzate dai trascritti RNA messaggeri sia dal filamento che serve come
template per dare poi origine al genoma del virione.
- All’interno di questi capsidi parte la trascrizione degli RNA genomici ad opera della RNA
polimerasi RNA-dipendente: si formano dei filamenti bicatenari (il genoma assume la confor-
mazione finale).
- Infine, manca il capside esterno, che prende origine dalla trascrizione secondaria di questi
RNA bicatenari (sempre filamento a polarità positiva). RNA messaggeri verranno tradotti in
proteine che daranno origine al capside esterno.

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Virus a RNA a singola elica a polarità positiva (ssRNA+)

Non è una struttura partico-


lare a definire RNA+ o
RNA-, bensì l’unica diffe-
renza tra i due è che gli
RNA+ possono essere di-
rettamente tradotti dai ribo-
somi, gli RNA- no, sono
complementari agli RNA+.
Ci sono dei virus che si
sono evoluti con un singolo
filamento di RNA positivo.
Alcuni esempi sono: picor-
naviridae (poliomielite),
caliciviridae (gastroenete-
rite), coronaviridae
(SARS), flaviviridae (feb-
bre gialla), retroviridae
(HIV), togaviridae (rosolia).
Lo schema generale di replicazione prevede di utilizzare l’RNA virale direttamente come messag-
gero (non ci sono tappe intermedie): la traduzione delle proteine è diretta. Inoltre, c’è la trascrizione
di un intermedio ssRNA negativo, trascritto grazie alla RNA polimerasi RNA-dipendente (che deriva
dalla trascrizione del filamento virale originale positivo), che verrà a sua volta ritrascritto in RNA+, il
quale costituirà il genoma dei nuovi virioni.
- L’RNA virale che funge da RNA messaggero viene tradotto in un’unica poliproteina, anche
perché non ci sono segnali monocistronici (si dice di mRNA a cui è associata una sola pro-
teina, una sola informazione per gene) a livello dei messaggeri virali.
- La poliproteina viene tagliata da un suo stesso dominio dotato di attività proteasica, dando
origine alle varie proteine funzionali, tra le quali la RNA polimerasi RNA-dipendente, e pro-
teine strutturali.
- Questa RNA polimerasi poi trascrive l’RNA+ in RNA-, il quale viene ritrascritto in RNA+, che
viene infine assemblato nelle proteine strutturali per dare origine alla progenie virale.
Domanda: La funzione dell’RNA – qual è? Risposta: L’RNA– non ha una funzione specifica ma è solo un
intermedio per far sì che si possa tornare ad avere un RNA+.

Ci sono delle varianti a questo processo. Una di esse è molto importante ed è quella dei togavirus.
Essi sono degli RNA+, ma invece di procedere nella traduzione completa del filamento, viene tra-
dotta soltanto la porzione che sta al 5’. Essa dà origine a una singola proteina: RNA polimerasi RNA-
dipendente, che ha due compiti:
- trascrivere il suo stesso RNA di origine in RNA- che viene poi ritrascritto in RNA+
- trascrivere RNA subgenomico al 3’, che darà origine a proteine strutturali
La variante tra questo e il procedimento generale è che nel primo caso a partire dalla traduzione di
un unico filamento hanno origine sia RNA polimerasi sia proteine strutturali, mentre in questo caso
c’è un passaggio intermedio con la traduzione della sola RNA polimerasi la quale poi provvede a
dare origine al filamento RNA+ e alla trascrizione delle proteine strutturali che assemblandosi con il
genoma daranno origine ai virioni.

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Retroviridae: ssRNA+ con intermedio DNA

È una famiglia che com-


prende due virus impor-
tanti: HIV (human immuno-
deficiency virus) e HTLV
(human T-lymphotropic vi-
rus), che dà origine a una
forma abbastanza rara di
leucemia che interessa i lin-
fociti T. Questi virus conten-
gono un enzima peculiare,
la trascrittasi inversa, che
è una DNA polimerasi
RNA-dipendente (non ha
in realtà solo la funzione di
trascrivere, ma ha varie e
complesse funzioni). È for-
mata da due subunità.
Quindi questi virus sono
caratterizzati da un intermedio DNA-RNA poi DNA-DNA, il quale va a integrarsi nel genoma
della cellula ospite.
Non hanno un singolo filamento, ma ne hanno due, non complementari, entrambi a polarità positiva,
tenuti insieme all’estremità 5’ all’interno del capside. La trascrittasi inversa trascrive entrambi effet-
tuando il “salto del filamento”, ossia trascrive un po’ da una parte e un po’ dall’altra (ciò ha conse-
guenze molto pesanti per quanto riguarda la stabilità dell’acido nucleico).
La replicazione si svolge in questo modo:
- La trascrittasi inversa virus specifica (RT) agisce sull’RNA+ portando alla formazione di un
complesso ibrido RNA-DNA.
- La funzione ribonucleasica della trascrittasi inversa entra in azione (digerisce il filamento
di RNA).
- Allo stesso tempo, mentre il filamento di RNA dell’ibrido viene digerito, viene replicato il fila-
mento di DNA rimasto, dando origine a un doppio filamento di DNA che corrisponde all’RNA
originale (tutti i passaggi fin qui sono avvenuti nel citoplasma).
- A questo punto il doppio filamento viene trasferito nel nucleo e va a integrarsi nel DNA cel-
lulare in siti random e si comporta come un qualunque gene cellulare: viene trascritto dalle
RNA polimerasi cellulari e dà origine a due tipi di mRNA+: mRNA subgenomici, che daranno
le proteine strutturali, e mRNA pregenomici o genomici, che costituiranno il genoma del vi-
rione che verrà assemblato. L’RNA polimerasi cellulare inoltre trascrive mRNA che vengono
tradotti in proteine accessorie o regolatrici (dette ancillari), che servono a stimolare e pro-
teggere la replicazione del virus e quindi ad aumentare significativamente la carica virale.
- I virioni in formazione acquisiscono poi frammenti di membrana che vanno a costituire il pe-
ricapside.

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Virus a RNA a singola elica a polarità negativa (ssRNA-)

Alcuni esempi di virus di


questo genere sono: para-
myxoviridae (morbillo, pa-
rotite), rhabdoviridae (rab-
bia), filoviridae (ebola),
orthomyxoviridae (in-
fluenza), arenaviridae
(febbri emorragiche).
All’interno del capside è
presente l’RNA polimerasi
RNA-dipendente. L’RNA-
viene da essa trascritto in
RNA+, che da un lato darà
origine a RNA– pregeno-
mici e dall’altro verrà usato
per la produzione di pro-
teine strutturali che an-
dranno a formare il virione finale. In realtà dagli mRNA viene tradotta anche RNA polimerasi: saranno
quindi operative sia RNA polimerasi originali presenti sin dall’inizio nel capside sia RNA polimerasi
neosintetizzate. Gli RNA– trascritti a partire dall’RNA+ vengono a loro volta nuovamente trascritti
per formare mRNA, che viene poi tradotto in ulteriori proteine strutturali.

Nel caso per esempio di ortomixo l’evento finale è l’acquisizione del pericapside tramite prelievo
dalla membrana cellulare. Nei virus ssRNA- ci sono delle varianti sul tema nella replicazione: ad
esempio orthomixo è segmentato (8 segmenti in influenza A e B, 7 nel caso di influenza C), il che
comporta che ci sia una tappa intermedia svolta a livello nucleare, perché l’RNA polimerasi RNA-
dipendente deve trovare degli inneschi che sono presenti a livello nucleare.

Assemblaggio e fuoriuscita dei virioni


• Auto-montaggio del capside: i capsomeri per loro natura possono assemblarsi automatica-
mente. Ad esempio, il vaccino contro HPV, composto da 4 ceppi che sono 6, 11, 16, 18, è
formato dal capside di questi virus, che vengono prodotti come singoli capsomeri i quali
messi assieme tendono a combinarsi e dare origine a un capside completo. I legami fra i
capsomeri non sono covalenti e non è necessaria la presenza dell’acido nucleico per il loro
assemblaggio. La sintesi dei capsomeri avviene in contemporanea con la trascrizione degli
acidi nucleici che in essi dovranno essere assemblati.
• Fuoriuscita: in seguito all’assemblaggio avviene la liberazione del virus e le conseguenze
sono la comparsa di un effetto citopatico, che può variare a seconda del tipo di virus (lisi
totale della cellula, lisi parziale, formazione di sincizi, …). Le tappe di fuoriuscita compren-
dono:
- Avvicinamento del nucleocapside alla membrana cellulare; le proteine virali tendono ad
aggregarsi escludendo le proteine cellulari.
- Costituzione dell’envelope tramite un frammento di membrana lipidica.
- Gemmazione vera e propria.
Il capside è costituito da proteine di origine virale, il pericapside è costituito sia da proteine di origine
virale sia da alcune proteine di origine cellullare, grazie alle quali il virus potrebbe evadere il
riconoscimento da parte del sistema immunitario.
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Durante la replicazione virale esiste una fase, che va dall’uncoating alla maturazione della progenie
virale, definita fase di eclissi, o periodo di latenza; comprende la replicazione del genoma e la sintesi
di proteine. È una fase in cui non sono ancora visibili i virioni. Questi cominciano a comparire all’in-
terno della cellula e ad essere visualizzabili a partire dalla fase di assemblaggio e poi in quella di
rilascio.

Patogenesi virale
✓ Per patogenesi virale si intende un processo grazie al quale il virus causa una patologia.
✓ Per virulenza si intende la capacità del virus, grazie alle sue strutture, di causare una pato-
logia.
La malattia è la somma di effetti che comprendono la replicazione del virus e il danno diretto alla
cellula, e il tipo di risposta immunitaria contro il virus, che può variare da individuo a individuo. La
combinazione di questi fattori determina caratteristiche e severità della malattia. A volte il sistema
immunitario stesso può essere causa dell’insorgenza della patologia. A parità di virus la risposta
individuale è differente a seconda delle caratteristiche del sistema immunitario di ciascun individuo.
L’esito dell’infezione dipende dal tipo di virus ed essa può essere:
- Acuta: si risolve nel tempo e scompare a livello clinico, può avere diversi gradi di gravità (es:
rinovirus).
- Persistente: mantenimento della replicazione virale, ma a bassa carica virale, quindi il virus
è difficilmente rilevabile.
- Latente/Recidiva: prima fase acuta, seguita da una fase di latenza (in cui la presenza del
virus è dimostrabile solo con frammenti del genoma). In seguito a insulti ambientali si pos-
sono verificare delle recidive con ricomparsa di replicazione virale (slatentizzazione) in se-
guito alle quali si ha nuovamente una fase di latenza. (es: herpes).

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- Lente: lentivirus come HIV, che ha un episodio acuto iniziale aspecifico e un periodo di per-
sistenza seguito dopo molti anni, a seconda dell’individuo, da una massivo rialzo della carica
virale.
- Trasformazione cellulare: come nel caso di papilloma virus.
Le infezioni possono essere
- Sintomatiche: visibili clinicamente;
- Inapparenti: subcliniche.
La natura della malattia dipende da:
- Sito bersaglio (ci sono virus che utilizzano bersagli disparati).
- Punto di entrata.
- Capacità del virus di diffondersi o meno (malattia localizzata o diffusa, nel secondo caso
più dannosa).
- Tropismo cellulare: caratteristiche tipiche della cellula (es: recettori).
- Natura del virus: alcuni virus nel corso dell’evoluzione si sono “attenuati” nel tipo di malattia
causata all’uomo, questo per raggiungere una sorta di equilibrio con l’organismo ospite (es:
herpes). Infatti, lo scopo del virus non è di uccidere l’ospite, poiché si perderebbe questo
equilibrio. Per questo i virus utilizzano la fase di latenza.
- Severità della malattia: dipende dalla capacità del virus di causare danno organico alla
cellula.
- Carica virale iniziale: dipende se veniamo a contatto con poche particelle di virus o con un
milione di esse. Al concetto di carica virale è associato quello di morbilità, che è la capacità
del virus di causare malattia in correlazione alla carica virale, ossia ad alcuni virus bastano
poche particelle virali per scatenare una patologia, altri hanno bisogno di una carica virale
molto elevata
- Compromissione del sistema immunitario: se la risposta immunitaria è debole o assente
il virus non viene bloccato. Ad esempio, durante il decorso finale di infezioni da HIV si pre-
sentano varie infezioni causate da funghi o batteri e altri microorganismi, che non darebbero
malattia in un individuo integro.
- Background genetico: ad esempio alcuni individui hanno recettori virali mutati (es: CCR5
per HIV nel 10% della popolazione, che non può contrarre il virus anche se ne viene a con-
tatto).
- Età: con l’invecchiamento la reazione ai virus tende a essere meno efficace.
Fasi attraverso cui il virus causa malattia:
- Primo contatto con il virus;
- Periodo di incubazione: può essere molto variabile, da una settimana, a un mese, a sei
mesi, ad anni;
- Diffusione del virus dal sito di contatto;
- Invasione dei tessuti bersaglio (inizia a comparire il quadro sintomatologico, a volte difficile
da interpretare, anche se si possono riconoscere segni peculiari di ciascun virus);
- Tropismo cellulare e tissutale;
- Replicazione del virus e rilascio a livello sistemico (capacità di raggiungere altri organi).
Tutto ciò viene contrastato dalla risposta immunitaria, sia innata sia specifica, che però in ge-
nere è più lenta rispetto alla velocità di replicazione del virus.
Come avviene il passaggio di un virus da individuo a individuo? È importante saperlo soprattutto dal
punto di vista epidemiologico per poter circoscrivere un’infezione (es: virus ebola è oggi circoscritto
perché viene riconosciuto prima che inizi a diffondersi). Le modalità sono:

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- Via orizzontale: diretta, da individuo a individuo, oppure indiretta, veicolata ad esempio da


artropodi o cibo e acqua contaminati.
- Via verticale: transplacentale, perinatale o via allattamento.

Infezioni congenite possono essere letali per il feto, che è facilmente aggredibile dal virus perché
non possiede un sistema immunitario, ma un ruolo fondamentale di difesa nel passaggio del virus
da madre a figlio può essere svolto dalla placenta.
Siti di entrata:
- Bocca
- Tratto respiratorio: è la più comune via di entrata. Le barriere contro l’infezione sono la
formazione di muco, l’azione delle ciglia, l’azione dei macrofagi, le IgA. I virus possono viag-
giare in “goccioline” quindi trasmettersi tramite aerosol, colpi di tosse, stranuti, contatti sali-
vari.
- Tratto alimentare: le infezioni possono essere trasmesse a questo livello tramite alimenti e
bevande contaminate. È in realtà un ambiente molto ostile per i virus grazie al ph dello sto-
maco, all’ambiente basico intestinale, ai vari enzimi digestivi che tendono a disgregare il
capside, ai sali biliari, che essendo dei saponi possono disgregare l’envelope lipidico del
virus. I virus hanno sviluppato dei meccanismi di resistenza. Ad esempio, alcuni virus come
enterovirus e coronavirus possono superare le barriere intestinali.
- Tratto urogenitale: protetto da muco e basso ph, ma a volte, come nel caso di HIV, sono
sufficienti piccole lesioni a livello della mucosa. Altri virus producono essi stessi delle lesioni
(es: papillomaviridae).
- Occhi: congiuntiva e sclera sono i siti di ingresso preferenziali. L’operazione meccanica di
“lavaggio” delle palpebre svolge un ruolo importante per abbassare la probabilità di infezione.
In genere se l’occhio è integro è difficile che il virus possa penetrare, ma quando si verificano
dei traumi è più facile. Le infezioni possono essere localizzate a livello congiuntivale o disse-
minarsi soprattutto a livello del sistema nervoso centrale. Un particolare virus può infettare
la cornea intatta e può portare a lesioni cerebrali molto gravi che hanno come esito finale la
cecità
- Cute: attaccata soprattutto da artropodi. All’esterno presenta uno strato corneo formato da
cellule cheratinizzate, che non possono supportare un’infezione. Ad esempio nel caso di
HPV, l’infezione avviene grazie ad abrasioni e lesioni che mettono in comunicazione l’esterno
con lo strato basale (dove risiedono le cellule staminali). L’epidermide è priva di capillari per
impedire il diffondersi di un’eventuale infezione.
Quando il virus raggiunge il circolo sanguigno si parla di viremia. Essa può essere

• Passiva (primaria): dipende dalla carica virale (tanto virus entra nell’organismo, tanto può
andare nel circolo sanguigno). Si ha una prima viremia, in cui il virus una volta raggiunto il
circolo sanguigno va incontro a una fase viremica, ossia una prima replicazione diretta-
mente a livello del sangue. In genere questo processo non rappresenta mai una carica virale
importante
• Attiva (secondaria): in cui la carica virale aumenta significativamente.

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Diagnostica virale

Un’infezione è il processo grazie al quale il virus introduce il suo genoma della cellula; questo con-
cetto non va confuso con il concetto di malattia. Infatti, per infezione si intende esclusivamente il
processo iniziale in cui il virus aggancia il suo recettore cellulare e rilascia il suo genoma nella
cellula. Per malattia invece si intende tutto il processo tramite il quale il virus si replica e gli effetti
che ciò ha sull’organismo.
Produttività: un’infezione si dice produttiva se vengono prodotti nuovi virus, ossia se il virus può
replicarsi.
Latenza: l’infezione è latente se la produzione di nuovi virus non avviene immediatamente, ma il
virus rimane in grado di riattivarsi in tempi successivi, dando origine a un’infezione produttiva solo
in un secondo tempo (riattivazione).
Quasi-specie: una mistura di particelle virali, di uno stesso virus, che tendono a differenziarsi gra-
datamente e che sono presenti nell’ospite a un tempo determinato.
Quando si viene infettati da un virus, non si viene infettati da una singola particella virale, ma da una
popolazione mista iniziale (A) di particelle virali appartenenti alla stessa specie. Questa popolazione
di virus in realtà non è costituita da virioni con identico corredo genetico, perché durante la replica-
zione virale i virus subiscono mutazioni, dato che sia le polimerasi dei ribovirus sia le polimerasi dei
deossiribovirus commettono degli errori a livello di trascrizione del templato originale. Ogni popola-
zione mista presenta quindi differenze nel genoma. Ad esempio, sequenziando 25 ceppi di HCMV
si è visto che tutti e 25 avevano omologie dell’85/90% fra loro, ma che per il restante 10/15% erano
diversi. Si dice che il virus va incontro a speciazione. Ciascuna di queste popolazioni viene detta
quasispecie, cosiddetta perché non ci sono differenze tali da giustificare la classificazione di una
nuova specie, ma ci sono comunque differenze genomiche non trascurabili. I tassi di mutazione
variano da virus a virus (i più notevoli sono HCV e HIV). Le polimerasi dei virus a RNA sono gene-
ralmente le meno precise. La diagnostica virale si occupa del riconoscimento di queste quasi-specie.
Il percorso ospedaliero per diagnosticare un’infezione virale parte da un sospetto clinico. Si possono
sviluppare due possibili percorsi:
- Percorso virologico (o microbiologico): porta ad evidenziare la presenza del virus in modo
diretto o indiretto.
- Percorso sierologico (o immunologico): porta ad evidenziare la presenza del tipo di rispo-
sta immunitaria che il nostro organismo sta mettendo in atto contro il virus; porta cioè a iden-
tificare la produzione di anticorpi e di linfociti T e B contro un determinato virus.
Il virus va ricercato o in campioni di tessuto o in liquidi organici come sangue, urina, saliva, lacrime.

Percorso virologico
Analisi diretta: si basa sulla ricerca di componenti del virus tramite vari metodi:
- Osservare la presenza dell’antigene vi-
rale tramite tecniche di immunofluore-
scenza:
Si ricercano questi antigeni su monociti o
fibroblasti, comunque su cellule in coltura.
Le cellule vengono fatte reagire con degli
anticorpi commercialmente disponibili di-
retti contro strutture virali del virus che si
sospetta essere responsabile

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dell’infezione. Dopodiché si aggiunge un anticorpo fluorescente (un anticorpo coniugato con


un fluoroforo). Il risultato è osservabile tramite microscopio a fluorescenza. Se il primo anti-
corpo riconosce un antigene virale allora poi viene legato a sua volta dall’anticorpo fluore-
scente che può essere visualizzato al microscopio a fluorescenza. I vantaggi sono che è
molto rapido (3-4 ore) ed è molto sensibile (bastano poche particelle virali, nell’ordine di 1
cellula infettata su 100 000). Gli svantaggi sono che richiede personale specializzato, stru-
mentazione adeguata e il campione deve essere di elevata qualità.
- Microscopia elettronica: molto poco usata perché costosa, richiede personale specializ-
zato. Il vantaggio è che mette in evidenza le particelle virali, ma a bassa sensibilità (è neces-
saria un’alta carica virale). Si usa pertanto in 2 casi: quando si deve mettere in evidenza un
virus non coltivabile oppure quando si sospetta la presenza di un virus non classificato.
- Microscopia ottica: si ricerca un di danno tissutale, ma non si possono evidenziare virus
direttamente. Si possono cercare corpi di inclusione (accumulo di materiale virale) su prepa-
rati istologici. È una tecnica poco sensibile e poco specifica. Esempi di corpi di inclusione
sono i corpi del Negri nel virus della rabbia e quelli ad occhi di gufo nel CMV. Questa tecnica
è ancora ad esempio per evidenziare lesioni neuronali dovute a rabdovirus.
- Rilevamento degli acidi nucleici: il metodo principale è la PCR.
Analisi indiretta: dimostra la presenza del virus grazie al danno che esso genera nella cellula ber-
saglio. I metodi sono:
- Colture cellulari: il metodo indiretto più utilizzato, per vedere l’effetto citopatico ossia il
danno del virus nei confronti della cellula (apoptosi, piroptosi, necrosi, …), formazione di
sincizi (cellule multinucleate giganti), emoassorbimento. Il campione virale viene steso sulla
coltura cellulare e dopo qualche tempo si può osservare il danno citopatico causato dal virus.
Il danno è peculiare per ciascun virus. Ad esempio, l’effetto citopatico da poliovirus è la com-
pleta distruzione della popolazione cellulare, quello da herpes è che le cellule assumono un
aspetto arrotondato e si distaccano.
- Uova (utilizzate per produrre vaccini).
- Animali.

Percorso sierologico
In riferimento al grafico sottostante, nella risposta immunitaria le IgM vengono prodotte subito, le IgG
vengono prodotte in un secondo momento. A livello diagnostico, cercando la presenza di anticorpi
diretti contro un determinato virus, se si trovano IgM sappiamo che l’infezione è appena partita
in quanto dopo circa 15 giorni queste immunoglobuline scompaiono, mentre se si trovano IgG
significa che l’infezione è più tardiva (i livelli di IgG si alzano dopo due settimane e poi tendono a
decadere gradualmente, ma se c’è una reinfezione hanno un boom). Conoscere lo stato temporale
dell’infezione è importante in quanto possono esserci diversi livelli di gravità a seconda che
l’infezione sia primaria o secondaria.
I problemi dell’approccio sireologico sono
che richiede tempo lunghi, che le infezioni
locali possono non indurre una risposta
anticorpale, la cross reattività tra vari virus, la
possibile immunocompressione del paziente,
pazienti con mononucleosi, pazienti con
malattie autoimmuni che possono dare falsi
positivi.

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