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BIOLOGIA MOLECOLARE

1. Struttura e proprietà generali degli acidi nucleici.

Acidi nucleici
Gli acidi nucleici sono composti formati da monomeri detti nucleotidi, cioè esteri fosforici dei nucleosidi.

L’immagine rappresenta la struttura generale di un nucleotide, in cui


l’esterificazione (sostituizione di un ossidrile, OH, libero con una
molecola di acido fosforico) è avvenuta sul carbonio 5’.
L’ esterificazione può avvenire anche in posizione 3’.
I Carboni 3’ e 5’ sono usati per indicare la polarità del filamento di
basi nucleotidiche (scritto in direzione 5’ → 3’).

I nucleotidi sono a loro volta formati da tre componenti:


1. un radicale fosforico (o gruppo fosfato) →
2. uno zucchero monosaccaride pentoso;
3. una base azotata.

Lo zucchero monosaccaride pentoso è diverso se si parla di DNA o RNA, infatti:

Lo zucchero del DNA è il Deossiribosio,


così chiamato perché privo di una
molecola di ossigeno in posizione 2’
rispetto al Ribosio, zucchero di RNA

Le basi azotate sono quattro, di cui tre presenti sia in DNA che RNA
e una caratteristica, suddivisibili in due gruppi: Purine,
composte da due anelli eterociclici azotati, e Pririmidine,
formate da un solo anello eterociclico azotato.

Le basi azotate si legano allo zucchero pentoso tramite un legame glicosidico


Struttura del DNA

La molecola del DNA è costituita da due filamenti di nucleotidi collegati da legami a idrogeno e avvolti
in una doppia elica. Il collegamento avviene tra le basi azotate dei due filamenti, che si abbinano a coppie
esclusive “adenina A - timina T (A-T)'' e ``citosina C- guanina G (C-G)''. Lo zucchero forma l'asse
centrale della catena legando la base azotata in posizione 1' e il gruppo fosfato in posizione 5'. La
connessione tra elementi contigui è assicurata dal legame del gruppo fosfato di un nucleotide con lo
zucchero del nucleotide successivo in posizione 3'. Pertanto i due estremi della catena si presentano liberi,
e saranno privi di residui fosforici rispettivamente gli atomi 3' e 5', conferendo così al polimero una
precisa direzionalità. L'accoppiamento delle due catene si realizza attraverso la formazione di ponti a
idrogeno, che sono legami facilmente scindibili, tesi tra le rispettive basi azotate, che vengono quindi a
situarsi nella porzione centrale - o core - della struttura. Questa particolare struttura permette al DNA di
replicarsi (cioè duplicarsi) con relativa semplicità: le due eliche si separano gradualmente e su ciascuna
può crescere un'altra elica, con la formazione infine di due doppie eliche uguali. In questa conformazione
ciascuna coppia di basi dista dalle contigue 0,34 nm; un giro completo dell'elica, o passo dell'elica, misura
3,4 nm, per cui sono presenti 10 coppie di basi per un giro completo. Entrambe le eliche sono destrorse,
ossia, immaginando di guardare lungo il loro asse, i due filamenti si avvolgono in senso orario. Le
informazioni sono trasmesse, tramite l'RNA, nei siti della cellula dove avviene la sintesi proteica, in modo
che gli amminoacidi si uniscano tra di loro secondo un ordine ben determinato, tale da produrre una
specifica proteina. Il DNA umano contiene 3 miliardi di nucleotidi divisi in 24 cromosomi.

Le scoperte di Watson e Crick


Grazie agli esperimenti di diffrazione dei raggi X i due scienziati dedussero che:
- le due catene polipeptidiche fossero avvolte intorno ad un asse comune e avessero direzionalità
opposte.
- Lo scheletro di zucchero-fosfato si trova all’esterno, mentre le basi azotate, idrofobiche, sono
disposte all’interno lontano dall’acqua.
- Le basi azotate sono quasi perpendicolari all’asse dell’elica e distano 3.4 A, esse sono rotate di 36°
rispetto alla base adiacente.
- Le basi si uniscono in combinazioni fisse, A-T e C-G.
- Il diametro dell’elica è di 20 A
L’effetto idrofobico dispone le basi una sopra l’altra, esse sono quindi sovrapposte e interagiscono tramite
forze di Van der Waals.

Altre forme di DNA


Alcuni organismi, come E. coli hanno un DNA circolare covalentemente chiuso o
cccDNA (dato dalla continuità dei filamenti e non dalla forma geometrica), infatti questa
forma permette all’asse della doppia elica di super avvolgersi formando una super elica,
una forma più compatta che può favorire o sfavorire la capacità della doppia elica di
svolgersi e quindi modificare l’interazione del DNA con altre molecole. Oltre al genoma della maggior
parte dei procarioti (dimensioni da 0,5 a 10 Mpb circa) il cccDNA si riscontra in vari altri casi, di minori
dimensioni come: Plasmidi batterici, piccoli DNA accessori (da 3 a qualche decina di kpb) recanti uno o
pochi geni non essenziali ma a volte utili al batterio; Alcuni batteriofagi e alcuni virus (di dimensioni
simili a quelle dei plasmidi), nella forma incapsidata e/o dentro la cellula infettata; DNA mitocondriale e
DNA cloroplastico (dimensioni dell’ordine di 104-105 pb).
Gli acidi nucleici a catena singola possono formare strutture complesse, come quelle ad asta e
stelo, in cui l’ansa è priva di appaiamenti, mentre sullo stelo possono instaurarsi appaiamenti
insoliti che destabilizzano la struttura locale ma introducono deviazioni della normale struttura
a doppia elica importanti per il ripiegamento ordinato o per la funzione. Spesso per stabilizzare
strutture più complesse si formano legami idrogeno in appaimenti non standard, inoltre
collaborano ioni metallici (ad esempio ioni magnesio Mg++). Queste strutture complesse permettono
al’RNA di svolgere funzioni che la doppia elica del DNA non può svolgere.
Il Twist è il numero di angoli giri (360°) che i due filamenti complementari del duplex effettuano l’uno
attorno all’altro lungo l’asse dell’elica. Il passo della doppia elica non vincolata (assenza di stress
torsionale, condizioni di soluzione simili a quelle fisiologiche), determinato quindi dalla minimizzazione
dell’energia libera locale, è di circa 10,5 coppie di basi per giro. Tale valore può essere modificato da
stress torsionale solo di poco e con dispendio energetico, essendo la costante torsionale del DNA duplex
alquanto elevata. Il Writhe (o superavvolgimento) è determinato dal grado di curvatura
dell’asse della doppia elica imposto dai vincoli topologici. Il duplex di DNA è relativamente flessibile e
deviare il suo asse dalla linea retta, normalmente (ma non sempre) situazione di minima energia locale,
non costa eccessivo dispendio di energia. Vi sono due tipi di superavvolgimento: A) solenoidale (o
toroidale) B) plectonemico. Lk = Tw + Wr Convenzionalmente si considera positivo il Twist destrorso,
cioè quello della normale doppia elica B-DNA, e quindi positivo l’Lk° corrispondente (cioè quando Wr =
0, cccDNA rilassato). Ne consegue che il superavvolgimento Wr può essere positivo o negativo a seconda
che Lk sia maggiore o minore di Tw. Il cccDNA cellulare tende a essere mantenuto dalla girasi a valori di
Lk minori di Tw, per cui il superavvolgimento è usualmente negativo, tale cioè da favorire (=essere
alleviato da) una “denaturazione” locale della doppia elica, evento presupposto per i processi cui il DNA è
sottoposto in vivo: la sua replicazione e la trascrizione in RNA.

Ogni ione etidio intercalato nel duplex induce uno “svitamento” della doppia elica pari a circa 26°
(e un allungamento di circa 0,34 nm). Ciò implica che per ogni 14 ioni etidio intercalati nel cccDNA
questo subisce una variazione di Twist pari a -360°, ovvero DTw = -1, che può essere compensato
dal rilassamento di un superavvolgimento (DWr = 1)

Forme teutomere e proprietà acido-base


Le basi del DNA assumono normalmente la struttura molecolare finora considerata. Sporadicamente
possono assumere una o più forme alternative tautomere (in cui un atomo di idrogeno risulta spostato in
una posizione diversa con riarrangiamento dei doppi legami). Il fenomeno è raro ma può avvenire anche
a pH fisiologico ed essere causa di mutazioni impedendo il normale appaiamento Watson-Crick (vedi
parte G).
Alterazioni rilevanti del pH rispetto al valore fisiologico intracellulare (ca. 7) inducono reazioni di
protonazione (pH acidi) o deprotonazione (pH basici) delle basi del DNA, con conseguente perdita della
normale struttura secondaria a doppia elica.
In particolare pH basici (circa 12) vengono normalmente usati in laboratorio per denaturare il DNA in
soluzione, provocando la perdita del protone imminico alle T e alle G e quindi dell’appaiamento Watson-
Crick. Il ripristino del pH 7 consente la rinaturazione del DNA con cinetiche più o meno veloci a seconda
dei casi. Più complessi ma meno rilevanti in pratica sono i fenomeni indotti dall’acidificazione.
NB: dal punto di vista chimico-fisico la timina (come l’uracile dell’RNA) non ha affatto proprietà basiche
(non lega protoni nemmeno a pH molto acidi).
Attenzione: Il valore di pH=12 denatura il DNA ma non lo degrada (cioè non idrolizza i legami
fosfoesterei). Per contro tale pH degrada l’RNA, che viene quindi facilmente depolimerizzato. Ciò
dipende dalla presenza di un intermedio “facile” nell’idrolisi alcalina dell’RNA, che la struttura del DNA
non consente.
La denaturazione del DNA, detta anche DNA melting, è il processo per cui l'acido desossiribonucleico a
doppio filamento si svolge e si separa in due filamenti singoli rompendo i legami idrogeno tra le basi
appaiate. Le basi del DNA possono essere protonate o deprotonate solo a pH non fisiologici (acidi o
basici rispettivamente) e sono incompatibili con la struttura a doppia elica. La stabilità termodinamica del
duplex di DNA (molecola formata da due filamenti complementari) e sua denaturazione: dipendenza da
fattori intrinseci (composizione in basi, peso molecolare) ed estrinseci (temperatura, pH, forza ionica,
cosoluti caotropi).
Il fenomeno dell’ipercromismo del DNA.
Le basi del DNA assorbono la luce UV tra 300 e 230 nm (con massimo di assorbimento attorno a 260
nm). Ma l’entità dell’assorbimento a parità di concentrazione è maggiore di quasi il 50% per il DNA
denaturato rispetto al DNA “nativo”, cioè a doppia elica. Pertanto misure di assorbimento UV a 260 nm,
facilmente ottenibili con uno spettro-fotometro, si sono rivelate particolarmente comode nello studio della
denaturazione (e della rinaturazione) del DNA. Gli spettri di assorbimento UV dei singoli nucleotidi sono
leggermente diversi l’uno dall’altro, sia come posizione del massimo che come intensità. La banda
centrata a 260 nm del DNA è la media pesata per la composizione in basi del dato DNA.
Da notare che gli spettri somma delle coppie C:G e A:T sono molto simili, per cui la composizione di un
DNA duplex influisce molto poco sull’assorbimento del DNA.
Cinetiche di rinaturazione
In genere la denaturazione termica del DNA in soluzione è un processo molto rapido. Per contro il
processo inverso, la rinaturazione (riformazione del duplex) in seguito ad abbassamento della
temperatura, è un processo la cui velocità (cinetica) può essere estremamente variabile a seconda della
natura del DNA all’esame, andando da velocità non molto minori di quelle di denaturazione nel caso di
oligonucleotidi, o DNA costituito da sequenze brevi ripetute, a velocità talmente basse da richiedere
giorni o addirittura mesi per osservare un grado di rinaturazione apprezzabile.
Lo sviluppo formale della figura seguente descrive il fenomeno in termini di cinetica del II° ordine,
valido sia per un oligonucleotide ben definito, lungo N paia di basi, sia per un DNA naturale a sequenza
non ripetitiva, anche frammentato in segmenti di poche centinaia di paia di basi, e in tal caso N è la
lunghezza totale del genoma se non contiene sequenze ripetute, come di solito nel caso di batteri e virus.
Se il genoma, come di solito nel caso degli eucarioti, contiene anche sequenze più o meno ripetute, la
rinaturazione avviene in più di un passo, più rapidamente per le sequenze altamente ripetute, molto più
lentamente per la parte non ripetuta nel genoma.
La formula finale N = k*Cbp*t1/2 dice che, nota la concentrazione del DNA in termini di paia di basi e
nota la costante cinetica, il tempo di semirinaturazione fornisce la misura della cosiddetta “complessità”
del genoma, cioè la lunghezza totale del DNA (non ripetitivo) che lo costituisce.

La struttura di RNA
La molecola di RNA è formata da numerosi nucleotidi uniti in un solo filamento avvolto a elica. L'RNA
differisce a livello strutturale dal DNA per la presenza del ribosio invece del desossiribosio, dell'uracile al
posto della timina e per la struttura monomerica. L'RNA, inoltre, al contrario del DNA, si presenta come
una molecola temporanea che viene continuamente sintetizzata e distrutta dalla cellula durante i processi
di trascrizione. Esistono vari tipi di RNA con funzioni specifiche; i due principali sono l'RNA-
messaggero (m-RNA), su cui vengono trascritte le informazioni del DNA e l'RNA di trasporto (t-
RNA), che traduce le informazioni dell'm-RNA nella sintesi corretta delle proteine attraverso l'unione di
amminoacidi nella giusta successione.

RNA-messaggero
L'RNA messaggero (mRNA) viene prodotto nel nucleo cellulare sul modello di un filamento di DNA per
mezzo di un enzima denominato RNA polimerasi DNA dipendente. L’RNA messaggero è molto
eterogeneo, poiché è costituito da filamenti contenenti tanti codoni quanti sono gli amminoacidi delle
proteine da loro codificate. Ogni mRNA è caratterizzato dal codone d'inizio AUG, specifico per
l'amminoacido metionina, e dai tre codoni UAA, UGA e UAG rappresentano invece il segnale di
terminazione della sintesi della catena polipeptidica. La precisione nell'andamento lineare dei
ribonucleotidi in gruppi di tre determina il corretto allineamento degli amminoacidi in una proteina.
Nei procarioti un singolo
mRNA può contenere
l'informazione per più di
una proteina. Negli
eucarioti la trascrizione
genera dei precursori
nucleari degli mRNA
(trascritti primari)
caratterizzati dalla
presenza di modificazioni
chimiche all'estremità 5'
(inizio della molecola) e
dalla presenza di zone
non codificanti detti
introni. Tali precursori
vengono in seguito
convertiti negli mRNA
maturi attraverso un
processo, detto splicing
che, grazie a un apparato enzimatico complesso in grado di riconoscere sequenze specifiche presenti nelle
zone di giunzione esone-introne, rimuove gli introni e ricongiunge le parti codificanti (esoni); i complessi
RNA-proteine che si formano durante questo processo sono detti spliceosomi. L'mRNA maturo diventa
così funzionale e, rimanendo associato a proteine, può venire trasportato attraverso i pori nucleari dal
nucleo al citoplasma. Qui si dissocia dalle proteine nucleari e si lega a proteine citoplasmatiche, alcune
sono responsabili della successiva localizzazione degli mRNA nei vari distretti citoplasmatici. La quantità
di mRNA all'interno di una cellula è una funzione sia della sua velocità di sintesi sia della velocità con cui
viene degradato; nei procarioti generalmente queste molecole hanno vita breve e vengono degradate in
pochi minuti; negli eucarioti, invece, gli mRNA sono più stabili: vivono da qualche decina di ore a vari
giorni.

RNA – transfer
I tRNA sono le molecole responsabili della lettura e traduzione del codice genetico,
sono piccole molecole di RNA a singola elica, lunghi circa 80 nucleotidi, con una
peculiare forma tridimensionale a "L", mentre se disegnato assume la caratteristica
forma a trifoglio. La conformazione tridimensionale è data da ibridazioni tra le basi: si
formano tratti a doppio filamento per l'appaiamento tra basi complementari sulla stessa
catena nucleotidica e questo provoca il ripiegamento della molecola di tRNA in modo
specifico e propedeutico allo svolgimento della sua funzione di molecola adattatrice.
Ogni tRNA presenta una sequenza di tre nucleotidi (anticodone) capace di riconoscere
una tripletta complementare dell'mRNA (codone) in direzione 5'-3', a molteplici
anticodoni può corrispondere uno stesso amminoacido. Alcuni anticodoni non hanno
funzione codificante ma solo regolatrice (segnali di inizio e di stop per la sintesi
proteica). L'estremità 3' del filamento polinucleotidico di tutti i tRNA sopravanza quella 5' di tre
nucleotidi uguali (C-C-A): tale sequenza rappresenta il sito accettore dell'amminoacido che, una volta
attivato dall'enzima aminoacil-tRNA sintetasi, si posiziona sul tRNA.
Le amminoacil-tRNA-sintetasi: è un enzima che catalizza l'esterificazione di uno specifico amminoacido
(o di un suo precursore) ad uno dei possibili tRNA corrispondenti, a formare un amminoacil-tRNA. Ne
esistono 20 in ciascun organismo, una per amminoacido. Ciò significa che ogni gruppo di tRNA
isoaccettori viene amminoacilato da un singolo enzima, ovvero ogni enzima lega l’amminoacido al tRNA
specifico. La sintetasi lega inizialmente una molecola di ATP ed il corrispondente amminoacido (o il suo
precursore), a formare un amminoacil-adenilato (con il rilascio di una molecola di pirofosfato), che resta
adeso all'enzima. Esso lega successivamente la molecola di tRNA appropriata, spostando l'amminoacido
dall'adenilato alla coda 3' della molecola del tRNA (in particolare il 2'-OH o il 3'-OH dell'ultima base,
A76).
amminoacido + ATP → amminoacil-tRNA + AMP
(amminoacido + ATP → amminoacil-AMP + PPi e amminoacil-AMP + tRNA → amminoacil-
tRNA + AMP)
Alcune sintetasi presentano anche attività di proofreading (correttore di bozze), per garantire il corretto
appaiamento amminoacido-tRNA: se il tRNA risulta caricato erroneamente, il legame con l'amminoacido
viene idrolizzato.
Esistono due classi di amminoacil-tRNA sintetasi:
 la classe I presenta due motivi di sequenza altamente conservati, e amminoacila il 2'-OH;
 la classe II presenta tre motivi di sequenza altamente conservati, e
amminoacila il 3'-OH.
L'unica eccezione è la fenilalanil-tRNA sintetasi (PheRS), enzima di classe II
che lega la fenilalanina al 2'-OH del tRNAPhe.
Entrambe le classi sono costituite da amminoacil-tRNA sintetasi composte da
diversi domini.
Tipicamente, esse presentano un dominio catalitico (dove si svolgono entrambe
le reazioni sopra descritte) ed un dominio legante l'anticodone (che interagisce
con l'anticodone del tRNA per garantire il legame del corretto amminoacido al
tRNA stesso). Alcune altre amminoacil-tRNA sintetasi presentano pure alcuni
domini leganti RNA, in grado di rompere eventuali legami tra amminoacidi e
tRNA non corrispondenti.
Tutti i domini catalitici delle amminoacil-tRNA sintetasi appartenenti ad una
singola classe presentano una elevata somiglianza tra loro. I domini catalitici
degli enzimi di classe I e II sono invece molto differenti: gli enzimi di classe I,
infatti, presentano il frequente ripiegamento di Rossmann, con una architettura
a foglietto beta parallelo, mentre quelli della classe II presentano un
ripiegamento proteico unico, composto da foglietti beta antiparalleli.
Il riconoscimento tra codone e anticodone: Avviene a livello del ribosoma mediante formazione di un
miniduplex antiparallelo tra ciascun codone del mRNA e l’anticodone del tRNA sull’ansa omonima. La
prima e la seconda base del codone devono appaiarsi rigorosamente “alla Watson-Crick”, mentre la terza
può anche derogare da questa regola: il caso più frequente è la formazione di un appaiamento G:U
(wobbling), meno frequentemente coinvolge una base modificata dell’anticodone, ad esempio
l’ipoxantina, derivata dalla deamminazione enzimatica di un’adenina del tRNA. Per cui un dato tRNA
può spesso riconoscere due codoni, o più raramente tre. Ciò rende conto del fatto che il numero degli
anticodoni può essere (e in genere è) minore del numero dei codoni, che nel codice standard sono 61.
Poiché più codoni di mRNA possono codificare per lo stesso amminoacido, o perché l’appaiamento è
accurato solo per le prime due basi, per la terza base può esistere una tolleranza agli appaiamenti
"sbagliati". Alcuni anticodoni infatti possono appaiarsi a più di un codone, in base ad un fenomeno
chiamato wobble pairing (o appaiamento incerto). Nel codice genetico è comune che un singolo
amminoacido occupi tutte e quattro le possibilità della terza posizione; ad esempio la glicina è codificata
dai codoni GGU, GGC, GGA e GGG. Per permettere una corrispondenza uno a uno tra molecole di tRNA
e codoni, ci sarebbe bisogno di 61 molecole di tRNA per cellula. Invece le cellule contengono meno di 61
tipi di tRNA perché la base "incerta" (fenomeno del wobble pairing) è capace di legarsi a molti -non
necessariamente tutti- i codoni che specificano un particolare amminoacido.

RNA- ribosomiale
I ribosomi sono la sede della sintesi proteica.
Sono costituiti da due subunità di dimensioni
diseguali, formate da acido ribonucleico (RNA)
e proteine. Possono essere associati al reticolo
endoplasmatico ruvido (in questo caso sin-
tetizzano proteine destinate a essere secrete
fuori dalla cellula) oppure liberi nel citoplasma
(sintetizzano proteine che la cellula trattiene al
suo interno).
A differenza dei batteri, in cui un’unica RNA
polimerasi è responsabile della trascrizione di
tutte le diverse molecole di RNA, le cellule
eucariotiche presentano tre diverse RNA
polimerasi di cui l’RNA polimerasi I e III sono
deputate alla produzione degli rRNA. Tre dei quattro rRNA (18S, 5,8S e 28S) sono trascritti dall’RNA
polimerasi I in forma di un lungo precursore che prende il nome di RNA 45S, mentre l’rRNA 5S è
codificato da un gene indipendente trascritto dall’RNA polimerasi III. L’rRNA 18S insieme a 30÷50
proteine ribosomali costituisce la subunità piccola 40S del ribosoma mentre la subunità grande 60S
contiene rRNA 5s, 5,8S e 28S insieme a 40÷50 proteine ribosomali.

Sintesi proteica
La sintesi proteica è il passaggio del’informazione genetica dal DNA all’RNA e dall’RNA alle proteine
(dogma centrale della biologia) tramite i processi di trascrizione e traduzione.
Due α-amminoacidi raramente usati nella sintesi proteica sono:
- Selenocisteina.Compare sporadicamente in poche proteine sia in procarioti che
eucarioti (uomo compreso). E’ codificata da UGA, che in presenza di una
particolare sequenza sul mRNA detta SECIS, al seguito dell’UGA o al 3’ non
tradotto, viene riconosciuto dal suo apposito tRNA anziché da un fattore di terminazione.
- Pirrolisina. E’ stata osservata in poche proteine di procarioti. E’ codificata da UAG, che in
presenza di una particolare sequenza sul mRNA detta PYLIS, viene riconosciuto dal suo apposito
tRNA anziché da un fattore di terminazione.

■ La trascrizione
La trascrizione è lo stadio della sintesi proteica in cui le informazioni sono trasferite dal DNA all’RNA,
tramite degli enzimi. Essa avviene tramite tre fasi distinte:
- fase di inizio, l’RNA polimerasi si lega al promotore e separa per un breve tratto i due filamenti di DNA,
partendo dal codone AUG, inserendo il primo nucleotide dell’RNA (detto promotore);
- fase di allungamento, l’RNA polimerasi si muove lungo il filamento di DNA e continua ad aggiungere
ribonucleotidi trifosfati alla estremità 3′ della catena di RNA nascente. L’energia per la reazione di
polimerizzazione e la formazione del legame fosfodiesterico è fornita dalla idrolisi dei nucleosidi
trifosfati. Alcune proteine (fattori di allungamento) accelerano la reazione legandosi all’RNA polimerasi.
Il DNA si srotola e si riavvolge continuamente a livello del sito di trascrizione, lasciando una zona
centrale in cui si forma una breve catena ibrida DNA-RNA;
- fase di terminazione, specifiche sequenze di DNA segnalano la fine della regione che deve essere
trascritta. Si verificano pertanto l’arresto della reazione di polimerizzazione e il distacco dell’enzima e
dell’RNA neosintetizzato.
Negli eucarioti vi è una quantità di DNA molto superiore a quella necessaria per la sintesi delle proteine.
Infatti, i geni degli eucarioti sono costituiti da sequenze di nucleotidi che codificano una proteina (esoni)
alternati a sequenze che non codificano nulla (introni). Quando un gene così strutturato viene trascritto, si
forma dapprima un lungo filamento di m-RNA (trascritto primario) che comprende esoni e introni.
Successivamente gli introni vengono rimossi e le estremità degli esoni saldate insieme (processamento
dell’mRNA). Solo a questo punto il filamento di m-RNA, detto maturo, passa per i pori della membrana
nucleare ed entra nel citoplasma, dove si lega ai ribosomi. Il DNA “modello” si riavvolge a formare la
doppia elica, oppure si lega a una nuova molecola di RNA-polimerasi per sintetizzare un nuovo filamento
di m-RNA.
Nonostante alcuni introni possono essere posizionati nel segmento 5’UTR o nel segmento 3’UTR, in
genere essi si trovano nell’interno della sequenza codificante o CDS (coding determining sequence)
costituita dalle triplette codoniche. Essi possono quindi separare esattamente un codone dal successivo
(fase 0), o situarsi all’interno di un codone, separando il primo nucleotide dagli altri due (fase 1) o i primi
due dal terzo (fase 2). Si osservano tutti e tre i casi, più spesso in fase 0 (circa 50% dei casi), poi in fase 1
(circa 30%), meno spesso in fase 2 (circa 20%). La fase degli introni riveste importanza nei fenomeni di
splicing alternativo, dove deve essere coerente per non causare la perdita della cornice di lettura corretta.
Autosplicing: Alcuni rari introni sono capaci di "autocatalisi", ovvero la parte intronica dell'RNA
trascritto è un "ribozima" che catalizza la propria escissione, con meccanismo diverso a seconda che
l’introne sia di I o di II gruppo. Lo splicing degli introni del gruppo I necessita di un nucleoside
guaninico, usato come nucleofilo: il suo –OH in 3’ si lega all’estremità 5’ dell’introne con un legame
fosfodiesterico 3’-5’ al primo nucleoside dell’introne. L’ossidrile in 3’ dell’esone precedente agisce da
nucleofilo completando la reazione e congiungendo i due esoni. Per gli introni del gruppo II, la reazione
è simile, ma il primo nucleofilo ad agire non è un nucleoside esterno, bensì un –OH in 2’ di un residuo
adenilato all’interno dell’introne. Questo meccanismo, definito "autocatalitico" perché può avvenire
anche in completa assenza di proteine, riguarda rari introni di alcuni geni degli organelli degli eucarioti
(gruppo II), dei geni nucleari codificanti l'rRNA di qualche eucariote (gruppo I) e di qualche gene
procariotico (entrambi i gruppi).
Splicing Catalizzato:Il terzo gruppo di introni, che è quello più comune e che riguarda la maggior parte
degli introni dei geni nucleari degli eucarioti, mostra lo stesso meccanismo di formazione del cappio
utilizzando una "A" interna all'introne, di solito prossima al 3', tuttavia necessita di complessi di RNA e
proteine chiamati Piccole Ribonucleoproteine Nucleari (small nuclear ribonucleoproteins o snRNP)
contenenti sequenze di 100-200 nucleotidi chiamati snRNA o RNA U. Quando il complesso si lega al
trascritto primario si forma lo spliceosoma. Nonostante che, anche in questo caso, la catalisi sia portata
avanti proprio da questi piccoli RNA, che agiscono quindi come ribozimi, il meccanismo è chiaramente
assistito e quindi non autocatalitico. Una quarta classe di introni, esemplificati da alcuni piccoli introni
ritrovati nei geni che codificano tRNA in eucarioti inferiori, mostrano meccanismo molto diverso, che
prevede un taglio dell'introne da parte di un enzima specifico endonucleasi, seguita da ricongiungimento
degli esoni da parte di una RNA Ligasi ATP-dipendente ATP. Esiste un ulteriore tipo catalizzato, chiamato
trans-splicing che salda due esoni di trascritti primari differenti.
Queste ultime classi sono riscontrabili solo negli eucarioti.

Trascrizioni dei Procarioti:


Un’unità trascrizionale, cioè la porzione di
DNA trascritta a partire da un dato elemento
promotore, contiene normalmente più geni
posti in tandem, ed è detta operone.
La trascrizione di tutti i tipi di RNA
(mRNA, tRNA, rRNA) è effettuata da
un’unica RNA polimerasi, assistita al
promotore da uno dei fattori di trascrizione
ed eventualmente controllata da proteine
regolatrici, che possono avere azione
attivante o repressiva.
L’mRNA è immediatamente pronto per
essere tradotto dai ribosomi, anche prima
che la sua sintesi sia conclusa (considerato che l’RNA viene trascritto nello stesso verso in cui verrà
tradotto dal ribosoma, e che il DNA e i ribosomi non sono separati da una membrana).

■ La traduzione
La traduzione è lo stadio della sintesi proteica in cui le istruzioni portate dall’m-RNA vengono tradotte
nella sequenza corretta di amminoacidi per formare una proteina. La traduzione (v. fig. 5.6) ha luogo nel
ribosoma. La traduzione ha inizio quando due codoni del filamento di mRNA si legano alla subunità
piccola di un ribosoma. Il primo codone è la tripletta di “inizio lettura” AUG, alla quale corrisponde
l’amminoacido metionina; il secondo codifica il primo vero amminoacido della proteina. I due t-RNA,
che hanno rispettivamente l’anticodone di inizio e l’anticodone complementare al secondo codone, si
legano alla subunità grande e si forma un legame peptidico (cioè il legame tra amminoacidi che forma le
proteine) tra i due amminoacidi trasportati. Il t-RNA di inizio si stacca dal ribosoma mentre il dipeptide (i
due amminoacidi uniti dal legame peptidico) rimane legato al secondo t-RNA. Il ribosoma si sposta sopra
un altro codone dell’m-RNA e una nuova molecola di t-RNA con il proprio amminoacido si dispone nel
sito di legame vuoto del ribosoma. Si crea un nuovo legame peptidico e il tripeptide si salda all’ultimo t-
RNA. Il processo di allungamento della catena polipeptidica prosegue in questo modo finché tutte le
triplette sono state tradotte e viene raggiunto il codone di “fine lettura”. La proteina completa si stacca dal
ribosoma e specifici enzimi scindono il legame con la metionina.

Traduzione nei Procarioti: il corretto legame tra il ribosoma e l'mRNA è facilitato dall'accoppiamento di
una serie di basi nota come sequenza di Shine-Dalgarno, che si trova tra 5 e 10 nucleotidi prima del
codone di avvio. L’RNA-transfer trasporta un amminoacido che viene legato alla catena polipeptidica in
crescita sul ribosoma. Il tRNA, sia che rechi metionina o N-formil-metionina, accoppia le sue basi con
quelle del codone di avvio coadiuvato da dei fattori di inizio
(IF) e si lega al sito P (peptide) del ribosoma formando un
ponte tra la subunità minore e la subunità maggiore. La sub-
unità maggiore forma quindi un complesso con quella minore
e i fattori di inizio vengono liberati. A questo punto avviene
l'allungamento. Un nuovo aminoacil-tRNA complessato con il
fattore di allungamento (una proteina GTP dipendente, EF-Tu
nei procarioti, αEF1 negli eucarioti, più semplicemente Tu)
entra sul sito A del ribosoma ed accoppia le sue basi con
quelle dell'mRNA. La subunità ribosomiale maggiore possiede
azione peptidil-transferasica, grazie alla quale crea un legame
peptidico tra gli amminoacidi vicini. Appena questo accade,
l'amminoacido sul sito P si stacca dal suo tRNA e la catena
peptidica in crescita si lega al tRNA sul sito A. Il ribosoma quindi si muove lungo l'mRNA spostando il
peptidil-tRNA dal sito A al sito P liberando nel contempo il tRNA vuoto. È possibile bloccare
specificamente la sintesi proteica facendo usare inibitori specifici quali l'anisomicina e la cicloesimide. La
traduzione può anche essere bloccata per effetto di mutazioni genetiche come ad esempio le mutazioni
con slittamento di fase (frame shift) le quali, possono essere ottenute con la delezione (o l'inserzione) di
un singolo paio di basi. Un ulteriore sistema di protezione della cellula da mutazioni, in particolare da
mutazioni puntiformi in grado di originare un codone di stop prematuro è rappresentato dal cosiddetto
complesso di giunzione esonica o EJC. Questo agglomerato di proteine in caso di normale traduzione
viene rimosso dal ribosoma nel suo normale avanzamento, ma resta sull'mRNA la cui traduzione sia stata
interrotta prematuramente, portandolo alla degradazione grazie al suo marchio

Tossine che inibiscono la sintesi proteica


Le tossine che inibiscono la sintesi proteica sono la tossina difterica, prodotta dal Corynebacterium
diphtheriae, la tossina A, prodotta da Pseudomonas aeruginosa, e la tossina di Shiga prodotta da Shigella
dysenteriae e le tossine Shiga-like (SLT o tossine Vero) prodotte dai ceppi di Escherichia coli
enteroemorragici.
La tossina difterica e la tossina A hanno un meccanismo molto simile: entrambe hanno una struttura A-B
ed entrambe hanno una attività ADP-ribosilante non dissimile da quella colerica, ma il bersaglio è la
proteina EF-2, fondamentale per la sintesi proteica. Il complesso EF-2-ADP-ribosio che ne risulta inattiva
l’allungamento della sintesi proteica, portando quindi a morte la cellula.
La tossina di Shiga e le SLT hanno invece un meccanismo molto diverso. Entrano nelle cellule per
endocitosi mediata da recettori ed hanno un’attività catalitica N-glicosidasica, il cui bersaglio è l’RNA
ribosomiale 28s, contenuto nella subunità 60s. Il taglio al 3′ dell’rRNA 28s causa un mancato legame, EF-
1 dipendente, dell’aminoacil-tRNA al sito A del ribosoma, bloccando quindi la sintesi proteica con
conseguente morte cellulare.

Biosintesi delle proteine destinate alla secrezione o all’ancoraggio di membrana


Il reticolo endoplasmatico (RE), oltre che nella sintesi dei lipidi di membrana, è coinvolto anche nella
sintesi delle proteine integrali di membrana. Come per i lipidi, le proteine vengono caricate per la prima
volta nelle membrane a livello del RE e in seguito fluiscono lungo il complesso di Golgi in direzione
della membrana plasmatica.

2. Replicazione del DNA: come si tramanda l'informazione genetica.

Codice Genetico
l codice genetico è il sistema per cui le informazioni genetiche codificate nel DNA arrivano a operare la
sintesi di tutte le proteine necessarie alla vita degli organismi. Il suo linguaggio si basa su sequenze dei
nucleotidi del DNA, che viene tradotto nella sequenza degli amminoacidi di una proteina. Le quattro
diverse basi azotate sono fondamentali per specificare i 20 amminoacidi. Utilizzando gruppi di 3
nucleotidi (triplette, o codoni) si ottengono 64 combinazioni diverse. Tre di queste triplette (dette triplette
nonsenso) non corrispondono a nessun amminoacido ma servono per segnalare la fine della catena
proteica (UAG-UAA-UGA). La tripletta AUG indica l’inizio della catena proteica; a essa corrisponde
anche l’amminoacido metionina. Si definisce gene la sequenza di triplette che codifica una proteina. Il
codice genetico è ridondante, poiché uno stesso amminoacido è codificato da più di una tripletta. Le
triplette che codificano lo stesso amminoacido sono molto simili e generalmente differiscono solo per
l’ultima delle tre basi. Ciò ha suggerito l’ipotesi che l’informazione fondamentale sia contenuta nelle
prime due basi e che la terza serva a garantire una maggiore precisione. Il codice genetico è universale,
dal momento che è identico in tutti gli esseri viventi (ogni tripletta ha lo stesso significato per tutti gli
organismi).

Struttura e dimensioni di genomi cellulari


Procarioti (Bacteria e Archaea): Tipicamente c’è un solo cromosoma nel citoplasma, contenente una
molecola di DNA circolare lungo da 0,5 a 10 milioni di paia di basi circa. Spesso possono essere presenti
anche uno o più plasmidi, piccoli DNA circolari accessori, costituiti da alcune migliaia di paia di basi.
Sono note eccezioni: alcuni procarioti con due o più cromosomi circolari, o un cromosoma lineare.
Eucarioti (unicellulari, piante, funghi, animali): Di regola c’è più di un cromosoma nel nucleo,
mediamente poche decine, anche se sono noti casi di parecchie centinaia e, all’altro limite, di uno solo.
Ciascun cromosoma contiene una molecola di DNA lineare. Nel nucleo può essere presente un solo
corredo di cromosomi diversi (la cellula si dice aploide), due serie (diploide), e sono i casi più frequenti,
o più (tri-, tetra-, esa-, …poli-ploide). Le dimensioni di un corredo aploide variano da una decina di
milioni di paia di basi circa (ad esempio i lieviti o qualche alga unicellulare) a un centinaio di miliardi
(alcune felci, i pesci polmonati e gli anfibi urodeli) o anche più in alcune amebe. Non si riscontra
relazione tra numero di cromosomi, lunghezza del loro DNA, e dimensioni del genoma (il paradosso C).
Al di fuori del nucleo è generalmente presente un certo numero di mitocondri, dotati di un proprio
minigenoma, costituito da una molecola di DNA circolare di circa 15000 – 100000 paia di basi.
I vegetali contengono anche un certo numero di cloroplasti, pure dotati di un proprio minigenoma,
costituito da una molecola di DNA circolare di circa 100000 paia di basi.
Al di là di questo schema base si riscontrano casi particolari. Alcuni unicellulari sono privi di mitocondri
(es.: Giardia lamblia), alcune alghe unicellulari (es. Guillardia theta) presentano due nuclei distinti
ciascuno con più cromosomi (il minore è detto nucleomorfo). I Ciliati (es. Tetrahymena), accanto al
nucleo normale, detto germinale o micronucleo, sviluppano secondariamente un secondo nucleo più
grande, detto somatico o macronucleo, contenente molte migliaia di minicromosomi a DNA lineare,
copie numerosissime di segmenti del DNA dei cromosomi del micronucleo. Le cellule salivari di
Drosophila replicano il proprio DNA a cascata una decina di volte senza disgiungerlo dando origine a
cromosomi giganti di oltre 1000 copie, detti politenici. Il batterio gigante Epulopiscium contiene un
numero molto elevato di copie del proprio genoma.

Il paradosso C dei genomi eucariotici


Nei procarioti numero di geni e dimensioni genomiche delle varie specie sono approssimativamente
proporzionali, in ragione di circa 1000-1200 pb/gene.
Le dimensioni genomiche (corredo aploide) nelle specie eucariotiche per contro variano enormemente
(da circa 107 a più di 1011) senza alcuna relazione con la complessità dell’organismo. Ad esempio, negli
unicellulari alcune amebe hanno le massime dimensioni genomiche mentre alcune alghe unicellulari e
alcuni lieviti le minime. Nelle piante superiori si va da circa 108 a circa 1011, e lo stesso succede con gli
animali. Questa osservazione è stata chiamata il Paradosso C (Complessità).
Il paradosso (in parte) rientra quando si scopre che la variazione nel numero di geni (che nella casistica
attuale, non vasta ma certamente significativa, vanno da circa 5000 a circa 30000) risulta molto più
contenuta e approssimativamente connessa alla complessità dell’organismo.
Il grosso della differenza nelle dimensioni genomiche è dovuto alla enorme variazione nella quantità di
DNA non codificante per proteine.

Replicazione DNA
Si definisce replicazione il processo di
duplicazione semiconservativa del
DNA. Il processo è definito
semiconservativo poiché le due nuove
doppie eliche di DNA sono formate
entrambe da uno dei vecchi filamenti e
da un nuovo filamento complementare.
La replicazione prende quando la DNA
primasi sintetizza un corto RNA
primer, quindi la DNA polimerasi
aggiunge nuove subunità nucleotidiche alla catena di DNA in allungamento. Altri enzimi e proteine sono
necessari per svolgere l’elica e stabilizzare i due filamenti separati. Le DNA elicasi svolgono la doppia
elica e le topoisomerasi impediscono la formazione di grovigli e nodi. La replicazione del DNA è
bidirezionale; inizia in un punto che prende il nome di origine di replicazione e da lì procede nelle due
direzioni opposte. Un cromosoma eucaristico può avere può origini di replicazione, quindi la sintesi di
DNA può avvenire in più punti contemporaneamente. La sintesi del DNA procede sempre in direzione 5’
→ 3’. Ciò richiede che un filamento, detto filamento in ritardo, sia sintetizzato in modo discontinuo, cioè
in piccoli tratti chiamati frammenti di Okazaki. La DNA polimerasi sintetizza corti RNA primer sul
filamento in ritardo e la DNA ligasi lega insieme i frammenti di Okazaki del Dna neosisntetizzato. Il
filamento antiparallelo, detto filamento guida, viene invece sintetizzato in maniera continua. La DNA-
polimerasi lega anche il gruppo fosfato di un nucleotide al desossiribosio del nucleotide seguente. Si
forma così un nuovo filamento di DNA complementare al DNA che fa da “stampo”. Nelle cellule
eucarioti la doppia elica di DNA si lega a particolari proteine, gli istoni, per formare fibre di cromatina.
Durante la divisione cellulare, la cromatina si avvolge su se stessa dando origine a masserelle molto
compatte, i cromosomi. Nelle cellule procarioti le due estremità della catena di DNA si congiungono e si
forma un unico filamento circolare. Nelle cellule procarioti, in cui il DNA è circolare, la replicazione
inizia in un solo punto e procede nelle due direzioni opposte, finché non è stato replicato tutto l’anello.
Nelle cellule eucarioti il processo avviene simultaneamente in diverse unità di replicazione, una dopo
l’altra lungo tutta la doppia elica di DNA; al termine, tutte le unità saranno congiunte.
Durante la replicazione, le DNA polimerasi effettuano una correzione di bozze ad ogni nucleotide
aggiunto rispetto al nucleotide stampo. Quando trova un errore nell’appaiamento di basi, la DNA
polimerasi rimuove immediatamente il nucleotide errato e inserisce quello corretto. Nella riparazione
degli errori di appaiamento (mismatch repair), degli enzimi riconoscono i nucleotidi appaiati in modo
errato e li rimuovono; le DNA polimerasi quindi inseriscono i nucleotidi mancanti. La riparazione per
escissione nucelotidica è comunemente utilizzata per riparale le lesioni al DNA causate dalle radiazioni
ultraviolette del sole o da sostanze chimiche dannose. Sono tre gli enzimi coinvolti: una nucleasi che
escinde il DNA danneggiato, una DNA polimerasi che aggiunge i nucleotidi corretti ed una DNA ligasi
che salda le rotture nello scheletro zucchero-fosfato. Le estremità dei cromosomi eucaristici, note come
telomeri, sono brevi sequenze ripetute di DNA non codificante, i telomeri si accorciano un po’ ad ogni
divisione cellulare, ma possono essere allungate dall’enzima telomerasi. In alcune cellule, la mancanza di
attività telomerasica può essere la causa dell’invecchiamento cellulare, per cui le cellule perdono la
capacità di dividersi dopo un certo numero di divisioni. La maggior parte delle cellule tumorali, incluse
quelle umane del cancro alla mammella, al polmone, al colon, alla prostata ed al pancreas, posseggono
telomerasi per mantenere intatta la lunghezza dei telomeri e probabilmente per resistere all’apoptosi.

Storia
Esperimento di Meselson-Stahl
Meselson e Stahl fecero crescere il batterio E. coli in un terreno minimo contenente
solo 15N. Il DNA 15N può essere separato dal DNA 14N usando la centrifugazione
all’equilibrio in gradiente di densità. Una soluzione di cloruro di cesio (CsCl) è
centrifugata ad alta velocità in modo che il cloruro di cesio formi in gradiente di
densità. Così il DNA 14N formerà una banda al di sotto della banda di DNA 15N.
I batteri marcati 15N erano trasferiti in un terreno contenente azoto nella forma
normale 14N ed erano lasciati replicare. Dopo un ciclo di replicazione in terreno
14N, tutto il DNA aveva una densità esattamente intermedia fra quella di DNA
completamente 15N e quella di DNA completamente 14N.
1) Se il modello conservativo di replicazione di DNA fosse corretto, dopo un ciclo
di replicazione si dovrebbero vedere due bande di DNA, una banda pesante
(contenente DNA parentale con entrambe le eliche di 15N) e una banda leggera
(contenente DNA figlio con entrambe le eliche 14N). il fatto che si trovasse DNA di
densità intermedia escludeva il modello conservativo.
2) Se il modello dispersivo di replicazione fosse giusto, tutto il DNA presente dopo
un ciclo di replicazione in 14N sarebbe di densità intermedia, e questo su il risultato
dell’esperimento.
Dopo un secondo ciclo di replicazione, il modello dispersivo prevedeva che i
segmenti di DNA della prima generazione sarebbero stati dispersi nelle doppie eliche di DNA prodotte (il
doppio della prima generazione): le molecole di DNA si dovrebbero trovare in una banda a metà strada
fra la posizione della banda a densità intermedia e quella della banda a densità leggera. Con cicli di
replicazione successivi, dovrebbe continuare ad esservi un’unica banda che via via diventa più leggera. In
realtà si possono osservare sempre due bande, una caratterizzata da DNA 14N/14N (leggera) e l’altra con
DNA 14N/15N che man mano diminuisce in numero. Queste osservazioni portarono alla conclusione che
il modello esatto di replicazione di DNA è il modello semiconservativo.

Procarioti vs eucarioti
I geni eucariotici ed i loro mRNA sono più complessi di quelli batterici. Dopo la trascrizione, alle
molecole di mRNA eucariotico viene aggiunto, all’estremità 5’, un cappuccio, una guanosina trifosfato
modificata. Molti messageri vengono modificati dall’aggiunta al terminale 3’ di una coda di poli-A, una
serie si nucleotidi adenilici. Queste modifiche sembrano proteggere le molecole di mRNA eucaristiche
dalla degradazione, aumentandone la vita media rispetto a quelle batteriche. In molti geni eucaristici, le
regioni codificanti, chiamate esoni, sono interrotte da regioni non codificanti, chiamate introni. Sia gli
introni che gli esoni sono trascritti, ma gli introni vengono successivamente rimossi dal trascritto
primario, o pre-mRNA, e gli esoni vengono riuniti insieme per costruire una sequenza codificante
continua. Diversamente dalle cellule eucaristiche, nelle cellule batteriche la trascrizione e la traduzione
sono accoppiate; infatti, i ribosomi batterici si legano all’estremità 5’ dell’mRNA in crescita prima che il
messaggio dia stato completamente sintetizzato. Fino a 15 ribosomi possono legarsi ad un singolo
mRNA, formando un poliribosoma. I retrovirus sono virus che sintetizzano il DNA da uno stampo di
RNA, il flusso di informazione genetica è invertito dall’attività dell’enzima trascrittasi inversa. L’HIV è
un esempio di retrovirus.

La frammentazione del DNA


Il DNA in natura è una molecola ad altissimo peso molecolare, generalmente da milioni a centinaia di
miliardi di Dalton (da 104 a 109 coppie di basi). Per frammentarlo la natura ha evoluto numerosissime
deossiribonucleasi o DNAasi, molte delle quali hanno trovato largo impiego in laboratorio. Anche l’RNA
può essere frammentato da numerose RNAasi.
Le nucleasi sono enzimi capaci di idrolizzare legami fosfoesterei degli acidi nucleici. In natura si sono
evolute numerosissime nucleasi che si differenziano per la natura del substrato, e per il grado di pecificità
rispetto alla sequenza nucleotidica.
DNAasi (DNAases) – agiscono solo sul DNA
RNAasi (RNAases) – agiscono solo sull’RNA
Esonucleasi (Exonucleases) – possono agire solo sul nucleotide terminale di una catena lineare,
liberandolo, alcune solo al terminale 5’, altre solo al terminale 3’, qualcuna ad entrambi
Endonucleasi (Endonucleases) – possono agire solo su legami fosfoesterei interni ad una catena, lontani
dal terminale per almeno alcuni nucleotidi
Nucleasi per filo singolo (single-strand Nucleases) – possono agire solo su legami fosfoesterei di
nucleotidi le cui basi non sono appaiate.
Nucleasi per doppio filamento (double-strand Nucleases) – possono agire solo su legami fosfoesterei
interni ad un duplex di filamenti complementari. Normalmente idrolizzano un legame su ciascuno dei
due filamenti, in posizione corrispondente (lasciando terminali tronchi o “blunt ends”, o sfalsata di
qualche posizione (lasciando alcuni nucleotidi sporgenti a filo singolo, al 5’ o al 3’, su entrambi i
frammenti, terminali adesivi o “sticky ends”).
Più spesso il gruppo fosfato viene lasciato al terminale 5’, ma da alcune al 3’.

Gli enzimi di restrizione


Gli enzimi di restrizione sono delle endonucleasi, enzimi della famiglia delle nucleasi, che i batteri
utilizzano per difendersi dai virus che li infettano, facendo a pezzi il DNA virale.
La nomenclatura è del tipo EcoRI, dove la prima lettera corsiva maiuscola è l’iniziale del genere
batterico d’origine (Escherichia), le due successive minuscole sono le prime due lettere della specie (coli)
salvo deroghe per casi di omonimia, e il resto distingue i diversi enzimi via via identificati nella stessa
specie. Gli enzimi di restrizione presentano la notevole peculiarità di tagliare il DNA solo in
corrispondenza di particolari sequenze di basi (in genere 4, 6 o 8 basi) che essi riconoscono (siti di
restrizione). I siti di restrizione sono quasi tutti palindromi, cioè la successione delle loro basi presenta
una sequenza ad essa complementare che risulta uguale se letta al contrario. Ad esempio la successione
ACTAGT ha come complementare la successione TGATCA (che è uguale alla precedente letta al
contrario). Per convenzione le sequenze di riconoscimento sono scritte da sinistra a destra in direzione 5’
→ 3’. Quindi ACTAGT rappresenta la sequenza 5’- ACTAGT -3’.
In un filamento di DNA si trovano naturalmente numerosi siti di riconoscimento per una particolare
endonucleasi. In questo modo le endonucleasi tagliano il DNA in molti segmenti, detti frammenti di
restrizione. Gli enzimi di restrizione possono tagliare il DNA in due modi. Alcuni enzimi tagliano il
DNA lasciandone le estremità piatte, altri lasciando le estremità sfalsate (alcuni con il filamento 5’ più
lungo del filamento 3’, altri viceversa). Gli enzimi di restrizione che generano estremità sfalsate sono
quelli comunemente usati in ingegneria genetica. Infatti tutte le estremità generate dagli enzimi che
operano un taglio sfalsato, siano esse sporgenti in 5’ o in 3’, sono “coesive” (o adesive o appiccicose,
sticky ends), cioè possono formare ponti idrogeno tra le due code a filamento singolo complementari. Nel
caso l’enzima di restrizione produca estremità piatte è possibile aggiungere una “coda” (tailing) sfalsata,
usando l’enzima terminal transferasi, che aggiunge nucleotidi alle estremità 3’ del DNA, generando
estremità coesive. Le estremità coesive facilitano la reazione di ricomposizione della DNA ligasi.
In questo modo, mescolando frammenti di restrizione, anche provenienti da DNA diverso, tagliati con la
medesima endonucleasi, i frammenti aderiscono spontaneamente con le loro estremità coesive per un
tempo sufficientemente lungo da rendere efficace l’azione di saldatura (formazione dei legami fosfo-
diestere) della DNA-ligasi.

Nucleasi di restrizione di tipo II “classico”


- Sequenza bersaglio: 4 o 6 (raramente 8) paia di basi palindromiche, per lo più contigue, di rado
separate al centro da una o poche paia di basi variabili. Talvolta è possibile l’ambiguità tra le due purine
o le due pirimidine.
- In accordo con la simmetria binaria del sito bersaglio sono proteine omodimeriche con i domini di
riconoscimento e di taglio nella stessa subunità.
- Richiedono Mg2+ come cofattore.
- Tagliano in modo simmetrico: o al centro, generando terminali tronchi (blunt ends) o fuori centro,
generando due brevi sporgenze a filo singolo, terminali adesivi (sticky ends), o al terminale 5’ o al 3’. Il
gruppo fosfato rimane quasi sempre al terminale 5’, ma sono anche note nucleasi che lo lasciano al 3’.
Le corrispondenti metilasi metilano due delle basi bersaglio in modo simmetrico, quasi sempre adenine
metilate sull’amminogruppo o citosine metilate sull’anello in posizione 5.
Il sequenziamento del DNA
Il sequenziamento del DNA è la determinazione dell'ordine dei diversi nucleotidi che costituiscono l'acido
nucleico. E’ un metodo chimico oggi sostanzialmente obsoleto, ma una breve descrizione può essere
ancora didatticamente interessante. Il metodo enzimatico di Sanger, oggi di gran lunga prevalente, sarà
descritto più avanti.

Le due basilari tecniche elettroforetiche per la separazione di frammenti di DNA (e di RNA).


Elettroforesi su gel di poliacrilammide (PAGE):
È una tecnica che serve principalmente per analizzare e separare le proteine, sfruttando le dimensioni e la
carica delle proteine stesse, e nel sequenziamento del DNA. Il gel è ottenuto per polimerizzazione in
soluzione acquosa tamponata di acrilammide con una piccola percentuale di bisacrilammide tra due vetri
con intercapedine di 0,5–2 mm mantenuti verticalmente. Il gel è costituito da una rete tridimensionale
covalente del polimero ed è sostanzialmente un gel irreversibile. Il gel di poliacrilammide è composto da
due parti: lo stacking gel e il running gel. Il primo, posto nella parte superiore, rappresenta la porzione di
gel all'interno del quale vengono creati i pozzetti di caricamento; inoltre consente di "impaccare" tutto il
materiale caricato in modo che arrivi uniformemente sul fronte di corsa. Il secondo invece è la porzione di
gel dove avviene la vera e propria corsa elettroforetica che consente di separare il campione di interesse in
base alle sue dimensioni. Stacking gel e running gel hanno composizione uguale ma presentano una
differente concentrazione di acrilammide (solitamente inferiore nello stacking gel).

Elettroforesi su gel di agarosio:


È una tecnica classicamente utilizzata per analizzare e separare acidi nucleici. Questa tecnica sfrutta le
cariche presenti nelle molecole di DNA o RNA (caricate negativamente) per farle migrare, in un campo
elettrico, attraverso un gel di agarosio. Il gel funge da setaccio, essendo costituito da una rete di pori, i
quali consentono di separare le molecole in base alla loro grandezza: quelle più piccole attraversano più
velocemente i pori rispetto a quelle più grandi quindi si avrà una separazione in funzione della velocità. Il
gel è ottenuto colando su un contenitore orizzontale una soluzione calda di agarosio (un polisaccaride
algale), che per raffreddamento gelifica in seguito alla formazione di interazioni non covalenti tra le
catene del polimero. Il gel è pertanto reversibile e può essere riportato a soluzione tramite successivo
riscaldamento.

Radioisotopi quali traccianti in biochimica e biologia molecolare


Un radiotracciante è una sostanza contenente un radionuclide utilizzata in modo da poter studiare i vari
processi scientifici. Se il nucleo prodotto del decadimento
radioattivo non è radioattivo allora il fenomeno segue la semplice
legge cinetica del I° ordine, ovvero di decadimento esponenziale:
N = N0exp(-k.t)
dove
N è il numero di nuclei al tempo t
N0 è il numero di nuclei al tempo iniziale t = 0
k è la costante cinetica
Il tempo di semivita fisico è T1/2 = (ln2/k)
In un campione contenente N nuclei radioattivi ne decadono in un
secondo DN ~ N.k
Pertanto il numero di nuclei che produce 1 Bq di attività è N(1Bq) ~ 1/k ~ T1/2/ ln2
Un campione radioattivo corrisponde a 1 Bq di attività quando produce 1 evento di decadimento al
secondo. Il Becquerel (Bq) è l’unità del Sistema Internazionale.
Molto usato per ragioni storiche è il Curie (Ci) corrispondente a 37 miliardi di Bq
Sequenziamento del DNA con il metodo di Sanger
Il metodo Sanger è un metodo cosiddetto enzimatico, poiché richiede l'utilizzo di un enzima; il principio
della tecnica sviluppata da Fred Sanger si basa sull'utilizzo di nucleotidi modificati (dideossitrifosfato,
ddNTPs) per interrompere la reazione di sintesi in posizioni specifiche. I nucleotidi dideossitrifosfato
sono molecole artificiali corrispondenti ai nucleotidi naturali, ma si differenziano per l'assenza del gruppo
idrossilico sul carbonio 2' e 3' della molecola. I dideossinucleotidi, a causa della loro conformazione,
impediscono che un altro nucleotide si leghi ad essi, in quanto non si possono formare legami
fosfodiesterici. Il protocollo classico richiede un templato di DNA a singolo filamento, un primer per
iniziare la reazione di polimerizzazione, una DNA polimerasi, deossinucleotidi e dideossinucleotidi per
terminare la reazione di polimerizzazione. I nucleotidi modificati (ddNTPs)o il primer devono essere
marcati (radioattivamente o per fluorescenza) in modo da poter visualizzare le bande dei frammenti di
DNA neosintetizzato dopo aver effettuato l'elettroforesi. Il campione di DNA da sequenziare viene diviso
in quattro reazioni separate, ognuna delle quali contiene la DNA polimerasi e tutti e 4 i
deossiribonucleotidi (dATP, dCTP, dGTP, dTTP). Ad ognuna di queste reazioni viene poi aggiunto solo
uno dei quattro nucleotidi dideossi (ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP) in quantità stechiometricamente
inferiore per permettere una elongazione del filamento sufficiente per l'analisi. L'incorporazione di un
dideossinucleotide lungo il filamento di DNA in estensione ne causa la terminazione prima del
raggiungimento della fine della sequenza di DNA stampo; questo dà origine ad una serie di frammenti di
DNA di lunghezza diversa interrotti in corrispondenza dell'incorporazione del dideossinucleotide , che
avviene casualmente quando esso è utilizzato dalla polimerasi in luogo di un nucleotide deossi.
I frammenti generati da queste reazioni vengono poi fatti correre su gel di poliacrilammide-urea che
permette la separazione dei vari frammenti con una risoluzione di un nucleotide. Ognuna delle 4 reazioni
è corsa su pozzetti vicini, dopodiché le bande sono visualizzate su lastra autoradiografica o sotto luce UV,
e la sequenza viene letta direttamente sulla lastra o sul gel, a seconda del tipo di marcatura dei nucleotidi
dideossi. Esistono quattro diversi modi di marcare i frammenti di Sanger:
- Il primer è reso radioattivo al fosfato 5’ tramite g-ATP marcato e kinasi;
- I frammenti di Sanger sono resi radioattivi per incorporazione di a-dNTP marcato;
questi metodi richiedono quattro reazioni di polimerizzazione separate e quattro corsie elettroforetiche
- Il primer è reso fluorescente con quattro fluorofori diversi, questo metodo richiede quattro reazioni di
polimerizzazione separate, ma basta un’unica corsia elettroforetica;
- Ciascun ddNTP è reso fluorescente con un fluoroforo diverso, questo metodo consente anche di
effettuare tutte le reazioni in un’unica provetta.

La PCR, o reazione di polimerizzazione a catena, permette di sequenziale anche minime quantità di DNA
prelevate da campioni essicati o conservati nei musei e anche da alcuni fossili; dopo aver selezionato per
l’analisi una molecola proteica o un appropriato segmento di acido nucleico, i sistematici determinano
l’esatta sequenza che compone la molecola così da poter paragonare direttamente la struttura primaria
delle proteine.

Applicazione della PCR: DNA fingerprinting


Il fingerprinting del DNA (o impronta digitale del DNA) è una tecnica che permette l’identificazione
individuale a livello molecolare, analizzando le caratteristiche uniche del DNA di un individuo.
A differenza del fingerprinting classico, che analizza un tratto fenotipico, la tipizzazione del DNA
analizza direttamente informazione genotipica. La tecnica si basa sulla presenza nel DNA umano di
sequenze altamente variabili che fanno sì che non esistano due individui (a parte i gemelli identici) con la
stessa identica sequenza. La tecnica del DNA fingerprinting si basa sull’analisi di due tipi di
sequenze altamente variabili presenti nel genoma umano, le VNTR (Variable Number Tandem Repeats), e
le STR (Short Tandem Repeats). Combinando le informazioni che derivano dall’analisi di più loci VNTR
o STR si ottiene un profilo distintivo di una persona, cioè il suo DNA fingerprint.
Alcune applicazioni:
-forense
-diagnosi di paternità
-compatibilità nella donazione di organi
-identificazione di resti umani
-analisi di alimenti
-studi sulle migrazioni di popolazioni umane
-problemi genealogici

RT-PCR (Reverse Transcriptase – Polymerase Chain Reaction):


Serve a rilevare l’eventuale presenza di esigue quantità di un dato RNA, o ad amplificare in DNA un
determinato RNA che si sa essere presente. Alla normale amplificazione di DNA tramite PCR standard
viene premesso un trattamento con una trascrittasi inversa. In presenza del dato RNA e di uno dei due
primer la RT sintetizza il DNA complementare o copia (cDNA). Questo è quindi amplificato
sottoponendolo ai normali cicli di PCR.
PCR quantitativa competitiva
Serve a valutare quantitativamente la presenza di un determinato segmento di DNA.
Alle soluzioni campione, contenenti una quantità non nota del DNA ricercato, vengono aggiunte quantità
note di un DNA stampo di riferimento il più possibile simile al frammento da amplificare, solo di
lunghezza un po’ diversa per poterlo distinguere nella successiva elettroforesi. Quindi si paragonano le
intensità delle bande ottenute dal
frammento ricercato e dal riferimento.
La PCR real-time, (rtq-PCR), è un
metodo di amplificazione (reazione a
catena della polimerasi o PCR) e
quantificazione simultanee del DNA. Il
DNA è amplificato da reazioni a catena
della DNA-polimerasi. Dopo ogni turno di
amplificazione, il DNA è quantificato. I
metodi comuni di quantificazione
includono l'uso delle colorazioni
fluorescenti che intercalano con il DNA
doppio-filamento (ds) e gli oligonucleotidi
modificati del DNA (denominati sonde)
che sono fluorescenti una volta ibridati con
un DNA. Spesso la PCR real-time è
combinata con la PCR Retro
Trascrizionale (RT-PCR) per quantificare i
livelli di espressione di specifici RNA: la
retro-trascrizione (o trascrizione inversa) produce del DNA complementare a singolo filamento detto
cDNA (complementary DNA) mantenendo inalterati i rapporti relativi di concentrazione delle diverse
specie degli RNA. In questo modo è possibile, ad esempio, misurare l'espressione relativa di un gene ad
un tempo particolare, o in una cellula o in un tipo particolare di tessuto. La combinazione di queste due
tecniche è spesso denominata RT-PCR quantitativa.

La sintesi chimica del DNA (metodo in fase solida tramite


fosforoammiditi, vedi struttura immagine)
I sintetizzatori di DNA rendono possibile la sintesi di
oligonucleotidi (≤60 nucleotidi) a singolo filamento
Sintesi in fase solida
1. reazioni in un unico reattore
2. Non necessita purificazioni intermedie
3. facilità di lavaggio
4. possibilità di usare reagenti in eccesso
5. possibilità di automazione
6. Permette di ottenere elevate quantità di prodotto (mg)
Direzione sintesi 3’ 5’ → Il primo nucleoside aggiunto (base 1) è anche l’ultimo dell’oligonucleotide se,
come consuetudine, si legge la sequenza del DNA in direzione 5’ 3’. La sintesi chimica del DNA procede
in direzione opposta rispetto a quello che avviene nelle cellule.

3. Mutagenesi, riparazione, eventi ricombinativi: come i geni e i genomi possono cambiare.


I tipi diversi di mutazione possono andare dalla completa distruzione della struttura di un cromosoma ad
un cambiamento in una singola coppia di basi. Una sostituzione di base può compromettere la funzione di
una proteina se altera un codone che quindi o specificherà un aminoacido diverso (mutazione missenso) o
darà origine ad un codone di stop (mutazione non senso). La sostituzione di una basa può avere effetti
minimi se l’aminoacido non è cambiato oppure se viene sostituito con un altro chimicamente simile.
L’inserzione o la delezione di una o due coppie di basi in un gene invariabilmente distrugge la funzione
della proteina, poiché porta ad una mutazione frameshift, che cambia completamente la sequenza dei
codoni a valle della mutazione. Le mutazioni possono anche verificarsi a causa di sequenze di DNA
mobili, note come trasposoni, che possono saltare all’interno di un gene. Molti di essi sono
retrotrasposoni, che si replicano mediante la formazione di un intermedio a RNA; la trascrittasi inversa
poi li converte nella loro sequenza di DNA di origine prima che possano ingerirsi in un gene.

Mutazioni per delezioni estese o per duplicazioni di segmenti


Mutazioni puntiformi
Mutazioni di sostituzione: una coppia di basi viene invertita o sostituita dall’altra:
a. Transizioni: una purina (o una pirimidina) viene sostituita dall’altra
b. Transversioni: una purina viene sostituita da una pirimidina (e viceversa)
Microdelezioni e microinserzioni: una o pochissime coppie di basi vengono perse o acquisite.
Ricombinazioni:
Ricombinazioni omologhe: avvengono per scambio di segmenti genomici a livello di
sequenze altamente omologhe (cioè identiche o quasi), quali che siano
Ricombinazioni sito-specifiche: avvengono per scambio di segmenti genomici a livello di
sequenze omologhe ben definite
Trasposizioni:
Trasposizioni semplici: un segmento genomico viene spostato da un sito ad un altro nel genoma
Trasposizioni replicative: un segmento genomico viene copiato e la copia trasposta in un nuovo
sito del genoma
Retrotrasposizioni: un segmento di RNA viene retrotrascritto, cioè copiato in DNA a doppio
filamento e questo viene inserito in un sito del genoma.

Le mutazioni sono in natura eventi di per sé puramente casuali, cioè non sono condizionate dall’effetto
che eventualmente produrranno. (Ma la mutabilità in sé può esserlo…).
Le ricombinazioni sono in genere eventi complessi biologicamente programmati, cioè destinati a
succedere di norma in date condizioni al fine di produrre un determinato effetto. Occasionalmente
possono attuarsi in modo erroneo (ricombinazioni illeggittime, causando a volte duplicazioni geniche,
delezioni, traslocazioni o fusioni cromosomiche). Le trasposizioni sono eventi più o meno sporadici
dagli effetti sostanzialmente non programmati, anche in ragione del fatto che il sito di inserzione è
definito da poche copie di basi e quindi comune nel genoma. Infine accadono sporadicamente
errori di segregazione durante la meiosi o la mitosi con conseguenti fenomeni di alterazione del corredo
cromosomico (per raddoppio o perdita di singoli cromosomi – aneuploidie - o raddoppi dell’intero
corredo - poliploidizzazione).

Cause più significative degli eventi mutazionali


- Intrinseci alla natura delle basi e della replicazione:
- Eventi di tautomerizzazione delle basi
- Eventi di slittamento durante la replicazione
- Dovuti ad agenti fisici:
- Da raggi UV
- Da radiazioni e.m. ad alta energia: raggi X e raggi g
- Da particelle ad alta energia: raggi a e raggi b
- Dovuti ad agenti chimici:
- Da agenti alchilanti
- Da agenti deamminanti
- Da agenti intercalanti
- Da agenti ossidanti (anche intrinseci al metabolismo)
- Da agenti mimetici delle basi
Effetti degli eventi modificatori del genoma: mutazioni non risolte dai sistemi di riparo del DNA,
nonché eventi ricombinativi:
Sugli organismi unicellulari e sulla linea germinale degli organismi pluricellulari
a) Conseguenze funzionali incompatibili con la vita (morte cellulare o mancato sviluppo
dell’organismo pluricellulare)
b) Conseguenze funzionali peggiorative dell’adattamento all’ambiente (minor successo riproduttivo
c) di conspecifici nell’ambiente)
d) Assenza di conseguenze funzionalmente rilevanti (mutazioni neutre)
e) Conseguenze funzionali migliorative dell’adattamento all’ambiente (maggior successo
riproduttivo di conspecifici nell’ambiente)
I punti b e d sono l’oggetto della selezione naturale darwiniana, la c è alla base del fenomeno della
deriva genica. Entrambi contribuiscono all’evoluzione dei viventi.
Sulle linee cellulari somatiche degli organismi pluricellulari:
1. Morte cellulare (per apoptosi)
2. Accumulo di mutazioni in geni rilevanti per il controllo del ciclo cellulare (sviluppo di tumori)
3. Invecchiamento dell’organismo.

Riparazione dei danni al DNA


La riparazione del DNA è un processo che opera costantemente nelle cellule; essa è essenziale alla
sopravvivenza in quanto protegge il genoma da danni e mutazioni nocive. Nelle cellule umane, sia le
normali attività metaboliche che i fattori ambientali (quali i raggi UV) possono causare danno al DNA,
determinando almeno 500000 singole lesioni molecolari per cellula al giorno. Tali lesioni provocano
danno strutturale alla molecola di DNA, e possono alterare in maniera drammatica il modo in cui la
cellula legge le informazioni contenute nei suoi geni. Di conseguenza, il processo di riparazione del DNA
deve lavorare in continuazione, per correggere qualsiasi danno nella struttura del DNA.
Quando la cellula invecchia, tuttavia, la velocità di riparazione del DNA decresce fino a che non può
tenere più il passo con la creazione del danno al DNA. A quel punto la cellula va incontro ad uno dei tre
possibili destini:

1. Uno stato di dormienza irreversibile, detto senescenza.

2. Il suicidio della cellula chiamato apoptosi o morte cellulare programmata.

3. La carcinogenesi, ossia la formazione del cancro.

La maggior parte delle cellule del corpo diviene inizialmente senescente. Poi, dopo un danno irreparabile
al DNA, va incontro ad apoptosi. In tal caso, l'apoptosi rappresenta un meccanismo di ultima istanza per
prevenire la trasformazione carcinogenica di una cellula, pericolosa per l'organismo.
Quando le cellule divengono senescenti, le alterazioni nella biosintesi e nel turnover determinano una
minore efficienza nel loro funzionamento, causando inevitabilmente malattia. La capacità di riparazione
del DNA in una cellula è vitale per l'integrità del suo genoma e quindi per il normale funzionamento della
cellula stessa e di tutto l'organismo. Molti geni, originariamente ritenuti capaci di influenzare la durata
della vita, si sono dimostrati coinvolti nella riparazione e nella protezione dal danno al DNA.
Errori nella correzione delle lesioni in cellule che producono gameti danno origine ad una progenie
mutata e quindi possono influenzare la velocità di evoluzione.

Essendo il DNA naturalmente soggetto a inevitabili danni molecolari, la natura ha evoluto numerosi
sistemi enzimatici di riparazione.
Alcuni possono essere definiti di
riparazione diretta: un enzima ripristina
la forma normale della base o delle basi
chimicamente alterate dall’evento anomalo.
Altri richiedono l’azione coordinata di più
enzimi: i due sistemi più noti sono:
-riparazione per escissione della base, in
cui l’evento iniziale è la rimozione della
base chimicamente alterata da parte di una
N-glicosilasi, a cui segue la rimozione del
resto del nucleotide e il suo rimpiazzo ad
opera di una DNA-polimerasi di riparo (ad
es. la DNA polimerasi I di E.coli).
-riparazione per escissione di nucleotidi,
in cui vengono idrolizzati enzimaticamente legami fosfoesterei alcune unità a monte e a valle del sito di
danno e un segmento di alcuni nucleotidi comprendente il danno viene rimosso, quindi la ricostruzione
avviene come nel caso precedente.
NB. La rottura spontanea del legame N-glicosidico tra base e zucchero non è un evento rarissimo nel caso
delle purine e il sito apurinico può dare adito al riparo.
La riparazione di una lesione al DNA può anche essere coordinata con eventi di tipo ricombinativo, in
particolare durante la replicazione del DNA.

4. Evoluzione molecolare: come i geni e i genomi cambiano sui tempi lunghi.

Teoria endosimbiontica
L'ipotesi è che alcuni organismi biologici furono ingeriti da
altri organismi e poiché ne trassero un vantaggio
evoluzionistico di sopravvivenza reciproco, svilupparono
una relazione simbiotica permanente che nelle generazioni è
divenuta indissolubile e imprescindibile; come esempio
viene postulato che, nel passato remoto del precambriano, un
batterio aerobico (che richiede ossigeno) fu ingerito da un
batterio anaerobio (possibilmente avvelenato da ossigeno)
acquisendo un vantaggio reciproco e che continuando la loro
relazione mutualistica abbiano superato
evoluzionisticamente gli altri organismi in quell'ambiente; nel tempo il batterio interno ha perso o
spostato materiale genetico nel nucleo dell'ospite, per la codifica di tutto ciò che non era più necessario o
superfluo. Secondo questa teoria, gli endosimbionti cedono evoluzionisticamente parte delle loro
informazioni genetiche all'ospite che dedica parte del proprio materiale genetico per codificare proteine
dedicate al simbionte permanente che inoltre perde parte delle informazioni (e funzioni) non necessarie
alla sua condizione di organismo stabilmente ospitato, a differenza dei simbionti che mantengono il
proprio codice integro. Il processo attraverso il quale alcune informazioni genetiche siano passate dal
simbionte all'ospite pare che sia la codifica delle proteine per la replicazione, trascrizione, divisione
cellulare, trasporto, regolazione, e trasmissione dei segnali del batterio, rimpiazzata dalla proteina
dell'ospite, che rende superflua la sua codifica nell'endosimbionte, e di conseguenza non più necessaria,
l'informazione scompare così legando l'endosimbionte per la sua sopravvivenza alla cellula ospite, in
pratica ne viene preso il controllo. Un organismo di questo tipo acquisisce un vantaggio evoluzionistico
consistente nel fatto di espandere enormemente il numero di ambienti nei quali può sopravvivere.
Mitocondri → organuli delle cellule eucariotiche, si originarono come organismi procarioti esterni,
introdottisi nella cellula come endosimbionti, circa 1,5 miliardi di anni addietro. I mitocondri si sarebbero
sviluppati da proteobacteria, alcune prove, sono ad esempio:
 I mitocondri contengono DNA diverso da quello del nucleo cellulare, circolare, con ribosomi
propri e hanno una doppia membrana. I mitocondri non hanno istoni ed i loro ribosomi sono
sensibili ad alcuni antibiotici, inoltre sono organelli semiautonomi in quanto replicano, per
scissione binaria, autonomamente rispetto alla cellula.
 Sono circondati da due o più membrane, la più interna delle quali mostra la presenza di molecole
di cardiolipina ed assenza di colesterolo, la sua composizione è simile a quella di una membrana
cellulare procariotica.

L’evoluzione è, in sintesi, il cambiamento genetico di una popolazione. I principali fattori coinvolti


dell’evoluzione sono dunque: popolazione, variabilità e selezione.
■ La popolazione
La popolazione è l’insieme di individui di una stessa specie che vivono in una medesima area. Ogni
individuo possiede un corredo di geni che costituisce il suo genotipo e, interagendo con l’ambiente, ne
definisce il fenotipo, cioè i caratteri morfologici e comportamentali. L’insieme dei geni di tutti gli
individui di una popolazione costituisce il pool genico della popolazione; la frequenza allelica è invece la
proporzione con cui i diversi alleli sono presenti nella popolazione.
■ La variabilità
In un individuo le fonti della variabilità genica sono le mutazioni e la ricombinazione genetica durante la
riproduzione sessuale. Le mutazioni sono rari cambiamenti dell’informazione genetica: molti non hanno
effetti immediati sull’organismo, altri sono dannosi e pochi sono benefici: non sono quindi la causa
primaria dell’evoluzione, ma sono fonte di nuovi alleli, su cui possono intervenire altri agenti
dell’evoluzione. La ricombinazione genetica si produce durante la riproduzione sessuale all’atto della
meiosi, quando i cromosomi omologhi sono distribuiti a caso nei gameti; oppure durante il crossing-over,
con scambio di porzioni di cromosomi; o infine all’atto della fecondazione, per l’unione casuale di
un gamete maschile e uno femminile. In una popolazione, fonti di variabilità sono la migrazione e
la deriva genetica. La migrazione è intesa come flusso di geni tra popolazioni (e non solo “spostamento”
fisico di una popolazione): per esempio, la “migrazione” di un maschio dominante in un nuovo
branco fornisce nuovi geni al pool genico del branco. La migrazione può distribuire alleli vantaggiosi
nelle diverse popolazioni di una specie e allo stesso tempo contribuisce a mantenere le caratteristiche
della specie in tutto il territorio. La deriva genetica è la fluttuazione della frequenza allelica in una piccola
popolazione dovuta a un evento casuale. Nel meccanismo detto a “collo di bottiglia” l’evento casuale
è determinato da una notevole riduzione del numero degli individui della popolazione (per esempio, per
malattia o carestia): se la popolazione non si estingue, la frequenza allelica delle future generazioni sarà
determinata dal patrimonio dei pochi individui rimasti. Analogo è “l’effetto del fondatore”: se pochi
individui colonizzano una nuova zona e rimangono isolati, da quei pochi pionieri deriverà una nuova
popolazione con frequenze alleliche diverse da quella di origine. In una popolazione ampia è meno
probabile che questo alteri le frequenze geniche in modo da determinare un cambiamento apprezzabile
nella popolazione, cioè un’evoluzione. In una popolazione di pochi individui, invece, la frequenza di
alcuni alleli è bassa, per cui avvenimenti casuali possono facilmente eliminarli dal pool genico.
■ La selezione naturale
Uno dei meccanismi cardinali della teoria evolutiva è la selezione naturale: l’insieme dei processi che
all’interno di una popolazione consentono ad alcuni individui di sopravvivere e riprodursi. Gli individui
in cui si manifesta un carattere favorevole all’ambiente possiedono un maggiore valore adattativo, o
fitness, e sono dunque “selezionati”: hanno cioè più possibilità di riprodursi rispetto al resto della
popolazione e nelle generazioni successive sarà presente un maggior numero di individui che possiedono
quel carattere “favorevole” (riproduzione differenziale). In questo modo la selezione naturale porta a una
graduale modificazione della composizione genetica della popolazione, nella quale i caratteri con
maggiore fitness si manifesteranno con frequenza sempre maggiore. Nella popolazione si verifica allora
una pressione di selezione che modifica la distribuzione dei fenotipi, cambiando la posizione nella
popolazione del carattere medio più frequente. La selezione naturale non provoca cambiamenti genetici
negli individui, ma, agendo sulla loro possibilità di sopravvivenza e sulla capacità riproduttiva, controlla
indirettamente la variabilità genetica, per cui l’evoluzione si manifesta nella popolazione. I cambiamenti
evolutivi non sono necessariamente “buoni” o finalizzati, ma solo preferibili in quel momento e in
quell’ambiente: il risultato della selezione naturale è quindi “solo” l’adattamento all’ambiente, sia alla sua
componente abiotica (caratteristiche fisico-climatiche), sia a quella biotica (costituita dagli organismi).
5. La tecnologia del DNA ricombinante: quadro introduttivo.

Il DNA ricombinante è un frammento di DNA che può essere modificato e inserito in altre cellule per
essere copiato più volte (amplificato) ed espresso, è ottenuto dalla combinazione di materiale
genetico di diversa origine. Il DNA ricombinante viene utilizzato per: ottenere frammenti specifici di
DNA in grandi quantità, studiare la sequenza di determinati frammenti genici, identificare particolari
sequenze in un cromosoma, studiare le modalità di espressione e regolazione genica, creare piante o
animali transgenici, diagnosticare e curare malattie genetiche.
Nel 1973 Cohen e Boyer combinano due sequenze diverse di DNA per produrre una nuova
molecola di DNA ricombinante, creando il primo OGM moderno. I due ricercatori, grazie all'uso
combinato delle nuove tecniche di biologia molecolare che si stavano sviluppando in diversi laboratori,
come l'uso dell'enzima ligasi, degli enzimi di restrizione e della trasformazione batterica, riuscirono per
primi a clonare un gene di rana all'interno del batterio Escherichia coli, dimostrando che era possibile
trasferire materiale genetico da un organismo ad un altro tramite l'utilizzo di vettori plasmidici in grado di
autoreplicarsi, abbattendo di fatto le barriere specie-specifiche. Un grosso impulso venne poi negli anni
successivi con la messa a punto delle tecniche di sequenziamento del DNA (che permetteva una
conoscenza dettagliata a livello molecolare del DNA manipolato) e delle tecniche di sintesi chimica del
DNA (che permetteva la costruzione ex novo di frammenti di DNA a sequenza desiderata da utilizzare
nelle ricombinazioni).
Una biblioteca di DNA genomico è l’insieme dei vettori di clonaggio in cui sono stati ricombinati
frammenti di DNA genomico, generalmente con la finalità del sequenziamento.
La procedura base per creare una biblioteca di DNA genomico consiste in:
1) isolare il DNA genomico dalle cellule di interesse
2) frammentare il DNA mediante l’enzima di restrizione opportuno
3) ricombinare i frammenti nel vettore prescelto
4) trasformare i batteri del ceppo adatto
5) coltivare i batteri trasformati su terreno solido onde ottenerne cloni isolati
Tali biblioteche sono ragionevolmente rappresentative del genoma di partenza, anche se la variabilità di
dimensioni dei frammenti e gli aspetti statistici pongono delle limitazioni.
L’ingegneria genetica è un insieme di tecniche (biotecnologia) che ha l’obiettivo di inserire, eliminare,
inattivare o modificare geni all’interno di un organismo, producendo organismi geneticamente
modificati (OGM). Il termine ‘OGM’ è improprio da un punto di vista biologico in quanto tutti gli
organismi caratterizzati da riproduzione sessuata sono, a rigor di termini, geneticamente modificati
(nessun individuo è uguale ai propri genitori e nemmeno ai propri fratelli). Con il termine OGM si
intende fare una distinzione tra gli organismi il cui patrimonio genetico è stato modificato tramite l'uso di
tecniche di miglioramento genetico classico, considerate "naturali", da quelli modificati tramite la tecnica
del DNA ricombinante, che consentono l'inserimento mirato di sequenze geniche che conducono al
fenotipo desiderato. La maggior parte dei risultati finora conseguiti attraverso l’utilizzo delle tecniche de
DNA ricombinante sono stati ottenuti attraverso l’isolamento di geni e la successiva introduzione in un
ospite eterologo, anche appartenente ad una specie differente (una sorta di trapianto genico), al fine di
conferire caratteristiche nuove alle cellule riceventi. L’obiettivo è quello di esprimere una proteina nuova
all'interno di un organismo diverso da quello di origine allo scopo di conferirgli caratteristiche utili.
Attualmente le applicazioni più promettenti si hanno in campo agroalimentare, biomedico ed ambientale.

Le tecnologie del DNA ricombinante si avvalgono di tre strumenti molecolari fondamentali:


- i vettori genici particolari molecole di DNA in grado di ospitare un gene estraneo e di introdurlo in
un genoma.
- gli enzimi di restrizione in grado di ‘ritagliare’ un frammento di DNA contenente il gene e di
‘aprire’ i vettori genici in modo tale che entrambi, vettore ed inserto genico, presentino le
estremità complementari e facilmente ricomponibili
- le DNA-ligasi, enzimi in grado di ricomporre i frammenti in modo tale che il gene si integri nel
vettore genico.

cDNA (DNA complementare)


Gli enzimi di restrizione non sono l’unico modo per ottenere un inserto genico da inserire in un vettore.
Attraverso l’enzima trascrittasi inversa (o retrotrascrittasi) è possibile catalizzare la trascrizione
dell’mRNA in DNA. Dopo che è avvenuta la sintesi di un filamento singolo di DNA si assembla il
secondo filamento di DNA, usando il primo come stampo. Il DNA che si forma in questo modo è detto
cDNA (DNA complementare). Questa tecnica è utile quando si vuole far esprimere un gene umano ad un
batterio. I geni umani sono infatti costituiti di sequenze codificanti (esoni) e sequenze non codificanti
(introni) ed i batteri non possiedono le strutture adatte per eliminare gli introni prima di sintetizzare la
proteina corrispondente. La molecola di mRNA che si è formata a partire dal gene ha già eliminato gli
introni (splicing). Ricostruendo quindi il gene a partire dall’mRNA si ottiene una sequenza genica ‘pulita’
che i batteri potranno poi trasformare nella proteina corrispondente.

Vettori genici
I vettori genici sono delle sequenze di DNA di diversa natura nelle quali sia possibile inserire delle altre
sequenze nucleotidiche (gene esogeno) e che siano in grado di integrarsi con il DNA-bersaglio
introducendovi il gene esogeno. Attualmente sono disponibili diversi tipi di vettori genici, la cui scelta
dipende dalla natura (animale, vegetale, procariote) della cellula bersaglio che deve ricombinare il suo
DNA e dalle dimensioni dell’inserto genico che devono ospitare.

VETTORI GENICI DIMENSIONI DELL’INSERTO


Plasmide 0 -10 kbp
Fago λ 10 -20 kbp
Cosmide 30 -45 kbp
Fago P1 70 – 100 kbp
PAC (cromosomi artificiali P1 ) 130 – 150 Kbp
BAC (cromosomi batterici artificiali) 0 – 300 Kbp
YAC (cromosomi artificiali di lievito) 0,2 – 2 Mbp
MAC (cromosomi artificiali di mammifero) > 1 Mbp

I vettori più usati per i batteri (E.coli) sono i plasmidi e i derivati da virus batteriofagi.
Nel caso di vegetali si utilizza un batterio parassita endocellulare di molte specie di piante,
l’Agrobacterium tumefaciens, il cui plasmide Ti è in grado di inserirsi nel genoma della cellula vegetale.
Per il lievito (Saccharomyces cerevisiae), un eucariote unicellulare, si utilizza il suo plasmide naturale 2
μm (lunghezza della sua circonferenza) ed una serie di vettori ingegnerizzati da esso derivati.
Infine, per ricombinare cellule animali si utilizzano prevalentemente vettori di natura virale.

CELLULA OSPITE VETTORI GENICI COMPATIBILI


Batterio Plasmidi, fago λ, fago M13, fago P1, PAC, BAC, YAC
Lievito Plasmide 2 μm, Plasmidi “navetta” (shuttle), vettori ARS, YAC
Cellule animali Vettori derivati da virus
Cellule vegetali Plasmidi derivati dal batterio Agrobacterium tumefaciens

Caratteristiche di un vettore genico


In generale, per svolgere la sua funzione, un vettore deve possedere le seguenti proprietà:
• Un segmento di DNA che lo renda capace di replicarsi nella cellula ospite (replicon) o di integrarsi al
suo genoma. Il DNA del replicone interagisce con gli enzimi coinvolti nell’avvio della replicazione del
DNA. Un replicone è un’unità genetica composta da un’origine di replicazione del DNA (ori) e dagli
elementi di controllo ad essa associati. Si può anche definire come il più piccolo pezzo di DNA in grado
di replicarsi nell’ospite mantenendo un numero stabile di copie. Nei plasmidi, un “replicone” è lungo in
media 500 bp.
• Uno o più marcatori genetici, la cui presenza permetta di selezionare le cellule che ospitano il
plasmide. I marcatori genetici possono essere resistenze ad antibiotici o marcatori nutrizionali.
• Singoli siti di taglio per il più alto numero possibile di enzimi di restrizione. I vettori sintetici
(ingegnerizzati) più recenti presentano un unica regione (sito di policlonaggio o polylinker) che riunisce i
siti di riconoscimento per gli enzimi di restrizione più comuni. Questi siti devono stare al di fuori delle
regioni essenziali (replicone e marcatore).

PRIONI
I prioni, acronimo di particella infettiva solamente proteica, sono attualmente considerati i più probabili
agenti patogeni delle Encefalopatie Spongiformi Trasmissibili (TSE) dell'uomo e degli animali:
UOMO ANIMALI
Malattia di Creutzfeld-Jacob (MCJ); Scrapie; pecora
Nuova variante della MCJ (nvMCJ); Encefalopatia spongiforme bovina (BSE)
Malattia di Gerstmann-Sträussler-Scheinker Encefalopatia degli ungulati esotici: nyala-kudu
(MGSS); (EUE)
Insonnia familiare fatale (IFF); Encefalopatia trasmissibile del visone (TME)
Kuru (Nuova Guinea). Malattia del dimagrimento cronico del cervo
(CWD
Encefalopatia spongiforme dei felini (FSE)

Sono isomeri conformazionali di una glicoproteina normalmente espressa. Il prione (PrPres=proteina


prionica resistente alle proteasi o PrPsc=proteina della scrapie) sarebbe la forma alterata di una proteina
utile presente nei mammiferi (PrPsen=proteina sensibile alle proteasi o PrPc=proteina cellulare), tra cui
l'uomo, in tutti gli organi ma in particolare sulle cellule del tessuto nervoso la cui funzione ipotizzata
implica la trasmissione di impulsi nervosi e alcuni meccanismi relativi alla memoria a lungo termine.
Nell'uomo la PrPc è codificata da un solo gene che sta nel braccio corto del cromosoma 20. Il complesso
di maturazione della proteina comporta la riduzione di 22 R (catena residuale degli amminoacidi legati)
della NH2 e 23 del terminale COOH. All'amminoacido 23 viene legata una molecola di GPI (glicosil
fosfatidil innositolo) che ha funzione di ancorare la proteina matura alla membrana cellulare dei neuroni.
Una volta ancorata ai neuroni se viene a contatto con PrPsc, la PrPc subisce un cambiamento
conformazionale (la differenza tra le due è solo conformazionale ed è legata alla mutazione puntiforme di
un solo amminoacido). La PrPsc è poco solubile e quindi precipita formando aggregati insolubili chiamati
placche amiloidi che innescano la reazione a catena.
Secondo il modello più accreditato (proposto dallo stesso Prusiner) la PrPc diviene pericolosa in seguito
a un mutamento conformazionale, indotto da un prione infettante o da una mutazione genetica spontanea,
che la trasforma in PrPres, la quale a sua volta agisce su altre PrPc con una reazione a catena.
La PrPsc differirebbe dalla proteina naturale per la conformazione tridimensionale: PrPc ha una struttura
più aperta contenente 3 segmenti "alfa eliche" e pochi "foglietti beta"; PrPsc invece ha una struttura più
compatta e stabile in cui troviamo un aumento di "foglietti beta".

Regolazione dell’espressione genica


Il concetto di regolazione dell’espressione genica si riferisce al fatto che la cellula, attraverso varie
metodiche e in base a determinati stimoli e necessita, è in grado di indurre o reprimere la trascrizione e
quindi la traduzione di geni e di conseguenza la sintesi delle relative proteine.

Eucarioti
La cromatina, già dai suoi primi livelli strutturali rappresenti un ostacolo per il legame alla doppia elica
dei fattori trascrizionali e dell'apparato generale della trascrizione, determinando, di conseguenza, una
generale inibizione dell'espressione genica. L'attivazione trascrizionale è, quindi, generalmente preceduta
o accompagnata da un locale rimodellamento della struttura della cromatina e da cambiamenti dinamici
nelle modalità di condensazione del DNA templato.
Le modificazioni degli istoni generano un “codice istonico”.
La riorganizzazione della posizione dei nucleosomi da parte di complessi di rimodellamento ATP-
dipendenti e la modificazione covalente delle proteine istoniche rappresentano due meccanismi centrali
nella regolazione dell'attività cromatinica. In accordo con ciò, le cellule eucariotiche sono dotate di un
numero straordinariamente elevato di complessi, capaci di introdurre sulle proteine del nucleosoma una
vasta serie di cambiamenti post-traduzionali. L'importanza di questo fenomeno è facilmente apprezzabile
se si considera: (a) che prevalentemente le code N-terminali, ma anche alcuni residui del dominio
globulare purché situati in una posizione accessibile, possono essere acetilati sulle lisine (K), metilati
sulle lisine e le arginine (R), fosforilati sulle serine (S) e le treonine (T), ubiquitinati o sumoilati sulle
lisine o ADP ribosilati; (b) che l'espressione genica è influenzata da queste modificazioni e, più in
particolare, che in funzione del tipo di modificazione chimica così come del residuo amminoacidico
coinvolto si può avere una risposta di tipo attivatorio o repressorio. Gli istoni del core sono codificati
nella maggior parte degli organismi da diverse copie geniche, tutte altamente conservate e trascritte
durante la fase di sintesi del DNA, quando il genoma duplicato deve essere opportunamente condensato.
L'elevata conservazione di queste proteine suggerisce una loro capacità di legare il DNA in maniera
aspecifica, indipendente dalla provenienza dell'acido nucleico. Questa aspecificità è molto importante per
garantire la condensazione e il conseguente corretto funzionamento dell'intero genoma; l'insorgenza di
mutazioni potenzialmente capaci d'influenzare le sequenze di DNA legate dagli istoni, è un evento
estremamente pericoloso per la cellula, e quindi non selezionato favorevolmente nell'evoluzione.
Diversi dati dimostrano che i complessi di rimodellamento della cromatina e quelli deputati a modificare
post-traduzionalmente gli istoni cooperano funzionalmente. Per esempio, è noto come sia le mutazioni
delle subunità del complesso SAGA (ad attività istonacetiltransferasica), sia quelle del complesso ATP-
dipendente SWI/SNF di per sé non causano importanti difetti nella vitalità cellulare, ma, quando
combinate insieme, conducono alla morte cellulare. Un simile risultato può essere spiegato solo
ipotizzando un'interazione funzionale tra le due attività. Coerentemente con questi dati, è stato anche
possibile dimostrare come sugli stessi promotori nelle cellule di mammifero possono essere
contemporaneamente presenti entrambe le funzioni. Quindi, anche se probabilmente la corretta
regolazione trascrizionale di ciascun promotore necessita di entrambe le funzioni, non sembra esserci un
ordine preferenziale nel loro utilizzo; ogni promotore lavora seguendo un proprio schema individuale
avvalendosi di specifici complessi di rimodellamento, che possono differire per numero, tipo oppure
ordine di intervento da quelli usati da un altro promotore. Anche l'apparato trascrizionale partecipa alla
regolazione della specifica espressione di un gene, complicando ulteriormente la fitta rete di interazioni
molecolari che si susseguono su un promotore. In sintesi, la coordinata azione di tutte queste diverse
funzioni permette al DNA stampo di raggiungere al momento giusto quell'architettura proteica, che gli
garantisce il corretto livello di trascrizione.

Procarioti
La cellula procariota è in grado di regolare l’espressione genica attraverso la struttura dell’operone.
L’operone è un tratto di DNA che comprende tratti regolatori, promotore ed operatore e geni strutturali.
La funzione del promotore è quella di legare l’RNA polimerasi, quella dell’operatore è di impedire, se
serve, la trascrizione. Gli operoni possono essere di due tipi: operone inducibile ed operone reprimibile.
L’operone inducibile è caratterizzato dal fatto che viene attivato dai substrati sui quali il suo prodotto
lavora. Per capire il suo funzionamento prendiamo in considerazione l’operone che sintetizza gli enzimi
necessari alla scissione del lattosio in glucosio e galattosio (operone LAC). L’operone LAC è composto,
dal 5’ al 3’, dal promotore, dall’operatore e da un cluster di 3 geni (z,y,a). In assenza di lattosio una
proteina, il repressore, è legato all’operatore impedendo stericamnte lo scorrimento dell’RNA pol e quindi
la trascrizione dei geni. In presenza di lattosio esso entra nella cellula ed è in grado di legarsi al
repressore, in un sito allosterico, inducendo una modificazione strutturale del repressore stesso, che non
più affine all’operatore, si stacca da esso. Perciò, in presenza dell’induttore (nel nostro caso il lattosio), è
possibile la trascrizion,e poiché il sito O è libero e la RNA pol può scorrere e trascrivere gli mRNA per gli
enzimi necessari al catabolismo del lattosio, in particolare la β- galattosidasi (gene z). questo un tipo di
regolazione qualitativa, ma ne esiste anche una di tipo quantitativo, che regola cioè la velocità di
trascrizionee quindi la quantità di trascritto. Questa regolazione quantitativa è operata da uno dei prodotti
stessi del catabolismo, in questo caso il glucosio. La diminuzione della concetrazione plasmatica di
glucosio stimola la produzione di cAMP. Il cAMP si lega alla proteina CAP (Proteina Attivatrice del
Catabolismo) ed il complesso CAP-cAMP si lega all’operatore, causando un particolare ripiegamento del
segmento di DNA, che permette una maggiore affinità dell’RNA pol per il promotore e quindi una
maggiore velocità di trascrizione.
Gli operoni reprimibili sono invece anabolici (per esempio sintesi di aa). I geni che li compongono
sintetizzano per un prodotto che ha anche la funzione di sintetizzare il corepressore, che legandosi al
repressore inattivo ne cambia la conformazione e lo rende affine all’operatore, inibendo la trascrizione.
Un esempio è l’operone reprimibile TRP (triptofano). In assenza di triptofano l’operatore è libero,
cosicché è possibile la trascrizione del gene per la sintesi del triptofano. L’operone è, in particolare,
costituito da un cluster di 5 geni (e, d, c, b, a), che codificano per 5 diversi enzimi, che entrano a far parte
della via di biosintesi del triptofano. Se la quantità di triptofano presente è invece sufficiente il triptofano
stesso, fungendo da corepressore, si lega al repressore inattivo, ne cambia la conformazione e lo rende
affine all’operatore, al quale si lega, impedendo stericamente lo scorrimento dell’RNA pol e quindi la
trascrizione del gene. Anche nell’operone TRP è presente una regolazione quantitativa, che permette una
attenuazione della trascrizione. In particolare nel segmento 1 dell’mRNA del cluster di geni, cioè quello
posto all’estremità 5’ (che viene quindi trascritto e tradotto per primo) sono presenti codoni regolativi
UGG, che codificano per il triptofano. In presenza di molto triptofano questi codoni regolativi sono
tradotti più velocemente e quindi i ribosomi occupano in un tempo minore i segmenti 1 e 2. Ciò permette
la formazione solo di loops nell’mRNA tra i segmenti 3 e 4. I loops 3-4 sono loops di termine, che
inibiscono quindi la trascrizione del gene. Se, invece, è presente poco triptofano, i codoni regolativi UGG
sono tradotti più lentamente, con il conseguente stallo dei ribosomi sul segmento 1. In questi casi è
possibile la formazione di loops 2-3, che permettono, invece, la trascrizione. Questo dimostra un’altra
attività del ribosoma, quella della regolazione dell’espressione genica.