Recombinant DNA

Technology
(An Introduction)

Drs. Lalu Zulkifli, M.Si., Ph.D

 BIOTEKNOLOGI
(reminder)
Pemanfaatan organisme hidup
(keseluruhan atau bagiannya) untuk
menghasilkan barang dan jasa yang
bermanfaat bagi manusia.
Pemahaman mengenai struktur,
fungsi, ekspresi dan regulasi
gen dan DNA adalah sangat
mendasar

Recombinant DNA Technology

dan Molecular Biotechnolgy
 Definition of recombinant DNA
technology

 A series of procedures used to

recombine DNA segments, and
under certain conditions, a
recombinant DNA molecule can
enter a cell and replicate.
 Cloning DNA Molecules
Principle of recombinant DNA technology

1. Purify DNA from desired source

2. Cut DNA with restriction endonuclease
3. Join fragments to cloning vectors cleaved with
compatible restriction endonuclease to create
recombinant DNA molecules (ada hibridisasi)
4. Transfer recombinant molecules to host cells
5. Isolate DNA from individual clones of
transformed host cells

Do as you please with the isolated DNA

segments…
 Bacterium
1 Gene inserted into
Cell containing gene
plasmid
of interest

Bacterial Plasmid
chromosome Gene of
Recombinant interest DNA of
DNA (plasmid) chromosome
2 Plasmid put into
Gambaran bacterial cell (“foreign” DNA)
gene Recombinant
cloning dan bacterium

penggunaan 3 Host cell grown in culture to

gen yang form a clone of cells containing
the “cloned” gene of interest
telah di klon
Gene of Protein expressed from
interest gene of interest
Copies of gene Protein harvested

4 Basic research
Basic and various Basic
research applications research
on gene on protein

Gene for pest Gene used to alter Protein dissolves Human growth
resistance inserted bacteria for cleaning blood clots in heart hormone treats
into plants up toxic waste attack therapy stunted growth
 Cloning into
Enzim restriksi

Plasmids
(contoh lebih spesifik)
Enzim restriksi Enzim ligase

Kloning DNA dengan menggunakan vektor

 Important terms
DNA asing/foreign DNA/Gene of interest)
Vektor (plasmid, bakterofage, cosmid)
Restriction endonuclease
Multiple Cloning Site (MCS)
Hibridisasi pasangan basa (sticky end)
DNA Ligase
Transformasi
Seleksi transforman
 Vector :

Alat transport pada rekayasa

genetika
 Cloning Vectors
 A vector is used to amplify a single molecule of
DNA into many copes. A DNA fragment must be
inserted into a cloning vector. A cloning vector is
a DNA molecule that has an origin of replication
and is capable of replicating in a bacterial cell.

 Most vectors are genetically engineered

plasmids or phages.
 Beberapa jenis vektor
Plasmid (5 kb)
Bacteriophage (mengapa virus ini dpt
digunakan sebagai vektor kloning? (15 kb)
Cosmid (45000)
 Apa itu plasmid
• Molekul DNA ekstrakromosomal kecil,
sirkuler, terdpt secara alami
• Memiliki ori sendiri (dpt berepkikasi
autonom)
• Memiliki gen-gen resisten terhdp antibiotik
• Memiliki faktor2 virulensi penyakit.
 Plasmid
• Merupakan DNA ekstrakromosom bakteri
• Merupakan replicon (autonom) yg secara
stabil diturunkan dari 1 generasi ke
generasi berikutnya
• Sering membawa gen resisten terhadap
antibiotik (dpt menentukan sifat bakteri)
 Plasmid vektor
• Ukuran kecil lebih efektif (2-4kb) utk
dimanipulasi dan transformasi (proses
pengabilannya oleh sel host)
• Mengandung gen resisten antibiotik (1
atau 2) utk seleksi transforman.
Contoh :pBR322 (4,3 kb) memiliki gen
resiten Amp dan Tet)
 Salah satu gen E.coli yg sgt penting berkaitan dgn
peran plasmid sebagai vektor adalah gen Lac-Z.
Jika bakteri ditumbuhkan pada media yg mengandung
X-gal, maka setelah 12 jam sel akan membentuk coloni
berwarna biru (karena adanya gen Lac-Z). Jika gen Lac-
Z rusak/mutasi koloni akan tetap berwarna putih (gen
lac-Z tdk berfungsi)

 Hal di atas dpt digunakan utk konfirmasi

keberhasilan kloning fragmen DNA asing tertentu.

Prinsip dasar
Seleksi putih biru.
Syarat utama plasmid dpt dijadikan
vektor kloning :
 Berukuran kecil (mudah dimanipulasi,
biasanya bersifat multiple copy)
 Mempunyai sifat yg dpt digunakan
untuk seleksi
 Mempunyai situs spesifik utk enzim
restriksi.
 Bakteriophage sebagai vector
Bagaimana cara memodifikasi bakteriophage sehingga
dapat dijadikan sebagai vektor?

 Genom phage : 50000 ps basa (15000 tdk penting utk

siklus hidup virus dan 35000 penting utk replikasi
virus)
 Sdh diketahui sekuennya termasuk situs
pemotongannya oleh enzim restriksi.
 Dgn info tersebut dilakukan modifikasi :
Gen-gen yg tdk penting utk replikasi dibuang dan
diganti dengan gen asing yang ingin kita kloning.
Dengan demikian semua partikel virus juga akan
membawa gen yang disisipkan pada genomnya.
 Cosmid
 A. Plasmid dgn gen resisten terhadap antibiotik
(penting utk seleksi pada medium seleksi)
 B. Gen Cos pada virus : dalam siklus hidup virus
terdapat tahap dimana genom virus masuk ke dalam
partikel virus. Kemampuan genom virus utk masuk
kedalam partikel virus di kontrol oleh gen cos.
 Partikel virus dpt menampung 50.000 bp

 Bhn dasar pembuatan cosmid : A (plasMID) dan B

(gen COS)
 Gen cos berukuran 30 bp sedangkan plasmid 5000
bp artinya ukuran cosmid sendiri adalah 5030.
 Jadi cosmid dpt membawa DNA insert sekitar 45.000
bp
 Multiple cloning site (MCS)/polylinker pada vektor

pUC18 adalah salah satu contoh plasmid vektor utk kloning

dengan teknik seleksi WHITE-BLUE Colony

 As small as possible with

minimum restriction
endonuclease cutting sites in
genes
 Ori (origin of replication)
 Selectable marker(s)
 Multiple cloning site (MCS)
Using Restriction Enzymes to
Make Recombinant DNA
• Bacterial restriction enzymes cut DNA
molecules at specific DNA sequences called
restriction sites
• A restriction enzyme usually makes many cuts,
yielding restriction fragments
• The most useful restriction enzymes cut DNA in a
staggered way, producing fragments with “sticky
ends.”
 Enzim Restriksi
Memotong DNA pada situs tertentu yang
dikenal sebagai situs pengenalan
(recognition sites) oleh enzim restriksi
Dapat menghasilkan potongan ujung
lengket (Sticky ends) atau ujung tumpul
(blunt ends).
 Recognition
Restriction site
Enzyme Cleavage
Endonucleases (Cleavage Source
sequence pattern

Sticky ends (Ujung lengket)

Situs pengenalan
(recognition site)
enzim restriksi pada
molekul bersifat simetris
dan menunjukkan untai
DNA berlawanan
dengan sekuen basa
terbalik (yang disebut
Palindrom). Blunt ends (Ujung tumpul)

Ujung tumpul
Hasil pemotongan molekul DNA dengan enzim restriksi endonuklease berbeda.
(A) ujung blunt dan ujung sticky. (B) Tipe ujung sticky berbeda.
(C) Tipe sticky sama dihasilkan oleh dua enzim restriksi berbeda.

A. Blunt and sticky

ends.

B. 5` and
3` overhangs

C. The same sticky

ends produced by
diffreent enzymes
 Konsep :
Molekul DNA Rekombinan

Belum tersambung
DNA dipotong dgn EcoRI
 LIGASI
• Penyambungan potongan DNA target
dengan DNA plasmid membentuk ikatan
fosfodiester oleh enzim DNA Ligase
• Sticky ends can bond with complementary sticky
ends of other fragments
• DNA ligase is an enzyme that seals the bonds
between restriction fragments
 Restriction site
5 3
GAATTC
DNA CTTAAG
3 5
1 Restriction enzyme
cuts sugar-phosphate
Penggunaan backbones.
3 5
5 3
Enzim restriksi
dan DNA ligase 3
5 Sticky 3
5
untuk membuat end
5
DNA rekombinan 3

2 DNA fragment added 3

from another molecule 5
cut by same enzyme.
Base pairing occurs.

5 3 5 3 5 3
G AATT C G AATT C
C TTAA G C TTAA G
3 53 5 3 5
One possible combination
3 DNA ligase
seals strands
5 3

3 Recombinant DNA molecule 5

 Cloning DNA Molecules
Principle of recombinant DNA technology

1. Purify DNA from desired source

2. Cut DNA with restriction endonuclease
3. Join fragments to cloning vectors cleaved with
compatible restriction endonuclease to create
recombinant DNA molecules
4. Transfer recombinant molecules to host cells
5. Isolate DNA from individual clones of
transformed host cells

Do as you please with the isolated DNA

segments…
Cloning into Plasmids
(gambaran umum)
Prinsip Dasar DNA cloning
Prinsip dasar transformasi sel bakteri dgn plasmid pembawa gen
resisten antibiotik

Sel bakteri Restriksi, ligasi

kompeten

Sel pembawa
plasmid TUMBUH Sel yg tdk membawa
pada cawan yg plasmid MATI pada
mengandung cawan yg
antibiotik ttt mengandung
antibiotik ttt
 Teknik INSERTIONAL INACTIVATION

Screening for insert by

Disruption of Antibiotic
Resistance gene
Contoh : disrupsi gen resisten INSERTIONAL INACTIVATION
ampisilin pada plasmid vektor

Penggunaan plasmid pBR322

Restriksi (Pemotongan)
untuk cloning DNA asing pada E.
coli dan mengidentifikasi (seleksi)
sel yang mengandungnya setelah E.
coli ditransformasi Ligasi (Penyambungan)

Transformasi host

Seleksi (penapisan)

Diperoleh koloni E.
coli yang membawa Mengapa demikian?...
DNA rekombinan
 Plasmid pBR322 untuk cloning DNA dgn
teknik insertional inactivation

Salah satu
unique site
 Teknik Komplementasi α

Alpha complementation
β-Galactosidase activity can be used as an indicator
of the presence of a foreign DNA insert.
 Blue/White Screening for β-galactosidase
(polylinker)
Pada plasmid

(Kloning tdk berhasil)

(X-gal diuraikan menjadi

produk berwarna biru
: Kloning tdk berhasil),
dan sebaliknya

(Kloning berhasil)
 pUC18 adalah salah satu contoh plasmid vektor utk kloning
dengan teknik seleksi WHITE-BLUE Colony

 As small as possible with

minimum restriction
endonuclease cutting sites in
genes
 Ori (origin of replication)
 Selectable marker(s)
 Multiple cloning site (MCS)
 Plasmid memiliki bagian gen Seleksi putih-biru
lacZ 5` yang mengandung dgn α-Complementation
MCS
 Host strain memiliki bagian
gen lacZ 3`
 Ekspresi keduanya
menghasilkan enzim yang
fungsional menguah
senyawa X-gal menjadi
warna biru
 Jika ada insersi pada MCS
maka tdk dapat terjadi
komplementasi/fungsional
 X-gal pada media dapat
digunakan utk seleksi putih
biru Berhasil Tdk berhasil
 Applications of Recombinant DNA
Technology : BIOTEKNOLOGI
(contoh sederhana : produksi insulin
manusia pada bakteri)

Production of human proteins by genetically

engineered bacteria.

Such as : insulin
 REKAYASA GENETIKA
ORGANISMA
• MIKROBA
• TANAMAN
• HEWAN
MIKROBA
Production of Human Insulin
(disederhanakan)
1) Obtaining the human insulin gene
Human insulin gene can be obtained by making a
complementary DNA (cDNA) copy of the
messenger RNA (mRNA) for human insulin.
 2)Joining the human insulin gene
into a plasmid vector
The bacterial plasmids and the cDNA are mixed
together. The human insulin gene (cDNA) is
inserted into the plasmid through complementary
base pairing at sticky ends.
3)Introducing the recombinant DNA
plasmids into bacteria

The bacteria E.coli is used as the host cell. If E.

coli and the recombinant plasmids are mixed
together in a test-tube.
 4)Selecting the bacteria which have
taken up the correct piece of DNA

The bacteria are spread onto nutrient agar. The

agar also contains substances such as an
antibiotic which allows growth of only the
transformed bacteria.

Further manipulation :
Production and
purification of human
insulin from large scale
culture sistem
( bioreactor)
 Gambaran
REKAYASA GENETIKA
TANAMAN melalui
Agrobacterium
PRODUKSI TANAMAN TRANSGENIK
(dimediasi Agrobacterium)
Tikus transgenik dengan GFP