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Pedro Pinheiro Nº 080305095

Faculdade de Ciências da Universidade do Porto ± Toxicologia Geral

Janeiro 2011

—
Y

Uma das práticas mais recorrentes para analisar a toxicidade das substâncias ou a sua interacção sobre os
organismos vivos, são os ensaios de toxicidade. A actividade experimental tem como objectivo avaliar o efeito da
toxicidade do cloreto de sódio em diferentes concentrações, sobre a germinação e crescimento de sementes de
alface (Lactuca sativa). Para isso, as sementes foram colocadas em placas de Petri com diferentes concentrações da
substância em estudo, de maneira a inferir a sua toxicidade na germinação. Depois de 7 dias de incubação, foram
contadas as sementes germinadas e medidas as respectivas radículas. Os dados obtidos permitiram aferir que as
concentrações mais elevadas de NaCl inibem significativamente o crescimento da radícula da alface, visto que o
comprimento médio da radícula varia perante diferentes concentrações. A percentagem de germinação e a
percentagem de inibição do crescimento radicular relativamente ao meio de controlo foram calculadas e utilizadas
para análise dos resultados. Nesta actividade experimental recorremos a um programa estatístico, SPSS, que
permitiu não só validar as conclusões obtidas no trabalho como também calcular a concentração máxima de efeito
não observável (NOEC), a concentração mínima de efeito observável (LOEC) e a concentração efectiva mediana
(CE50) para o tóxico em estudo.

—
 YY
Toxicidade; „

  ; Cloreto de sódio; Crescimento radicular; SPSS.

— Y taminantes. Esta é uma etapa com elevada sensibilidade

A crescente evolução tecnológica e actividade
humana têm efeitos adversos sobre o ambiente natural
quer pela adição de substâncias químicas resultantes da
industrialização quer pelo aumento do uso intensivo
dos recursos naturais. A situação actual conduz à
necessidade de realizar um maior número de ensaios de
relativamente a factores adversos externos,
nomeadamente a salinidade, pois estes agentes
interferem directa ou indirectamente nos mecanismos
de desenvolvimento normal da planta. A germinação
de sementes é o maior factor limitante do
desenvolvimento das plantas, em condições salinas 


.
toxicidade para as mais variadas substâncias tóxicas,
com o objectivo de avaliar e quantificar a capacidade
de um tóxico em produzir efeitos adversos nos
organismos vivos.
Esse foi o objectivo deste protocolo experimental no
qual se submeteu um grupo de organismos teste
(„

  ) a diferentes concentrações de um
agente nocivo, por um determinado período de tempo.
Os resultados obtidos nestes testes são importantes para
a análise do impacto ambiental de muitas substâncias
usadas em diferentes actividades. Estas substâncias
estão muitas vezes em contacto directo com as
comunidades animais e com o ambiente, existindo um
risco de contaminação muitas vezes desconhecido.
Espíndola et al. (2000).
Durante o período de germinação e nos primeiros dias
de desenvolvimento da plântula ocorrem inúmeros
processos fisiológicos que podem ser afectados pela
presença de um ou vários agentes nocivos/con-
˜˜ 

Grande parte das reacções e processos que ocorrem no
interior das sementes durante a germinação são comuns
à grande maioria das espermatófitas, pelo que a
resposta da espécie em estudo, „

  , e os
resultados obtidos a partir da execução deste ensaio de
toxicidade acerca dos efeitos dos compostos nas
sementes, são facilmente extrapolados para as plantas
em geral.
A salinidade é um dos factores que mais afecta a
germinação. Os efeitos mais marcantes da salinidade
sobre a planta reflectem-se em alterações no potencial
osmótico, na toxicidade iónica e no desequilíbrio da
absorção dos nutrientes, provocando a inibição
generalizada do seu crescimento.
A alface („

   por ser um dos vegetais mais
consumidos em todo o Mundo é desde logo um
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Y


 YY
Y
YYY

Procedeu-se então à análise estatística dos resultados

obtidos para procurar melhor compreender quais os
efeitos do NaCl no crescimento radicular de sementes
de alface

@ Percentagem das sementes não germinadas em

função da concentração de NaCl (scatter plot).

@ Scatter plot da percentagem de inibição em função

da concentração de NaCl

@ Percentagem das sementes não germinadas em

função da concentração de NaCl (95%).

Estes gráficos permitem visualizar qual a variação da

percentagem de inibição radicular, assim como, das
sementes não germinadas com o aumento da
concentração de NaCl. Facilmente se detecta uma
grande variabilidade nas percentagens, não sabendo
especificamente qual a razão, pode-se deduzir que uma
das razões prende-se com a variabilidade genética
inerente a cada grupo de sementes levando a respostas
diferentes à mesma concentração.
@ Percentagem de inibição em função da
concentração de NaCl (95%) Para comprovar que o NaCl é um factor de influência
foi posteriormente feita uma análise de variância
(anova). Para isso a população em estudo teve de
obedecer a três critérios* (1) apresentar distribuição
normal; (2) amostragem aleatória e amostras
independentes e ainda (3) homogeneidade das
variâncias.

ј 

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  c
c
Y


 Y Y—  Y

Para avaliar a normalidade de uma distribuição, geral- seguinte (tabela 1) estão apresentados os testes de nor-
mente utilizam-se dois testes estatísticos de normali- malidade para as diferentes concentrações de NaCl.
dade* 
  e   !
. Na tabela


 YY  '

NaCl (mg.L- Kolmogorov-Smirnova Shapiro-Wilk

1) Statistic df Sig. Statistic df Sig.
% sementes não 0 ,387 15 ,000 ,658 15 ,000
germinadas ,375 ,365 16 ,000 ,697 16 ,000
,750 ,347 16 ,000 ,645 16 ,000
1,500 ,329 16 ,000 ,718 16 ,000
3,000 ,391 16 ,000 ,700 16 ,000
6,000 ,346 16 ,000 ,701 16 ,000
12,000 ,275 16 ,002 ,769 16 ,001
a.Y Lilliefors Significance Correction
? "
Testes de normalidade da percentagem de sementes não germinadas. 

Y
Y
Y
Y $" %

%Y
 &Y
Y"#
Y Statistic df Sig. Statistic df Sig.
% inibição 0 ,100 15 ,200* ,990 15 ,999
,375 ,198 15 ,116 ,898 15 ,090
,750 ,180 16 ,177 ,910 16 ,118
*
1,500 ,121 16 ,200 ,955 16 ,567
*
3,000 ,172 14 ,200 ,930 14 ,302
*
6,000 ,158 13 ,200 ,920 13 ,249
*
12,000 ,134 9 ,200 ,961 9 ,806
a. Lilliefors Significance Correction
*. This is a lower bound of the true significance.
? "
Testes de normalidade da percentagem de inibição .

Observando os resultados obtidos através do teste resultados apresentam distribuição normal. Cumpre-se
  !
, verifica-se que a significância (sig ou P- assim o primeiro dos pressupostos da análise de
value) é superior a 0,05 (5%) em todas as variância paramétrica. O segundo requisito está
concentrações. também à partida satisfeito face ao método
experimental utilizado.
Ao analisar-se o teste 
   (com cor-
recção de „

# ), verifica-se que o sig. (P-value) é

Ao contrário do observado no teste de normalidade da
maior que 0,05 (5%) em todas as concentrações. Não
percentagem de inibição, aqui a significância (sig ou P-
se poderão rejeitar, por isso, as respectivas hipóteses
value) em ambos os teste é inferior a 0,05 (5%) em to-
nulas (H0), ou seja, não se rejeita a normalidade das
das as concentrações. Neste caso, pode-se rejeitar a
distribuições, assim, todas as subpopulações de
˜ 

c
c 
   
 
cc  
  c
c
hipótese de uma distribuição normal por parte dos 
resultados.
$"%&
Para comprovar que o NaCl é um factor de influência
foi posteriormente feita uma análise de variância Levene
(anova). Esta análise procura demonstrar a Statistic df1 df2 Sig.
homogeneidade das variâncias, pelo teste de „
2,592 6 91 ,023
que nos dirá se estamos perante um caso de
homogeneidade ou não. ? "
   Teste da homogeneidade de variâncias da
percentagem de inibição.
Y

Y Segundo os dados obtidos pelo 

'Y 
% na
Neste modelo estatístico são usados a variabilidade
como método de comparação das várias médias. A
análise da variância a um único factor é chamado de


experiência efectuada podemos concluir que não existe
homogeneidade das variâncias, assim pode-se anular a
hipótese nula (hipótese de igualdade das variâncias).
Isto deve-se ao facto do valor de sig. (P-value) ser bem
'Y 
% (admite que todas a observações de inferior a 0,05 (0,023). Deste modo não se cumpre um
um grupo têm a mesma resposta esperada sendo que dos pressupostos da análise 

'Y 
%Y , a
explica as diferenças por uma variação aleatória). homogeneidade das variâncias.


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Y
Y
YYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYY 

Sum of Mean
% inibição
Squares df Square F Sig.
Between Groups 63149,360 6 10524,893 6,322 ,000
Within Groups 151486,962 91 1664,692
Total 214636,322 97
  ? "
Comparação das médias com o anova 

aplicou-se o teste
'
para perceber quais os
grupos que mais diferiam entre si.
Como o tamanho da amostra é suficientemente elevado
procede-se então a uma análise #Y Segundo a 
 Y
Y
significância obtida por este teste (P-value = 0)
confirma-se que não existe igualdade dos valores Os dados obtidos pelo teste 
permitem
médios para o nível de significância admitido (5%). A determinar qual o valor de NOEC (concentração
variação total presente nas amostras situa-se nos máxima sem efeito observável) e o de LOEC
214636.322, sendo na sua maioria devida à (concentração mínima com efeito observável) por
variabilidade dentro de cada grupo. comparação com o controlo (concentração NaCl = 0).
O valor de LOEC do NaCl é de 1,5 mg/L. O valor de
Pode então afirmar-se que o NaCl, nas condições NOEC encontra-se entre a concentração de 0 mg/L e
testadas, interferiu e inibiu a germinação de sementes 1,5 mg/L.
de uma forma relevante, do ponto de vista
observacional e estatístico. Apesar da variabilidade
entre grupos não ser a que mais determina o total de
variação neste caso, esta é ainda considerável pelo que

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Y 

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    Mean 95% Confidence Interval
 
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(I) NaCl (mg.L-1) (J) NaCl (mg.L-1) Difference (I-J) Std. Error Sig. Lower Bound Upper Bound
Tukey HSD 0 ,375 -2,837 14,898 1,000 -47,76 42,09
,750 -1,637 14,664 1,000 -45,85 42,58
1,500 -11,538 14,664 ,986 -55,75 32,68
3,000 -29,173 15,162 ,470 -74,89 16,55
*
6,000 -51,278 15,461 ,021 -97,90 -4,66
*
12,000 -79,975 17,203 ,000 -131,85 -28,10
,375 0 2,837 14,898 1,000 -42,09 47,76
,750 1,200 14,664 1,000 -43,02 45,42
1,500 -8,701 14,664 ,997 -52,92 35,51
3,000 -26,336 15,162 ,593 -72,05 19,38
6,000 -48,441* 15,461 ,036 -95,06 -1,82
*
12,000 -77,139 17,203 ,000 -129,01 -25,27
,750 0 1,637 14,664 1,000 -42,58 45,85
,375 -1,200 14,664 1,000 -45,42 43,02
1,500 -9,901 14,425 ,993 -53,40 33,60
3,000 -27,536 14,932 ,522 -72,56 17,49
*
6,000 -49,641 15,235 ,025 -95,58 -3,70
*
12,000 -78,338 17,000 ,000 -129,60 -27,08
1,500 0 11,538 14,664 ,986 -32,68 55,75
,375 8,701 14,664 ,997 -35,51 52,92
,750 9,901 14,425 ,993 -33,60 53,40
3,000 -17,635 14,932 ,900 -62,66 27,39
6,000 -39,740 15,235 ,136 -85,68 6,20
12,000 -68,437* 17,000 ,002 -119,70 -17,18
3,000 0 29,173 15,162 ,470 -16,55 74,89
,375 26,336 15,162 ,593 -19,38 72,05
,750 27,536 14,932 ,522 -17,49 72,56
1,500 17,635 14,932 ,900 -27,39 62,66
6,000 -22,105 15,715 ,797 -69,49 25,28
12,000 -50,802 17,432 ,065 -103,36 1,76
*
6,000 0 51,278 15,461 ,021 4,66 97,90
*
,375 48,441 15,461 ,036 1,82 95,06
*
,750 49,641 15,235 ,025 3,70 95,58
1,500 39,740 15,235 ,136 -6,20 85,68
3,000 22,105 15,715 ,797 -25,28 69,49
12,000 -28,698 17,692 ,669 -82,05 24,65
12,000 0 79,975* 17,203 ,000 28,10 131,85
*
,375 77,139 17,203 ,000 25,27 129,01
*
,750 78,338 17,000 ,000 27,08 129,60
*
1,500 68,437 17,000 ,002 17,18 119,70
i˜ 
 3,000 50,802 17,432 ,065 -1,76 103,36
6,000 28,698 17,692 ,669 -24,65 82,05
Tamhane 0 ,375 -2,837 16,504 1,000 -58,06 52,39
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c

 Y
  

? "
 + - comparação múltipla da análise post-hoc para a
percentagem da inibição da radícula N of Cases
Valid 24
1ejected Missing 0
— Y
LOG Transform Cannot be 0
A regressão linear consiste num tipo de regressão no Done
qual se analisam dados independentes e normalmente
Number of 1esponses > 0
distribuídos. Contudo a relação dose/efeito não é linear
pelo que a sua análise é feita através de um método de Number of Subjects
regressão não linear ou linearizando-se os dados Control Group 4
através de métodos de transformação (transformação ? "
,Probit informação dos dados da percentagem de
log Probit). sementes não germinadas

Na tabela estão representados os valores estimados

(Estimate), desvio padrão (Std. Error), nível de 
%
"


Y
  

significância (Sig.) e intervalo de confiança (95%
Confidence Interval), provenientes da análise de Number of Optimal
regressão linear dos resultados já transformados como Iterations Solution Found
acima descrito.
P1OBIT 12 Yes
? "
-Dados de informação convergente

 

Y  

95% Confidence Interval
Parameter Estimate Std. Error Z Sig. Lower Bound Upper Bound
a
P1OBIT Concentração ,856 ,125 6,864 ,000 ,611 1,100
Intercept -,852 ,081 -10,550 ,000 -,932 -,771
a. P1OBIT model* P1OBIT(p) = Intercept + BX (Covariates X are transformed using the base 10,000 logarithm.)

? "
.resultados da análise de regressão linear sobre os resultados transformados (transformação log -probit)

Como o coeficiente de regressão (Concentração, variáveis que foram transformadas, sendo elas a
Parameter) possui um valor de significância inferior a concentração ou dose e a resposta (percentagem de
0,05 (5%), ou seja é significativo, rejeita-se a hipótese inibição).
nula de que não existe correlação linear entre as duas

Y Y

Y Y

Y Y

Y Y

Y Y

Y Y

ü˜ 

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cc  
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c
— ——Y



Y
 
Chi-Square dfa Sig.
P1OBIT Pearson Goodness-of-Fit 83,522 22 ,000b
Test
a. Statistics based on individual cases differ from statistics based on aggregated cases.
b. Since the significance level is less than ,150, a heterogeneity factor is used in the calculation of confidence
limits
? "
Teste do qui-quadrado

A significância do teste de Qui-Quadrado foi de 0, logo a um factor de correcção (heterogeneity factor) para o
inferior aos 5%, o que revela a inadequação da cálculo dos intervalos de confiança, processado de
transformação do LogProbit para descrever a relação forma automática pelo programa estatístico SPSS.
dose-resposta. Assim é necessário recorrer


Y
Y
Y—

Number of Observed Expected
Number Concentração Subjects 1esponses 1esponses 1esidual Probability
P1OBIT 1 -,426 10 0 1,120 -1,120 ,112
2 -,426 30 8 3,360 4,640 ,112
3 -,426 30 6 3,360 2,640 ,112
4 -,426 10 0 1,120 -1,120 ,112
5 -,125 10 0 1,689 -1,689 ,169
6 -,125 30 9 5,068 3,932 ,169
7 -,125 30 2 5,068 -3,068 ,169
8 -,125 10 2 1,689 ,311 ,169
9 ,176 10 1 2,417 -1,417 ,242
10 ,176 30 7 7,251 -,251 ,242
11 ,176 30 6 7,251 -1,251 ,242
12 ,176 10 0 2,417 -2,417 ,242
13 ,477 10 0 3,288 -3,288 ,329
14 ,477 30 13 9,863 3,137 ,329
15 ,477 30 11 9,863 1,137 ,329
16 ,477 10 0 3,288 -3,288 ,329
17 ,778 10 0 4,263 -4,263 ,426
18 ,778 30 13 12,789 ,211 ,426
19 ,778 30 15 12,789 2,211 ,426
20 ,778 10 0 4,263 -4,263 ,426
21 1,079 10 1 5,286 -4,286 ,529
22 1,079 30 27 15,858 11,142 ,529
23 1,079 30 21 15,858 5,142 ,529
24 1,079 10 2 5,286 -3,286 ,529

? "
Contagem de células e resíduos
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 YY
  Y  Y


cY cY 
Y
Y  c
cY Y
Y

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  YÿY Y
Y
Y
c
c 
   
 
cc  
  c
c
A partir dos dados desta tabela podemos saber a CE50 
Y
estimada e o seu intervalo de confiança.
 Y ÿ
ÿ Após a análise de todos os dados obtidos neste


%Y
Y

Y 

ÿ Conclui-se que, protocolo experimental, conclui-se que as
através dos valores obtidos a concentração 0,995 mg.L- concentrações testadas de NaCl inibiram a
1 de NaCl produziu efeito adverso ou tóxico (inibição germinação das sementes de alface testadas. Verifica-
se ainda que em concentrações elevadas este
radicular) em 50% das sementes de alface. 
composto produz um efeito tóxico agudo no

organismo teste com uma inibição bem acima dos
Y
50% da germinação das sementes.
Y P1OBITa

 —( Y

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