lOMoARcPSD|4494519

12. Laboratoriobiomol 3

Biologia molecular (Universidad Libre de Colombia)

StuDocu no está patrocinado ni avalado por ningún colegio o universidad.

Descargado por Valentina Arango (tinaarango135@gmail.com)
 lOMoARcPSD|4494519

1.Qué es y Qué contiene el reactivo Go Taq Green MasterMix (Promega)

GoTaq Green MasterMix es una solución premezclada lista para usar, que contiene derivado de
bacterias Taq ADN polimerasa, dNTPs, MgCl2 y tampones de reacción a concentraciones
óptimas para la amplificación eficiente de plantillas de ADN por PCR. Contiene dos colorantes
(azul y amarillo) que permiten el seguimiento del progreso durante la electroforesis. Las
reacciones combinadas con una mezcla GoTaq® Green MasterMix tienen una densidad
suficiente para la carga directa sobre geles de agarosa.

2.Cuál es la ventaja que ofrece este reactivo para la ejecución de una pcr
Que trae todo lo necesario para el PCR son contar con la cadena y los primer, esto facilita el
proceso ya que viene con proporciones estandar de cada componente
3.Cuál es la función de cada uno de los siguientes reactivos en una pcr? Taq polimerasa,
Buffer 10X, Primer,MgCl2, dNTPs y agua ultrapura
Taq polimerasa: Su función es polimerizar una nueva cadena de ADN tomando como molde
otra ya existente, la enzima trabaja a 95°C
Buffer 10X: Proporciona el pH y concentraciones de sales adecuadas para la correcta
función de la ADN polimerasa. Se maneja a un pH de 8.4 y está compuesto por Tris-HCl y
KCl
Primer:Su función radica en proporcionar un extremo 3’ libre al que se han de añadir los
nucleótidos consecutivos mediante enlaces fosfodiéster, ya que la ADN polimerasa necesita
de un extremo 3’OH preexistente
MgCl2: Actúa como cofactor de la ADN polimerasa, su concentración debe estar entre 1.0 a
2.5 mM dependiendo de la PCR pues una baja en la [Mg+] puede disminuir la producción
del amplificado y una alta [Mg+] causa el efecto contrario
dNTPs: Son necesarios para que la Taq ADN polimerasa pueda funcionar correctamente ya
que estos son los que se unen a la nueva hebra de ADN.
Agua ultrapura: Para garantizar que se encuentre libre de cualquier molécula contaminante
de la muestra, ya sea Cl, Mg, Na, microorganismos, o hasta de ADN diferente al de la
muestra

4.Para qué se usa el tapón de aceite mineral

Para evitar la evaporación de la mezcla Go Taq Green MasterMix mientras la mezcla se
encuentra en el termociclador.

5.Cuál es el fundamento físico químico que permite calcular la temperatura de anillamiento

la temperatura de anillamiento que se escoge para una PCR depende directamente de la
longitud (como mínimo 17 bases de longitud) y composición de los primers
(dependiendo de la cantidad de T o C)

6.Cuál cree que es la razón por la cual la temperatura de anillamiento se debe ubicar 5
grados centígrados por debajo de la temperatura de fusión (TM)
Para garantizar temperaturas de alineamiento similares para ambos primers y una eficiencia
de amplificación adecuada

7.Porque la temperatura de fusión (TM) del primer CCR5-2 es mayor que la del CCR5-1?
Porque el primer CCR5-2 posee más cantidad de nucleótidos que el primer CCR5-1.

Descargado por Valentina Arango (tinaarango135@gmail.com)

 lOMoARcPSD|4494519

8.Qué es la TM y qué significado molecular tiene?

La temperatura de fusión (TM) temperatura en que la mitad de las moléculas
complementarias se encuentran unidas, depende principalmente de su contenido de C+G

9.Cómo es posible que temperatura de elongación sea de 72 grados centígrados? No

debería ser 37 grados centígrados Al fin y al cabo Esa es la temperatura corporal.
La temperatura de elongación se mantiene a 72°c porque es la temperatura de máxima
eficiencia de la enzima Taq ADN polimerasa. Hay que recordar que esta enzima no es
humana, sino bacteriana por lo cual tiene una temperatura de trabajo ideal diferente a la
humana.

10.Cuál es la razón para que el volumen de la mezcla por tubos sea 23 microlitros y no otro

11. Porque existe un primer R y un primer F

Porque uno es complementario y antiparalelo a la cadena 3’-5’ del ADN molde y el otro (F)
es complementario a la cadena 5’-3’. Cada uno se pegara a un extremo diferente de la
cadena y determinara el tamaño del producto de PCR según la longitud existente entre
ambos

12.Cuál es el significado del tamaño expirado de amplificador y cómo se establece

De que se hallo el gen que se buscaba en la muestra. Dl tamaño del producto de PCR esta
determinado según la longitud existente entre ambos primers (R y F)

14. ¿Qué es y para qué sirve la familia de programas BLAST?

R/ El algoritmo BLAST (basic local alignment search tool) es la base de una familia de
varios programas, este permite comparar una secuencia seleccionada de ADN o proteína
contra miles o millones de secuencias depositadas en los bancos de datos. Esta aporta una
lista de las secuencias más similares encontradas en la base de datos seleccionada.

15. ¿Qué es y para qué sirve el Genbank?

R/ es la base de datos de secuencias genéticas del NIH, una colección de disponibilidad
pública de secuencias de ADN. Es parte de international Nucleotide Sequence Database
Collaboration, que está integrada por la base de datos de ADN de Japón, el laboratorio
europeo de biología molecular.

17. ¿Cuáles son los tamaños esperados de los posibles amplificados de estos primers?
R/ Los posibles tamaños esperados son de 225 pares de bases.

18. Explique el fundamento de cada una de los pasos y temperaturas usadas durante la
programación de la máquina de PCR

Un ciclo típico de PCR consta de tres temperaturas:

- Desnaturalización: se realiza a 95 C° tiene como objetivo desnaturalizar la doble
cadena de ADN y/o destruir las estructuras secundarias del ADN, lo que permite el
acceso de los primers a la cadena molde en sus secuencias complementarias. Esta
temperatura se mantiene por 30 segundos.

Descargado por Valentina Arango (tinaarango135@gmail.com)

 lOMoARcPSD|4494519

- Alineación: en esta fase, la temperatura se encuentra en un rango entre 55 y 60 C°,

en el cual la mayoría de los iniciadores hibridan; esto genera energía cinética
necesaria para que los iniciadores busquen en las cadenas de ADN su secuencia
complementaria y formen los puentes de hidrógeno con la cadena molde, dejando el
extremo 3’ OH disponible y listo para la adición de los nucleótidos consecutivos por
la ADN polimerasa.
- Extensión: se produce a la temperatura óptima para el funcionamiento de la ADN pol
empleada, que es la Taq polimerasa la más utilizada es a 72°.
- Amplificación final: una vez terminados los ciclos designados por la PCR, la
temperatura de extensión se mantiene por cinco minutos, lo que permite a la ADN
pol terminar de extender los productos a los cuales está unida.
- Almacenamiento temporal: Durante la programación de los ciclos de la PCR se
programa también un ciclo final de 4 C° por varias horas, lo que permite conservar
los productos de PCR hasta que se retire.

19. ¿Porque se considera el agua un control negativo?

R/ Se considera negativo porque este no posee una secuencia de ADN que sea posible de
replicarse.

20. ¿Cuáles pueden ser las razones de obtener amplificación en el tubo de control de agua?
R/ Las razones pueden ser que haya una contaminación provocada por la mala limpieza de
los materiales, que posiblemente hayan sido usados en previas pruebas. O otra situación es
que haya una secuencia de ADN dispersa en el aire y pueda llegar al tubo de control
negativo.

21. ¿Que es el CCR5 y que funciones tiene?

R/ Es una proteína, que actúa como correceptor en la membrana de los macrofagos y
linfocitos T CD4. Estos receptores pertenecen a la superfamilia de receptores acoplados a
proteínas G, y se clasifican de acuerdo a la estructura de sus ligandos (quimiocinas).

22.¿En qué consiste la mutación Del 32 en el gen del CCR5?

R/ Es un polimorfismo, denominado CCR5- Delta 32, es una deleción de 32 pb en la región
correspondiente al segundo dominio extracelular de la molécula.

23. ¿Que significado tiene la mutación Del 32 en el gen del CCR5?

R/ Los pacientes seropositivos heterocigotos progresaran lentamente hacia el SIDA que los
pacientes portadores de dos copias normales del gen

16. Indique cuales son los blancos (subject) a los cuales se unen estos primers. Escoja los 5
primeros resultados con sus respectivos alineamientos. (anexe una hoja impresa con el
resultado)

>AH005786.2 Homo sapiens CC chemokine receptor 5B (CCR5) gene, complete sequence; and
CCR5 truncated isoform (CCR5) genes, CC chemokine receptor 5 (CCR5) gene, complete cds
product length = 225
Forward primer 1 ACCAGATCTCAAAAAGAAGGTCT 23
Template 5336 ....................... 5358

Descargado por Valentina Arango (tinaarango135@gmail.com)

 lOMoARcPSD|4494519

Reverse primer 1 CATGATGGTGAAGATAAGCCTCACA 25

Template 5560 ......................... 5536

>KM355945.1 Homo sapiens clone V201 CC chemokine receptor 5 (CCR5) gene, complete cds
product length = 225
Forward primer 1 ACCAGATCTCAAAAAGAAGGTCT 23
Template 499 ....................... 521

Reverse primer 1 CATGATGGTGAAGATAAGCCTCACA 25

Template 723 ......................... 699

>KM355943.1 Homo sapiens clone V90C2 CC chemokine receptor 5 (CCR5) gene, complete
cds
product length = 225
Forward primer 1 ACCAGATCTCAAAAAGAAGGTCT 23
Template 499 ....................... 521

Reverse primer 1 CATGATGGTGAAGATAAGCCTCACA 25

Template 723 ......................... 699

>KM355940.1 Homo sapiens clone V1C1 CC chemokine receptor 5 (CCR5) gene, complete cds
product length = 225
Forward primer 1 ACCAGATCTCAAAAAGAAGGTCT 23
Template 499 ....................... 521

Reverse primer 1 CATGATGGTGAAGATAAGCCTCACA 25

Template 723 ......................... 699

>KM355939.1 Homo sapiens clone V32 CC chemokine receptor 5 (CCR5) gene, complete cds
product length = 225
Forward primer 1 ACCAGATCTCAAAAAGAAGGTCT 23
Template 499 ....................... 521

Reverse primer 1 CATGATGGTGAAGATAAGCCTCACA 25

Template 723 ......................... 699

Descargado por Valentina Arango (tinaarango135@gmail.com)