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Fondazione Ricerca

Fibrosi Cistica - Onlus

XV CONVENTION D’AUTUNNO
Fondazione Ricerca
Fibrosi Cistica - Onlus DEI RICERCATORI IN FIBROSI CISTICA
15th Convention of Investigators in Cystic Fibrosis
In collaborazione con Con il patrocinio di

Azienda Ospedaliera 26-28 October 2017


Universitaria Integrata
Verona Verona, Camera di Commercio Congress Center
Fondazione Ricerca
Fibrosi Cistica - Onlus

Presso Ospedale Maggiore B.go Trento


P.le A. Stefani, 1 - 37126 Verona
Presidenza e Segreteria
Tel. 045 8123438 - fax 045 8123568
e-mail: fondazione.ricercafc@aovr.veneto.it
Codice fiscale 93100600233
Consiglio di Amministrazione
Presidente: Vittoriano Faganelli
Vice Presidente: Matteo Marzotto
Consiglieri: Michele Bauli
Sandro Caffi
Francesco Cobello
Paolo Del Debbio
Francesco Ernani
Giuseppe Ferrari
Gianni Mastella
Michele Romano
Donatella Treu
Luciano Vettore
Patrizia Volpato
Direzione Scientifica
Fondazione Ricerca
Fibrosi Cistica - Onlus
Fondazione Ricerca
Fibrosi Cistica - Onlus – Direttore Scientifico: Gianni Mastella
Tel. 045 8123567
e-mail: gianni.mastella@aovr.veneto.it
– Vicedirettore Scientifico: Graziella Borgo
Tel. 045 8127027 / 346 5126013
e-mail: borgograziella@gmail.com
Comitato di Consulenza Scientifica
Presidente: GiorgioBerton
Consulenti: Paolo Bernardi
Paola Bruni
Roberto Buzzetti
Gian Maria Rossolini
XV CONVENTION D’AUTUNNO XV CONVENTION D’AUTUNNO
a
DEI RICERCATORI IN FIBROSI CISTICA Fondazione Ricerca
DEI RICERCATORI IN FIBROSI CISTICA
us

15th Convention of Investigators in Cystic Fibrosis


Fibrosi Cistica - Onlus

15th Convention of Investigators in Cystic Fibrosis


Per donazioni: • SWIFT-BIC code (per pagamenti dall’estero)
il patrocinio di In collaborazione con Con il patrocinio di UNCRITM1N58
26-28 October 2017 Azienda Ospedaliera 26-28 October 2017
Verona, Camera di Commercio Congress Center
Universitaria Integrata
Verona Verona, Camera di Commercio Congress Center
• Bonifico Unicredit Banca:
IBAN IT 47 A 02008 11718 000102065518
Alcuni dei Ricercatori della Rete FFC che hanno contribuito con più continuità • Bonifico Banco Popolare di Verona:
e intensità ai programmi di Ricerca FFC. IBAN IT 92 H 05034 11708 000000048829
Some of the FFC Network Researchers who contributed with more intensity and continuity • On-line sul sito: www.fibrosicisticaricerca.it
to the FFC research programs. Redazione: • 5 x mille dell’IRPEF: Cod. Fisc. 93100600233
Gianni Mastella, Graziella Borgo,
In prima di copertina, da sinistra: Tecla Zarantonello, Federica Lavarini Nella denuncia dei redditi per i privati, le donazioni a FFC sono
Giorgio Berton, Alessandra Bragonzi, Luis Galietta, Valeria Casavola, deducibili fino al 10% del reddito complessivo e comunque non
Maria Cristina Dechecchi, Mario Romano, Nicoletta Pedemonte, Giulio Cabrini, Grafica ed impaginazione: oltre 70.000 euro/anno (art. 14 legge n. 80/2005). Per le aziende
Oscar Moran, Laura Lentini, Carlo Castellani, Olga Zagarra Ada Frapporti la deducibilità è totale e senza limiti.
In quarta di copertina, da sinistra:
Paola Melotti, Giuseppe Castaldo, Paolo Landini, Giovanna Riccardi, Alberto Luini, www.fibrosicisticaricerca.it
Stampa:
Silvia Campana, Roberto Gambari, Franco Pagani, Alessandro Pini, Claudio Sorio,
Livia Leoni, Giovanni Taccetti, Graziella Messina, Vittorio Venturi, Paolo Visca, Tipolitografia Artigiana snc
San Giovanni Lupatoto (VR) Certificazione IID 2008/10
Annamaria Bevivino Aderiamo agli standard
Stampato il 19 ottobre 2017 della Carta della Donazione
15th CONVENTION OF FFC INVESTIGATORS
IN CYSTIC FIBROSIS
XV Convention d’Autunno
dei Ricercatori in Fibrosi Cistica
nel ventennale FFC

Centro Congressi Camera di Commercio di Verona


Verona, October 26th – 28th, 2017

Work progress of projects funded by FFC (2015-2017)


Presentazione dello stato di avanzamento dei progetti
finanziati dalla Fondazione Ricerca Fibrosi Cistica
(2015-2017)

Azienda Ospedaliera
Universitaria Integrata
Verona
Program at a glance
Thursday, October 26th
10:00-11:30 Registration and poster display
11:30-13:30 Plenary Session 1: Entering the clinical world
13:30-14:30 Lunch bag & poster view
14:30-16:30 Plenary Session 2: New proposals for recovering CFTR function
16:30-17:00 Coffee breack & poster view
17:00-19:00 Plenary Session 3: New insights on CF microbiology/infection
19:00-20:00 Informal meeting: Clinical Research
Friday, October 27th
08:30-10:30 Plenary Session 4: Supporting & stabilizing CFTR function
10:30-11:00 Coffee breack & poster view
11:00-13:10 Poster Session 1 (plenary): CF Inflammation – Near clinical approaches
13:10-14:10 Lunch bag & poster view
14:10-16:10 Plenary Session 5: State of the art and new perspectives on CF disease models
16:10-16:30 Coffee breack & poster view
16:30-18:20 Poster Session 2 (plenary): CF microbiology/infection
19:30-23;00 Twenty-years FFC Celebration dinner
Saturday, October 28th
09:00-11:00 Plenary Session 6: Is there really way to contain or prevent CF inflammation?
11:00-11:20 Coffee breack
11:20-13:30 Poster Session 3 (plenary): Towards CF basic defect therapy
13:30-13:40 Closing remarks
13:40-14:00 Poster detachments

Special Notes
- The official language will be Italian. However, foreign researchers will be able to present their projects or to intervene in discus-
sion in English
- The completed projects will be presented in plenary sessions: the presentation should not exceed 14 minutes, with a maximum
of 12 slides; it will be followed by 5 min. discussion.
- The completed pilot projects will be presented in plenary session together with the approved extension project: a total of 14
minutes (12 slides) followed by 5 minutes of discussion.
- The extension projects must also be exhibited with a poster (without oral presentation in the poster session).
- Current (in progress) and new projects will be presented both as posters and as brief communications. The last ones will be held
in special plenary sessions. The oral presentation should not exceed 7 minutes (maximum 6 slides) and will be followed by 4
minutes of discussion.
- The slides will be written in English, will have a simple setting and be legible from a distance (please, prove in advance the di-
stance effect). It is recommended that the Powerpoint slides are in 16/9 format.
- The posters (printed on one sheet, with simple setup and clearly legible up to 2 meters) will have width of 90 cm and height of
140 cm and will be displayed in the poster hall before the beginning of the works.
- Speakers and moderators are invited to comply with the times indicated: this makes it possible to avoid calls, forced interruptions
and above all not to compromise the smooth running of the work.
- In this program the projects are marked with the names of the principal investigators and partners. The corresponding abstracts
in the book of abstracts may also have the names of other research collaborators.
- The presence of a clinical chairman in all the sessions intends to contribute in the discussion to identify the binding of basic study
with possible clinical perspectives.
- It is strongly recommended to all participants to attend all sessions, including the two ones on Saturday, October 28. It should
be recalled that the Convention was thought to be an opportunity for the FFC Network to take a look at everything that moves
in this area and to interweave exchanges and collaborative contacts.

3
Program /Index
Thursday, October 26th
10:00-11:30 Registration and poster display
11:30-13:30
Plenary Session 1 - ENTERING THE CLINICAL WORLD
Chairmen: Roberto Buzzetti, Claudio Sorio
Buzzetti R An introduction: why is production of independent clinical research in Italy so difficult? (20 min.)
1. Bisogni S ............................................................................................................................................................................................................................................................... 10
The use of Virtual Reality in the reduction of pain and anxiety during venipuncture in children with Cystic Fibrosis: a
randomized controlled trial (FFC#21/2016, completed)
2. Sorio C, Averna M ........................................................................................................................................................................................................................................ 11
Testing CFTR repair in cystic fibrosis patients carrying nonsense and channel gating mutations (FFC#29/2015, completed)
3. Padoan R............................................................................................................................................................................................................................................................... 11
Cystic fibrosis and meconium ileus: a multicentric study on risk factors for adverse outcome in infancy
(FFC#28/2015, completed)
4. Taccetti G .......................................................................................................................................................................................................................................................... 12
Pseudomonas aeruginosa eradication in patients with cystic fibrosis: a randomised multicentre study comparing classic
treatment protocols with classic treatment together with antibiotic treatment of upper airways (FFC#30/2015, in Progress)
– General discussion, with reference to introduction (20 min.)

13:30-14:30 Lunch bag and Poster view


14:30 -16:30
Plenary Session 2 - NEW PROPOSALS FOR RECOVERING CFTR FUNCTION

Chairmen: Alberto Luini, Valeria Raia

5/5bis. Cozza G, Tosco A, Ferrari E ........................................................................................................................................................................................................... 14


Alternative strategies for F508delCFTR repair: novel targets for drug discovery approach in Cystic Fibrosis
(FFC#2/2016 Pilot completed, FFC#10/2017 Extension)
6/6bis. Ghigo A ....................................................................................................................................................................................................................................................... 15
Development of a PI3K•-derived peptide as a novel F508del-CFTR potentiator (FFC#4/2016 Pilot completed,
FFC#11/2017 Extension)
7/7bis. Salvi M .......................................................................................................................................................................................................................................................... 16
Modulation of protein kinases in the regulation of chaperone machinery leading F508delCFTR fate
(FFC#10/2016 Pilot completed, FFC#12/2017 Extension)
8. Cavalli A, Pedemonte N ..................................................................................................................................................................................................................... 17
RNF5/RMA1 ubiquitin ligase as a drug target for mutant CFTR rescue (FFC#2/2015, Completed)
9/9bis. Galietta LJV, Bandiera T .................................................................................................................................................................................................................... 18
FFC Strategic Project: Task Force for Cystic Fibrosis (TFCF, completed) and TFCF preclinical study (New),
(35 min. including discussion)
– Raia V Final clinical commentary (5 min.)
16:30 -17:00 Coffee break and Poster View
17:00-19:00
Plenary Session 3 - NEW INSIGHTS ON CF MICROBIOLOGY/INFECTION
Chairmen: Annamaria Bevivino, Giovanni Taccetti
10/10bis. Tortoli E, Colombo C, Di Serio M ..........................................................................................................................................................................................
Establishment of single-cell and animal model to investigate pathogenesis of infection by Mycobacterium abscessus com-
plex members in cystic fibrosis patients (FFC#13/2016 Pilot completed, FFC#20/2017 Extension: presented by Cirillo DM)
11. Bertoni G ................................................................................................................................................................................................................................................ 19
Role of small RNA-based regulatory systems in cystic fibrosis airways infection by Pseudomonas aeruginosa: a new
frontier in the identification of molecular targets for novel antibacterials (FFC#14/2016, Completed)
12. Ghisotti DE ............................................................................................................................................................................................................................................ 20
Phage therapy against Pseudomonas aeruginosa Infections in Cystic Fibrosis Patients (FFC#16/2016, Completed)
13. Riccardi G, Ungaro F ..................................................................................................................................................................................................................... 21
Inhalable formulations of new molecules effective against Burkholderia cenocepacia: from in vitro to in vivo
applications (FFC#19/2015, Completed: presented by Buroni S)
14/14bis. Visca P, Peri F, Sorrentino R ....................................................................................................................................................................................................... 22
Exploiting the potential of gallium for the treatment of Pseudomonas aeruginosa pulmonary infection (FFC#21/2015,
Completed: FFC#18/2017, Extension)
15/15bis. Lorè NI ..................................................................................................................................................................................................................................................... 23
Genetically diverse mice as innovative model for cystic fibrosis (FFC#11/2015, Completed)
Phenotyping new genetically-diverse mouse models mirroring the complexity of the Cystic Fibrosis pathology
(FFC#4/2017, Extension)
– Taccetti G Final clinical commentary (5 min.)

4
19:00-20:00
INFORMAL MEETING ON CLINICAL RESEARCH

Chairmen: Carlo Castellani, Roberto Buzzetti


“Looking for ideas to improve independent clinical research”.
Free discussion based on topics suggested by the chairmen, also with reference to the introduction of the Plenary Session 1.
Chairmen will propose a concluding summary.
> At the same time, small group meetings can be held in the poster showroom.

Friday, October 27th


08:30-10:30
Plenary Session 3 - SUPPORTING AND STABILIZING CFTR FUNCTION

Chairmen: Nicoletta Pedemonte, Rita Padoan


16. Gambari R, Corradini R ........................................................................................................................................................................................................................... 24
MicroRNA Therapeutics in CF: Targeting CFTR and inflammation networks (MICRORNA-CF) (FFC#3/2016, Pilot completed)
17. Atlante A ............................................................................................................................................................................................................................................................ 25
Relationship between mitochondria and F508del-CFTR in Cystic Fibrosis (FFC#1/2015, Completed)
18. Tamanini A, Aureli M ................................................................................................................................................................................................................................ 26
Identification of molecular targets to reduce the side effect of gating potentiators on the F508delCFTR plasma
membrane stability (FFC#9/2015, Completed)
19. Duga S, Seia M, Orrenius C ................................................................................................................................................................................................................. 27
The plant cytokine kinetin and its analogues as potential therapeutic agents to correct CFTR splicing defects
(FFC#5/2015, Completed)
20. Piacentini M, Maiuri L .............................................................................................................................................................................................................................. 28
Dissecting the role of TG2 in cystic fibrosis pathogenesis: identification of possible novel therapeutic targets
(FFC#8/2015, Completed: presented by Rossin F)
– Padoan R Final clinical commentary (5 min.)

10:30-11:00 Coffee break and Poster view


11:00-13:10
Poster Session 1
CF INFLAMMATION

Chairmen: Cristina Dechecchi, Laura Minicucci


21. Romani L ........................................................................................................................................................................................................................................................... 29
Anakinra in cystic fibrosis: from targeting pathogenic inflammation to correcting CFTR defect (FFC#9/2016, In progress)
22. Recchiuti A ....................................................................................................................................................................................................................................................... 29
Resolvin D1 for Targeting Chronic Lung Inflammation, Infection, and Damage in Cystic Fibrosis (FFC#19/2016, In progress)
23. Boschi F .............................................................................................................................................................................................................................................................. 30
Testing the anti-inflammatory effects of matrix metalloprotease inhibitors in P. aeruginosa-infected CFTR-knockout mice by
in vivo imaging techniques (FFC#21/2017, New)
24. Signorelli P ....................................................................................................................................................................................................................................................... 31
Myriocin potential as a phenotype-modifying therapeutical in Cystic Fibrosis (FFC#11/2016, In progress)
25. Ungaro F, Merkel OM ............................................................................................................................................................................................................................... 32
Enabling pulmonary delivery of siRNA in cystic fibrosis lung inflammation: therapeutic potential of hybrid
lipid/polymer nanoparticles (FFC#23/2017, New)
– Minicucci L Final clinical commentary (5 min.)

NEAR CLINICAL APPROACHES

Chairmen: Natalia Cirilli, Donatello Salvatore


26. Castellani C ..................................................................................................................................................................................................................................................... 33
Outcomes of spontaneous application of carrier screening for cystic fibrosis: follow-up of its effects on birth prevalence,
neonatal screening and reproductive behaviour of carrier couples (FFC#26/2015, In progress)
27. Pistocchi AS ..................................................................................................................................................................................................................................................... 34
In vivo validation of phage therapy against Pseudomonas aeruginosa infections using the new zebrafish (Danio rerio)
animal model (FFC#22/2017, New)
28. Battezzati A, Colombo C, Lucidi V, Magazzù G, Mari A................................................................................................................................................... 35
Italian multicenter study of glucose tolerance defects in cystic fibrosis (FFC#20/2016, In progress)
29. Signoretto C .................................................................................................................................................................................................................................................... 36
Environmental and human reservoirs of Pseudomonas aeruginosa and other bacterial species colonizing the lower airways
of cystic fibrosis patients (FFC#22/2016, In progress)

5
30. Nosotti M .......................................................................................................................................................................................................................................................... 36
Extracorporeal photopheresis as induction therapy to prevent acute rejection after lung transplantation in cystic fibrosis
patients (FFC#24/2017, New)
31. Leal T, Ceri S, Nguyen-Khoa T ............................................................................................................................................................................................................ 37
Implementation of a new imaged-controlled sweat test for in vivo quantification of CFTR function: value for diagnosis
and efficacy of new therapies (FFC#5/2016, In progress: presented by Melotti P)
32. Melotti P ............................................................................................................................................................................................................................................................ 38
Human intestinal organoids for detecting CFTR rescue molecules in human plasma (FFC#7/2016, In progress)
– Salvatore D Final clinical commentary (5 min)
13:10-14:10 Lunch bag and Poster view
14:10-16:10
Plenary Session 5 - STATE OF THE ART AND NEW PERSPECTIVES ON CF DISEASE MODELS
Chairmen: Mario Romano, Vincenzina Lucidi
Alessandra Bragonzi
Animal models of Cystic Fibrosis: setting the stage and directing the workforce for the future (Lecture, 30 min.)
Discussion (10 min.)

Luis Galietta
An overview of in vitro and ex vivo CF disease models (Introduction, 25 min.)
Contributions (7 min. each, 6 slides) will follow on proposals and personal experiences of in vitro & ex vivo models ................... 39
for research and therapy support.
- Netti P Artificial full thickness airway tissue
- Sorio C Monocytes
- Castaldo G Nasal epithelial cells
- Romano M Human periodontal ligament stem cells
- Melotti P Intestinal organoids
Discussion (15 min.)
16:10-16:30 Coffee break and Poster view
16:30-18:20
Poster Session 2 - CF MICROBIOLOGY/INFECTION
Chairmen: Paolo Visca, Cesare Braggion

33. Pini A, d’Angelo I .......................................................................................................................................................................................................................................... 41


Development of inhalable particles for optimal delivery of a potent antimicrobial molecule in P. aeruginosa infected
lungs (FFC#16/2016, In progress)
34. Biavasco F ......................................................................................................................................................................................................................................................... 41
Induction of viable but non-culturable forms, possibly responsible for treatment failure, in in vitro biofilms of
Pseudomonas aeruginosa. Role of antibiotics and antibiotic concentrations (FFC#13/2017, New)
35. Fraziano M......................................................................................................................................................................................................................................................... 42
Preclinical study of a host-directed therapy based on Metformin and bioactive liposomes for the control of multidrug
resistant P. aeruginosa infection (FFC#14/2017, New)
36. Mangoni ML, Ferrera L ............................................................................................................................................................................................................................ 43
Frog skin-derived peptides for treatment of Pseudomonas aeruginosa lung infection and bronchial epithelial repair: advanced
in vitro and in vivo characterization and development of polymeric nanoparticles for lung delivery (FFC#15/2017, New)
37. Pizzo E ................................................................................................................................................................................................................................................................ 44
Pre-clinical effectiveness of three human cryptic anti-biofilm peptides (GVF27, HVA36 and IMY47): efficacy against
lung pathogens and studies in animals (FFC#16/2017, New)
38. Sabatini S .......................................................................................................................................................................................................................................................... 45
Identification of new efflux pumps inhibitors able to contrast nontuberculous mycobacterial infections in cystic fibrosis
patients (FFC#17/2017, New)
39. Bragonzi A, Corvol H ............................................................................................................................................................................................................................... 46
Cystic fibrosis modifier genes related to Pseudomonas aeruginosa lung disease (FFC#15/2016, In progress)
40. Bevivino A, Mengoni A, Segata N .................................................................................................................................................................................................... 46
A longitudinal metagenomic analysis to uncover microbial signatures of lung disease: unraveling host-microbial
community interactions in humans and animal models (FFC#19/2017, New)
– Braggion C Final clinical commentary (5 min)

19:30-23:00 Twenty-Year FFC Celebration Dinner


(Palazzo della Gran Guardia, Piazza Brà)

Saturday, October 28th


09:00-11:00
Plenary Session 6 - IS THERE REALLY A WAY TO CONTAIN OR PREVENT CF INFLAMMATION?

Chairmen: Giulio Cabrini, Giuseppe Magazzù

6
41. Cigana C, Naggi A ....................................................................................................................................................................................................................................... 48
Interfering with glycosaminoglycans during Pseudomonas aeruginosa chronic lung infection: pre-clinical exploitation of
a novel therapeutic strategy for cystic fibrosis (FFC#18/2016, Completed)
42. Evangelista V ................................................................................................................................................................................................................................................... 48
Phosphodiesterases type-4 (PDE4) inhibitors and • 2-adrenergic agonists to reduce neutrophilic lung inflammation in cystic
fibrosis. Preclinical studies and identification of biomarkers of efficacy (FFC#16/2013, Completed)
43. Dechecchi MC, Aureli M ....................................................................................................................................................................................................................... 49
A systematic investigation of miglustat-derivative iminosugar clusters as possible anti-inflammatory agents for Cystic Fibrosis
lung disease (FFC#22/2015, Completed)
44. Rimessi A ........................................................................................................................................................................................................................................................... 50
Mitochondrial quality control machinery a role in the P. aeruginosa-triggered inflammatory response in Cystic Fibrosis
(FFC#20/2015, Completed)
45. Cirillo DM ........................................................................................................................................................................................................................................................ 51
Impact of anti-Staphylococcus aureus treatment on Pseudomonas aeruginosa-induced lung damage (FFC#15/2015,
Completed: presented by Riva C)
46. Strazzabosco M ............................................................................................................................................................................................................................................ 52
CFTR-defective biliary cells from human induced pluripotent-stem cells (iPSC) as a model to study the role of innate immunity
in cystic fibrosis liver disease (FFC#24/2015: Completed)
– Magazzù G Final clinical commentary (5 min)
11:00-11:20 Coffee break
11:20-13:30
Poster Session 3 - TOWARDS CF BASIC DEFECT THERAPY
Chairmen: Oscar Moran, Marco Cipolli

47. Cereseto A, Debyser Z, Arosio D ..................................................................................................................................................................................................... 53


SpliceFix: fixing splicing defects in the CFTR gene through CRISPR/Cas9 technology (FFC#1/2017, New)
48. Moran O ............................................................................................................................................................................................................................................................ 54
Identification of the binding sites of CFTR correctors (FFC#8/2016, In progress)
49. Chilin A ............................................................................................................................................................................................................................................................... 54
New generation trimethylangelicin (TMA) analogues for selective modulation of defective CFTR or inflammation
(FFC#1/2016, In progress)
50. Lentini L, Pibiri I ......................................................................................................................................................................................................................................... 55
Optimization of a new lead promoting the readthrough of nonsense mutations for the CFTR rescue in human CF cells
(FFC#3/2017, New)
51. Millo E, Cichero E ...................................................................................................................................................................................................................................... 56
Pharmacophore and pharmacokinetic filtering tools guiding for the design and synthesis of novel thiazole-containing and
VX-809 hybrid derivatives as F508del correctors (FFC#6/2017, New)
52. Pedemonte N, Cavalli A ........................................................................................................................................................................................................................ 57
RNF5 inhibitors as potential drugs for Cystic Fibrosis basic defect (FFC#9/2017, New)
53. Ferrera L ............................................................................................................................................................................................................................................................. 58
Properties of airway mucus in cystic fibrosis: their modification by changes in the activity of CFTR and after application
of bicarbonate-continuation (FFC#12/2016, In progress)
54. Luini A ................................................................................................................................................................................................................................................................. 59
Understanding the mode of action of regulatory pathways controlling F508del- CFTR proteostasis and developing drugs
that rescue F508del-CFTR by targeting these pathways synergistically (FFC#6/2016, In progress)
55. Galietta LJV ..................................................................................................................................................................................................................................................... 60
Identification of deubiquitinases and ubiquitin ligases that affect mutant CFTR rescue (FFC#2/2017, New)
56. Netti P, di Bernardo D ............................................................................................................................................................................................................................. 61
A novel Full Thickness Cystic Fibrosis model on a microfluidic chip to study pathogenic mechanisms and evaluate
therapeutic strategies (FFC#8/2017, New)
57. Messina G ......................................................................................................................................................................................................................................................... 62
Dissecting the potency of human Mesoangioblasts to differentiate into CFTR-expressing epithelial cells: a step forward to
an innovative cell-based therapy for Cystic Fibrosis disease (FFC#5/2017, New)
– Cipolli M Final clinical commentary (5 min.)

13:30-13:40 Closing remarks


13:40-14:00 Poster detachment

APPENDICES

1. Archive of Publications & Congress Abstracts from FFC Projects ..................................................................................................................................... 63


2. Institutes and laboratories involved in FFC projects ................................................................................................................................................................... 103
3. International Reviewers of FFC Projects ............................................................................................................................................................................................ 106
4. 2002-2017 FFC Projects: funding, publications and impact factor ........................................................................................................................... 108
5. Research Funding by FFC (1997-2017) .............................................................................................................................................................................................. 109
6. FFC Projects (2015-2017) Adopted by Supporters ........................................................................................................................................................................ 110

7
INTRODUZIONE ALLA CONVENTION DEL VENTENNALE FFC

Questa XV Convention della Rete Italiana di Ri- liane, ed aperto a nuove potenziali collaborazioni.
cerca FC cade nel Ventennale della nascita della Nel panorama della Rete appare ancora insuf-
Fondazione Ricerca FC e alla conclusione della XV ficiente l’apporto della ricerca clinica. Ne cono-
Campagna Nazionale di sensibilizzazione e raccol- sciamo in parte le ragioni, prevalentemente dovute
ta fondi finalizzate a realizzare gli obiettivi della all’enorme impegno assistenziale che i potenziali
Fondazione. ricercatori clinici debbono affrontare quotidiana-
La Fondazione FFC nacque nel gennaio 1997 per mente in un contesto nazionale di carenza di per-
volontà di un gruppo di persone con storie diverse sonale e di mezzi nei centri specializzati. Tuttavia,
ma con intenti comuni: alcune provate in famiglia crediamo che ulteriori passi possano venire com-
dalla malattia, altre da lungo impegnate nell’assi- piuti, intanto potenziando l’interazione tra clinici e
stenza ai malati o nella sua organizzazione, altre ricercatori attivi in progetti di base. Si avverte infatti
provenienti dall’imprenditoria illuminata. Dopo la necessità che la ricerca biomedica istruisca una
5 anni di preparazione e di raccolta di risorse, nel maggiore connessione con chi conosce la malattia
2002 iniziò a svilupparsi la Rete di Ricerca, via via nel suo complesso e nelle sue implicazioni di cura.
cresciuta con i contributi di studio di sempre più Non basta infatti che i curanti si limitino a fornire
numerosi gruppi afferenti a università italiane, ospe- al bisogno campioni biologici o dati clinici, appa-
dali, centri CNR e istituti privati di cura e ricerca. re invece indispensabile che già nella fase di pro-
La Rete ha costituito l’incontro e l’integrazione tra gettazione vi sia un confronto tra biologi e clinici
esperienze e competenze diverse in un settore della sulla natura e sulla rilevanza del progetto rispetto
medicina, quello della fibrosi cistica, ancora molto al suo potenziale di avvicinare lo studio ai bisogni
bisognoso di nuove conoscenze verso soluzioni cu- di diagnosi e cura. E del resto, la ricerca biologica
rative possibili. La guida scientifica fu affidata ad un potrebbe dare non marginale supporto anche alla
qualificato comitato di consulenza scientifica che, revisione e ottimizzazione dei percorsi clinici cor-
con la collaborazione di un folto gruppo di esperti renti. L’obiettivo insistentemente raccomandato è
indipendenti, quasi tutti stranieri, è riuscito ad orien- infatti quello di orientare la ricerca di base nella di-
tare le linee di ricerca più promettenti attraverso la rezione cosiddetta “translazionale”. Questo implica
valutazione e la selezione annuale di progetti, i cui d’altra parte che il clinico non viva come altro da sé
risultati stanno costituendo un patrimonio di cono- l’interesse per la ricerca biomedica ma, per quanto
scenze innovative, cui ha progressivamente attinto la possibile, vi si accosti passo passo per avvicinarla al
comunità scientifica internazionale. malato, anche a livello di comunicazione con lui.
Nei piani di ricerca l’attenzione prevalente si è È anche questa la ragione del tentativo di coinvol-
rivolta con apprezzato successo ad alcuni aspetti gere più direttamente i clinici nello svolgimento di
della patologia FC con cui le persone malate anco- questa Convention: essi saranno co-moderatori in
ra debbono fare fortemente i conti, in particolare tutte le sessioni ed a loro è richiesta in conclusione
l’infezione e l’infiammazione polmonare. Tuttavia, di sessione una breve riflessione che sia di ponte
negli ultimi anni ha avuto sempre maggiore impul- tra i due versanti dell’approccio alla malattia ed ai
so la ricerca mirata a correggere il difetto di base, malati.
passando attraverso nuove conoscenze dei mec- Infine, questa Convention del Ventennale intende
canismi connessi con le anomalie generate dalle ricordare quanto la Rete di Ricerca FC sia strettamente
mutazioni genetiche, con le diverse implicazioni legata alla Rete dei Volontari FFC che in questi anni
del loro prodotto, la proteina CFTR, e la comples- hanno creduto nella Ricerca e sostenuto gli sforzi
sità della macchina cellulare che ne regola funzio- della Fondazione per renderla sempre più produttiva
ne e destino. Da questo filone stanno emergendo e competitiva. Sono loro che in larga misura hanno
proposte che nel panorama scientifico generale adottato i progetti selezionati da FFC: li scelgono, li
stanno diventando sensibilmente competitive. È fanno propri, li seguono, li comunicano nelle comu-
da questo profilo che FFC ha intrapreso il sostegno nità di tutto il territorio nazionale nelle quali attivano
ad un progetto strategico, denominato Task Force le loro iniziative di sensibilizzazione e raccolta fondi.
for Cystic Fibrosis. Il progetto è arrivato a selezio- Sono spesso persone malate, loro famigliari ed ami-
nare piccole molecole correttive di CFTR F508del ci, ma sono anche gruppi professionali ed aziende,
mutata, molto promettenti per prossimi sviluppi che dalla ricerca attendono risposte innovative e forte-
clinici. Il nome del progetto intendeva riassumere mente legate ai bisogni di cura. La Convention espri-
il senso operativo di quello studio, basato su con- me loro convinta riconoscenza e assieme a loro lancia
tributi preliminari di parecchie ricerche, anche ita- la sfida augurale per i tempi a venire.

8
INTRODUCTION TO THE TWENTY-YEAR FFC CONVENTION

The 15th Italian Cystic Fibrosis (CF) Research In the panorama of the Italian Network, the con-
Network Convention is held in the 20th year since tribution to clinical research is still insufficient. We
the inception of the Italian CF Research Foundation are partly aware of the reasons, the main one being
(FFC), and at the end of the 15th National Campaign the huge amount of assistance that potential clinical
for raising funds and awareness, an effort aimed at researchers face daily in a national context of short-
accomplishing the Foundation’s goals. age of staff and means at specialist centers. However,
FFC was born in 1997, in January, through the we believe that further steps can be accomplished,
will of a group of people with diverse backgrounds, while enhancing the interaction between clinicians
but similar intentions: some had been battling the and active researchers in basic projects. Indeed,
disease within their own family, some had long been there is a great need for biomedical research to
taking care of the sick or otherwise organizing the nurture a greater connection with those who know
various procedures, others still had been enlight- the disease as a whole and its implications for care.
ened entrepreneurs. After 5 years of stocking up on Having doctors simply presenting biological sam-
resources and funding, the Research Network began ples or clinical data is not sufficient: what is really
to develop in 2002 and continued to grow with the fundamental is a close cooperation and mutual un-
contributions of an increasing number of groups in- derstanding between biologists and clinicians, every
volved in Italian universities, hospitals, CNR centers step of the way, about the nature and relevance of
and private care and research institutes. The Network the project and how it relates to its potential to bring
was the merge between different areas of expertise the study closer to the needs of diagnosis and care.
and know-how in a medical field, that of Cystic Fi- Moreover, biological research could also provide sig-
brosis, still very much in need of new possible heal- nificant support for the revision and optimization of
ing solutions. The scientific guide was entrusted to a current clinical pathways. The repeatedly reminded
qualified scientific advisory committee that, through goal is to guide basic research in the so-called “trans-
the help of a large group of independent experts, al- lational” direction. This implies, on the other hand,
most all of whom were foreigners, managed to orient that the clinician should not see research as an au-
the most promising research lines through the an- tonomous endeavor per se, but should rather seek to
nual evaluation and selection of projects, whose re- make it more tangible for the patient, adjusting his
sults are becoming an asset of innovative knowledge communicative style to meet that goal. This is also
and a major source of insight for the international the reason for attempting to involve clinicians more
scientific community. directly in the conduct of this Convention: they will
In the research area, a lot of effort has, successful- be co-moderators in all sessions and it will be re-
ly, been put in finding a solution to some aspects of quired of them to present a brief thought to bridge
the CF pathology which patients still need to reckon the two sides of the approach to the illness and to
with, namely pulmonary inflammation and infection. the ill.
However, in the last year, there has been an ever Finally, this Twenty Year Convention intends to
increasing effort in targeting specifically the problem remember how the CF Research Network is closely
at its core, an attempt made possible by a better, linked to the FFC Volunteer Network, which in re-
newer understanding of the mechanisms linked with cent years believed in Research and supported the
the anomalies generated by genetic mutations and Foundation’s efforts to make it more productive and
their products, the CFTR protein and the complexity competitive. They have largely adopted the projects
of the cellular machine, which regulates its function selected by FFC: they choose them, nurture a deep
and its future. The proposals that are arising from this respect for them, follow them, communicate them
branch are gaining considerable competitiveness in in communities throughout the national territory
the general scientific landscape. It is from this profile in which they activate their awareness-raising and
that FFC has embarked on a strategic project called fundraising initiatives. They are often sick people or
Task Force for Cystic Fibrosis. The project managed their family members and friends, but they are also
to select small correctional CFTR F508 mutated mol- professional groups and companies that are looking
ecules, which are looking very promising for future to research for innovative solutions closely tied to
clinical developments. The name of the project in- care needs. The Convention reserves them whole-
tends to summarize the meaning of that study, which hearted gratefulness, with a nod to the future chal-
is based on preliminary contributions from several lenges we will face together.
researches, including Italian ones, and is open to
new potential alliances. Gianni Mastella

9
ABSTRACTS OF PRESENTATIONS

P L E NA RY S E S S I O N 1
ENTERING THE CLINICAL WORLD

1. The use of Virtual Reality in the reduction of p 0.013) and the pain perceived by the child evaluated by the
parent (0.7 vs 3.44, p 0.018).
pain and anxiety during venipuncture in chil- Spin-off for research & clinical purposes. This study dem-
dren with Cystic Fibrosis: a randomized con- onstrates the effectiveness of RV in patients with CF, there-
trolled trial fore it suggested that the use of VR will be systematic and
widespread in all CF outpatient clinics. Further research will
Bisogni S1, Neri S1, Ciofi D2, Festini F1 evaluate the effectiveness of this method even in subjects with
1
Università degli studi di Firenze, Dipartimento di Scienze della cognitive impairment.
Salute Umana,2AOU Meyer, Firenze (FFC#21/2016, Completed)
Realtà virtuale vs cure standard per ridurre il
dolore e l’ansia del prelievo venoso nei bambini
con fibrosi cistica
Ragioni dello studio. Fin dalla prima infanzia i pazienti
affetti da Fibrosi Cistica (CF) vengono sottoposti a perio-
dici controlli che prevedono procedure dolorose quali i
prelievi venosi (PV). Ripetute esperienze negative possono
influenzare la soglia del dolore. Infatti il bambino affetto
da patologia cronica ha una soglia del dolore più bassa
rispetto al coetaneo non affetto da patologia cronica. La
Realtà Virtuale (RV) come tecnica di distrazione è risultata
efficace durante procedure dolorose, ma nessuno studio è
stato ancora pubblicato sul suo utilizzo nel paziente con
Sofia Bisogni, responsabile del progetto Fibrosi Cistica (CF).
Ipotesi ed obiettivi. Si ipotizza che l’impiego della RV
durante la venipuntura riduca significativamente la paura,
Background and rationale. From early childhood, pa- l’ansia ed il dolore causati da questa procedura. L’obiettivo
tients with Cystic Fibrosis (CF) undergo at least 1 blood principale di questo studio è di stimare l’efficacia della RV
sample (BS) per year. As shown in previous studies it is com- nel ridurre il dolore ansia e paura durante il PV nei bambini
mon for children with CF to display distress and behavioural con CF.
problems during invasive procedures. Indeed, the child with Metodi essenziali. Sono stati considerati eleggibili i
chronic disease has a lower threshold of pain compared to pazienti di età compresa tra i 6 ed i 16 anni per i quali i
non-chronic patients. Virtual Reality (RV) as a distraction genitori abbiano fornito il consenso allo studio. I pazienti
technique was effective during painful procedures . Actu- arruolati sono stati randomizzati nel gruppo sperimentale o
ally few studies have been published to assess its efficacy nel gruppo di controllo. I pazienti nel gruppo sperimentale
in reducing needle related pain and distress in children and hanno visionato durante il PV un filmato di RV mentre quelli
none in children with CF. assegnati al gruppo di controllo hanno ricevuto durante il
Hypotesis and objectives. It is hypothesized that the use PV le cure standard.
of RV during BS significantly reduces fear, anxiety and pain A tutti i pazienti è stata applicata la crema anestetica.
caused by this procedure. The main objective of this study Il distress comportamentale è stato misurata con la scala
is to estimate the effectiveness of RV in reducing anxiety and OSBD-R e l’ansia anticipatoria con la scala M-YPAS, mentre
fear pain during PV in children with FC. la paura, il dolore e collaborazione sono state misurate con
Essential methods. Patients between the ages of 6 and 16 scala VAS.
years were considered eligible. Patients enrolled were rand- Risultati. Sono stati arruolati complessivamente 21 pa-
omized to the experimental group or control group, with a zienti, dei quali 11 nel gruppo sperimentale e 10 nel grup-
1 to 1 allocation ratio. Children assigned to the experimen- po di controllo. Prima dell’inizio della procedura il distress
tal group used VR during the BS, those in the control group comportamentale non è risultato diverso nei due gruppi
received routine care. Anesthetic cream has been applied (6,2 vs 10,3), come anche la paura percepita dal bambino
to all patients. Behavioural distress has been measured with e l’ansia. 30 secondi dopo l’inizio del filmato di RV, il di-
the OSBD-R scale and anticipatory anxiety with the M-YPAS stress comportamentale è risultato significativamente infe-
scale, while fear, pain, and collaboration were measured with riore nel gruppo sperimentale (0.1 vs 8.9, p 0.018), come
VAS scale. anche il dolore espresso dal bambino (0,6 vs 4,1, p 0,013)
Results. A total of 21 patients were enrolled, of whom 11 ed il dolore del bambino valutato dal genitore (0,7 vs 3.44,
in the experimental group and 10 in the control group. Before p 0,018).
the beginning of the procedure, behavioural distress did not Possibili ricadute per ricerca e clinica. Questo studio
appear to be different in the two groups (6.2 vs. 10.3), as dimostra l’efficacia della RV nei pazienti affetti da FC, se ne
well as the fear perceived by the child and anxiety. 30 sec- auspica pertanto un utilizzo sistematico e diffuso in tutti i
onds after the start of the RV video, behavioural distress was centri FC. Ulteriori ricerche potranno valutare l’efficacia di
significantly lower in the experimental group (0.1 vs. 8.9, p questa metodica anche in soggetti con FC affetti da deficit
0.018), as well as the pain expressed by the child (0.6 vs 4.1, cognitivi.

10
2. Testing CFTR repair in cystic fibrosis pa- method to measure CFTR function in leukocytes. Monitoring
CF patients taking CFTR correctors or potentiators with a sim-
tients carrying nonsense and channel gating ple blood test can represent a further step toward a personal-
mutations ized medicine approach in CF.
Sorio C1, Averna M2
1
Department of Medicine, Laboratory of Applied Research Analisi della correzione del difetto del canale
in Cystic Fibrosis “D. Lissandrini”, University of Verona, CFTR in pazienti con mutazione nonsense e di
2
Department of Experimental Medicine-Section of Biochemistry,
University of Genova 16132 (FFC#29/2015, Completed)
difetti di aperture del canale
Ragioni dello studio. I leucociti sono cellule del sangue
importanti negli eventi patologici associati alla fibrosi cisti-
ca. Studi precedenti hanno dimostrato che essi esprimono il
canale CFTR funzionante e che possono essere utilizzati per
monitorarne l’espressione e l’attività.
Ipotesi e obiettivi. L’obiettivo di questo studio è definire la
sensibilità e la specificità di un metodo non invasivo per mi-
surare la funzionalità del canale CFTR in un tipo di leucociti
estratti da sangue periferico (PBMCs o monociti).
Metodi. Abbiamo utilizzato una linea cellulare che sovra-
esprime CFTR, MM6, trattando queste cellule con specifici
inibitori del canale o con la tecnologia del silenziamento siR-
NA. Abbiamo isolato le cellule primarie da sangue periferico
in diversi centri ed eseguito un nuovo test basato sulla fluore-
Claudio Sorio, terzo da sinistra, con i collaboratori scenza della proteina HS-YFP per misurare l’attività di CFTR.
Risultati. In entrambe le condizioni studiate per valutare
se il test fosse specifico, trattando le cellule MM6 con inibi-
Background. In order to measure CFTR activity in a mini- tori specifici o riducendone l’espressione tramite la tecnolo-
mal invasive manner, we set up a method to assay functional gia del silenziamento, abbiamo ottenuto una riduzione del
CFTR and focussed on leukocytes from healthy and CF do- segnale statisticamente significativa rispetto alle condizioni
nors. Leukocytes are recognized in the scientific literature as di controllo. Anche nelle cellule dei pazienti il test HS-YFP
a key component of the pathogenetic events associated to sembra in grado di discriminare, attraverso la diversa capa-
cystic fibrosis and represent an easily accessible source of cità di trasportare lo iodio, i soggetti sani (n=14) dai pazienti
primary cells that might be exploited to monitor CFTR expres- CF (n=7). Al fine di ottimizzare le condizioni sperimentali
sion and activity. abbiamo provato anche diversi tipologie di stimolo e diversi
Hypothesis and objective. The major aim of this project tempi di esposizione. Più in dettaglio a Genova sono stati rac-
is to validate the sensitivity and specificity of a fluorescence colti dati riguardanti un paziente con le mutazioni G1349D/
reporter assay as a functional, minimally invasive test of F508Del in trattamento con Ivacaftor e si è registrato un au-
CFTR channel activity in peripheral blood cells (PBMCs or mento della capacità di trasporto dello iodio in tutte le visite
monocytes). dopo l’inizio della terapia (7 visite a partire da Ottobre 2015).
Methods. The readout of this method is based on measure- A Rotterdam sono stati seguiti 14 pazienti omozigoti per la
ments of the residual amount of iodide left in the cell superna- mutazione S1251N prima e dopo il trattamento con Ivacaf-
tant, after proper stimulation, quantified by the fluorescence tor e i risultati preliminari sembrano confermare l’abilità di
of Halide Sensitivity Yellow Fluorescence Protein (HS-YFP). questo farmaco nell’aumentare l’attività del canale CFTR.
Results. The specificity of the assay for CFTR activity is Tuttavia sono state identificate alcune variabili ancora da otti-
tested using two different CFTR inhibitors, CFTR-172 and mizzare tra i diversi centri.
PPQ-102, and downregulating CFTR (siRNA technology) in Possibili ricadute per la ricerca e la pratica clinica. Stia-
the acute monocytic leukemia MM6 cell line, highly express- mo valutando l’idoneità e i parametri ottimali di questo sag-
ing CFTR. The outcome was confirmed also in peripheral gio per valutare l’efficacia di possibili correttori/potenziatori
blood leukocytes collected by venipuncture (3-5 mL), per- di CFTR. La potenzialità di questo test risiede nella facile ac-
formed in different centers and by different operators. Signifi- cessibilità delle cellule primarie utilizzate (prelievo di san-
cant differences between WT and CF peripheral blood mono- gue), veloce preparazione del campione e rapida risposta.
nuclear cells (PBMC) and purified monocytes were recorded.
Of special interest were the results obtained by the HS-YFP
assay performed in PBMCs of a patient carrying the G1349D/
F508del mutation and taking Ivacaftor, showing a significant
3. Cystic fibrosis and meconium ileus: a mul-
increase in iodide transport at all time points (7) after the ticentric study on risk factors for adverse out-
start of the treatment (running from October 2015 to Sep- come in infancy
tember 2016). Furthermore leukocytes from 18 patients in
a PTC clinical trial (flow cytometry for CFTR expression and Padoan R1, Cesana B2, Falchetti D3
HS-YFP assays available), 7 patients taking Orkambi, 4 pa- 1
Centro Regionale di Supporto per la Fibrosi Cistica, Clinica
tients in clinical trial n. 108/110 (VX 770+VX 661), 5 non-CF Pediatrica, Ospedale dei Bambini, AO Spedali Civili Brescia,
patients affected by COPD, 6 patients with recurrent pancre- 2
già Dipartimento di Medicina molecolare e Traslazionale,
atitis were also tested by the HS-YFP CFTR assay. 14 S1251N Medicina e Chirurgia, Università di Brescia, 3Chirurgia
CF patients before and after ivacaftor treatment were studied Pediatrica, H Niguarda Ca’ Granda, Milano (FFC#28/2015,
in Rotterdam confirming the ability of the VX770 potentia- Completed)
tor to enhance S1251N CFTR activity in PBMCs in an acute
fashion. We identified several assay variables that need further Background. Meconium ileum (IM) is recognized as a risk
optimization among partners. factor for worse growth in early years in Cystic Fibrosis (CF)
Spin-off for research and clinical purpose. HS-YFP assay CF, as demonstrated by a previous 0-12 month population
might represent a minimally invasive, convenient and fast diagnosed for neonatal screening positivity (FFC 19/2012).

11
Metodi. Sono stati arruolati nello studio i soggetti con IM,
nati negli anni 2009-2015. È stato costruito un database per
la raccolta di dati clinici, anagrafici e di follow up: diagnosi
di ileo, storia chirurgica, (IM medico o chirurgico, semplice
o complesso), trattamenti medici e chirurgici, dati antropo-
metrici da zero a 36 mesi. Sono stati definiti outcome (ri-
sultati) negativi la mancata crescita e/o l’infezione cronica
da Pseudomonas a 1 anno, il decesso. Alcune delle variabili
valutate come eventuali fattori di rischio per un outcome av-
verso sono: la presenza di IM chirurgico, IM complicato, la
presenza di stomia, la durata della prima ospedalizzazione,
la presenza di nutrizione parenterale, l’età alla presa in carico
da parte dello specialista FC.
Rita Padoan, responsabile del progetto Risultati. Sono stati arruolati nello studio 85 soggetti se-
guiti in 13 centri. Lo studio copre il 70% dei casi italiani di IM
come riportati dal registro (85/121). 39 sono maschi.
We do not yet have epidemiological data or clinical infor- In 20 soggetti (24%) era stata posta una diagnosi prena-
mation on early life and on clinical follow-up for Italian CF tale di occlusione intestinale e in 11/20 (55%) era presente
patients with IM. We suggest that risk factors associated to atresia ileale. 71 (84%) sono IM chirurgici, di cui 33 (46%)
poor clinical outcomes might be identified in patients with complicati. 40/71 (56%) sono stati resecati, e in 41 (58%) è
MI, and eventually they might be modifiable. The first aim of stata confezionata una stomia. In 18/85 (21%) era presente
the study is to identify risk factors associated to poor clinical colestasi. In 9 su 50 (18) sottoposti a screening neonatale,
outcomes in the first year of life in MI infants. Secondary aim questo era negativo. Il 55% (47 soggetti) sono stati allattati al
is to describe complications presented in early age. seno. L’analisi statistica completa sui fattori di rischio verrà
Methods. Subjects with IM who were born in the years presentata alla Convention FFC.
2009-2015 were enrolled, followed in 13 FC Centers. A data- Conclusioni. Il database è stato costruito in modo da poter
base was built for the collection of data: diagnosis of ileum, essere utilizzato per studi prospettici internazionali. Poiché
surgical history, (IM medical or surgical, simple or complex), non esistono raccomandazioni condivise per la gestione del
CF diagnosis data, medical and surgical treatments, anthro- neonato con IM fra centri FC e chirurgie pediatriche sono
pometric data and follow up from zero to 12 months. Nega- opportuni programmi di miglioramento per la diagnosi e il
tive outcome was the failure to grow and/or chronic Pseu- follow up nel primo anno di vita.
domonas infection at 1 year, death. Some variables evaluated
as possible risk factors for an adverse outcome are: presence
of IM, complicated IM, presence of stoma, duration of the first
hospitalization, parenteral nutrition, age at CF specialist visit.
4. Pseudomonas aeruginosa eradication in pa-
Results. In the study, 85 subjects were enrolled from 13 tients with cystic fibrosis: a randomised mul-
centers. The study covers 70% of Italian IM cases as reported ticentre study comparing classic treatment
in the register (85/121). 39 are males. 20 subjects (24%) protocols with classic treatment together with
had prenatal diagnosis of intestinal occlusion and in 11/20
(55%) there was an ileal atresia. 71 (84%) were surgical IM, antibiotic treatment of upper airways
of which 33 (46%) were complicated. 40/71 (56%) were Taccetti G
resected, and in 41 (58%) a stoma was packaged. In 18/85 Dipartimento di Medicina Pediatrica, Centro fibrosi cistica -
(21%) cholestasis was present. 9 out of 50 (18%), under- Università di Firenze, Ospedale dei Bambini A. Meyer, Firenze
gone neonatal screening, this was negative. 55% (47 sub- (FFC#30/2015, in progress)
jects) were breast-fed. Full statistical analysis of the risk fac-
tors will be presented at the XV Convention FFC
Conclusion. The database has been built so that it could
be used for international prospective studies. Since there are
no shared recommendations for the management of infant
with IM between FC centers and pediatric surgeries, appro-
priate improvement programs for diagnosis and follow up in
the first year of life of MI infants are needed.

Fibrosi cistica ed ileo da meconio: studio mul-


ticentrico sui fattori di rischio per esiti avversi
durante l’infanzia
Ragioni del progetto. Un precedente studio sulla popo-
lazione 0-12 mesi diagnosticata per la positività allo scre-
ening neonatale (FFC#19/2012) ha dimostrato che l’ileo da Giovanni Taccetti, responsabile del progetto
meconio (IM) è fattore di rischio per scarsa crescita nei primi
anni di vita. A tutt’oggi inoltre non disponiamo di dati epi-
Background. Chronic pulmonary infection due to P. aer-
demiologici o informazioni cliniche sui primi periodi della
uginosa is a negative prognostic factor for cystic fibrosis (CF)
vita e sul follow-up per i pazienti italiani con IM. Obiettivo
patients. The eradication of P. aeruginosa in CF patients has
dello studio è identificare fattori di rischio per prognosi ne-
been one of the major areas of treatment success in the last
gativa nel primo anno di vita nei pazienti con IM, nell’ipotesi
10 years. Early antibiotic treatment can eliminate the bacteria
che alcuni di essi possano essere modificabili e descrivere le
in 70% of cases and delay the development of chronic infec-
complicanze cliniche che si presentano nei primi anni di vita
tion. Currently there is no gold standard treatment protocol.
nei soggetti con IM.

12
Hypothesis and objectives. It has been demonstrated stica (FC). L’eradicazione di P. aeruginosa è stata nell’ultimo
that patients can be reinfected by P. aeruginosa. Recent data decennio uno dei maggiori progressi nella terapia della FC.
indicate that the paranasal sinuses are an initial site of the Il trattamento antibiotico precoce elimina il germe dalle vie
infection and serve as a reservoir for subsequent reinfection. aeree nel 70% dei casi e ritarda notevolmente lo sviluppo
It has also been hypothesized that P. aeruginosa undergoes dell’infezione cronica. Attualmente non esiste un protocollo
genetic adaptation in the respiratory tract of CF patients. The di trattamento eradicante migliore degli altri.
main objective of this study is to compare the efficacy of two Ipotesi e obiettivo. Dopo il trattamento eradicante mol-
types of antibiotic treatment: the classic eradication protocol ti pazienti possono ripresentare infezioni da P. aeruginosa. I
used until now, versus the classic protocol together with nasal seni paranasali possono essere la sede iniziale dell’infezione
lavage with colistin. The role of the paranasal sinuses in the e avere un ruolo anche nei successivi episodi infettivi a livello
development of P. aeruginosa infection will be studied micro- polmonare. È ipotizzabile che a livello dei seni si verifichi
biologically. un progressivo adattamento genetico di P. aeruginosa alle vie
Essential methods. CF patients will be randomized to re- aeree del paziente FC. Questo studio multicentrico ha come
ceive either the classic or the experimental treatment, which obiettivo quello di comparare l’efficacia di due tipi di tratta-
will last 4 weeks in both groups. Eradication success will be mento per eliminare P.aeruginosa dalle vie aeree nelle fasi
defined as 3 negative, successive P. aeruginosa cultures within iniziali dell’infezione. Verrà inoltre studiato dal punto di vi-
6 months. Possible differences in the time required before P. sta microbiologico il ruolo dei seni paranasali nello sviluppo
aeruginosa recolonization will also be studied. The P. aerugi- dell’infezione da P. aeruginosa.
nosa strains isolated both from the sinuses and the lower res- Metodi essenziali. Un apposito software assegna in modo
piratory tract of the patients will be investigated microbiologi- casuale a uno dei due schemi di trattamento (classico o spe-
cally to evaluate genetic mutations. rimentale). Nel gruppo classico sono prescritti gli schemi e i
Preliminary results. The study was registered (Eu- farmaci finora usati nei centri, nel gruppo sperimentale sono
draCT2015-003881-96) and obtained a positive opinion prescritti gli stessi farmaci con l’aggiunta di lavaggi nasali con
from the Ethics Committee of Meyer Hospital and AIFA colistina in soluzione fisiologica. Il trattamento ha la durata
(18/5/2016). Patient randomization software and a service di 4 settimane in entrambi i gruppi. L’eradicazione viene de-
for centralising clinical and microbiological data were pro- finita come 3 risultati colturali negativi successivi nell’arco
vided. To date, 36 patients, 18 males and 18 females (mean di 6 mesi. Verranno inoltre precisate eventuali differenze nel
age 13.3 ± 10.4 years), were randomised in 3 centres. The tempo di reinfezione da P. aeruginosa.
mean±SD FEV1 values at recruitment were 78.6 ± 20.8 (% Risultati preliminari. Lo studio è stato registrato (EudraCT
of the predicted). 18 patients were randomised to classical 2015-003881-96), ha ottenuto parere positivo dal Comitato
treatment and 18 patients to classical treatment associated Etico dell’Azienda Ospedaliera Meyer e da AIFA (18/5/2016.)
with nasal irrigations with colistin. 22 (61%) out of 36 pa- ed è stata stipulata polizza assicurativa per i pazienti che vi
tients completed 6 months of follow-up having performed 3 parteciperanno. (Disposizione 279 3/8/2016). È stato disposto
cultures. There are currently no differences in primary out- un apposito software per la randomizzazione dei pazienti e
come. 14 (39%) patients, randomised most recently, have to un servizio per la centralizzazione dei dati clinici e microbio-
complete the 6-month follow-up. logici. A oggi sono stati randomizzati 36 pazienti in 3 Centri,
Expected final results and their significance. The combi- 18 maschi e 18 femmine (età media 13,3 ± 10,4 anni). I valori
nation of classic eradication therapy together with nasal lav- medi di FEV1 al reclutamento nei pazienti oggetto di studio
age could prove to be a simple and useful method for further sono 78,6±20,8 (% del predetto). 18 pazienti sono stati rando-
delaying the reappearance of P. aeruginosa in the lungs of mizzati a trattamento classico e 18 a trattamento classico asso-
CF patients. This study will help to focus on the role of the ciato a irrigazioni nasali con colistina. 22 (61%) su 36 pazienti
paranasal sinuses and reveal the possible utility of a different hanno completato 6 mesi di follow-up con 3 esami colturali.
approach to P. aeruginosa infection in CF patients. Al momento non esistono differenze nell’outcome (risultati)
> This study will be concluded on September 2018. The delay has
primario. 14 (39%) pazienti, randomizzati più recentemente,
been needed to manage administrative tasks with Ethical Commit- devono completare i 6 mesi di follow-up post-trattamento.
tees and also feasible thanks to the agreed postponement excep- Possibili ricadute per ricerca e clinica. Lo studio valuterà
tionally allowed by the Cystic Fibrosis Research Foundation. se l’associazione fra trattamento classico e lavaggio nasale
possa eradicare P.aeruginosa in modo più efficace rispetto al
Studio randomizzato multicentrico sull’eradi- solo trattamento eradicante classico. Il laboratorio di micro-
biologia inoltre, con i campioni raccolti durante le visite, stu-
cazione di Pseudomonas aeruginosa in pazienti dierà il ruolo dei seni paranasali nello sviluppo dell’infezione
con fibrosi cistica: confronto tra il trattamento da P. aeruginosa.
eradicante classico e il trattamento classico as-
> Questo studio sarà concluso nel settembre 2018. Il posticipo si è
sociato con la terapia delle alte vie respiratorie. reso necessario per gestire molteplici formalità amministrative con i
Ragioni dello studio. L’infezione polmonare cronica da vari Comitati Etici coinvolti e in virtù della proroga eccezionalmen-
P. aeruginosa è un fattore prognostico negativo in Fibrosi Ci- te concessa dalla Fondazione Ricerca Fibrosi Cistica.

13
PLENARY SESSION 2
NEW PROPOSALS FOR RECOVERING CFTR FUNCTION
5/5bis. Alternative strategies for F508del- tive in restoring F508del-CFTR function: after a preliminary
screening campaign we have identified three compounds
CFTR repair: novel targets for drug discovery (SPH1, SPH2 and SEC1) with PDI inhibitory activity, able
approach in Cystic Fibrosis to restore between 45-60% of F508delCFTR function in cell
models. To note that SPH2 is able to increase the level of
Cozza G1,2, Tosco A3, Ferrari E1, Villella VR3, Esposito S1, F508delCFTR band C of almost 90%.
Monzani R1, Spinella MC1, Venerando A4, Rossetto M2, Spin-off for research & clinical purposes. The novel com-
Bosello Travain V2, Ursini F2, Raia V3, Maiuri L1 pounds identified represent a new frontier for the treatment
1
European Institute for Research in Cystic Fibrosis (IERFC), of Cystic Fibrosis, by a) clarifying the roles of several other
San Raffaele Institute, Milan, Italy, 2Department of Molecular protein targets in CF, despite from the F508del-CFTR itself; b)
Medicine, University of Padua, Padua, Italy, 3Department paving the way for novel phase clinical studies with a combi-
of Translational medical sciences, University of Naples nation of molecules (or a single drug candidate) able to im-
Federico II, Regional Cystic Fibrosis Care Unit, Naples, Italy, prove the life of CF patients.
4
Department of Biomedical Sciences, University of Padua, Extension project. The project FFC#10/2017 will exploit
Padua, Italy (FFC#2/2016 Pilot completed; FFC#10/2017, essentially the same methodology previously described with
Extension) the aim to develop a novel generation of optimized com-
pounds against TG2, PDI and protein kinases. Aim 1: refining
existing leads for the repair of CFTR defect: we will consider
several novel analog of cysteamine and CT11 by analyzing
their ability to restore F508del-CFTR function. The same strat-
egy will be applied to a novel generation of PDI and protein
kinases inhibitors, by exploiting a novel protein purification
machinery combined with SPR technique. Aim 2: validation
tests of efficacy of drug candidates in CF: the most promising
molecules will be evaluated ex vivo in nasal cells collected
from CF patients, and in mouse model (F508delCFTR ho-
mozygous mice).

Giorgio Cozza (terzo da sinistra), responsabile del progetto e le


Strategie alternative per il ripristino funzionale
partner Antonella Tosco (a dx sopra) e Eleonora Ferrari (a dx in basso) di F508del-CFTR: nuovi target per lo sviluppo
di farmaci contro la fibrosi cistica
Background and Rationale. Cystic Fibrosis (CF) is a life- Ragioni dello studio. La Fibrosi Cistica (FC) è una malat-
shortening genetic disorder, caused by mutations of Cystic tia genetica a prognosi infausta, causata da mutazioni della
Fibrosis Transmembrane-conductance Regulator (CFTR). In proteina CFTR. In particolare nella mutazione più comune
particular, the most common F508delCFTR mutant is unable (F508delCFTR), la proteina non è in grado di spostarsi e man-
to traffic to and reside at the plasma membrane (PM). Cur- tenersi a livello della membrana plasmatica (MP). Attualmen-
rently, no highly effective CFTR-repairing therapies are avail- te non esistono terapie altamente efficaci per la mutazione
able for F508del-CFTR. For this reason our novel approach F508delCFTR. Il nostro nuovo approccio mira a migliorare il
aims at targeting the derailed CF intracellular environment, compartimento intracellulare che causa la bassa espressione
and not directly the mutant CFTR, through a combination of del CFTR sulla superficie cellulare invece di colpire diretta-
drugs (e.g. cysteamine and epigallocatechin-gallate, EGCG) mente la CFTR mutata, attraverso la combinazione di farmaci
able to inhibit TG2/PDI activities and specific protein kinases. (es. cisteamina e EGCG) in grado di inibire l’attività di TG2/
Hypothesis and Objectives. We aim to 1) Refine new tar- PDI e specifiche proteine chinasi.
gets as novel therapeutic strategy in CF by exploiting a net- Ipotesi e obiettivi. 1) definire nuovi target terapeutici nel-
work of in silico and experimental approaches; 2) Validate the la FC utilizzando un network di approcci computazionali e
efficacy of novel drug candidates in pre-clinical CF models. sperimentali. 2) Validare l’efficacia dei nuovi candidati farma-
Essential Methods. We used: a) in silico approaches to ci in modelli FC preclinici.
identify novel chemical entities able to interact with our new Metodi essenziali. a) Approcci computazionali per identi-
protein targets; b) in vitro and in cell methodologies to vali- ficare nuove molecole capaci di interagire con i nuovi target
date the best candidates from (a); c) In vivo validation into proteici. b) Metodologie in vitro e in cellule per validare i
appropriate mouse models. migliori candidati del punto a). c) Validazione in vivo in ap-
Results. a) Refining cysteamine structure: the chemical propriati modelli murini.
optimization of cysteamine led to a novel compound (CT11), Risultati. a) Ottimizzazione della cisteamina: l’ottimizza-
active in restoring F508delCFTR function equally to cysteam- zione dello scaffold (strutture di contorno)della cisteamina ha
ine in cell models (CFBE41o-), but at a concentration 500 portato all’identificazione di una nuova molecola (CT11), in
fold lower. These results were confirmed also in ex vivo ex- grado di ripristinare in modelli cellulari (CFBE41o-) la fun-
periments in nasal cells collected by nasal brushing from CF zione del F508delCFTR in maniera paragonabile alla cistea-
patients. CT11 was more efficacious than cysteamine also in mina, utilizzando concentrazioni 500 volte inferiori. Questo
vivo (F508delCFTR homozygous mice). b) New generation of risultato è stato confermato anche con studi ex vivo su cellule
safety tested natural compounds: our selection of natural com- derivate da brushing nasale di pazienti CF. CT11 si è dimo-
pounds led to the discovery of a three natural molecules (AC1, strato più efficace della cisteamina anche in vivo (topi omozi-
AC2, AC3) able to restore between 50-78% of F508del-CFTR goti per F508delCFTR). b) Nuovi derivati naturali atossici: la
function in cell models (CFBE41o-). c) Novel PDI inhibitors ac- nostra selezione di composti naturali ha portato alla scoperta

14
di 3 molecole (AC1, AC2, AC3) capaci di ripristinare in mo- rectors and potentiators, restoring membrane expression and
delli cellulari (CFBE41o-) la funzione del F508del-CFTR tra cAMP-mediated activation of the channel, have been devel-
il 50 e il 78%. c) Nuovi inibitori PDI capaci di ripristinare la oped, but their efficacy is not fully satisfactory.
funzione di F508del-CFTR: uno screening preliminare ci ha Hypothesis and objectives. The ultimate goal of this proj-
permesso di individuare 3 inibitori di PDI (SPH1, SPH2 and ect is to validate a novel therapeutic tool for CF. We recently
SEC1) in grado di recuperare la funzione del F508del-CFTR developed a peptide targeting the kinase-independent func-
tra il 45 e il 60%. Da notare che SPH2 è capace di aumentare tion of PI3K• , which we found involved in the regulation of
la banda C del F508del-CFTR di quasi il 90%. cAMP-mediated gating of the CFTR. Here, we hypothesize
Possibili ricadute per ricerca e clinica. I nuovi composti that this molecule could be therapeutically exploited to res-
rappresentano una nuova frontiera per il trattamento della cue the conductance of the most prevalent CFTR mutant,
FC: a) chiarendo il ruolo di altre proteine target nella FC, F508del-CFTR.
al di là di F508del-CFTR; b) aprendo le porte ad una nuova Essential methods. The biological function of the PI3K••
fase clinica per una combinazione di molecole (o un singo- peptide was assessed in clinically-relevant CF models, namely
lo farmaco) capaci di migliorare la vita dei pazienti affetti human primary airway epithelial monolayers and primary in-
da FC. testinal organoids from F508del patients. Moreover, with the
Progetto di estensione. Il progetto FFC#10/2017 sfrutterà aim of reducing the costs of peptide synthesis as well as po-
essenzialmente le stesse metodologie descritte in preceden- tential side effects of the compound, chemical optimization
za al fine di sviluppare una nuova generazione di molecole procedures were initiated.
ottimizzate contro TG2, PDI e proteine chinasi. Obiettivo 1: Results. The peptide potentiated F508del-CFTR and was
ottimizzazione dei composti lead esistenti per riparare il dif- significantly more efficient than the gold-standard CFTR po-
fetto della FC: prenderemo in considerazione diversi analo- tentiator VX-770 both in bronchial monolayers and in intesti-
ghi della cisteamina e del CT11 analizzando la loro capacità nal organoids. Furthermore, the peptide improved F508del-
di recuperare la funzione di F508del-CFTR. La stessa strate- CFTR conductance even after chronic Orkambi®, a condition
gia sarà applicata nello studio di una nuova generazione di wherein the gold-standard potentiator VX-770 is totally inef-
inibitori di PDI e di proteine chinasi sfruttando una nuova fective, without interfering with channel stability. On the con-
tecnologia di purificazione e la tecnica SPR. Obiettivo 2: va- trary, the peptide per se ameliorated F508del-CFTR stability at
lidazione dell’efficia dei nuovi candidati farmaci in model- the plasma membrane.
li FC. Le molecole più promettenti saranno validate ex vivo Spin-off for research & clinical purposes. The PI3K•-
in cellule nasali ottenute da pazienti FC e in modelli murini derived peptide is covered by patent number TO2014A00110
(F508del-CFTR omozigoti). - WO/2016/103176 and received the Orphan Drug Designa-
tion by the European Medicinal Agency (EU/3/17/1859) in
2017. We therefore intend to develop the PI3K• peptide as
a novel medicinal product that could be used, either alone
6/6bis. Development of a PI3K•-derived pep- or in combination with gold-standard therapies, in F508del
tide as a novel F508del-CFTR potentiator patients.
Extension project (FFC#11/2017). Within the extension of
Ghigo A1, Murabito A1, Ren K1, Pirozzi F1,2, Quinney NL3, the project, we intend to complete the chemical optimization
Caldrer S4, Sala V1, Laudanna C5, Melotti P4, Gentzsch of our peptide lead and the characterization of the therapeu-
M3, and Hirsch E1 tic potential of PI3K• peptides (parent and optimized) in CF
1
Department of Molecular Biotechnology and Health Sciences, relevant models.
Molecular Biotechnology Center, University of Torino, Torino,
Italy, 2 Division of Internal Medicine, Department of Translational Sviluppo di un peptide derivato da PI3K• come
Medical Sciences, Federico II University, Naples, Italy, 3Marsico
Lung Institute/Cystic Fibrosis Research Center, University
nuovo potenziatore del CFTR F508del
of North Carolina at Chapel Hill, Chapel Hill, USA, 4Cystic Ragioni dello studio. La causa principale della fibrosi ci-
Fibrosis Centre, Azienda Ospedaliera Universitaria Integrata stica (FC) è una mutazione nel gene che codifica il CFTR, un
Verona, Italy, 5Department of Pathology and Diagnostics, canale che trasporta ioni cloruro. Recentemente sono stati
Division of General Pathology, School of Medicine, Verona, sviluppati farmaci “correttori” e “potenziatori” del CFTR, che
Italy. (FFC#4/2016, Completed; FFC#11/2017, Extension) recuperano la funzione del canale difettoso, ma la loro effi-
cacia è insoddisfacente.
Ipotesi e obiettivi. L’obiettivo ultimo di questo progetto
è di validare un nuovo strumento terapeutico per la FC. A
questo scopo, abbiamo sviluppato un farmaco biologico, un
peptide derivato dall’enzima PI3K• che ci aspettiamo possa
essere utilizzato per ripristinare la funzionalità del CFTR che
porta la mutazione F508del, la più diffusa.
Metodi essenziali. La funzione del peptide derivato da
PI3K• è stata valutata in modelli di FC, ossia cellule dell’epite-
lio bronchiale e colture tridimensionali di cellule dell’epitelio
intestinale (organoidi) di pazienti con la mutazione F508del.
Risultati. I nostri studi dimostrano che il peptide derivato da
PI3K• è più efficiente del miglior potenziatore attualmente in
uso, VX-770, ed è in grado di recuperare la funzione del CFTR
Alessandra Ghigo, prima da sinistra, con i collaboratori F508del in colture di cellule epiteliali bronchiali e in organoi-
di intestinali. Inoltre, negli stessi modelli, il peptide potenzia
significativamente l’effetto del trattamento combinato VX-770/
Background and rationale. The underlying cause of cys- VX-809 (Orkambi®), noto per essere parzialmente inefficace
tic fibrosis (CF) is a mutation in the gene encoding the CF nei pazienti in seguito a somministrazione su lungo periodo.
transmembrane conductance regulator (CFTR), a cyclic AMP Possibili ricadute per ricerca e clinica. Il peptide de-
(cAMP)-stimulated chloride channel. A number of CFTR cor- rivato dall’enzima PI3K•, coperto dal brevetto numero

15
TO2014A00110 - WO/2016/103176, ha ricevuto nel 2017 the precise mechanism(s) of action of this class of compounds
la designazione di Farmaco Orfano dalla Agenzia Medicinale is the basis for developing an efficient combinatory therapy.
Europea (EU/3/17/1859). Abbiamo quindi intenzione di svi- Essential Methods. We performed in vitro and in cells
luppare il peptide PI3K• come un nuovo farmaco che potreb- studies to demonstrate how CK2 can affect F508del stability
be essere utilizzato, da solo o in combinazione con le terapie using transfections, specific CK2 kinase inhibitors and CK2
standard, in pazienti che hanno la mutazione F508del. knockout cells.
Progetto di estensione (FFC#11/2017). Durante l’esten- Results. We have demonstrated that CK2 inhibition may
sione del progetto, completeremo la caratterizzazione delle represent an important tool to reduce the expression of HSP27,
proprietà terapeutiche del peptide derivato dall’enzima PI3K•• a chaperone that specifically recognize F508del leading to its
in modelli di FC rilevanti per la patologia umana. Inoltre, nel ubiquitylation and degradation. Moreover the detailed mech-
tentativo di ridurre i costi di produzione di questo potenziale anisms by which HSP27 expression is regulated by CK2 has
farmaco, modificheremo la struttura chimica del peptide, ge- bees elucidated. However, the direct correlation between CK2-
nerando nuove molecole più piccole, e quindi di più sempli- HSP27-F508delCFTR is still lacking and is under study.
ce sintesi, che mantengano però le stesse funzioni biologiche Spin-off for research & clinical purposes. These pre-clin-
del peptide originale. ical study are important to provide the rationale for the use
of CK2 inhibitors in combinatory therapies with correctors
or proteostasis regulators for the rescue and stabilization of
7/7bis. Modulation of protein kinases in the F508delCFTR at the plasma membrane.
Extension project (FFC#12/2017). Our extension project
regulation of chaperone machinery leading is based on three task. Task 1. Investigation of the contribu-
F508del-CFTR fate tion of HSP27 downregulation induced by protein kinase CK2
inhibition in F508delCFTR stability. Task 2. Evaluation of CK2
Vilardell J1, Borgo C1, Cesaro L1, Gray M2, Venerando A1, as an effective target in combinatorial therapies for treating
Salvi M1 F508del patients. We have generated CFBE cells deprived of
1
Department of Biomedical Sciences, University of Padova, specific CK2 subunits that will be a very important tool to
Padova, Italy, 2Epithelial Research Group, Institute for Cell and highlight possible additive/synergic effects of CK2 inhibitors
Molecular Biosciences, University Medical School, Newcastle with correctors and potentiators. Task 3. Characterization of
University, Framlington Place, Newcastle upon Tyne, NE2 CK2 signaling in F508del-CFTR patients. We have observed a
4HH, UK (FFC#10/2016 Pilot, completed; FFC#12/2017, different CK2 subunits expression in 16-HBE and CFBE cells.
Extension) Expression and activity of CK2 subunits will be quantified in
primary cells from healthy individuals and F508del patients.

Modulazione delle protein chinasi per regolare le


molecole chaperoniche che controllano il desti-
no della proteina F508delCFTR
Ragioni dello studio. La delezione di un singolo aminoaci-
do nella posizione 508 del CFTR (F508del) è la mutazione più
frequente nei malati di Fibrosi Cistica (CF). Questa mutazione è
responsabile di un ripiegamento non corretto della proteina che
rimane bloccata nel reticolo endoplasmatico e rapidamente de-
gradata. Inoltre la minima quantità che raggiunge la membrana
plasmatica, dove la proteina svolge la sua funzione fisiologica,
mostra una emivita più breve rispetto alla forma non mutata. La
Mauro Salvi, secondo da destra, con i suoi collaboratori combinazione di due farmaci (lumacaftor-ivacaftor, OrkambiTM)
rappresenta la prima terapia approvata dalla FDA per il tratta-
mento di pazienti omozigoti per la mutazione F508del-CFTR
Background/Rationale. Deletion of phenylalanine 508 in ed attualmente la ricerca scientifica sembra suggerire che una
CFTR (F508del) is the most common mutation in Cystic fibro- terapia combinata possa generalmente offrire maggiori possi-
sis (CF) patients (70-90%). F508del-CFTR maintains channel bilità di successo rispetto alle monoterapie attualmente dispo-
activity, but the mutation causes the majority of CFTR protein nibili. La proteina chinasi CK2 è stata proposta quale bersaglio
to be retained in the endoplasmic reticulum and prematurely molecolare per trattare pazienti CF nella terapia combinata ci-
degraded by the ubiquitin-proteasome system before it reach- steamina ed epigallocatechin gallato. La cisteamina favorisce
es the plasma membrane. The combination of lumacaftor- un recupero di F508delCFTR alla membrana plasmatica mentre
ivacaftor (corrector plus potentiator, OrkambiTM) represents l’epigallocatechin gallato, che è stato selezionato per la sua abi-
the first FDA-approved therapy for CF patients homozygous lità di inibire CK2, ne amplifica gli effetti.
for F508del-CFTR mutation, and in general a combination of Ipotesi e Obiettivi. Non si conosce come la proteina CK2
therapy seems to show improved clinical benefits over avail- regoli la stabilità del F508del. Il nostro principale obiettivo è
able monotherapies. CK2 has been suggested as a potential mettere in luce i meccanismi molecolari alla base di questa
target to rescue the membrane restoring autophagy while regolazione per un utilizzo di inibitori di CK2 in terapie combi-
epigallocatechin gallate, selected for its ability to target the nate con correttori o regolatori della proteostasi (meccanismo
protein kinase CK2, sustains its permanence at the plasma che controlla sintesi, conformazione e degradazione proteica)
membrane, even if not able alone to rescue F508del-CFTR. . La conoscenza del preciso meccanismo di azione degli inibi-
Hypothesis and objectives. The main aim of the project tori di CK2 è infatti alla base di una terapia combinata.
was to reveal the molecular mechanism and clarify the role Met odi essenziali. Sono state utilizzate cellule bronchiali
of CK2 in regulating F508delCFTR stability. Indeed CK2 in- umane che esprimono CFTR normale e cellule che esprimo-
hibitors should be used in combination with F508delCFTR no CFTR con la mutazione F508del e sottoposte a trattamento
rescuing molecules, as they would permit an increase stability con inibitori specifici per CK2.
of the protein but not the maturation of F508del-CFTR to the Risultati. Abbiamo dimostrato che l’inibizione di CK2
plasma membrane where it exerts its function. Understanding può rappresentare un importante strumento per ridurre l’e-

16
spressione di HSP27, una proteina che riconosce in maniera in CFTR activity in intestinal epithelial cells. In vitro and in vivo
specifica F508del-CFTR favorendone la sua degradazione. experiments clearly demonstrate that RNF5 could constitute a
Inoltre, abbiamo chiarito i meccanismi molecolari mediante strong target for the development of novel therapies for CF.
i quali una inibizione di CK2 riduce l’espressione di HSP27. Methods. The project relied on a computational approach,
Tuttavia, evidenze di una diretta relazione tra CK2, HSP27 e based on homology modeling followed by high-throughput pro-
stabilità di F508del-CFTR non sono ancora state dimostrate. tein-ligand docking to virtually screen large collection of chemi-
Possibili ricadute per ricerca e clinica. Il nostro studio cal compounds. Biological evaluation of selected compounds
pre-clinico mira a fornire il razionale per l’uso di inibitori di was performed by means of biochemical, microfluorimetric and
CK2 in terapie combinate con correttori o regolatori della pro- electrophysiological techniques to measure CFTR-mediated ion
teostasi per il recupero e la stabilizzazione del F508delCFTR transport activity. In parallel, we also developed novel assays
alla membrana plasmatica. based on high-content imaging and analysis to monitor the ef-
Progetto di estensione (FFC#12/2017). 1. Analisi del con- fects of hit compounds on RNF5 downstream targets.
tributo della ridotta espressione di HSP27 indotta da inibitori Results. Our project has led to the identification of a drug-
di CK2 nel recupero della funzionalità di F508delCFTR. 2. like small-molecule, called 2A2, that efficiently inhibits RNF5
Valutazione dell’efficacia di CK2 quale bersaglio farmacolo- ligase activity and rescue F508del-CFTR in human bronchial
gico in una terapia combinata per trattare pazienti con mu- cells derived from CF patients. In vitro experiments demon-
tazione F508del-CFTR. Cellule bronchiali umane che espri- strated that treatment with inh-02 modulates ATG4B and pax-
mono F508del-CFTR geneticamente prive di CK2 saranno illin, both being known RNF5 targets.
utilizzate per verificare se la mancanza di CK2 possa ave- Final results and their significance. These studies point to
re effetti additivi e/o sinergici con correttori e potenziatori. potential use of RNF5 as a novel target for F508del-CFTR. Our
3. Abbiamo osservato una diversa espressione di CK2 nelle results validate RNF5 as a drug target, providing evidences to
cellule umane bronchiali sane (16HBE) rispetto a quelle che support its druggability. In addition, the efficacy of the identi-
esprimono F508delCFTR (CFBE). L’espressione e l’attività di fied compound as mutant CFTR corrector in primary cells dem-
CK2 in cellule primarie di individui sani e di pazienti con onstrate the biological relevance of this rescue mechanism.
mutazione F508del in CFTR sarà analizzata.
La ubiquitina ligasi RNF5/RMA1 quale nuovo
bersaglio terapeutico per il recupero della pro-
RNF5/RMA1 ubiquitin ligase as a drug target teina CFTR mutata
for mutant CFTR rescue Ragioni dello studio. La fibrosi cistica (FC) è una malattia
ereditaria causata da mutazioni che provocano la perdita di
Pedemonte N1, Cavalli A2 funzione di una proteina (CFTR) che trasporta ioni cloruro.
1
U.O.C. Genetica Medica, Istituto Giannina Gaslini, Genova, La mutazione più frequente è la delezione della fenilalanina
Italy, 2Dipartimento di Farmacia e Biotecnologie, Università di 508 (F508del), che blocca la maturazione della proteina, che
Bologna, Italy (FFC#2/2015) viene quindi degradata. Il difetto di maturazione può essere
trattato con molecole chiamate correttori, tuttavia, la loro ef-
ficacia è ridotta. Studiando le proteine che interagiscono con
CFTR si è visto sia in vitro su cellule sia in vivo su un modello
animale che la soppressione di una proteina chiamata RNF5
è in grado di recuperare la proteina CFTR mutata.
Ipotesi e obiettivi. Il presente progetto si proponeva di
identificare, attraverso studi computazionali, piccole mole-
cole chimiche farmaco-simili in grado di inibire l’attività di
RNF5, e di studiare i meccanismi molecolari indotti dalla
soppressione di RNF5, al fine di fornire le basi per lo sviluppo
di nuove terapie per la fibrosi cistica.
Metodi. Il progetto si è basato su un approccio compu-
tazionale che ha permesso di costruire un modello 3D della
proteina di interesse e di utilizzarlo come “stampo” per iden-
Nicoletta Pedemonte, prima da sinistra, con le collaboratrici tificare composti chimici in grado di interagire con esso. Suc-
cessivamente, è stata eseguita una valutazione biologica dei
composti basata su saggi per misurare l’attività di trasporto
Background. Cystic fibrosis (CF) is a severe hereditary ionico di CFTR (attraverso tecniche biochimiche, microfluo-
disease caused by mutations that abolish the function of a rimetriche ed elettrofisiologiche), e per evidenziare eventuali
membrane protein (named CFTR) needed to transport chlo- effetti dei composti su processi cellulari regolati da RNF5.
ride ions. The most frequent mutation in CF patients is the Risultati. Il progetto ha portato alla identificazione di un
deletion of phenylalanine 508 (F508del), causing misfolding composto, chiamato 2A2, che inibisce l’attività di ligasi di
and premature degradation of the mutant protein. The traf- RNF5, e migliora la maturazione di F508del, in cellule bron-
ficking defect can be rescued by molecules called correctors, chiali umane derivate da pazienti FC. In parallelo, abbiamo
however, the efficacy of known compounds is reduced. By dimostrato che il composto è in grado di modulare processi
studying proteins that interact with CFTR we identified the biologici noti per essere regolati da RNF5, ed in maniera con-
ubiquitin ligase RNF5 as a protein of particular interest, since sistente con la inibizione di questo enzima.
its inhibition can lead to mutant CFTR rescue both in vitro Risultati finali attesi e loro significato. Questi studi sono
and in vivo using animal models. stati mirati all’utilizzo di RNF5 come nuovo bersaglio farma-
Hypothesis and objectives. In vitro RNF5 silencing causes cologico per la F508del-CFTR. I risultati ottenuti dimostrano
a significant F508del-CFTR rescue additive/synergic with the in primo luogo la possibilità di modulare farmacologicamen-
effect of the investigational drug VX-809. RNF5 loss in F508del- te tale enzima. In secondo luogo, l’efficacia del composto nel
CFTR transgenic animals ameliorated intestinal malabsorption recuperare la funzione di F508del-CFTR in cellule bronchiali
as evidenced by changes in body weight, and reduced fecal umane derivate da pazienti FC depone a favore della sua ri-
excretion of biliary acids, and concomitantly led to an increase levanza terapeutica.

17
9/9 bis. FFC Strategic Project: Task Force for drug-likeness in a number of assays conducted at IGG, IIT, and
Contract Research Organizations (CROs). Those studies al-
Cystic Fibrosis (TFCF) lowed us to identify 2÷3 compounds as possible candidates for
preclinical development.
Bandiera T1, Pedemonte N2, Galietta Luis JV3, Tomati V2, Caci Spin-off for research & clinical purposes. The best compounds
E2, Ferrera L2, Bertozzi F3, Berti F3, Sorana F3, Rodriguez A3 identified in the TFCF project represent possible candidates to de-
1
Istituto Italiano di Tecnologia (IIT), Genova, 2U.O.C. Genetica velop novel drugs for the correction of the CF basic defect.
Medica, Istituto Giannina Gaslini (IGG), Genova, 3Telethon Extension Project (TFCF Preclinical). A preclinical study will
Institute for Genetics and Medicine (TIGEM), Pozzuoli (NA). follow, with the help of a CRO, aimed at the development of
(TFCF, Completed; TFCF preclinical study, Extention) one or more drugs (derived from TFCF molecules) for human
experimentation.

Task Force for Cystic Fibrosis (TFCF)


Ragioni dello studio. La mutazione più frequente della
proteina CFTR nei pazienti con fibrosi cistica (FC), F508del,
impedisce alla proteina di completare il processo di matura-
zione e di raggiungere la superficie cellulare. Questo difetto
può essere trattato con composti chiamati correttori. Proteine
con F508del e altre mutazioni presentano anche un difetto di
funzionamento su cui si può intervenire con un diverso tipo
di composti chiamati potenziatori. Ad oggi, non esistono cor-
rettori di F508del con buona efficacia nell’uomo ed è quindi
necessario identificarne di nuovi.
Ipotesi e obiettivi. Il progetto è finalizzato a selezionare un
Luis Galietta (riquadro in alto a sx), responsabile di progetto,
Nicoletta Pedemonte (riquadro in basso), partner nuovo correttore da avanzare allo sviluppo preclinico, ovvero l’in-
e Tiziano Bandiera (secondo da sinistra nel gruppo), partner sieme di studi propedeutici e necessari per iniziare la sperimenta-
zione clinica, e ad avviare lo sviluppo preclinico di tale composto.
In parallelo, verranno condotte attività per identificare un possibile
Background. The most frequent mutation among patients sostituto (backup) del candidato allo sviluppo preclinico.
with cystic fibrosis (CF), F508del, causes defective maturation Metodi. Il composto che verrà scelto per lo sviluppo pre-
and early degradation of CFTR protein. The F508del defect can clinico sarà testato in un ampio pannello di saggi per verificare
be targeted with compounds known as correctors. Proteins car- primariamente l’assenza di tossicità, in particolare per quanto
rying F508del and other mutations also show a channel gating riguarda gli effetti sul patrimonio genetico delle cellule, e l’a-
defect that can be addressed with another type of compounds zione su proteine coinvolte in importanti processi fisiologici.
called potentiators. Currently, there are no F508del-CFTR cor- Verranno condotti anche studi di tossicità in vivo.
rectors with adequate efficacy in human. Therefore, new com- Risultati Preliminari. Tra gli oltre 500 composti sintetiz-
pounds are needed. zati nel progetto TFCF, appartenenti alla classe dei correttori,
Hypothesis and objectives. The project aims at the selection ne sono emersi alcuni che mostrano efficacia a concentrazio-
of a compound to progress to preclinical development, and at ni molto basse su cellule bronchiali primarie da pazienti CF. I
starting preclinical development activities. In parallel, activities composti migliori sono stati studiati più in dettaglio median-
to identify a backup compound will be conducted. te saggi eseguiti in IGG e IIT, e presso aziende specializzate.
Methods.The compound that will be selected for preclini- Questi studi hanno permesso di restringere la rosa dei possibili
cal development will be tested in a large set of assays to verify candidati allo sviluppo preclinico a 2÷3 composti.
first if there is any sign of genetic toxicity and, second, if other Possibili ricadute per ricerca e clinica. I composti migliori
molecular targets are hit. A preliminary in vivo toxicity study finora identificati rappresentano possibili candidati per lo svi-
will also be conducted. luppo di nuovi farmaci per la correzione del difetto di base
Preliminary Results. Among the 500+ compounds synthe- nella fibrosi cistica.
sized as correctors in the TFCF project, we identified molecules Progrtto di estensione (TFCF Preclinical). Seguirà uno stu-
that in primary bronchial epithelial cells from CF patients show dio preclinico, con intervento anche di una CRO, mirato allo
rescue of F508del-CFTR activity at nanomolar concentrations. studio di uno o più farmaci (da molecole TFCF) per la sperimen-
Those compounds have been evaluated more in-depth for their tazione sull’uomo.

PLENARY SESSION 3
NEW INSIGHTS ON CF MICROBIOLOGY/INFECTION
10/10bis. Establishment of single-cell and ani- (FFC#13/2016, Completed; FFC #20/2017, Extension)
mal model to investigate pathogenesis of in-
Background and rationale. M. abscessus (MA) is one of
fection by Mycobacterium abscessus complex the most frequently isolated non tuberculous mycobacteria
members in cystic fibrosis patients (NTM) in patients with cystic fibrosis (CF). Despite the in-
creasing reports on prevalence of MA, including multidrug
Tortoli E1, Riva C1, Gona F1, Bragonzi A2, Cigana C2, Rossi resistant strains, its pathogenic role is still controversial, due
M1, Cirillo DM1 to the limitations of the available cellular and animal models
1
Emerging Bacterial Pathogens Unit, IRCCS San Raffaele used to study MA infection.
Scientific Institute, Milano, Italy, 2Infections and Cystic Fibrosis Hypothesis and objectives. Our hypothesis is that strains
Unit, IRCCS San Raffaele Scientific Institute, Milano, Italy of MA isolated from patients with deteriorated lung function-

18
isolati da pazienti con funzionalità polmonare compromessa
possano differire in patogenicità da quelli isolati da pazienti
asintomatici. Per questo motivo abbiamo realizzato un mo-
dello murino di infezione polmonare cronica per studiare la
patogenicità dei diversi ceppi di MA e identificare i pazienti
che potrebbero beneficiare del trattamento antibiotico.
Metodi. Ceppi di riferimento di MA (MA sspp abscessus
ATCC 19977, MA sspp bolletii ATCC 8156 and MA sspp mas-
siliense ATCC 48898) sono stati utilizzati per infettare cro-
nicamente i topi C57Bl/6Ncr. I topi sono stati analizzati per
la perdita di peso, la mortalità e i loro polmoni sono stati
processati per la conta batterica, la risposta infiammatoria e
l’analisi istopatologica.
Enrico Tortoli (secondo da sinistra), responsabile del progetto, Risultati preliminari. Per stabilire un’infezione polmonare
con i collaboratori
cronica da MA nel modello murino fino a 75 giorni, caratte-
rizzata da basse percentuali di mortalità e di eliminazione
ality may differ in pathogenicity from the ones isolated from del batterio dal polmone si sono dovute apportare delle mo-
asymptomatic patients. For this reason we established a mu- difiche al protocollo utilizzato per la preparazione delle agar
rine model of chronic lung infection to investigate the patho- beads. La carica batterica polmonare è risultata costante per
genicity of the MA subspecies (sspp) and identify the patients tutta la durata dell’infezione ( 1X10

6
-1X107) con una minima
who could benefit from antimicrobial treatment. diffusione sistemica e una stabile risposta infiammatoria nel
Methods. In this study the agar beads method, already es- compartimento bronchiale. L’analisi istopatologica polmona-
tablished for other pathogens (e.g. P. aeruginosa), was adapt- re ha rivelato la presenza di flogosi granulomatose ricche di
ed to MA sspp reference strains (MA sspp abscessus ATCC linfociti e macrofagi che caratterizzano le lesioni polmonari
19977, MA sspp bolletii ATCC 8156 and MA sspp massiliense durate tutto il corso dell’infezione da MA.
ATCC 48898) to establish chronic infection in C57Bl/6NCr Risultati finali attesi e loro significato. Durante le conti-
mice. Mice were monitored for body weight, mortality and nuazione del progetto (Progetto di estensione FFC#20/17), 6
lungs were processed for microbiological analysis, inflamma- ceppi di MA appartenenti alle 3 specie e isolati da pazien-
tory response and histological evaluation. ti FC cronici (3 sintomatici e 3 asintomatici) saranno testati
Results. Our results demonstrated that MA modified agar nel modello murino di infezione cronica. I risultati saranno
beads preparation from the standard protocol was able to es- correlati ai dati genomici per trovare i potenziali fattori di
tablish a chronic infection in mice up to 75 days with MA sspp virulenza. Sarà inoltre introdotto uno studio longitudinale
abscessus, bolleti and massiliesne, with a low rate of clearance. con la risonanza magnetica per valutare la progressione delle
The analysis of the bacterial load in the total lung showed an lesioni polmonari degli animali infetti. La disponibilità di un
high and stable number of colony forming unit (CFU) ( 1X10 
6 modello murino di infezione cronica ci permetterà di indivi-
-1X10 ) during the course of infection with minimal systemic
7 duare precocemente i ceppi che causano una malattia severa
spread and stable inflammatory response in broncoalveolar e di valutare in vivo nuovi protocolli di trattamento dell’infe-
lavage fluid (BALF) up to 75 days of infection. Lung histop- zione da MA.
thological analysis revealed granulomatomatous response with Progetto di estensione (FFC# 20/2017). Il prosieguo dello
lymphocytes and macrophage aggregation that are dissemi- studio prevede di utilizzare, per riprodurre l’infezione cronica
nated in the lung during the course of MA infection. nel modello murino, 6 ceppi di MA, due per ciascuna sot-
Spin-off for research and clinical purposes. The avail- tospecie, isolati tre da pazienti con infezione sintomatica ed
ability of a murine model for MA chronic infection will allow altrettanti da soggetti asintomatici. L’outcome sarà correlato
the identification of strains causing severe disease and open con i genomi dei ceppi allo scopo di cercare eventuali fattori
the door to further investigate the impact of MA pathogenesis di virulenza. La progressione delle lesioni polmonari sarà mo-
and treatment. nitorata mediante risonanza magnetica. In prospettiva il mo-
Extension project (FFC#20/2017). In the next year, six dello murino potrà essere impiegato per differenziare i ceppi
MA strains belonging to the three sspp and isolated both from patogeni e per testare nuovi protocolli antimicobatterci.
chronic symptomatic and asymptomatic CF patients will be
tested in murine model of chronic lung infection. Outcomes
will be matched with genomic data to find out potential viru- 11. Role of small RNA-based regulatory sys-
lence factors. Furthermore, we will perform longitudinal mon-
itoring by Magnetic Resonance Imaging (MRI) of the infected
tems in cystic fibrosis airways infection by
animals to evaluate the progression of the pulmonary lesions. Pseudomonas aeruginosa: a new frontier in
The availability of a murine model for MA chronic infection the identification of molecular targets for nov-
will allow the identification of strains causing severe disease el antibacterials
and to evaluate in vivo novel antimycobacterial protocols.
Ferrara S1, Macchi R1, Falcone M1, Rossi A2, Ranucci S2,
Messa a punto di un modello animale per lo stu- Bragonzi A2, Cigana C2, Bertoni G1
dio della patogenesi dell’infezione da Mycobacte- 1
Department of Biosciences, Università degli Studi di Milano,
rium abscessus in pazienti con fibrosi cistica Milan, Italy, 2Infections and Cystic Fibrosis Unit, Division
of Immunology, Transplantation and Infectious Diseases,
Ragioni dello studio. M. abscessus (MA) è il micobatte- San Raffaele Scientific Institute, Milan, Italy (FFC#14/2016,
rio non tubercolare più frequentemente isolato nei pazien- Completed )
ti affetti da fibrosi cistica (FC). Nonostante l’aumento della
prevalenza di MA, e la loro elevata multiresistenza, il ruolo Background and rationale. In the field of CF airways in-
patogeno rimane ancora da chiarire a causa delle limitazioni fection by Pseudomonas aeruginosa, the comprehension of
dei modelli cellulari e animali utilizzati per lo studio dell’in- molecular mechanisms underlying the infection process is
fezione da MA. crucial to the design of new clinical protocols to prevent and
Ipotesi e obiettivi. La nostra ipotesi è che ceppi di MA contrast it. Anti-virulence therapies have become an attrac-

19
spettiva, i piccoli RNA batterici (sRNA) rappresentano una
categoria ancora poco sfruttata di potenziali bersagli. È inte-
ressante inoltre notare che gli sRNA hanno mostrato di gioca-
re un ruolo chiave non solo nei meccanismi di modulazione
della virulenza batterica ma anche in processi di resistenza
agli antibiotici.
Ipotesi ed obiettivi. In questo contesto, gli obiettivi princi-
pali di questo progetto sono stati i) valutare il coinvolgimento
di tre sRNA di P. aeruginosa recentemente scoperti nel labo-
ratorio del PI (chiamati ErsA, ReaL e PesA) in meccanismi di
regolazione alla base di processi di resistenza ad antibiotici;
ii) indagare la capacità di ceppi mutati in questi sRNA di sta-
bilire infezioni croniche in modelli murini.
Giovanni Bertoni, al centro, con due collaboratrici Metodi essenziali. Per raggiungere questi obiettivi, ceppi
mutanti per gli sRNA sono stati i) soggetti alla determina-
zione della minima concentrazione inibente (MIC) per an-
tive approach that may yield drugs with high specificity and tibiotici di uso clinico; ii) analizzati in modelli murini di
narrow spectra, and in this perspective bacterial small RNAs infezione cronica.
(sRNAs) represent a largely unexploited category of poten- Risultati. I risultati ottenuti suggeriscono che lo sRNA ErsA
tial targets for anti-virulence design. Interestingly, sRNAs have sia coinvolto in meccanismi di regolazione alla base della resi-
been shown to play key roles not only in modulating bacterial stenza ad alcuni antibiotici di uso clinico. Inoltre, la delezione
virulence but also microbial processes leading to antibiotic di ErsA riduce fortemente la virulenza di P. aeruginosa in un
resistance. modello murino di infezione cronica. Questo risultato correla
Hypothesis and objectives. The main aims of this proposal con l’osservazione che un mutante di ErsA si è rivelato meno
were: i) to assess the involvement of three newly discovered pro-infiammatorio rispetto al wild-type ed ha mostrato di in-
P. aeruginosa sRNAs, named ErsA, ReaL and PesA , in regula- durre una minore mortalità in cellule bronchiali infettate.
tory mechanisms underlying antibiotics resistance; ii) to in- Possibili ricadute per ricerca e clinica. I risultati di que-
vestigate the capability of mutants for these sRNAs to estab- sto progetto hanno la potenzialità di permettere lo sviluppo
lish chronic infection in murine models. di strategie antimicrobiche innovative. Infatti, lo studio del
Essential methods. To achieve these goals, sRNA-deleted ruolo funzionale degli sRNA nell’interazione ospite/patogeno
mutants were subjected to i) Minimum Inhibitory Concentra- può fornire una conoscenza fondamentale per il disegno di
tions (MICs) determination of antibiotics commonly used in antibatterici di nuova generazione che usino gli sRNA o le
the clinical practice; ii) tests for virulence in murine models funzioni di virulenza da essi regolati come bersagli. Nel caso
of chronic infection. di utilizzo degli sRNA come bersaglio, l’informazione deri-
Results. Our results suggest that the sRNA ErsA is involved vante dagli studi meccanicistici sulla interazione sRNA/target
in regulatory mechanisms underlying resistance to certain è importante per identificare delle molecole che leghino gli
antibiotics commonly used in the clinical practice. In addi- sRNA e ne inibiscano la funzione.
tion, ErsA deletion strongly reduces virulence of P. aeruginosa
in a murine model of chronic infection. This result correlates
with the observation that an ErsA-deleted mutant is less pro-
inflammatory than the wt and induces lower cell death in 12. Phage therapy against Pseudomonas aeru-
infected bronchial epithelial cells. ginosa Infections in Cystic Fibrosis Patients
Spin-off for research and clinical purposes. The achieve-
ments of this project have the potential to foster the develop- Forti F1, Roach DR 2, Cafora M 1, Pasini ME 1, Horner DS1,
ment of innovative antimicrobial strategies. In fact, illuminat- Briani F 1, Debarbieux L 2 and Ghisotti D 1
ing the functional roles of sRNAs in host/pathogen interaction 1
Dep. of Biosciences, University of Milan, Italy, 2Institut
can provide the fundamental knowledge for the development Pasteur, Paris, France (FFC#16/2016, Completed)
of next-generation antibiotics using sRNAs and the virulence
functions that they regulate as novel targets. In the case of the
use of sRNAs as novel targets, the information resulting from
mechanistic studies on the interactions with target genes will
be invaluable for identifying drug molecules that can bind
and inhibit sRNA functions. In addition, due to their specific-
ity, these drugs would preserve CF patient healthy commen-
sal flora.

Ruolo di sistemi regolati da piccoli RNA non co-


dificanti nell’infezione da Pseudomonas aeru-
ginosa delle vie aeree di malati FC: una nuova
frontiera nell’identificazione di bersagli moleco-
lari per antibatterici innovativi Daniela Erica Ghisotti, seconda da sinistra, con i collaboratori
Ragioni dello studio. Nel campo delle infezioni delle vie
aeree CF da parte del batterio Pseudomonas aeruginosa, ri-
sulta cruciale riuscire a comprendere i meccanismi moleco- Background and rationale. Pseudomonas aeruginosa infec-
lari che stanno alla base delle infezioni al fine di progettare tions affect the airways of cystic fibrosis (CF) patients, whose
nuovi protocolli clinici per prevenirle e contrastarle. Le tera- quality of life depends largely on the therapeutic efficiency of
pie anti-virulenza appaiono come un interessante approccio antibiotic treatment. The alarming diffusion of multidrug resist-
che potrebbe condurre all’identificazione di nuovi farmaci ant (MDR) strains requires the discovery of alternative thera-
con elevata specificità e spettro ristretto ed, in questa pro- pies. Phage therapy is a promising therapeutic option.

20
Hypothesis and objectives. Phages are viruses capable to gnificativo. Inoltre, abbiamo esteso l’infezione a ceppi clinici
infect and kill bacteria, and can be used to counteract bac- MDR, mucoidi e cronici con lo stesso positivo risultato. Non
terial infections. Compared to antibiotics, phages are highly solo, ma la somministrazione preventiva del cocktail di fagi è
host-specific, avoiding collateral aspecific effects on com- in grado di ridurre la gravità dell’infezione da Pseudomonas.
mensal microbiota; moreover, they multiply when the target Possibili ricadute per ricerca e clinica. I nostri risultati
bacteria are present, increasing their number where the infec- indicano che l’uso dei fagi può essere un nuovo approccio te-
tion is active, whereas antibiotic drugs must be dispensed at rapeutico contro le infezioni da Pseudomonas che affliggono
high concentration and repeatedly to achieve a therapeutic i pazienti FC, che può anche essere proposto come profilassi.
effect. Aim of this project was the validation of phage therapy Inoltre, l’utilizzo di larve in sostituzione del modello murino
and of the larvae in vivo model system to be used as a pre- permette di effettuare una prima veloce verifica dell’efficacia
liminary alternative to the mouse model. di un particolare tipo di fago contro uno specifico batterio.
Essential methods. We isolated new phages able to in- Analisi che presenta evidenti vantaggi sia dal punto di vista
fect P. aeruginosa and characterized their ability to grow on a economico sia dal punto di vista etico.
large number of Italian P. aeruginosa clinical strains, isolated
from CF patients. Six phages were mixed in a cocktail. The
genome sequence of the six phages excluded the presence 13. Inhalable formulations of new molecules
of genes undesired for phage therapy, such as genes encod-
ing toxins or lysogenic functions. We tested the ability of the effective against Burkholderia cenocepacia:
phage cocktail to eliminate P. aeruginosa infections in vivo. from in vitro to in vivo applications
Results. Two different in vivo animal models were com-
pared: acute respiratory infection in mouse and bacteremia Riccardi G1, Ungaro F2, Buroni S1
in Galleria mellonella larvae. In both models we showed that 1
Laboratorio di Microbiologia Molecolare, Dipartimento di
bacterial infection can be counteracted by administration of Biologia e Biotecnologie Lazzaro Spallanzani, Pavia, 2Dip.
the phage cocktail. Survival of mice was recovered at 100%, di Farmacia - Università degli Studi Federico II, Napoli
whereas in Galleria larvae a significant delay in lethality was (FFC#19/2015, Completed)
observed. The use of the Galleria model was extended to infec-
tions caused by clinical strains, including MDR, chronic and
mucoid strains. Furthermore, administration of the phage cock-
tail to larvae prior to bacterial infection provided prophylaxis.
Spin-off for research & clinical purposes. Our results con-
firm that phage therapy could be a valid treatment option
against P. aeruginosa infections, not only with a therapeutic
effect but also as prophylaxis, and indicate that larvae can be
used as a preliminary approach, costless and without ethical
constraints, to determine the efficiency of a phage treatment
to resolve a specific infection.

Terapia fagica per combattere le infezioni da


Pseudomonas aeruginosa in pazienti con fibro-
Giovanna Riccardi, seconda da destra, con i collaboratori
si cistica
Ragioni dello studio. Pseudomonas aeruginosa è il batte-
rio patogeno più comune in infezioni polmonari di pazienti Background. Burkholderia cenocepacia is a dangerous
con fibrosi cistica (FC), la cui qualità di vita dipende molto opportunistic pathogen for Cystic Fibrosis (CF) patients, re-
dal successo della terapia antibiotica nel controllo delle in- sistant to almost classes of available antibiotics . Advanced
fezioni. La comparsa e diffusione di ceppi batterici multiresi- formulations for pulmonary administration represent an ideal
stenti agli antibiotici (MDR) rende spesso inefficace la cura. way to locally treat the infections. A benzothiadiazol deriva-
Di conseguenza, in tutto il mondo, si cercano nuove terapie tive (C109) has been shown to be effective against B. ceno-
capaci di sostituirli. cepacia , but it is poorly soluble so, for translation in vivo, it
Ipotesi e obiettivo. La terapia fagica, cioè l’uso dei fagi needs to be adequately formulated.
per combattere le infezioni batteriche è una delle possibili Hypotesis and objectives. 1. To characterize the cellular
soluzioni proposte. I fagi sono virus che infettano solamente target of the compound; 2. to develop safe and effective in-
i batteri patogeni, causandone la morte, senza alterare la mi- halable formulations for a prompt translation in vivo; 3. to
croflora intestinale. Scopo di questo progetto era confermare test the efficacy of drug formulations against B. cenocepacia
l’efficacia della terapia fagica nel combattere le infezioni da and to perform toxicity studies on bronchial epithelial cells; 4.
P. aeruginosa e eventualmente nel prevenirle. Inoltre, si inten- to test the formulations in mouse models of B. cenocepacia
deva validare l’utilizzo del modello in vivo ricorrendo a lar- infection.
ve, in alternativa al modello comunemente utilizzato (topi). Methods. C109 target characterization has been pursued
Metodi essenziali. Abbiamo isolato e caratterizzato nuovi through biochemical experiments. Drug nanosuspensions were
fagi contro P. aeruginosa verificando la loro capacità di infet- produced by evaporative precipitation into aqueous solution
tare un gran numero di ceppi isolati da pazienti Italiani FC. in the presence of different stabilizers and freeze-dried with a
Sei fagi, che mostravano caratteristiche adatte ad essere usati cryoprotectant. The resulting dry powder has been tested in
per la terapia, sono stati mescolati in un cocktail, di cui è sta- vitro through the microdilution method, while cytotoxicity was
ta saggiata la capacità di combattere le infezioni causate da P. checked through a cell viability assay. Meanwhile, in vivo toxic-
aeruginosa. Sono stati messi a confronto due diversi modelli ity and efficacy studies have been performed in healthy mice
di infezione in vivo, il topo e le larve di Galleria mellonella. and in a mouse model of B. cenocepacia infection.
Risultati. La somministrazione del cocktail di fagi ha Results. C109 cellular target, which is involved in cell divi-
debellato l’infezione acuta nel 100% dei topi, conferman- sion, was purified and biochemically characterized. Inhalable
do l’efficacia della terapia fagica. Nel modello delle larve, formulations of C109 were developed, fully characterized in
abbiamo osservato che la letalità viene ritardata in modo si- view of pulmonary delivery and tested against B. cenocepacia

21
and human cells with good results. Nevertheless, in vivo experi-
ments suggested a dose-dependent toxicity of the formulation
when intratracheally administered in mice. To elucidate this phe-
nomenon, C109 nanocrystals stabilised with different types and
amounts of excipients are under investigation in vitro and in vivo.
Spinn-off for research and clinical purposes. We devel-
oped inhalable formulations effective against B. cenocepacia,
clinical isolates, other Gram-negatives and S. aureus, not toxic
on CF human lung epithelial cells, and administrable in vivo
which is currently being improved to be tested in a murine
model of B. cenocepacia infection.

Formulazioni inalabili di nuove molecole attive


contro Burkholderia cenocepacia: dalle applica-
zioni in vitro a quelle in vivo Paolo Visca, primo a destra, titolare del progetto; nei riquadri a
Ragioni dello studio. Burkholderia cenocepacia è un pa- destra in alto, Francesco Peri, sotto, Raffaella Sorrentino, partner
togeno opportunista molto pericoloso per i pazienti affetti da
Fibrosi Cistica e resistente a quasi tutte le classi di antibiotici
disponibili. Queste infezioni possono essere trattate local- Background and rationale. Morbidity and mortality in
mente utilizzando formulazioni per somministrazione pol- cystic fibrosis (CF) patients is ultimately attributable to per-
monare. Un derivato benzotiadiazolico (C109) ha dimostrato sistent pulmonary infection mainly caused by the bacterium
una buona efficacia contro B. cenocepacia ma, essendo poco Pseudomonas aeruginosa (Pa). The emergence of antibiotic
solubile, deve essere adeguatamente formulato per poter es- resistance in Pa has become a worrisome problem that calls
sere somministrato in vivo. for the identification of new drug targets for the development
Ipotesi e Obiettivi. 1. caratterizzare il bersaglio cellulare of new antimicrobials.
del composto; 2. sviluppare formulazioni inalabili sicure ed Gallium (Ga3+) inhibits bacterial growth, acting as an
efficaci da utilizzare in vivo; 3. testare l’efficacia delle formu- iron mimetic, and is a drug already used in clinical practice
lazioni contro B. cenocepacia ed effettuare prove di tossicità (Ganite®) for the treatment of non-infectious disorders2.
su cellule epiteliali bronchiali; 4. testare le formulazioni in Hypothesis and objectives. Pa erroneously incorporates
modelli murini di infezione da B. cenocepacia. Ga3+ instead of Fe3+ within essential molecules being unable
Metodi. Il bersaglio cellulare del composto C109 è sta- to discriminate between these two ions, ultimately resulting in
to caratterizzato mediante tecniche biochimiche. Sono state suppression of bacterial growth. Fostered by our previous ob-
preparate nanosospensioni inalabili di C109 mediante nano- servations that the anti-Pseudomonas activity of Ga3+ can be
precipitazione in soluzione acquosa in presenza di diversi potentiated by complex formation with suitable ligands (i.e.
eccipienti. Le formulazioni sono state testate in vitro attraver- PCH: the Pa siderophore pyochelin), the specific objective
so microdiluizione, mentre la citotossicità è stata verificata of this project has been the development of Ga3+ compounds
mediante un test di vitalità su cellule umane. Infine, studi that can specifically and selectively be directed to Pa in the
preliminari di tossicità ed efficacia sono stati condotti me- lung of CF patients, via inhalable formulations.
diante somministrazione intratracheale in un modello di infe- Essential methods. We have capitalized upon expertise
zione da B. cenocepacia. in organic synthesis, pharmaceutical chemistry and mi-
Risultati. Il bersaglio cellulare di C109, coinvolto nella crobiology to: i) synthesize gallium complexes ex novo; ii)
divisione cellulare, è stato purificato e caratterizzato dal pun- generate a panel of biosensors Pa strains to investigate their
to di vista biochimico. Sono state sviluppate con successo mechanism of action; iii) generate new formulations for in
formulazioni per inalazione di C109, caratterizzate in vista vivo administration and determine their pharmacological
dell’applicazione polmonare e testate contro B. cenocepacia and antibacterial activity; iv) investigate acute toxicity and
e cellule umane con buoni risultati. Gli esperimenti nel topo, the organ distribution of Ga(NO3)3, upon intra-tracheal ad-
tuttavia, hanno rivelato una tossicità dose-dipendente dovuta ministration in rats.
probabilmente agli eccipienti. Al fine di chiarire questo feno- Results. We generated a panel of luminescence-based
meno, nanosospensioni inalabili di C09 stabilizzate con ec- biosensors which allowed us to elucidate how PCH and
cipienti diversi per tipo e quantità saranno oggetto di ulteriori PCH-based carriers enter the Pa cell and affect pch genes
studi in vitro/in vivo. expression. Moreover, we have optimized some reactions in
Possibili ricadute per ricerca e clinica. Abbiamo svilup- the multistep synthesis of Ga3+ carriers and developed novel
pato una formulazione per inalazione efficace contro B. ce- dry powders for inhalation. Remarkably, all our in vivo results
nocepacia da isolati clinici, e contro altri Gram-negativi e S. clearly prove the possibility of using Ga3+ for inhalation, since
aureus. La formulazione non è tossica ed è pronta per essere we did not observe any toxicity, at least after a single dose and
testata in un modello murino di infezione da B. cenocepacia. up to 14 days. In addition, the pharmacokinetic results con-
firm the possibility to reach significant Ga3+ levels in the lung.
Spin-off for research & clinical purposes. In the worrying
scenario of increasing antibiotic resistance in Pa, the identifi-
14/14bis. Exploiting the potential of gallium cation of new antimicrobials such as Ga3+-based compounds,
for the treatment of Pseudomonas aeruginosa is highly desirable. These compounds hold great promise for
pulmonary infection the progression into drugs with potential clinical applicability
in the short-medium perspective.
Visca P1, Peri F2, Sorrentino R3 Extension project (FFC#18/2017). The microbial flora of
1
Department of Sciences, University Roma Tre, Rome, the respiratory tract in patients with cystic fibrosis (CF) is a
2
Department of Biotechnology and Biosciences, University of diverse ecosystem in which multispecies communities coex-
Milano Bicocca, Milan, 3Department of Pharmacy, University ist. Increasing antibiotic resistance concerns all CF pathogens,
of Naples Federico II, Naples (FFC#21/2015 completed; not only Pa. Given the ability of Ga3+ to inhibit the growth
FFC#18/2017, Extension) of Gram-positive as well as Gram-negative bacteria, Ga3+-

22
derived compounds may represent good candidates to gen- 15/15bis. Genetically diverse mice as innovative
erate broad-spectrum antimicrobials. This one-year extension
project will capitalize on our previous experience on the use
model for cystic fibrosis (FFC#11/2015, completed).
of Ga3+ against Pa, with the main aims of: i) comparatively Phenotyping new genetically-diverse mouse
evaluating the antibacterial activity of selected Ga3+ com- models mirroring the complexity of the Cystic
plexes/formulations against major CF pathogens, and ii) to Fibrosis pathology (FFC#4/2017, Extension)
investigate their toxicology and pharmacokinetics.
Sipione B1, Viviani F1, De Fino I1, Iraqi F 2, Bragonzi A1, Lorè
Utilizzo del gallio come antibatterico nel tratta- NI1
mento delle infezioni polmonari da Pseudomo- 1
Infection and Cystic Fibrosis Unit, Division of Immunology,
nas aeruginosa Transplantation and Infectious Diseases, IRCCS - San Raffaele
Scientific Institute, Milan, Italy, 2Department of Clinical
Ragioni dello studio. I pazienti con fibrosi cistica (FC)
Microbiology and Immunology, Sackler Faculty of Medicine,
vanno incontro a frequenti infezioni polmonari, causate prin-
Tel Aviv University, Ramat Aviv, 69978, Tel Aviv, Israel
cipalmente da P. aeruginosa (Pa), che cronicizzano e com-
promettono la funzionalità respiratoria. Il fenomeno dell’an-
tibiotico-resistenza nei ceppi di Pa responsabili di infezioni
in FC è oggi aggravata dalla mancanza di nuovi antibiotici.
Il gallio (Ga3+) inibisce la crescita batterica agendo da ferro-
mimetico, ed è già utilizzato in medicina (nome commer-
ciale Ganite®) per il trattamento di patologie non infettive.
Le sue proprietà farmacologiche si basano sulla somiglianza
chimica tra lo ione Ga3+ e lo ione ferrico (Fe3+).
Ipotesi e obiettivi. Pa è incapace di distinguere Ga3+ e
Fe , e quindi incorpora erroneamente Ga3+ al posto di Fe3+
3+

risultandone inibito. Il nostro obiettivo principale è quello di


ottenere dei derivati del Ga3+ più attivi ed opportunamente
formulati per la veicolazione aerosolica e di dimostrarne la
fattibilità e la sicurezza terapeutica.
Metodi essenziali. Abbiamo combinato competenze in
chimica organica, chimica e tecnica farmaceutica, micro-
biologia e farmacologia per: i) sintetizzare ex novo com- Nicola Ivan Lorè, al centro, con collaboratori
plessi del Ga3+, ii) generare un pannello di biosensori utili
alla comprensione del meccanismo d’azione, iii) generare
formulazioni farmaceutiche e determinare le caratteristi- Background. Clinical evidences suggest that the outcome
che farmacologiche e l’efficacia nel combattere le infezioni of the respiratory infections may be extremely variable among
causate da Pa, iv) valutare la tossicità e la distribuzione del cystic fibrosis (CF) patients. In addition to the CF transmem-
Ga(NO3)3 in vivo in seguito alla somministrazione intra-tra- brane conductance regulator (CFTR) gene defect, the progres-
cheale nel ratto. sion and severity of pulmonary disease seems to correlate also
Risultati. Al fine di favorire l’entrata del Ga3+ nella cel- to other genetic factors. Several CF mouse models were gener-
lula batterica sono state sintetizzate delle molecole con una ated by using redundant genetic backgrounds, which do not
struttura analoga al sideroforo piochelina, una molecola na- represent the heterogeneity of the human population. Recently,
turalmente prodotta da Pa durante l’infezione. Utilizzando Collaborative Cross (CC) mouse population has been gener-
un pannello di ceppi Pa biosensori è stata valutata la capacità ated as a powerful source to model the diversity of the human
dei veicoli di nuova sintesi di entrare nella cellula batterica population and overcoming the limitation of existing resources.
e di indurre la produzione di piochelina. In parallelo, sono Hypotesis and objectives. The underlying hypothesis guid-
state sviluppate delle nuove formulazioni inalabili di Ga3+. ing our proposal is that the disruption of CFTR in populations
Esperimenti nel ratto hanno dimostrato che il Ga3+ non ha with genetic diversity may cause different pathological altera-
effetti tossici e che, se somministrato per via inalatoria, rag- tions in the lung when compared to genetic backgrounds of
giunge elevate concentrazioni nei polmoni. the common laboratory strains. Thus, this project will take
Possibili ricadute per ricerca e clinica. Nella prospettiva advantage of unique CC mice and existing CF mouse model
di un prevedibile aumento dell’antibiotico-resistenza in Pa, (ΔF508-/-) to generate new ΔF508-/- murine lines in CC genetic
è auspicabile che siano sviluppati approcci antimicrobici background with deviant susceptibility to airway infection.
innovativi, come la terapia con gallio, che offre la speran- Methods. Selection of candidate resistant (R) and suscep-
za di essere trasferita dal laboratorio alla clinica nel breve- tible (S) CC lines to P. aeruginosa infection was performed
medio termine. using a data sets, including survival rate, bacterial load and
Progetto di estensione (FFC#18/2017). Il polmone dei inflammatory response. By backcross breeding, the ΔF508-/-
pazienti affetti dalla fibrosi cistica rappresenta un ecosiste- mutation have been introduced in two (R and S) CC back-
ma complesso in cui più specie batteriche coesistono. Date grounds. Marker-Assisted Accelerated Backcrossing was used
le proprietà antibatteriche del Ga3+, una strategia vincente è to accelerate backcross strategy.
rappresentata dallo sviluppo di composti Ga-derivati che ab- Results. Phenotypic characterization of CC lines showed
biano un ampio spettro d’azione. Grazie all’esperienza matu- that the host genetic diversity influences the progress and
rata nello studio delle proprietà del Ga come agente anti-Pa, severity of P. aeruginosa airway infection, in term of bacte-
in questo anno di estensione del progetto sarà effettuato uno rial load and inflammatory cytokines, such as KC, Mip-2 and
studio comparativo dell’attività antibatterica di complessi/for- TNF-α. Based on these results, ΔF508-/- of C57Bl/6 mice has
mulazioni del Ga contro i principali patogeni della fibrosi ci- been backcrossed into two CC lines with deviant phenotypes,
stica. Inoltre, saranno valutate sia la tossicità che le proprietà resistant CC-R and susceptible CC-S mouse strains for airway
farmacocinetiche dei composti/formulazioni che risulteranno disease. We encontered good fertility and breeding perfor-
più promettenti nei saggi in vitro. mance. We have now generated two new lines C57Bl/6N-CC-
RΔF508-/- and C57Bl/6N-CC-S ΔF508-/- for further characterization.

23
Spin-off for research & clinical purposes. Two new CF murini con mutazione ΔF508 in assetti genetici caratterizzati
mouse models were generated and will be used to study the da diversa suscettibilità alle infezioni delle vie respiratorie.
role of the genetic background in the CF pathogenesis. This Metodi. Linee di topo CC sono state caratterizzate per la
population can be considered a potential tool for future stud- gravità della patologia polmonare al fine di selezionare quel-
ies on CF modifier genes/prognostic markers. le più resistenti (R) e suscettibili (S) all’infezione respiratoria
Extension project (FFC#4/2017). Thanks to the previ- da P. aeruginosa. Linee murine selezionate dalla popolazione
ous project FFC# 11/2015 we have developed two new CF CC sono state incrociate con un modello già esistente di topo
murine strains (C57Bl/6N-CC-RΔF508-/- and C57Bl/6N-CC-S FC con l’obiettivo di trasferire la mutazione ΔF508 nel profilo
ΔF508-/-
) that will be phenotyped under this project. We plan genetico del topo CC.
to analyze pathological mechanisms induced spontaneuosly Risultati. La caratterizzazione fenotipica in topi CC, mo-
or after infection by P. aeruginosa. Thus, inflammatory and stra che il profilo genetico dell’ospite influenza la severità e
microbiological profile during basal conditions or after acute la progressione dell’infezione da P. aeruginosa. Sulla base di
and chronic airways infection will be studied. Histopathology questi risultati, sono state selezionate due linee murine della
will be associated with quantitative analyses to highlight cel- popolazione CC aventi diversi profili genetici (R e S). Attra-
lular and structural modifications in the lung. Overall results verso approcci genetici e molecolari, abbiamo introdotto la
will provide new knowledge about CF pathogenesis and new mutazione ΔF508 nelle due linee CC-S e CC-R e generato
animal model for CF community potentially usefull for pre- nuovi modelli murini CC-S-ΔF508 e CC-R-ΔF508. Ci aspet-
clinical studies on innovative personalized therapies. tiamo che questi modelli manifestino la malattia polmonare
FC con diversa gravità.
Nuovi modelli murini di fibrosi cistica con diver- Possibili ricadute per ricerca e clinica. Due nuovi mo-
delli murini per lo studio della FC sono stati generati. Questi
si profili genetici avranno un impatto su diverse aree di ricerca FC: i) studio
Ragioni dello studio. Nei pazienti con fibrosi cistica (FC), della fisiopatologia delle vie respiratorie in soggetti con la
la variabilità individuale della progressione e gravità della mutazione ΔF508; ii) identificazione di potenziali geni modi-
malattia polmonare è influenzata dal difetto del gene CFTR ficatori o marcatori prognostici in FC.
ma anche associata a specifici fattori genetici dell’ospite Estensione del progetto (FFC#4/2017). Grazie al preceden-
(geni modificatori). Finora nei modelli murini è stata trascu- te progetto FFC# 11/2015 abbiamo generato due nuovi mo-
rata l’importanza del profilo genetico individuale come de- delli murini FC. L’obiettivo del nuovo progetto sarà quello di
terminante della gravità della malattia FC. Infatti, sono stati fenotipizzare i due nuovi ceppi. In particolare, analizzeremo
sviluppati diversi modelli murini FC, utilizzando profili ge- la patologia insorta spontaneamente o indotta dall’infezione
netici ridondanti che non rappresentano l’eterogeneità della da P. aeruginosa nel polmone. Studieremo il profilo infiamma-
popolazione umana. Recentemente è stata generata una po- torio e microbiologico in condizioni basali e durante processi
polazione murina, chiamata ‘Collaborative Cross’ (CC), che d’infezione acuta e cronica. In aggiunta, verranno effettuate
mima la diversità genetica della popolazione umana. analisi istologiche per evidenziare possibili modificazioni cel-
Ipotesi e obiettivo L’ipotesi di questo progetto è che il difet- lulari e strutturali a livello polmonare. Questo nuovo modello
to del canale CFTR in popolazioni con profili genetici differen- potrà fornire nuove conoscenze riguardo la patogenesi FC e
ti possa causare diverse alterazioni patologiche nel polmone. nuovi modelli sperimentali utili per studi preclinici su terapie
Pertanto, l’obiettivo del progetto è di generare nuovi modelli innovative personalizzandole in base alla risposta individuale.

PLENARY SESSION 4
SUPPORTING AND STABILIZING CFTR FUNCTION
16. MicroRNA Therapeutics in CF: Targeting
CFTR and inflammation networks (MICROR-
NA-CF)

Gambari R1, Corradini R2


1
Dipartimento di Scienze della vita e Biotecnologie, Sezione
di Biochimica e Biologia Molecolare, Università di Ferrara,
2
Dipartimento di Chimica, Università di Parma (FFC#3/2016
Pilot completed)

Background. Epigenetic regulation of expression of defec-


tive CFTR protein by microRNAs (a class of short non-coding
RNAs exhibiting key roles in the control of gene expression) Roberto Gambari, al centro, con le collaboratrici
has been reported in the literature and explored by different
groups in CF primary bronchial epithelial cells in vitro or from
bronchial brushings ex vivo. In addition, microRNAs are ex- pression and function of CFTR and CFTR-interacting proteins;
pected to be involved in controlling the expression of proteins of (b) study of changes of the gene expression in CF using PNAs
the CFTR interactome. Modulation of miRNA expression can be targeting microRNAs; (c) development and biological valida-
achieved by the use of pre-miRNAs as well as using antagomiRs, tion of novel PNA-based molecules interfering with multiple
including peptide-nucleic acids (PNAs). microRNAs.
Hypothesis and objectives. The major objectives of MI- Key methods. Identification and validation of microRNAs/
CRORNA-CF were: (a) identification of microRNAs highly mRNAs networks involved in CF have been performed using
expressed in epithelial cells and involved in regulation of ex- bioinformatics tools. The modulation of microRNA activity

24
has been studied using PNAs targeting the 3’UTR sequences tro miR-335-5p aumenta il contenuto (Western blotting) e
of CFTR, NHERF1 and EZR mRNAs. PNA-based antagomiR la funzionalità (in cellule FRT-YFP F508del CFTR) di CFTR,
molecules and suitable delivery systems have been employed. con un’attività simile a VX809. Tutti i PNA valutati si sono
Results. PNAs have been synthesized and tested targeting dimostrati non tossici, non interferendo con la proliferazione
the 3’UTR of CFTR, EZR and NHERF1 mRNAs. We have dem- cellulare e non inducendo apoptosi.
onstrated that PNAs specific for miR-145-5p and miR-101-3p Possibili ricadute per ricerca e clinica. La conclusione di
inhibit miR-145-5p and miR-101-3p biological activity (mutant questo progetto pilota è che il targeting con PNA di microR-
PNAs being not effective) and increase CFTR mRNA content NA regolatori di CFTR e del suo interattoma possono essere
(RT-qPCR) and CFTR protein production (Western blotting) by considerati potenziali modulatori del processo di rescue della
cystic fibrosis Calu-3 cells. We have found that a PNA targeting proteina CFTR mutata.
miR-335-5p (specific for NHERF1 3’UTR sequence) inhibits
miR-335-5p and induces NHERF1 production (Western blot-
ting). At the same time, it is able to increase CFTR (Western 17. Relationship between mitochondria and
blotting) and CFTR function in the FRT-YFP F508del CFTR cells.
The potency of this effect was similar to VX809. All the em- F508del-CFTR in Cystic Fibrosis
ployed PNAs were not toxic, did not induce inhibition of cell
growth and activation of apoptosis. Atlante A
Spin-off for research & clinical purposes. The general Istituto di Biomembrane, Bioenergetica e Biotecnologie
conclusion of this pilot project is that PNA-based targeting Molecolari (IBIOM) - Bari (FFC#1/2015, Completed)
of miRNAs regulating CFTR and players of the CFTR interac-
tome could implement mutated CFTR rescue.

Strategie terapeutiche in Fibrosi Cistica basate su


MicroRNA in grado di modulare CFTR e infiam-
mazione (MICRORNA-CF)
Ragioni del progetto. La regolazione epigenetica (regola-
zione dovuta a materiale genetico non cromosomico, n.d.r.)
dell’espressione della proteina difettiva CFTR da parte dei mi-
croRNA (una classe di piccole molecole di RNA non codifi-
canti che hanno un ruolo chiave nel controllo dell’espressio-
ne genica) è stata riportata in letteratura ed è già stata studiata
da numerosi gruppi di ricerca, in vitro nelle cellule epiteliali
bronchiali primarie, ex vivo su brushing bronchiali. Anche il Anna Atlante, a destra, con una collaboratrice del progetto
controllo dell’espressione delle proteine dell’interattoma di
CFTR coinvolge microRNA. La modulazione dell’espressione
dei miRNA può essere ottenuta mediante l’uso di pre-miRNA, Background. It is known that i) some steps of mitochon-
nonché utilizzando antagomiRs, tra cui quelli basati su acidi drial oxidative phosphorylation are impaired in airway cells
peptido-nucleici (PNA) inducendo l’espressione di CFTR e/o homozygous for the F508 deletion and ii) increased produc-
del suo interattoma, con conseguente aumento della funzio- tion of ROS - mainly of mitochondrial source - is central to
nalità di CFTR. the progression of CF. However the mechanisms sparking off
Ipotesi e obiettivi. Tra gli obiettivi del progetto MICROR- the elevated ROS production as well as if and how CF cells
NA-CF sono: (a) l’identificazione di microRNA espressi nelle compensate for their increased ROS burden are still poorly
cellule epiteliali bronchiali e lo studio del loro effetto nella re- investigated.
golazione dell’espressione di CFTR e delle proteine che intera- Hypothesis and objectives. The aim of this study was to
giscono con CFTR; (b) lo studio delle variazioni di espressione identify the enzyme/s contributing to the overproduction of
genica e di funzionalità di CFTR e di alcune proteine coinvolte intracellular ROS, besides mitochondria, and to analyse an-
nell’interattoma di CFTR utilizzando PNA in grado di colpire tioxidant enzymes along with supporting enzyme/s, such as
miRNA; (c) lo sviluppo di nuove molecole basate su PNA in glutathione reductase (GR) - that provide the first line of de-
grado di interferire con molteplici miRNA coinvolti. fence against superoxide anion radical (O2−•) and hydrogen
Metodi essenziali. Negli esperimenti abbiamo prima peroxide. Furthermore, the levels of intra- and extra-cellular
eseguito l’identificazione dei microRNAs/mRNAs validati e GSH and the redox states of the NAD and NADP pools were
predetti coinvolti in CF mediante programmi di bioinforma- investigated.
tica e dati ottenuti da pubblicazioni disponibili. In seguito Methods. Experiments were performed with two airway
sono stati eseguiti protocolli sull’utilizzo di PNA antagomiRs cell lines: CFBE41o-cells expressing F508del CFTR (CF) and
per la modulazione dell’attività dei microRNA in grado di CFBE41o-cells stably expressing wildtype CFTR (Wt). O2−•
riconoscere le sequenze 3’UTR di mRNA codificanti CFTR, was detected using the Fe3+-cyt c method. The enzyme ac-
NHERF1 e EZR. Infine è stata fatta l’analisi dell’espressione tivities as well as GSH amount were assayed spectrophoto-
genica e della funzionalità. metrically. Measurements of NADH or NADPH by using the
Risultati ottenuti. Abbiamo sintetizzato e validato PNA method involving MTT as terminal electron acceptor.
in grado di colpire la porzione 3’UTR di mRNA codificanti Results. We found that in CF cells NADPH oxidase
CFTR, EZR e NHERF1. Abbiamo dimostrato che PNA specifi- (NOX)-dependent ROS production increased and GR activity
ci per miR-145-5p e miR-101-3p inibiscono in modo speci- decreased, not depending on GR protein level decrease. Fur-
fico l’attività biologica dei miR-145-5p e miR-101-3p (i PNA thermore, defective CFTR proved to cause both extracellular
mutanti si sono invece dimostrati inefficaci) e incrementano and intracellular GSH level decrease, probably by reducing
l’mRNA CFTR (RT-PCR) e la produzione di proteina CFTR the amount of extracellular GSH-derived cysteine required for
(Western blotting) in cellule Calu-3. Abbiamo dimostrato cytosolic GSH synthesis. Importantly, we provide evidence
che un PNA per miR-335-5p (che regola NHERF1) inibisce that defective CFTR and NOX/GR activity imbalance both
in modo specifico il miR-335-5p e induce la produzione di contribute to NADPH and GSH level decrease and ROS over-
NHERF1 (Western blotting). Allo stesso tempo il PNA con- production in CF cells.

25
Spin-off for research & clinical purposes. This work pro-
vides first essential prerequisites for future research aimed at
understanding the molecular mechanisms responsible for the
interaction between CFTR, mitochondrial (patho)physiology
and ROS and aims to detect what is/are the protein/s primar-
ily responsible of the cell redox imbalance in CF.

Correlazione tra mitocondri e F508del-CFTR


nella Fibrosi Cistica
Ragioni del progetto. È noto che i) alcune tappe della
fosforilazione ossidativa mitocondriale sono compromesse
nelle cellule CF e che ii) la maggiore produzione di ROS -
principalmente di origine mitocondriale - è determinante per Anna Tamanini, responsabile del progetto
la progressione della malattia. Tuttavia i meccanismi che i)
scatenano l’iperproduzione di ROS e ii) compensano l’au-
mentato carico di ROS in cellula non sono noti. activity (potentiators), even if their efficacy seems to be time-
Ipotesi e Obiettivi. Lo scopo di questo studio è stato quello limited in particular for the most common CF-causing muta-
di identificare gli enzimi che contribuiscono alla sovrapprodu- tion F508del . Several factors contribute to the PM CFTR sta-
zione di ROS intracellulare, oltre ai mitocondri, e analizzare bility, including its compartmentalization in the sphingolipid
gli enzimi antiossidanti – ed anche quelli di supporto, quali la (SL)-enriched lipid rafts, the formation of the multiprotein
glutatione reduttasi (GR) – che forniscono la prima linea di di- complex involving ezrin and NHERF1. Many evidence show
fesa contro l’anione superossido (O2−•) ed il perossido di idro- that the phosphorylation state of ezrin is, in turn, regulated
geno. Inoltre, sono stati studiati i livelli intra- ed extracellulare by PM ceramide levels. Furthermore, epithelial cells express-
di GSH e gli stati redox dei pool di NAD e NADP. ing F508del CFTR have a lower plasma membrane levels of
Metodi. Gli esperimenti sono stati eseguiti con due linee monosialoganglioside 1, GM1. Based on these findings, we in-
cellulari delle vie aeree: cellule che esprimono la forma mu- vestigated the effects of potentiators and correctors on CFTR
tata F508del CFTR (CF) e cellule che esprimono stabilmente PM microenvironment.
il genotipo wildtype della CFTR (Wt). O2−• è stato rilevato Hypotesis and objectieves. The aim of our project was to
utilizzando il metodo del Fe3+-cyt c. Le attività enzimatiche contribute in understanding the mechanisms underlying the
ed il livello di GSH sono stati analizzati spettrofotometrica- negative effects of VX-770 potentiator on CFTR rescued on the
mente. Le misurazioni di NADH o NADPH sono state effet- PM in human airway epithelial cells. In particular, we wanted to
tuate utilizzando il metodo del MTT come accettore termina- provide further evidence for a central role of the reorganization
le di elettroni. of membrane SLs, NHERF1 expression, and ezrin phosphoryla-
Risultati. Nelle cellule CF abbiamo osservato un aumen- tion in the potentiators-induced decrease of wild-type CFTR or
to della produzione di ROS dipendente dall’attività della F508del CFTR expression in the airway epithelium.
NADPH ossidasi (NOX) ed una diminuzione di attività della Essential methods. We analysed the SL composition by
GR, non dipendente dal livello di espressione della proteina. biochemical SL procedures, the phosphorylation state of ez-
Inoltre, abbiamo dimostrato un abbassamento del livello di rin and the expression of NHERF1 in CF bronchial epithelial
GSH, sia extracellulare che intracellulare, dovuto probabil- cell lines, treated or not with VX-809 (corrector) and VX-770
mente alla ridotta quantità di cisteina extracellulare prove- by Western Blot. We also evaluated the SL pattern of lipid rafts
niente dal GSH secreto e necessaria per la sintesi del GSH and further experiments were conducted to investigate the ef-
citosolico. Infine, forniamo evidenza del fatto che sia la CFTR fect of GM1 on CFTR function by fluorescent probes.
mutata che gli enzimi NOX e GR contribuiscono alla riduzio- Results. In CF cells treated with VX-809 and VX-770,
ne del livello di NADPH e GSH e alla produzione esagerata we found an important reduction of phosphorylated ezrin,
di ROS nelle cellule CF. NHERF1 expression and only modest differences in the SL
Possibili ricadute per ricerca e clinica. Lo studio forni- pattern, whereas a marked increase of all SL species in lipid
sce requisiti essenziali per future ricerche mirate ad indaga- rafts. Interestingly, treatment with GM1 abolished the nega-
re i meccanismi molecolari responsabili dell’interazione tra tive effect of VX-770.
CFTR, fisio/patologia mitocondriale e ROS ed ha l’obiettivo di Spin-off for research & clinical purposes. These results
identificare qual è/quali sono la/le proteina/e responsabile/i indicate that combined treatment with corrector/potentia-
dello squilibrio redox nella cellula CF. tor induces modification in lipid rafts organization in terms
of proteins and lipids, and that GM1 is able to restore the
stability of mutated rescued CFTR at PM level. These findings
could permit the development of new therapeutical strategies
18. Identification of molecular targets to re- for CF treatment.
duce the side effect of gating potentiators on
the F508delCFTR plasma membrane stability Identificazione di bersagli molecolari per ridurre
l’effetto collaterale dei potenziatori sulla stabili-
Aureli M2, Mancini G2, Loberto N2, Munari S1, Dechecchi tà in membrana della proteina F508del CFTR
MC1, Bassi R2, Schiumarini D2, Lippi G1, Sonnino S2, Cabrini Ragioni del progetto. Per correggere efficacemente il di-
G1, Tamanini A1 fetto della proteina CFTR con mutazione F508del è necessa-
1
Laboratory of Molecular Pathology, Department of Pathology rio l’uso combinato di correttori e potenziatori, che tuttavia
and Diagnostics, University Hospital of Verona, Italy, può avere effetti negativi come dimostrato per il VX-770. Ri-
2
Department of Medical Biotechnology and Translational sulta, quindi di estrema importanza capire i meccanismi mo-
Medicine, University of Milano, Italy (FFC#9/2015, Completed) lecolari che portano a questo effetto negativo. Inoltre, è noto
che cellule CF hanno una più alta espressione di sfingolipidi
Background and rationale. Many drugs have been de- come Ceramide e una più bassa espressione di Ganglioside
signed to increase the surface level of mutated CFTR (cor- 1 (GM1). Sulla base di queste scoperte è stato studiato l’ef-
rectors), as well as its plasma membrane (PM) stability and fetto del potenziatore VX-770 e del correttore VX-809 sul

26
microambiente di membrana della proteina CFTR. the polymorphic TG(9-13)T(5,7,9) locus, which influences exon 10
Ipotesi e obiettivi. La stabilità in membrana della CFTR inclusion and is associated with CF monosymptomatic forms.
è promossa dalla formazione di complessi multiproteici che Hypothesis & objectives. Among correction strategies
coinvolgono le proteine adattatrici, NHERF1 ed ezrin. Alcuni developed to rescue/increase normal splicing, the plant cy-
studi mostrano che lo stato di fosforilazione di ezrin è regola- tokinin kinetin was shown to be effective in familial dysau-
to dal contenuto di ceramide della membrana plasmatica. Il tonomia and neurofibromatosis. Our preliminary results en-
presente studio è volto alla comprensione dei meccanismi che couraged us to further investigate the therapeutic potential
inducono l’effetto negativo del potenziatore sulla CFTR mutata of kinetin in both monosymptomatic and typical CF and to
riportata in membrana dal correttore VX-809 in cellule respira- perform structure-activity relationship screening of kinetin
torie con particolare riguardo al ruolo svolto dagli sfingolipidi, analogues to identify new therapeutics.
dall’espressione di NHERF1 ed ezrin nell’induzione dell’effet- Methods. Methods were adopted to: confirm the effect of
to negativo di VX-770 sull’espressione della proteina CFTR. kinetin on exon 10 inclusion in different cell systems; evaluate
Metodi essenziali. Il progetto è stato sviluppato usando the effect of kinetin on patient-derived cells (epithelial cells
cellule CF. L’effetto del VX-770 è stato studiato analizzando from nasal brushing, lymphoblastoid cells); define kinetin-
l’espressione di ezrin, NHERF1 e CFTR; identificando il pat- sensitive exons and kinetin-responsive elements at the ge-
tern sfingolipidico e i livelli di espressione e di attività dei nome scale to better understand the mechanism of action;
principali enzimi coinvolti nel metabolismo degli SL; è stato identify novel small molecules acting on splicing by virtual
studiato l’effetto della somministrazione di GM1 alle stesse high-throughput screening; validate lead compounds by cell-
cellule sul microambiente di membrana della proteina CFTR. based screenings; explore the possibility to use kinetin/kinetin
Risultati. Le cellule CF trattate con VX-809 e VX-770 pre- analogues to correct CF-causing splicing mutations.
sentano un importante riduzione dell’espressione di ezrin e Results. During this 2-year project we: confirmed the ef-
di NHERF1, una modesta differenza nel pattern SL, ma un fect of kinetin on exon-10 inclusion both on the endogenous
marcato aumento di tutte le specie lipidiche nei microdomini transcript and in cells transiently transfected with CFTR mini-
di membrana. Inoltre, il trattamento con GM1 riduce note- genes carrying different arrays of TG/T repeats; tested the
volmente l’effetto negativo del VX-770. efficacy of 8 additional compounds (among them RECTAS
Possibili ricadute per ricerca e clinica. Questi risultati indi- proved to be the best, being active at a concentration ∼10
cano che il trattamento combinato con modulatori della CFTR fold lower than kinetin); analyzed the global effect of kinetin
induce modificazioni dell’organizzazione dei microdomini di on Caco2 transcriptome by RNAseq experiments, confirming
membrana in termini di lipidi e proteine e che il GM1 è in that kinetin impacts on the expression of a limited number of
grado di recuperare la stabilità della CFTR mutata sulla mem- genes; produced a dual-fluorescence reporter vector for the
brana plasmatica. Queste scoperte potrebbero permettere lo validation of lead compounds; confirmed the effect of kinetin
sviluppo di nuove strategie terapeutiche per la cura della FC. on CFTR splicing in cultured epithelial cells from nasal brush-
ing of 3 CF patients and in 3 lymphoblastoid lines; found that
the mechanism of action of kinetin on CFTR splicing does
not depend on specific in-cis sequence elements reported for
19. The plant cytokine kinetin and its ana- other genes, and may be mediated by the level of the splicing
logues as potential therapeutic agents to cor- regulatory protein hnRNPA2B1.
rect CFTR splicing defects Spin-off for research & clinical purposes. Splicing modu-
lators leading to the augmentation of CFTR mRNA might be
Straniero L1, Soldà G1, Rimoldi V1, Giannone V2, Ferrari F2, used as “CFTR amplifier” drugs to enhance other CFTR mod-
Colombo C3, Asselta R1, Orrenius C4, Seia M2, Duga S1 ulating agents in combination therapy.
1Department of Biomedical Sciences, Humanitas University,
Pieve Emanuele – Milan, Italy and Humanitas Clinical and La citochina vegetale kinetina e suoi analoghi
Research Center, Rozzano - Milan, Italy, 2Medical Genetics come potenziali composti terapeutici per la cor-
Laboratory, Fondazione IRCCS Ca’ Granda Ospedale
Maggiore Policlinico, Milan, Italy, 3Cystic Fibrosis Center of rezione dei difetti di splicing del gene CFTR
Milan, Fondazione IRCCS Ca’ Granda Ospedale Maggiore Ragioni dello studio. Circa il 14% delle mutazioni che
Policlinico, Milan, Italy, 4Nerviano Medical Sciences, causano Fibrosi Cistica (FC) sono difetti di splicing, cioè in-
Discovery Oncology – Chemistry, Computational Sciences terferiscono con la maturazione delle molecole (mRNA) che
Unit, Nerviano, Italy (FFC#5/2015, Completed) portano l’informazione per la sintesi proteica. Oltre a queste
mutazioni gravi, altre varianti modulano lo splicing di CFTR:
la più importante è una regione contenente diverse ripetizioni
dei nucleotidi TG e T. Questa variante influenza l’inclusione
di una regione del mRNA (esone 10) ed è stata associata a
forme monosintomatiche di FC.
Ipotesi e obiettivi. Recenti progressi nel trattamento della
FC hanno dimostrato l’efficacia di farmaci mutazione-spe-
cifici, quali potenziatori e correttori. Questo tipo di terapia
non è oggi disponibile per pazienti con mutazioni di splicing.
L’ormone vegetale kinetina è stato utilizzato con successo per
correggere lo splicing in 2 malattie genetiche gravi. Noi pro-
poniamo di studiare il potenziale terapeutico della kinetina
nel trattamento della FC causata da difetti di splicing e di
identificare altre molecole simili da utilizzare come farmaci.
Stefano Duga, primo in alto a sinistra, con partner e collaboratori Metodi. Abbiamo verificato la capacità della kinetina
del progetto di correggere lo splicing di CFTR in modelli cellulari, e
confermato questi dati in cellule derivate da pazienti. In
Background. Near 14% of CF mutations are classified as parallelo, abbiamo individuato, attraverso un’analisi di
splicing defects. Besides severe mutations, other variants are una libreria virtuale che raccoglie le strutture chimiche di
known to modulate CFTR splicing, the most important being migliaia di composti, alcune nuove molecole, simili alla

27
kinetina, che sono state studiate mediante saggi in vitro. disease phenotype of CFTRF508del/TG2–/– mice that exhibited
Risultati. Abbiamo confermato l’efficacia del trattamento increased channel functionality, improved intestinal function,
con kinetina in diversi sistemi cellulari. Abbiamo verificato reduced inflammation, as well as resistance to infection with
che il trattamento è in grado di aumentare i livelli di mRNA Pseudomonas aeruginosa. We demonstrated that TG2, by its
wild type anche in cellule ottenute da brushing nasale e da protein disulphide isomerase activity, triggers the trimeriza-
linee linfoblastoidi di pazienti FC. Abbiamo esaminato l’effi- tion and activation of HSF1, the master transcription factor
cacia di 8 composti simili alla kinetina; fra questi il migliore that regulates the response to proteotoxic stress, promoting
è risultato essere RECTAS, che ha una efficacia paragonabile the induction of the stress inducible chaperone HSP70. Im-
alla kinetina a un dosaggio 10 volte inferiore. Infine, abbiamo portantly, CF mice as well as primary nasal epithelial cells de-
studiato l’effetto della kinetina sull’insieme delle molecole di rived from CF patients usually displayed increased levels of
mRNA prodotte dalla cellula, in modo da valutare possibili HSF1 and HSP70 expression as compared to normal controls.
effetti su altri geni e parzialmente compreso il meccanismo Notably, we found that these alterations were significantly
di azione del farmaco. ameliorated by genetic TG2 ablation as well as by its phar-
Possibili ricadute per ricerca e clinica. Molecole attive macological inhibition with cysteamine, which indeed sup-
sullo splicing possono essere utilizzate per aumentare il livel- pressed the PDI activity of TG2.
lo di mRNA di CFTR che può quindi consentire la produzio- Spin-off for research & clinical purposes. Altogether, our
ne di una maggiore quantità di proteina funzionante. Questi results indicate that TG2 plays a key role in CF by regulating
nuovi farmaci, chiamati “amplificatori”, possono essere utili proteostasis through the modulation of chaperone expression.
in combinazione con potenziatori e correttori. This study provides a platform to identify protective agents,
that modulating TG2 activity could restore CFTR proteostasis.

20. Dissecting the role of TG2 in cystic fibrosis Studiare il ruolo della TG2 nella patogenesi della
pathogenesis: identification of possible novel fibrosi cistica: identificazione di possibili bersa-
therapeutic targets gli terapeutici innovativi
Ragioni dello studio. La Transglutaminasi 2 (TG2) svolge
Piacentini M , Maiuri L , Rossin F
1 2 1 un ruolo cruciale nella patogenesi della fibrosi cistica (FC).
1
Dipartimento di Biologia - Università di Tor Vergata, Roma, La TG2 è un enzima mutifunzionale coinvolto in numerosi
2
IERFC, Istituto Europeo per la Ricerca in Fibrosi Cistica processi cellulari tra cui morte, autofagia e infiammazione.
- Istituto Scientifico San Raffaele, Milano (FFC#8/2015, Tra i partner intracellulari della TG2, molti sono chaperoni
Completed) molecolari, (proteine con funzione di “accompagnamento”
di altre proteine, n.d.r.) suggerendo che svolge un ruolo chia-
ve nella regolazione della proteosasi. A tal proposito, la TG2
è deregolata nelle principali malattie umane con caratteristi-
che di alterato adattamento delle cellule allo stress. È impor-
tante considerare che la TG2 è costantemente sovra-espressa
nelle vie respiratorie di pazienti FC determinando infiamma-
zione cronica. Inoltre, la sua inibizione migliora il trasporto
in membrana del mutante più comune del CFTR (F508del)
ripristinando la funzione del canale.
Ipotesi e obiettivi. Considerando il coinvolgimento della
TG2 nella patogenesi della FC, l’obiettivo di questo progetto
era comprenderne il ruolo studiando i meccanismi molecola-
ri che regolano il trasporto del CFTR mutato.
Metodi essenziali. A questo scopo, abbiamo sviluppato
Mauro Piacentini con il gruppo di ricerca un nuovo modello sperimentale murino con FC e difettoso
per la TG2. Utilizzando un approccio proteomico abbiamo
inoltre identificato complessi multiproteici che interagiscono
Background and rationale. Transglutaminase 2 (TG2), the con la TG2 rivelando che molte proteine, come i chaperoni,
most ubiquitous member of the TG family, plays a crucial role sono anche interattori del CFTR.
in Cystic Fibrosis (CF) pathogenesis. TG2 is a multifunctional Risultati. L’ablazione in vivo della TG2 ha migliorato la ma-
enzyme involved in a variety of cellular processes such as cell lattia in topi senza TG2–/– che hanno mostrato una maggiore
death, autophagy and inflammation. Among the TG2 intra- funzionalità del canale, una diminuzione dell’infiammazione
cellular partners, many are molecular chaperones suggesting e resistenza all’infezione con Pseudomonas aeruginosa. In
that TG2 plays a key role in proteostasis. In keeping with this, particolare abbiamo dimostrato che la TG2 determina l’attiva-
TG2 is deregulated in major human diseases with common zione di HSF1, il fattore di trascrizione che regola la risposta
features of unbalanced cell adaptation to stress. Of note, TG2 a stress proteotossici, promuovendo l’induzione dello chape-
is constitutively up-regulated in CF airways and drives chronic rone HSP70. È importante considerare che i topi con FC e le
inflammation. Moreover, its inhibition improves the trafficking cellule epiteliali nasali, derivate da pazienti, hanno mostrato
of the most common misfolded F508del CFTR mutant leading un aumento dei livelli di HSF1 e di HSP70 rispetto ai controlli.
to restoration of CFTR function. Abbiamo riscontrato che queste alterazioni sono significativa-
Hypothesis and objectives. Considering the involvement mente migliorate dopo rimozione della TG2 così come dopo la
of TG2 in CF pathogenesis the goal of this project was to elu- sua inibizione farmacologica con la cisteamina.
cidate the molecular mechanisms by which TG2 regulates Possibili ricadute per ricerca e clinica. Complessiva-
F508del CFTR trafficking. mente i nostri risultati indicano che la TG2 svolge un ruolo
Essential methods. To this aim, we developed a new experi- chiave nella FC regolando la proteosasi attraverso la mo-
mental CF mouse model defective for TG2. We also used a pro- dulazione dell’espressione degli chaperoni. Questo studio
teomic approach to identify multi-protein complexes interacting fornisce una piattaforma per identificare agenti protettivi,
with TG2, such as the chaperones, that also target the CFTR. che modulando l’attività della TG2 potrebbero ripristinare
Results. Ablation of TG2 function in vivo improved the la proteostasi del CFTR.

28
POSTER SESSION 1
CF INFLAMMATION
21. Anakinra in cystic fibrosis: from targeting Expected results and their significance. This study may
provide the foundation for repurposing anakinra as ideal anti-
pathogenic inflammation to correcting CFTR inflammatory drug in CF that not only interrupts the vicious
defect cycle that sustains inflammation but also generates favourable
conditions for CFTR trafficking (see the intermediate scientific
Pariano M1, Puccetti M1, Oikonomou V1, Borghi M1, Villella report).
VR2, Stincardini C1, Sforna L1, Renga G1 and Romani L1
1
Dipartimento di Medicina Sperimentale, Università degli Anakinra, un farmaco promettente nella fibrosi
Studi di Perugia, Perugia, 2European Institute for Research
in Cystic Fibrosis, Division of Genetics and Cell Biology, San cistica: da anti-infiammatorio a correttore
Raffaele Scientific Institute, 20132 Milan, Italy (FFC#9/2016, Ragioni dello studio. Nel corso dei nostri precedenti stu-
In progress) di, volti a capire e colpire i meccanismi infiammatori noci-
vi–causa di un pericoloso circolo vizioso tra infezione ed in-
fiammazione aerea nella fibrosi cistica–abbiamo notato che
anakinra (un potente farmaco anti-infiammatorio, già usato
nel trattamento di varie patologie umane e con ottima tol-
lerabilità e scarsa tossicità), era in grado di interferire con i
processi di controllo di qualità intracellulari, quali l’autofagia
e la degradazione proteasomica ubiquitina-dipendente.
Ipotesi e obiettivi. Essendo questi meccanismi coinvolti
nel traffico intracellulare della proteina CFTR, in questo stu-
dio abbiamo valutato la capacità di anakinra di modificare il
traffico intracellulare e ripristinare la funzionalità della pro-
teina mutata p.Phe508del-CFTR.
Metodi essenziali. Lo studio è stato condotto in vitro su
linee cellulari portatrici del gene p.Phe508del-CFTR ed HBE
Luigina Romani, terza da sinistra, con i ricercatori del suo (linee cellulari di epitelio bronchiale umano) da pazienti con
laboratorio la mutazione p.Phe508del-CFTR al fine di valutare la capa-
cità di anakinra di modificare traffico, espressione ed attività
Background and rationale. The p.Phe508del mutation in funzionale di p.Phe508del-CFTR, nonché in vivo in topi con
the first nucleotide-binding domain, which is the most com- la stessa mutazione.
mon mutation among individuals with CF, results in the pro- Risultati preliminari. I dati preliminari suggeriscono
duction of a misfolded protein with residual activity that is che anakirna aumenta l’espressione, la funzionalità nonché
degraded by the ubiquitin–proteasome system during biogen- la localizzazione a livello della membrana plasmatica di
esis. Thus, regulator of cellular protestasis may alter traffick- p.Phe508del-CFTR in linee cellulari e HBE da pazienti con la
ing of p.Phe508del-CFTR and favour its plasma membrane mutazione p.Phe508del-CFTR. A conferma di questi dati ot-
targeting and stability. tenuti in vitro, anakinra aumenta anche in vivo l’espressione
Hypothesis and objectives. In our last CF project, we have di CFTR nei polmoni di topi con la mutazione p.Phe508del-
defined mechanisms by which dysregulated inflammasome CFTR. Parallelamente, come già riportato, anakinra aumenta
activity may contribute to the vicious circle perpetuating la resistenza all’infezione da Aspergillus fumigatus e diminu-
pathogenic inflammation. Anakinra, a recombinant, non-gly- isce l’infiammazione.
cosylated version of human IL-1RA, limited the pathological Risultati attesi e loro significato. Questi risultati ci for-
consequences of microbial colonization in CF trough the au- niscono indicazioni precliniche sull’efficacia di anakinra
tophagic/proteasomal degradation system. As this pathway is nel promuovere l’attività di canale della proteina mutata
defective in CF and is associated with failure to target misfold- p.Phe508del-CFTR. Se così fosse, avremmo il vantaggio di
ed CFTR for degradation, we have proposed the evaluation of potere usare un farmaco già noto e sperimentato ampiamente
anakinra as a regulator of CFTR protein via proteostasis. in altre patologie umane capace di correggere il difetto di
Essential methods. The project included murine and hu- base e diminuire il processo infiammatorio allo stesso tempo
man studies. 1. In vitro, to assess the effect of anakinra on (vedi il report scientifico intermedio).
expression, cellular localization and functional activity of
p.Phe508del-CFTR and the molecular mechanisms behind
anakinra’s rescuing activity in p.Phe508del-CFTR-transfected 22. Resolvin D1 for Targeting Chronic Lung In-
CFBE41o-cells and HBE cells from patients homozygosus for
the p.Phe508del-CFTR mutation and controls. 2. In vivo, in
flammation, Infection, and Damage in Cystic
CFTR-F508del mice to define the pharmacology of anakinra. Fibrosis
Preliminary results. Anakinra increased cellular expres-
sion of mature p.Phe508del-CFTR on WT- or p.Phe508del- Recchiuti A1,3, Mari VC1,3, Isopi E1,3, Mattoscio D1,3,
CFTR-transfected CFBE41o-cells as well as in HBE cells from Lamolinara A2,3, D’Aurora M4,3, Gatta V4,3, Iezzi M2,3,
CF patients and increased plasma membrane localization of Bragonzi A5, Moretti P6, Dubordeau M7, Codagnone M1,3,
p.Phe508del-CFTR. Importantly, the corrector and stabilizing Cianci E1,3 and Romano M1,3
capacity of anakinra correlated with increased chloride ion 1
Department of Medical, Oral, and Biotechnology Science,
channel function of the rescued p.Phe508del-CFTR. Anakinra 2
Department of Medicine and Aging Science, and 3Center
also corrected CFTR in vivo. We found that anakinra restored on Aging Sciences and Translational Medicine (CeSI-MeT)
CFTR expression in CFTR-F508del mice infected with A. fumig- “G. d’Annunzio” University of Chieti-Pescara, Chieti, Italy;
atus while concomitantly increasing resistance to the infection. 4
Department of Psychological, Humanistic and Territorial

29
Sciences 5 Infection and Cystic Fibrosis Unit, Division of Ragioni del progetto. L’infiammazione cronica e le con-
Immunology, transplantation, and Infectious Diseases, IRCCS tinue infezioni batteriche sono la principale cause di danno
San Raffaele Scientific Institute, Milan, Italy; 5Centro Regionale ai polmoni e riducono la qualità e l’aspettativa di vita dei
Fibrosi Cistica, Ospedale San Salvatore, Atri (TE), 6Ambiotis pazienti con fibrosi cistica (FC). Nuovi farmaci sono neces-
SAS, Toulouse (FR) (FFC#19/2016, in progress) sari per curare questi aspetti della malattia poiché quelli già
disponibili non sono pienamente efficaci. Nel nostro corpo,
normalmente, vengono prodotte sostanze che stimolano il
sistema immunitario a combattere l’infezione, favorendo la
risoluzione dell’infiammazione e la rigenerazione dei tessuti
danneggiati. La resolvina (Rv) D1 è una di tali sostanze in gra-
do di trattare l’infiammazione cronica in modelli sperimenta-
li animali, come confermato da un recente studio derivante
da un progetto finanziato dalla Fondazione Ricerca Fibrosi
Cistica (FFC#21/2014). E’, pertanto, di estrema importanza
studiare le azioni di RvD1 in FC.
Ipotesi ed Obiettivi. In questo progetto studieremo se
RvD1
1. è in grado di ridurre l’infiammazione polmonare, l’in-
fezione da Pseudomonas aeruginosa (PA) ed il danno alle vie
Antonio Recchiuti, al centro seduto, con il gruppo di ricerca aeree in topi infettati;
2. è in grado di regolare la crescita delle cellule epiteliali
che formano le vie aeree favorendo la riparazione delle lesioni.
Backgroung and rationale. Lack of resolution of lung infec- Metodi essenziali. Topi privi di CFTR saranno infettati con
tion and inflammation is an underlying cause of progressive PA e trattati o meno con RvD1 per diverse settimane. Al termi-
loss in respiratory function and premature death among pa- ne del trattamento compareremo il numero di batteri vivi nei
tients with cystic fibrosis (CF). Resolvin (Rv) D1 is and endog- polmoni, il numero di globuli bianchi ed il grado di lesione ai
enous lipid mediator that promotes resolution of inflammation polmoni. Cellule di pazienti con FC saranno, invece, trattate
and has entered clinical trials for the treatment of inflammatory in laboratorio con RvD1 per stabilire se essa ne aumenta la
diseases. Recent results from a previous FFC-funded research crescita e la capacità di riparare ferite create artificialmente.
(FFC#21/2014) demonstrate that RvD1: a) reduces inflamma- Risultati preliminari. RvD1 riduce l’infezione cronica in-
tion and P. aeruginosa burden in vivo; b) stimulates cellular dotta da PA in topi privi di CFTR, diminuendo il grado di
mechanisms of resolution and microbial clearance; c) is organ infiammazione e del danno polmonare. In cellule epiteliali
protective in mouse chronic P. aeruginosa infection. bronchiali derivanti da pazienti sottoposte ad infezione RvD1
Hence, determining roles and functions of RvD1 in chron- regola l’espressione di specifici geni implicate nell’infiamma-
ic lung inflammation, infection, and damage is of wide inter- zione e nel riparo del danno cellulare.
est for CF. Possibili ricadute. Lo studio definirà le azioni anti-infiam-
Hypothesis and Objectives. To test the hypothesis that matorie, pro-risolutive e rigenerative di RvD1 in modelli spe-
RvD1 is effective in promoting resolution of inflammation, rimentali di FC, identificando i meccanismi mediante i quali
microbial clearance, and airway tissue regeneration in CF, 2 essa opera e che possono essere utilizzati per trattare l’infiam-
specific aims will be addressed: 1. Investigating if RvD1 lim- mazione, l’infezione ed il danno polmonare nella FC. Questo
its airway chronic inflammation, P. aeruginosa (PA) infection, studio fornirà, quindi, le conoscenze di base per lo sviluppo di
and damage stimulating tissue repair in preclinical models of studi clinici nei quali testare RvD1 direttamente sui pazienti.
CF. 2. Establishing if RvD1 regulates select genes that limit
inflammation and promote tissue repair by human CF cells.
Essential methods. RvD1 actions will be tested in CF mice
chronically infected with a clinical strain of PA. Lung bacterial 23. Testing the anti-inflammatory effects of
burden, inflammation, and tissue damage will be determined matrix metalloprotease inhibitors in P. aerugi-
to assess RvD1 activities. Also, direct actions of RvD1 on pri- nosa-infected CFTR-knockout mice by in vivo
mary CF airway epithelial will be established, to determine
molecular mechanisms activated to reduce neutrophil and
imaging techniques
enhance tissue regeneration. Boschi F1, Sandri A2, Lleò MM2
Preliminary results (personal). In vivo, RvD1 improves 1
Department of Computer Science and 2Department
chronic P. aeruginosa (PA) infection in Cftr-deficient mice, of Diagnostics and Public Health, University of Verona
lowers lung inflammation and damages, and regulates select (FFC#21/2017, New)
genes related to inflammation and injury repair in CF epithe-
lial cells infected with (PA).
Spin-off for research & clinical purposes. Results from
these experiments will further define: a) anti-inflammatory,
pro-resolutive, and tissue protective actions of RvD1 in CF
animal models and cells during PA infections; b) cellular and
molecular mechanism regulated by RvD1 exploitable to pro-
mote resolution and tissue repair in CF. These results will be
important for developing clinical trials for testing RvD1 in
within a relatively short time (~3-5 years), given that resolvins
showed no toxicity in background studies in humans.

Ruoli e meccanismi della Resolvina D1 per il


trattamento dell’infiammazione, dell’infezione Federico Boschi con le colleghe di ricerca
cronica e del danno polmonare in fibrosi cistica

30
Background and Rationale. P. aeruginosa secreted pro- 24. Myriocin potential as a phenotype-modify-
teases interfere with key host immune processes and de-
grade lung tissue. Thus, molecules interfering with bacterial
ing therapeutical in Cystic Fibrosis
proteases might limit host inflammatory response and lung
damage. Modern in vivo imaging tools could allow to assess Caretti A1, Bonezzi F1, Borghi E3, Cirilli N4, Ghidoni R1,
the anti-inflammatory effects of these molecules in infected Gallina A2, Signorelli P1
CF mice.
1
Laboratorio di Biochimica, 2Laboratorio di Biologia
Hypothesis and objectives. In order to evaluate the possi- Molecolare, 3Laboratorio di Microbiologia , Dipartimento di
ble beneficial effects of P. aeruginosa protease inhibition in CF Scienze della Salute, Università di Milano, Milano, 4Centro
lungs, we aim to achieve the following objectives: 1.To set-up Regionale per la Fibrosi Cistica, Ospedali Riuniti delle
a convenient, non-invasive imaging model for in vivo moni- Marche, Bambini Salesi Ospedale Madre, Pediatria, Ancona
toring of tissue inflammation, bacterial infection and protease (FFC#11/2016, In progress)
activity in mouse lungs. 2To assess the effects of molecules
interfering with protease production (azithromycin, clarithro-
mycin) or activity (doxycycline, ilomastat and marimastat) in
P. aeruginosa-infected mice by in vivo imaging. 3.To analyze
potency and efficacy of protease inhibitors ilomastat and ma-
rimastat in mice and describe possible adverse effects.
Essential methods. Establishment of P. aeruginosa acute
lung infection in wild-type and CFTR-knockout C57BL/6
mice, followed by in vivo imaging of lung inflammation, by
bioluminescence imaging of a bovine IL-8 promoter activa-
tion, infection and protease activity, using bacteria-detecting
and protease-activatable fluorescent probes (PerkinElmer),
respectively.
Preliminary results. P. aeruginosa protease down-regu-
lation by sub-MIC azithromycin or inactivation by ilomastat Paola Signorelli, seconda da destra, con il gruppo di ricerca
and marimastat seems to be associated with reduced inflam-
matory response in mouse lungs challenged with P. aerugi-
nosa culture supernatant. Background &Rationale. We demonstrated that myrio-
cin, an orphan drug with pleiotropic action, reduces
pro-inflammatory lipids accumulation and promotes an-
Studio dell’effetto anti-infiammatorio di farmaci
ti-oxidant response in Cystic Fibrosis (CF) lungs. Myrio-
che inibiscono le proteasi batteriche tramite tec- cin, administered in vivo via nanocarriers, reduces Cftr
niche di imaging in vivo in topi FC tm1UNCTgN(FABPCFTR) mice pulmonary inflammation,
Ragioni dello studio. Le proteasi, enzimi secreti da Pseu- ameliorates host response to pathogen infection, significant-
domonas aeruginosa, interferiscono con processi chiave ly limiting lung colonization, and corrects the defective abil-
dell’immunità e degradano il tessuto polmonare. Farmaci do- ity to kill internalized pathogens in CF epithelial cells. Other
tati di azione inibente le proteasi, già in uso o valutati per altri than CF, we proved that myriocin protects myocardium from
scopi clinici, potrebbero quindi limitare la risposta infiamma- ischemia/reperfusion damage and we obtained international
toria e il danno polmonare. patents for the use of myriocin in the therapy of Retinitis
Ipotesi e obiettivi. Gli obiettivi principali del progetto Pigmentosa, a disease that shares with CF the formation of
sono lo sviluppo di un sistema conveniente e non invasivo unfolded protein aggregates.
per monitorare nel polmone di topi FC la presenza di infiam- Hypothesis & Objectives. We hypothesize that the anti-
mazione, infezione e attività proteasica, e la valutazione dei oxidant/pro survival mechanisms promoted by myriocin could
possibili effetti benefici di farmaci che bloccano le proteasi decrease intracellular aggresomes stress and favour F508del-
batteriche. CFTR membrane expression. We speculate that myriocin could
Metodi essenziali. Topi FC verranno infettati con P. ae- be used alone or as adjuvant in the therapy with correctors and
ruginosa e trattati con farmaci che inibiscono la produzione potentiators and that it could reduce pathogens systemic infec-
(azitromicina, claritromicina) o l’attività (doxiciclina, iloma- tion spread. Our aim is to identify the mechanism by which
stat, marimastat) delle proteasi. La presenza di infezione, in- myriocin exerts its immunomodulatory and anti-microbial ac-
fiammazione e attività proteasica a livello polmonare verrà tivity and to prove its therapeutic potential in CF bronchial epi-
monitorata tramite moderne tecniche di imaging in vivo che thelia and in CF patients blood derived monocytes.
permettono l’osservazione e misurazione della biolumine- Essential Methods. Myriocin mechanism will be investi-
scenza e fluorescenza emesse dai topi in corrispondenza di gated in CF cell line. Myriocin anti-microbial activity will be
questi processi. investigated in CF patients monocytes isolated from peripher-
Risultati preliminari. L’azitromicina, farmaco già in uso al blood and combinatorial treatment with cysteamine will be
nei pazienti FC, inibisce la produzione delle proteasi da parte evaluated. The potential of combinatorial treatment of myrio-
di P. aeruginosa, mentre due farmaci valutati per altre patolo- cin with Lumacaftor will be evaluated ex vivo on CF bronchial
gie, Ilomastat e Marimastat, sono in grado di inattivare le pro- epithelial cells
teasi batteriche. In polmoni di topi trattati con proteasi attive Preliminary Results. We demonstrated that myriocin cor-
abbiamo precedentemente osservato la presenza di infiam- rects CF defective killing of internalized fungal conidia in CF
mazione, che risulta attenuata quando le proteasi sono in epithelia and restores the expression of pathogens receptors
quantità ridotta o inattive grazie all’azione di questi farmaci. TLR4 and NOD2 which are downregulated in CF and corre-
Risultati finali attesi e loro significato. I risultati attesi late with infection susceptibility. Myriocin activates the anti-
sono la validazione di un nuovo modello di imaging in vivo oxidant Nrf2/HO1 response, which is downregulated in CF.
applicabile alla ricerca di nuove strategie terapeutiche in FC, Myriocin changes lipid composition thus modulating mem-
la conferma dei possibili effetti benefici dell’inibizione delle brane fluidity and endocytosis.
proteasi e la caratterizzazione di nuovi farmaci per il tratta- Spin-off for research & clinical purposes. We predict that
mento dell’infezione da P. aeruginosa. myriocin could be used as adjuvant in personalized clinical

31
therapy once its mechanism of action will be ascertained to
better identify synergistic pharmacological combinations and
target patients.

Potenziale terapeutico della miriocina quale mo-


dulatore del fenotipo patologico in Fibrosi Cistica
Ragioni dello studio. Abbiamo dimostrato che myriocina,
che ha ricevuto la classificazione di farmaco “orfano” dalle
autorità regolatorie, riduce l’accumulo di lipidi pro-infiam-
matori e promuove la risposta anti-ossidante in Fibrosi Cistica
(FC). Mediante somministrazione intra-tracheale via nano-
carriers, questa molecola riduce l’infiammazione polmonare
in modelli murini di FC e migliora la difesa da infezioni, limi- Francesca Ungaro, al centro seduta, con il gruppo di ricerca e
tando significativamente la colonizzazione polmonare e au- Olivia Monica Merkel, nel riquadro, partner
mentando la capacità di uccidere i patogeni. Inoltre abbiamo
precedentemente dimostrato che la myriocina protegge dal strategy to move them from the laboratory to the bedside.
danno da riperfusione dopo infarto del miocardio e abbia- Hypothesis and objectives. The generation of break-
mo ottenuto brevetti internazionali per l’uso terapeutico del- through technologies and their translation into new pharma-
la myriocina nel trattamento della Retinite Pigmentosa, una ceutical products is crucial for CF treatment. In this context,
patologia legata alla la formazione intracellulare di aggregati the general aim of the present project is the integrated devel-
stressogeni di proteine anomale come la FC. opment of inhalable hybrid nanoparticles (hNPs) for siRNA
Ipotesi ed obiettivi. Ipotizziamo che il meccanismo antios- delivery made up of a combination of lipids and polymers. To
sidate e pro-sopravvivenza stimolato dalla myriocina riduca allow a proof-of-concept of the soundness of this approach,
significativamente lo stress da aggregati proteici endocellula- the in vitro/in vivo therapeutic potential of hNPs delivering a
ri e favorisca l’espressione in membrane del F508del-CFTR , siRNA against one of the most critical signal in evoking the in-
in terapie combinatorie con farmaci correttori clinicamente flammatory response in CF, that is nuclear factor-κB (NF-κB),
in uso. Il nostro obiettivo è identificare il meccanismo con il will be assessed.
quale myriocina esercita il suo effetto immunomodulatorio Essential methods. The experimental plan is organized
ed antimicrobico e di provarne il potenziale terapeutico in in 3 subsequent steps. First, hNPs based on biodegradable
cellule epiteliali e in monociti di pazienti FC. polymers and endogenous phospholipids delivering a siRNA
Metodi essenziali. Il meccanismo di azione della myrio- against NF-κB will be produced. Then, toxicity and efficacy
cina verrà studiato in line cellulari FC. L’attività anti-microbi- of siRNA-loaded hNPs will be evaluated in different human
ca della molecola myriocina sarà valutata su cellule isolate airway cell culture models, providing a tool to adjust hNP
da sangue periferico di pazienti FC, infettate e trattate con la properties for in vivo pulmonary delivery. Finally, results will
molecola soltanto o in trattamento combinatorio con farma- be confirmed in vivo in a murine model of lung inflammation.
ci clinicamente in uso. Inoltre valuteremo il potenziale del Preliminary results. We recently developed muco-inert
trattamento combinato di myriocina e farmaci come il Lu- hNPs based on poly(lactic-co-glycolic acid) and dipalmi-
macaftor nell’induzione di espressione e attività del canale toyl phosphatidylcholine for prolonged release of siRNA in
F508del-CFTR in cellule epiteliali FC the lungs. The developed formulations showed optimal in
Risultati. Abbiamo dimostrato che myriocina corregge la vitro aerosol performance and an excellent stability upon
alterata capacità delle cellule epiteliali FC di uccidere paras- incubation with artificial mucus, confirming the potential
siti e anche di indurre aumento dell’espressione dei recettori of hNPs for direct aerosolization on mucus-lined airways.
di difesa immune notoriamente poco espressi in cellule FC. siRNA-loaded hNPs were internalized inside human airway
Inoltre abbiamo dimostrato che Myriocina attiva la risposta di epithelial cells, causing a prolonged inhibition of the target
sopravvivenza anti-ossidante, dimostrata inefficiente e scar- protein expression.
samente attiva in FC. Expected final results and their significance. We plan
Possibili ricadute per ricerca e clinica. La nostra aspetta- to identify the correct operating conditions to produce
tiva è di identificare il meccanismo di azione della myriocina nanoparticles for prolonged release of siRNA in CF. The de-
in modo da poter proporre questa molecola quale adiuvante velopment of a siRNA delivery system already engineered
in terapie cliniche personalizzate di pazienti FC. for in vivo inhalation and transfection might shorten the time
to translation to patients, providing a therapeutic platform
to address multiple targets that are still considered “undrug-
gable” in CF.
25. Enabling pulmonary delivery of siRNA in
cystic fibrosis lung inflammation: therapeutic Somministrazione polmonare di siRNA nel trat-
potential of hybrid lipid/polymer nanoparticles tamento dell’infiammazione polmonare in fibro-
Ungaro F1, Merkel OM2
si cistica: potenziale terapeutico di nanoparticel-
1
Dipartimento di Farmacia, Università degli Studi di Napoli le ibride a base di lipidi e polimeri
“Federico II”; 2 Dept. Pharmazie, Ludwig-Maximilians Univer- Ragioni dello studio. La somministrazione per inalazione
sität, München (FFC#23/2017, New) di corti frammenti di RNA o siRNA, in grado di inibire selet-
tivamente l’espressione di singoli geni coinvolti nella patoge-
Background and rationale. The down-regulation of nesi della malattia, rappresenta oggi un approccio prometten-
genes directly involved in the pathogenesis of severe lung te nel trattamento di patologie polmonari severe, quali fibrosi
diseases through pulmonary delivery of short RNA frag- cistica (FC). Lo scarso successo di studi clinici in tale ambito,
ments, also known as siRNA, has gained recently remark- tuttavia, mette in luce l’urgente bisogno di adeguate formula-
able research interest, especially in cystic fibrosis (CF). zioni per trasferire tale approccio nella pratica clinica.
Nevertheless, the unsuccessful history of inhaled siRNA Ipotesi e obiettivi. L’obiettivo generale del progetto è lo
points out the urgent need of an appropriate formulation sviluppo di una nuova strategia formulativa in grado di pro-

32
muovere l’assorbimento polmonare di siRNA in FC. Tale Risultati preliminari. Sono state preparate nanoparticelle
obiettivo sarà perseguito attraverso la produzione, caratteriz- ibride a base di acido poli(lattico-co-glicolico) e dipalmitoil-
zazione e valutazione del potenziale terapeutico in vitro/in fosfatidilcolina per il rilascio modificato di siRNA al polmone.
vivo di nanoparticelle ibride a base di lipidi e polimeri per il I primi risultati sono molto incoraggianti visto che le nano-
rilascio controllato di un siRNA in grado di inibire il fattore particelle sono aerosolizzabili, stabili in muco FC simulato,
di trascrizione NF-κB, un mediatore cruciale del processo in- incapsulano efficacemente e rilasciano per tempi prolungati
fiammatorio polmonare caratteristico della FC. un siRNA modello. Studi in vitro confermano la capacità del
Metodi essenziali. Lo studio è organizzato in 3 linee di at- nanosistema di promuovere la captazione cellulare del siR-
tività successive. In una prima fase, si produrranno nanopar- NA rilasciato, inducendo un silenziamento prolungato della
ticelle ibride a base di polimeri biodegradabili e fosfolipidi proteina di interesse.
endogeni per il rilascio di un siRNA contro NF-κB. In una se- Risultati finali attesi e loro significato. Il progetto permet-
conda fase, lo screening delle nanoparticelle prevedrà studi terà di ampliare le attuali conoscenze sui fattori cruciali per
di tossicità ed efficacia su modelli cellulari in vitro. Nella fase lo sviluppo di nanomedicine per inalazione di siRNA in FC.
conclusiva del progetto i sistemi ottimizzati saranno testati in Il coinvolgimento di competenze di sviluppo farmaceutico,
modelli animali per la comprensione della loro biodistribu- preclinico e clinico potrà consentire una più facile traslazio-
zione e per valutarne l’efficacia terapeutica. ne dello studio dal laboratorio alla clinica.

NEAR CLINICAL APPROACHES

26. Outcomes of spontaneous application of on CF Genetic Counselings performed over the period 2014-
16 in an experimental subarea (Venice/Treviso/Belluno) with
carrier screening for cystic fibrosis: follow- the aim of evaluating the ways of access to genetic counseling
up of its effects on birth prevalence, neonatal of Carriers and Carrier Couples.
screening and reproductive behaviour of car- Results. The collection of data on Carrier Screening for the
year 2016 has been completed. Preliminary statistical analysis
rier couples of the collected data has been performed: a reduction in the
number of tests performed in the area is confirmed, with a con-
Castellani C
comitant increase in CF incidence. Identification of the main
Centro Regionale Fibrosi Cistica, Azienda Ospedaliera
most likely causes of the test reduction, namely: 1) effects of
Universitaria Integrata, Verona (FFC#26/2015, In progress)
the economic crisis; 2) reorganization and rationalization of
the activity of CF mutation analysis following the entry into
force of the pertaining recent regional legislation; 3) conse-
quent transformation of the private supply market. The results
of the Survey on Genetic Counselings suggest the importance
of including the CF Carrier test offering to the general popula-
tion in a structured screening program providing adequate ac-
cess to pre-test information and consulting after analysis.
Spin-off for research & clinical purposes. Better informa-
tion on the correlation between CF carrier screening, CF birth
prevalence and CF newborn screening. The substantiation of
the relationship between Carrier Screening and Cystic Fibro-
sis incidence opens the way to HTA studies

Carlo Castellani, responsabile del progetto Risultati di un’offerta non organizzata di scree-
ning del portatore di fibrosi cistica: monitorizza-
zione degli effetti su incidenza di FC, screening
Background. In the latest years the offer of CF carrier tests
to individuals and couples at no increased risk of having af-
neonatale e scelte riproduttive delle coppie di
fected children (carrier screening) has been widely practiced portatori
in a sub-area of north-eastern Italy (Eastern Veneto), although Ragioni dello Studio. Negli ultimi anni l’offerta del test
not in a structured and formal setting. del Portatore di Fibrosi Cistica agli individui e alle coppie
Hypothesis and objectives. This is an observational study senza rischio aumentato di avere bambini affetti da Fibrosi
which is monitoring trends of CF birth prevalence and is cor- Cistica (Screening del Portatore) è stata ampiamente diffusa
relating them with carrier screening over an unprecedented in una sotto-area dell’Italia nord-orientale (Veneto Orientale)
long period (25 years – 1993/2018) in the eastern part of the sebbene non ancora in un setting strutturato e formale.
Veneto. Ipotesi e Obiettivi. Questo è uno studio osservazionale
Methods. Analysis of the recently mutated scenario in the che sta monitorando i trend della prevalenza di nascite FC e li
CFTR offer in the Veneto Region; collection of data from labo- sta correlando con lo Screening del Portatore per un periodo
ratories on number of tests performed and results obtained; di tempo senza precedenti (25 anni – 1993/2018) nella parte
data cleaning, quality control and monitoring of laboratories orientale del Veneto.
results; collection of data on CF birth prevalence and on Metodi. Analisi dei recenti mutamenti nel panorama
positive predictive of the newborn screening procedures at dell’offerta del test del Portatore FC nella Regione Veneto;
the Verona CF Centre; analysis of the correlation between car- raccolta di dati dai laboratori sul numero di test effettuati e
rier screening birth prevalence and newborn screening per- relativi risultati ottenuti; pulizia dei dati, controllo qualità e
fomance; investigation on the causes of the decrease in the monitoraggio costante dei risultati di laboratorio;raccolta di
number of tests performed in recent years in the Area; survey dati sulla prevalenza di nascite FC e sul predittivo positivo

33
dello screening neonatale presso il Centro Fibrosi Cistica di type embryos, indicating that CFTR plays a vital role in the
Verona; analisi della correlazione tra Screening del Portatore, host response to infection.
prevalenza delle nascite e performance dello screening neo- Hypothesis and objectives. The goal of this project is to
natale; indagine sulle cause della diminuzione del numero di validate in vivo the efficacy of phage therapy against P. aer-
test effettuati negli ultimi anni nell’Area di studio; indagine uginosa infections using the CF-zebrafish animal model. The
sulle Consulenze Genetiche effettuate nel periodo 2014-15 lack of adequate animal models for human CF leads to the
in una sub-area sperimentale (Venezia/Treviso/Belluno) fina- research of new models. In a previous project, financed by
lizzata alla valutazione delle modalità di accesso alla con- FFC-2016, it has been demonstrated that P. aeruginosa infec-
sulenza genetica da parte di Portatori e Coppie di Portatori. tion in mice could be cured by administration of phages. The
Risultati preliminari. La raccolta di dati sullo Screening subsequent step is to validate in vivo phage therapy against P.
del Portatore FC per l’anno 2016 è stata completata. Sono aeruginosa infections in a CF-animal model.
state completate le analisi statistiche preliminari sui dati rac- Essential methods. Zebrafish embryos both wild-type and
colti: è stata confermata una riduzione del numero di test with reduced expression of cftr (cftr-loss-of-function) will be
effettuati nell’Area di Studio con un concomitante aumento infected with P. aeruginosa by microinjection, followed by
dell’incidenza FC. Identificazione delle probabili cause della phage administration. The therapeutic effects of phages will
diminuzione del numero di test, ovvero: 1) effetti della crisi be measured, following embryo mortality, bacterial burden,
economica; 2) riorganizzazione e razionalizzazione dell’at- and neutrophil migration. In addition, we plan to combine
tività di analisi mutazioni FC a seguito dell’entrata in vigore the phage treatment with antibiotics to verify if combination
della recente normativa regionale in materia; 3) conseguente of the two treatments has a positive outcome against P. aer-
trasformazione del mercato privato convenzionato. I risultati uginosa infections.
dell’Indagine sulle Consulenze Genetiche sottolineano l’im- Preliminary results. Phages able to infect and kill P. aer-
portanza di inserire l’offerta del test del portatore FC alla po- uginosa have been mixed in a cocktail and used for treat-
polazione generale in un programma strutturato di screening ing P. aeruginosa infected mice. 100% of the phage-treated
che preveda adeguate modalità di accesso all’informazione mice survived the infection. The same phages will be used for
pre-test ed alla consulenza dopo l’analisi. administration to zebrafish embryos both wild-type and cftr,
Possibili ricadute per ricerca e clinica. Una migliore previously infected with bacteria.
informazione sulla correlazione tra Screening del Portatore Final results expected and their significance. Two are the
FC, prevalenza di nascite FC e lo Screening Neonatale FC. expected results of this project: i) we will confirm that ze-
La conferma della relazione tra Screening del Portatore e brafish is a good CF-model that mimics the human disease
Incidenza della Fibrosi Cistica apre la strada agli studi HTA more faithfully than the mouse model in terms of immunologi-
(Health Technology Assessment: valutazione sistematica di cal response and can be used for in vivo validation of different
proprietà ed effetti di risorse tecniche in campo sanitario). therapeutic treatments relative to CF; ii) we expect to demon-
strate that phage therapy is effective in reducing P. aeruginosa
infections in CF-zebrafish.
27. In vivo validation of phage therapy against
Un nuovo modello di FC in Zebrafish per confer-
Pseudomonas aeruginosa infections using the mare in vivo la terapia fagica contro le infezioni
new Zebrafish (Danio rerio) animal model da Pseudomonas aeruginosa
Forti F1, Cafora M1, Deflorian G2, Ferrari L2, Ghisotti D1, Ragioni dello studio. Il piccolo pesce teleosteo (dotato di
Briani F1, Pistocchi A3 scheletro, n.d.r.) Zebrafish (Danio rerio) è un ottimo nuovo
1
Dept. of Biosciences, University of Milan, Italy, 2IFOM, Milan, modello animale per lo studio della fibrosi cistica (FC). Il gene
Italy, 3Dept. of Medical Biotechnology and Translational cftr di zebrafish presenta omologia con il gene umano; infatti
Medicine, University of Milan, Italy (FFC#22/2017, New) gli embrioni di zebrafish con aploinsufficienza (insufficiente
produzione di proteina CFTR, n.d.r.) o mutazioni CFTR, ma-
nifestano sintomi molto simili a quelli presenti nella malattia
umana. Inoltre, gli embrioni di zebrafish sono trasparenti e fa-
cilmente manipolabili dal punto di vista genetico e presenta-
no un sistema di immunità innata ben sviluppato, che è noto
essere la prima difesa nei confronti delle infezioni batteriche.
Ipotesi e obiettivo. Il principale obiettivo del progetto è
di confermare in vivo l’efficacia della terapia fagica contro le
infezioni da Pseudomonas aeruginosa, utilizzando il modello
di zebrafish per la FC.
Metodi essenziali. Verranno generati embrioni di zebra-
fish che mancano della funzione di Cftr da utilizzare come
modello animale della FC. Gli embrioni verranno infettati
con P. aeruginosa e trattati con la somministrazione di fagi,
Anna Silvia Pistocchi, responsabile capaci di debellare l’infezione.
del progetto Risultati preliminari. In un precedente progetto finanziato
dalla FFC (FFC #16/2016), erano stati utilizzati fagi capaci di
Background and rationale. Zebrafish (Danio rerio) is infettare e uccidere P. aeruginosa in un modello di infezione
gaining favor as a model for the study of host-bacterial in- nel topo per dimostrare come la somministrazione di fagi fos-
teractions, especially in its embryonic stage for the presence se in grado di curare i topi dall’infezione batterica. Il natura-
of a developed innate immune system. Moreover, the CFTR le proseguimento del progetto consiste nella verifica in vivo
gene is conserved in zebrafish and cftr-loss-of-function ze- dell’azione terapeutica dei fagi contro le infezioni batteriche
brafish mutants mimic cystic fibrosis (CF) human defects. In in presenza di alterazioni causate dalla mancanza della fun-
response to infection of P. aeruginosa, CFTR-loss-of-function zione CFTR. A questo scopo, infetteremo con P. aeruginosagli
embryos presented a dampened respiratory burst response embrioni di zebrafish FC e somministreremo i fagi, allo scopo
and a reduced neutrophil migration in comparison to wild- di debellare l’infezione.

34
Possibili ricadute per ricerca e clinica. Due sono i prin- b) propose reference values at a national level, sharing our
cipali risultati attesi da questo studio: 1) la validazione del previous single-center experience with centers from Central
nuovo modello di zebrafish come modello animale per lo and Southern Italy c) analyse differences among patients CF
studio degli effetti della FC; 2) la conferma dell’efficacia del- pancreatic sufficient, CF pancreatic insufficient, the role of CF-
la terapia fagica per combattere le infezioni batteriche. La associated liver disease and CF drugs use as predictors of the
messa a punto di un nuovo modello animale poco costoso e parameters under study, and the prevalence and symptoms of
facilmente utilizzabile permetterà di analizzare diversi tipi di hypoglycaemia during OGTT
trattamenti per curare la FC. Inoltre, la sostituzione del topo, Preliminary results. In the first year, approvals from Ethi-
attualmente più utilizzato ma non ideale, come modello di cal Committees have been obtained and a centralized data
FC. consentirà di ampliare gli studi relativi a nuove terapie platform has been created to upload all clinical and labora-
utili a migliorare la vita di pazienti affetti da FC. tory data from the single centers, and clinical OGTT studies
were begun. By the conclusion of the first year, data from 125
patients OGTTs had been uploaded.
Final results expected and their significance. Nomograms
28. Italian multicenter study of glucose toler- adjusted for sex and age of the OGTT parameters will be pow-
ance defects in cystic fibrosis erful tools at the Italian level to describe the natural history of
glucose tolerance defects in CF, to predict future CFRD, nutri-
Battezzati A1, Colombo C2, Lucidi V3, Magazzù G4, Mari A5 tional and respiratory decay, to identify patients with secreto-
1
Centro Internazionale per Inquadramento dello Stato ry defects and to set a rational basis for treatment. The project
Nutrizionale-ICANS, DeFENS, Università degli Studi di will promote awareness of CFRD and of the glucose tolerance
Milano, 2Dip. di Scienze Materno Infantili, Università di defects that may be significant for the future outcomes, will
Milano e Centro Regionale FC, Fondazione IRCCS Ospedale clarify the issue of reactive hypoglycaemia that could be seen
Maggiore Policlinico Mangiagalli e Regina Elena, Clinica as a mild side effect of this procedure.
Pediatrica De Marchi, Milano, 3Ospedale Pediatrico Bambin
Gesù, Roma, 4Dip. di Patologia Umana dell’adulto e dell’età Studio multicentrico italiano dei deficit di tolle-
evolutiva Gaetano Barresi, Università di Messina, 5Istituto di
ranza glicemica in fibrosi cistica
Neuroscienze, Consiglio Nazionale delle Ricerche IN-CNR,
Padova (FFC#20/2016, In progress) Ragioni dello studio. Il diabete in fibrosi cistica(CFRD)
è una complicanza frequente, associata a problematiche
polmonari e nutrizionali più severe anche anni prima della
diagnosi di diabete. Dipende da un deficit progressivo di se-
crezione insulinica. Le sue cause non sono chiare. Dal 2003
il centro di Milano ha avviato uno studio prospettivo locale
che impiega il carico orale di glucosio (OGTT) per misurare
la secrezione e la sensibilità insulinica. Grazie ad un prece-
dente finanziamento (FC#21/2013) abbiamo descritto la di-
pendenza dei parametri secretori dall’età e dal sesso, e la loro
importanza per lo stato nutrizionale e la funzione respiratoria
Ipotesi e obiettivi. Questo studio ipotizza che deficit di
secrezione insulinica, già presenti in età precoce, predispon-
gano successivamente a CFRD e a problematiche nutrizionali
e respiratorie. L’obiettivo è creare, per la popolazione italiana
Alberto Battezzati, responsabile del progetto CF, valori di riferimento per le risposte glicemiche e insuline-
miche e per i parametri di secrezione insulinica che ne posso-
no essere derivati. Questo studio dovrebbe definire meglio la
Background and rationale. Cystic Fibrosis Related Diabe- relazione dei deficit di secrezione insulinica con l’età, il sesso
tes (CFRD) is a frequent complication of Cystic Fibrosis asso- e le nuove terapie della fibrosi cistica
ciated to more severe pulmonary deterioration and nutrition- Metodi essenziali. La strategia proposta: a) utilizzare
al decay even years prior to diagnosis. The most important OGTT come metodo sperimentale: perché le linee guida rac-
cause is insufficient insulin secretion progressively worsening comandano che sia eseguito annualmente in tutti i pazienti,
with age. The reasons and the development of this defect are e perché permette di misurare simultaneamente la secrezione
currently under study. From 2003 we have followed prospec- e la sensibilità insulinica b) proporre valori di riferimento a li-
tively almost 300 patients with one thousand OGTTs (modi- vello nazionale, condividendo la nostra esperienza con centri
fied to quantify insulin secretory and sensitivity defects). In dell’Italia Centrale e Meridionale c) analizzare le differenze
FC21-2013 project we have investigated the age and sex de- tra i pazienti con e senza insufficienza pancreatica, l’effetto
pendency of insulin secretory parameters as well as their im- dei nuovi farmaci, la prevalenza e i sintomi di ipoglicemia
portance in nutritional status and respiratory function. durante OGTT. Si tratta di uno studio osservazionale
Hypothesis and objectives. Probably, defects in insulin Risultati preliminari. Nel corso del primo anno di proget-
secretion already present at young age, predispose to both to, sono state ottenute le approvazioni dei Comitati Etici, è
CFRD, nutritional and respiratory deterioration. We aim stata concordata e creata una piattaforma informatica centra-
to create for the Italian CF population, reference values of lizzata che permette l’inserimento dei dati clinici e di labo-
glucose, insulin and cpeptide concentrations in response to ratorio ed è iniziata l’esecuzione degli OGTT. Al termine del
OGTT, and of model-derived parameters of insulin secretion primo anno nella piattaforma erano stati inseriti i dati relativi
and insulin sensitivity. We should provide a better definition agli OGTT di 125 pazienti.
of the relationship of insulin secretory defects with age, sex, Risultati finali attesi e loro significato. Nomogrammi ag-
and new CF therapies. giustati per sesso ed età dei vari parametri a livello italiano,
Essential methods. The proposed strategy is: a) use OGTT saranno potenti strumenti per descrivere la storia naturale
as the experimental method because according to guidelines delle alterazioni glicemiche in fibrosi cistica, per predire il fu-
it should be performed annually and it allows simultaneous turo CFRD, le problematiche respiratorie e nutrizionali. Inol-
measurements of insulin secretory and sensitivity parameters tre permetteranno di individuare i pazienti portatori di deficit

35
di secrezione insulinica, a rischio di diabete, decadimento the onset of chronic infection in the lower respiratory tract.
respiratorio e nutrizionale e per porre una base razionale al Detecting possible vehicles for the transmission of environ-
trattamento. Il progetto aumenterà la conoscenza clinica di mental bacteria to the upper airways and the oral cavity, such
CFRD e dei deficit di secrezione insulinica che possono in- as toothbrushes, in order to reduce the probability of coloni-
fluenzare la prognosi. zation and infection of CF patients.

Serbatoi ambientali e umani di Pseudomonas


29. Environmental and human reservoirs of aeruginosa e altre specie batteriche in grado di
Pseudomonas aeruginosa and other bacterial colonizzare le basse vie respiratorie di pazienti
species colonizing the lower airways of cystic con fibrosi cistica
fibrosis patients Ragioni dello studio. Recenti studi indicano che le vie re-
spiratorie superiori e la cavità orale possano essere serbatoi di
Pseudomonas aeruginosa (Pa) e di altri batteri causa di infezioni
Signoretto C polmonari in pazienti con fibrosi cistica (FC). Tali distretti sono
Dipartimento di Diagnosi e Salute Pubblica, Sezione di considerati siti di adattamento che permettono ai batteri di colo-
Microbiologia, Università di Verona (FFC#22/2016, In nizzare le basse vie respiratorie. Il monitoraggio e l’eradicazione
progress) della flora nasale e orale potenzialmente patogena è fondamen-
tale per evitare o ritardare un’infezione polmonare cronica
Obiettivi. L’obbiettivo è validare un protocollo di cam-
pionamento della flora nasale/paranasale mediante lavag-
gio nasale (LN) in pazienti FC adulti e pediatrici e calcolare
l’incidenza delle specie batteriche potenzialmente patogene
nelle alte vie respiratorie e del cavo orale comparandola con
quella isolata dall’escreato. Viene valutata la possibilità che
gli spazzolini da denti fungano da serbatoi di batteri favoren-
do la colonizzano delle vie respiratorie. Il monitoraggio della
flora delle alte vie respiratorie/cavo orale ha lo scopo di evi-
tare o ritardare l’insorgenza di infezione polmonare cronica.
Si eseguirà anche un’indagine epidemiologica comparando i
profili molecolare dei ceppi di Pa in precedenza isolati con
Caterina Signoretto, responsabile del quelli isolati nel corso di questo studio.
progetto Pianificazione del progetto. Sono arruolati 60 pazienti FC
(adulti e pediatrici): 40 senza infezione/colonizzazione da Pa
e 20 con infezione cronica da Pa; monitorati per 12/15 mesi
Background. There are evidence that the upper airway e sottoposti, ogni 2/3 mesi, a prelievi di LN ed escreato. I
(nose, paranasal sinuses) and the oral cavity might be reservoir pazienti privi di Pa sono anche coinvolti nel monitoraggio
of Pseudomonas aeruginosa (Pa) and other bacterial species della flora del cavo orale e degli spazzolini con un prelievo
that cause infections in the CF lung. Probably are adaptation di saliva e ritiro dello spazzolino ad ogni visita. Tutte le specie
sites that allow bacteria to persist and then colonize the lower batteriche isolate sono identificate sia fenotipicamente che
airways. Monitoring and eradication of potentially pathogenic con metodi molecolari
nasal and oral micro-flora in patients with CF is therefore man- Risultati attesi e possibili ricadute. Validazione di proto-
datory to prevent or delay a chronic lung infection. collo di LN per il recupero della flora batterica dal naso/seni
Objectives. To set up and validate a protocol for the recov- paranasali e possibilità di introdurlo nel monitoraggio di se-
ery of bacterial nasal microflora by nasal lavage (NAL) both in lezionati pazienti FC. Proposta di linee guida per la raccolta/
CF adults and children. To evaluate the incidence of potentially monitoraggio della flora batterica dei serbatoi nasali/parana-
pathogenic bacterial species in the nasal/paranasal district in sali. Possibilità di confermare il ruolo di serbatoi ambientali
selected CF patients, monitoring NAL samples and comparing ed umani di flora batterica in grado di colonizzare il polmone
paranasal micro-flora with that in sputum. To explore the pos- al fine di evitare o ritardare l’insorgenza di infezione cronica
sibility that toothbrushes act as bacterial reservoirs favouring nelle basse vie respiratorie.Individuazione di possibili veicoli
the colonization of the oral cavity in CF. In addition epidemio- di trasmissione di batteri ambientali alle vie respiratorie supe-
logical survey to compares the molecular profiles of PA strain riori e cavo orale, quali gli spazzolini, per ridurre la probabi-
previously isolates with those isolated during this study lità di colonizzazione e infezione
Project planning. A total of 60 patients, adults and pediatri-
cians, were enrolled in this study. The patients were divided into
two different groups: those free of colonization of Pa and those
with chronic infection. All these patients are followed for about 30. Extracorporeal photopheresis as induction
12-15 months with visits and sampling of NAL and sputum every therapy to prevent acute rejection after lung
2/3 months.The 40 Pa free patients, are also involved in monitor- transplantation in cystic fibrosis patients
ing the bacterial flora in the oral cavity and toothbrushes with
saliva sampling. Isolated bacterial species will be identified both Nosotti M
phenotypically and typed by molecular methods Università degli Studi di Milano, IRCCS Fondazione Ca’
Expected results and spin-off. Validation and application Granda Ospedale Maggiore di Milano, U. O. di Chirurgia
of a NAL protocol for the recovery of bacteria from nose and Toracica e Trapianto di Polmone (FFC#24/2017, New)
paranasal sinuses and the opportunity to introduce it in the
monitoring of specific categories of CF patients. Identifica- Background. Despite the immunosuppressive therapy,
tion of reservoirs/vehicles of bacteria potentially colonizing acute rejection occurs frequently (about 35% of cases) in the
the oral cavity and upper airways in the patient CF. The pos- first year after lung transplantation.
sibility of confirming the role of environmental and human Although acute rejection can be treated with drugs, it deter-
bacterial flora by colonizing the lungs to prevent and/or delay mines the onset of chronic rejection which is the major cause

36
pressiva, il rigetto acuto si manifesta frequentemente (circa
35% dei casi) nel primo anno dopo il trapianto di polmone.
Anche se il rigetto acuto può essere trattato con farmaci, esso
determina l’insorgenza del rigetto cronico che è la principale
causa di perdita dell’organo nellungo periodo. Noi postuliamo
che la fotoferesi extrcorporea (ECP) potrebbe indurre immuno-
toleranza del graft evitando lo sviluppo di rigetto. L’esposizione
delle cellule T alla luce ultravioletta provoca danni al DNA e
apoptosi. Quando ri-infuse nel paziente, le cellule T apopto-
tiche vengono circondate dalle “cellule presentanti antigene”
(APC). Il gran numero di APC che circondano le cellule T dan-
neggiate limita la risposta infiammatoria e stimola specifiche
cascate di segnalazione nelle APC che promuovono la produ-
Mario Nosotti, responsabile del progetto zione di citochine anti-infiammatorie. Infine, le cellule dendri-
tiche immature potrebbero produrre fenotipi che inducono tol-
leranza immunologica. Sulla base di questi processi, una teoria
of graft loss in the long run. We postulate that ECP could induce postula che l’immuno-modulazione secondaria a ECP è cor-
graft immunotolerance avoiding the development of chronic relata ad un aumento generale delle cellule T regolatorie che
rejection. Exposing T-cells to ultraviolet light results in DNA causano una riduzione delle risposte immunitarie coinvolte
damage and apoptosis. When re-infused to the patient, apop- nell’insorgenza di rigetto cronico. Un’altra teoria presuppone
totic T-cells are surrounded by antigen presenting cells (APCs). che le cellule T soppressorie possano acquisire un’immunità
The large number of APCs encircling the damaged T-cells limits anti-clonale indotta dalle APC; quindi, una sorta di vaccinazio-
the inflammatory response and stimulates specific signalling ne delle cellule T come risultato dell’apoptosi dei leucociti. La
cascades in APCs that result in anti-inflammatory cytokine pro- nostra intenzione è di utilizzare la regolazione delle cellule T
duction; finally, immature dendritic cells could gain tolerogenic per indurre immunotolleranza verso l’organo trapiantato prima
phenotypes. Based on this process, a theory postulates that the dello sviluppo del rigetto, piuttosto operare quando il danno
immuno-modulation secondary to ECP is related to a general è in corso o già determinato. Per attivare questo effetto dalle
increase in regulatory T-cells that cause a down-regulation of prime ore dopo il trapianto, può essere utile l’attività immuno-
immune responses involved in chronic rejection onset. Another modulatoria della ECP già comprovata da studi clinici applicati
theory assumes that suppressor T-cells may acquire anti-clonal al trattamento del rigetto acuto e cronico.
immunity prompted by the APCs; therefore, a sort of T-cell vac- Obiettivi. Lo scopo di questo studio pilota è di valutare l’ef-
cination is the result of leukocyte apoptosis. Our intention is to ficacia e la sicurezza della fotoferesi extracorporea (ECP) come
use this T-cell regulation to induce immunotolerance toward terapia induzione per il rigetto acuto (AR) nei pazienti affetti
the graft before the development of chronic rejection, in spite da fibrosi cistica nel primo anno dopo il trapianto polmonare
to operate when the damage is in progress. To activate this ef- Metodi essenziali. I pazienti che subiranno il trapianto
fect from the first hours after transplantation, it can be useful di polmone nel primo anno dello studio faranno 6 cicli di
the immunomodulatory activity of extracorporeal photopher- fotoforesi (come una breve dialisi) dopo l’intervento chirur-
esis, already established by clinical studies applied to the treat- gico. Nel secondo anno si eseguiranno i normali controlli
ment of acute and chronic rejection. clinici più alcuni esami del sangue dedicati a scoprire mo-
Objective. The aim of this pilot trial is to evaluate the ef- lecole infiammatorie.L’efficacia della ECP come terapia di
ficacy and safety of extracorporeal photopheresis (ECP) as induzione sarà misurata con la registrazione del tasso di AR
induction therapy for prevention of acute rejection (AR) in nel gruppo di studio rispetto al gruppo di controllo. L’AR sarà
recipients affected of cystic fibrosis in the first year after lung diagnosticato con biopsia trans-bronchiale e classificato se-
transplantation. condo criteri istologici standard. Una riduzione stabile del
Essential Methods. The efficacy of ECP as induction ther- 10% di FEV1 sul basale sarà considerata come AR anche se la
apy will be measured with the identification of AR rate in the biopsia trans-bronchiale non fosse disponibile. Inoltre, l’im-
study group versus the control group. AR is diagnosed with munofenotipo linfocitario (con particolare riguardo al CD4
trans-bronchial biopsy and graded using standard histological + e CD25 +), il profilo della citochine (IL-4, IL-10, IL-12) e il
criteria: A0 (none), A1 (minimal), A2 (mild), A3 (moderate) contenuto di vescicole extracellulari verranno testati per va-
or A4 (severe). A stable 10% decrease of forced expiratory lutare la risposta terapeutica. Infine, si esaminerà il profilo
volume in 1 second (FEV1) on baseline will be considered degli anticorpi anti-HLA per comprenderne la dinamica.
as AR even though trans-bronchial biopsy is not available. In Risultati attesi e possibili ricadute. Ci si aspetta di vede-
addition, lymphocyte immunophenotype (with particular re- re diminuire consistentemente il numero di rigetti acuti nei
gard to CD4 + and CD25 +), the cytokine profile (IL-4, IL-10, pazienti trattati. Inoltre, gli esami biologici potrebbero darci
IL-12 measured by High Resolution Cytokines Array) and the l’identikit del paziente tipo che risponde alla terapia. In caso
extracellular vesicles content are tested to assess the thera- di esito positivo, si darebbe il via a uno studio più grande,
peutic response. Finally, anti-HLA antibodies are tested to un- nazionale, per confermare il risultato e passare poi alla appli-
derstand their dynamics. cazione generalizzata.
Expected results and spin-off. We expect to see decreases
consistently the number of acute rejection in patients treated.
In addition, the biological tests may give us an identikit of the
patient type that responds to therapy. If successful, the trial 31. Implementation of a new imaged-con-
would trigger a national study, to confirm the result and then trolled sweat test for in vivo quantification of
move on to the general implementation. CFTR function: value for diagnosis and effica-
cy of new therapies
Fotoferesi extracorporea come terapia d’indu-
zione per prevenire il rigetto acuto in pazienti Leal T1, Ceri S2, Nguyen-Khoa T3, (Presented by Melotti P)
affetti da fibrosi cistica e trapiantati di polmone 1
Louvain centre for Toxicology and Applied Pharmacology
Ragioni dello studio. Nonostante la terapia immunosop- (LTAP); Institut de recherché Expérimentale et Clinique (IREC);

37
Université catholique de Louvain, 2Dipartimento di Elettronica, are ongoing based on validation of the automated image analy-
Informazione e Bioingegneria, Politecnico Milano, 3Necker- sis software and on iontophoresis-based drug delivery that will
Enfants Malades Hospital, AP-HP Laboratory of General allow avoiding multiple intradermal injections.
Biochemistry, Paris, France (FFC#5/2016, In progress)
Realizzazione di un nuovo test del sudore video-
controllato per la misurazione della funzione del
canale CFTR: importanza per definire diagnosi
ed efficacia di nuove terapie.
Ragioni dello studio. Un test utile per complementare le
misurazioni della funzione del canale (CFTR) difettoso in fi-
brosi cistica (FC) già disponibili nei pazienti è stato allesti-
to da un gruppo statunitense confrontando la secrezione di
sudore CFTR-indipendente con quella CFTR-dipendente in
singole ghiandole sudoripare umane.
Ipotesi e obiettivi. Abbiamo voluto riprodurre, semplifi-
care ed implementare il metodo per permetterne un utilizzo
multicentrico riducendone i costi e la variabilità dipendente
Teresinha Leal, responsabile dal singolo operatore.
del progetto
Metodi essenziali. Nella stessa zona dell’avambraccio
due microiniezioni intradermiche successive di minimi vo-
Background and rationale. Diagnosis of CF is challeng- lumi (0,1ml) di stimoli farmacologici inducono prima sudo-
ing when sweat test has normal or borderline results and/ razione CFTR indipendente, monitorata fotograficamente per
or in the presence of CFTR mutations not reported to be 10 minuti, poi sudorazione CFTR dipendente, monitorata per
disease-causing. Sweat chloride test, the gold standard pa- 30 min. Il flusso di sudore viene quantificato misurando il
rameter for diagnosis of CF, has shown to be robust, but not volume delle goccioline prodotte dalle singole ghiandole su-
very sensitive. doripare, rese più precisamente visibili da un colorante blu.
Hypotesis and objectives. A bioassay for in vivo CFTR func- Sono stati valutati 22 soggetti affetti da FC, 22 non FC, 22
tion describing a ratio calculated between CFTR-dependent portatori sani, in tre casi non FC con manifestazioni cliniche
sweating, evoked by a • -adrenergic cocktail (C-sweat), and che richiamano per alcuni aspetti la FC.
CFTR-independent sweating, induced by cholinergic methacho- Risultati preliminari. Abbiamo confermato la capacità del
line (M-sweat), was reported in very small cohorts of subjects. test di distinguere significativamente i tre diversi gruppi tra di
The major objectives of this multicentre collaborative study are loro in base al rapporto tra il flusso di sudorazione dipenden-
to implement, validate and build reference C-sweat/M-sweat te da CFTR e quello indipendente. Abbiamo reso possibile
ratio values in larger CF and non-CF populations. l’allestimento dello stesso metodo nelle diverse sedi che par-
Essential methods. In this perspective, secretion rates of tecipano allo studio (in Francia ed in Belgio), ridotto i costi,
multiple sweat glands were quantified by testing 22 CF pa- semplificato la procedura e resa possibile l’individuazione
tients, 22 non-CF subjects (CTR), 22 healthy carriers (HTZ) automatica delle bolle di sudore mediante un software in fase
and three cases clinically resembling CF. di sviluppo per l’analisi delle immagini delle bolle il più pos-
Preliminary results. After having updated the image re- sibile veloce ed indipendente dal singolo operatore. L’analisi
cording setup, we observed that average ratios of C/M sweat di immagine in un gruppo selezionato di casi FC, non FC e
rates showed a quasi-linear readout of CFTR function: com- portatori ha evidenziando variabilità dipendente dall’opera-
pared to the average value found in non-CF controls, healthy tore dell’analisi di immagine, pur mantenendosi la capacità
carriers had half the value while CF subjects had values discriminante fra le 3 categorie di soggetti sottoposti al test.
around zero. Between-group comparisons showed significant Risultati finali attesi e loro significato. Questo studio pro-
differences of C/M ratios, confirming the highly discriminant pone un metodo utile per la misurazione della funzione CFTR
power of the test. Indeed, a cut-off value of 0.0055 fully dis- nei pazienti, da sviluppare nel prossimo anno per possibili
criminated between CF and non-CF patients (CTR+HTZ), applicazioni nelle diagnosi controverse, in presenza di mu-
providing sensitivity and specificity of 100%. A cut-off value tazioni con dubbia capacità di causare FC, nello sviluppo e
of 0.131 discriminated between HTZ and CTR, providing monitoraggio di nuove terapie mirate sul difetto di base per
sensitivity of 82% and specificity of 86%. In a patient with un approccio sempre più individualizzato.
a CFTR-related disorder, the C/M ratio value (0.06) was be-
tween those found in the CF and the HTZ groups. A C/M
ratio of 0.52 was found in a patient displaying primary ciliary
dyskinesia and CFTR genotype F1052V/1716G>A; this was 32. Human intestinal organoids for detecting
consistent with a CFTR variant (F1052V) of varying clinical CFTR rescue molecules in human plasma
consequences (www.cftr2.org). In a patient of Kartagener’s
syndrome, the C/M ratio was 0.96. Specificity of C-sweat Melotti P
induction was confirmed by full inhibition of sweat droplet Centro regionale Fibrosi Cistica, Azienda Ospedaliera
formation under long-term therapy with • –blocker eye drops. Universitaria Integrata di Verona (FFC#7/2016, In progress)
Expected final results and their significance. Moreover,
because of data analysis of volume of droplets formed during Background and rationale. Active drugs on specific CFTR
the bubble test is, as initially reported, labor-intensive and op- mutations are available for clinical trials, and some are ready for
erator-dependent, we have launched a pilot development of a therapy in CF patients. To better understand the variability of re-
prototype software suitable for automated image analysis. The sponse among different FC patients and possibly adapt therapy
automated detector used for image analysis exploits some ad- (choice and dosage of the drug), we aim to evaluate the plasma
vanced routines provided by the Image Processing Toolbox of levels of active substance (Orkambi, Kalydeco, Ataluren) in the
MATLAB. Finally, we have confirmed here, using much larger plasma of individual patients. For this purpose the approach by
populations, that the bubble test is able to fully discriminate be- intestinal organoids promise to be an efficient tool.
tween CF, non-CF and healthy subjects. Further improvements Hypotesis and objectives. Drugs active on specific CFTR

38
Organoidi intestinali umani per diagnosticare il
recupero di CFTR mutata per effetto di farmaci
modulatori di CFTR presenti in campioni di pla-
sma umano.
Ragioni dello studio. Farmaci attivi su specifiche mutazioni
del gene CFTR sono disponibili per sperimentazione clinica
ed ormai alcuni per terapia della fibrosi cistica (FC). Mancano
ancora validi sistemi per prevedere nel singolo malato e moni-
torarne nel tempo l’efficacia. Gli organoidi intestinali (struttu-
re microscopiche ottenute da staminali di epitelio da biopsia
rettale) promettono di essere strumento efficiente a tale scopo.
Ipotesi e obiettivi. Per meglio comprendere la variabilità
Paola Melotti (al centro), responsabile del progetto, di risposta tra i diversi pazienti FC ed eventualmente adegua-
con i colleghi di ricerca
re la terapia (scelta e dosaggio del farmaco), si vogliono valu-
tare i livelli di farmaco attivo circolante (Orkambi, Kalydeco,
mutations have been evaluated and added to the plasma Ataluren) nel plasma di singoli pazienti.
of healthy subjects in laboratory to set up and calibrate the Metodi essenziali. Sono stati valutati farmaci attivi su spe-
method, as well as present in plasma of FC patients from cifiche mutazioni del gene CFTR sia aggiunti in laboratorio
ongoing treatment with Orkambi. In both circumstances, al plasma di soggetti sani per mettere a punto e calibrare il
we have found recovery of the function of CFTR protein in metodo, sia presenti in plasma di pazienti FC per trattamento
respiratory epithelial cells with FC characteristics (mutation in corso con Orkambi. In entrambe le circostanze è stato da
F508del homozygous). To develop a “personalized” model noi individuato recupero della funzione della proteina CFTR
of medicine for single FC patients, we evaluated the function in cellule di epitelio respiratorio con le caratteristiche FC (mu-
of CFTR in intestinal organoids of FC patients. tazione F508del in omozigosi). Per sviluppare un modello di
Essential methods. These approximately spherical shaped medicina “personalizzata” per singoli pazienti FC abbiamo va-
epithelial structures are developed in the laboratory from lutato la funzione di CFTR in organoidi intestinali di pazienti
stem cells recovered from rectal biopsies (obtained by mini- FC. Tali strutture epiteliali di forma approssimativamente sferi-
mally invasive procedure) according to a method already ca sono sviluppate in laboratorio da cellule staminali recupe-
established by a Dutch research group and then set up in rate da biopsie rettali (ottenute con procedura minimamente
Verona (Sorio C, FFC project # 3/2014) in collaboration with invasiva) secondo un metodo già in precedenza stabilito da un
Rotterdam, deJonge C).). The organoids swell when CFTR gruppo di ricerca olandese ed allestito poi a Verona (C. Sorio:
protein (defective in FC) is activated: their volume variation FFCt#3/2014), in collaborazione con R otterdam (H. deJonge).
depends on CFTR activity and can be measured. Gli organoidi si rigonfiano quando viene attivata la proteina
Preliminary results. By treating in the laboratory FC or- CFTR, difettosa in FC: la loro variazione di volume dipende
ganoids with CFTR targeted drugs (Orkambi, Ataluren, Ka- dall’attività di CFTR e può essere misurata.
lydeco) we detected swelling that was absent prior to treat- Risultati preliminari. Mantenendo in laboratorio gli or-
ment. The availability of organoids coming from a CF patient ganoidi FC con farmaci che correggono la proteina CFTR
treated with Ataluren in which recovery of CFTR function on mutata (Orkambi, Ataluren, Kalydeco) abbiamo individuato
nasal epithelium (by nasal potential difference measurement) rigonfiamento che era assente prima del trattamento. Nell’u-
was demonstrated and good clinical response (pulmonary nico caso (di organoidi disponibili di paziente trattato con
function) was known, permitted us to identify a good drug Ataluren con buona risposta clinica (funzione polmonare) e
response (swelling) in organoids themselves when treated in di CFTR su mucosa nasale (misurazione di potenziali nasali)
the laboratory with the same drug. abbiamo identificato anche in laboratorio buona risposta allo
Expected final results and their significance. We will con- stesso farmaco (rigonfiamento degli organoidi).
tinue, while participating in international initiatives, to set Possibili ricadute per ricerca e clinica. Proseguiremo, an-
up organoid applications for the development of new drugs, che partecipando ad iniziative internazionali, ad allestire con
monitoring the established therapies in individual patients, organoidi applicazioni per sviluppo di nuovi farmaci, moni-
predicting clinical response, possibly supporting atypical di- toraggio delle terapie instaurate nei singoli pazienti, previsio-
agnosis, and understanding the mechanism and consequenc- ne della risposta clinica, eventuale supporto alla diagnosi di
es of rare CFTR mutations. forme atipiche, maggior comprensione delle conseguenze di
rare mutazioni CFTR.

PLENARY SESSION 5
STATE OF THE ART AND NEW PERSPECTIVES ON CF DISEASE MODELS
Chairmen: Mario Romano, Vincenzina Lucidi • Netti P (CRIB Istituto Italiano di Tecnologia, Napoli)
Tissue engineering strategy for reconstituting full thickness
Alessandra Bragonzi. Animal models of Cystic Fibrosis: setting
airway tissue in vitro
the stage and directing the workforce for the future
The development of safe and effective drugs is currently hampered by
Discussion the poor predictive power of existing preclinical animal models that
often lead to failure of drug compounds late in their development
Luis Galietta. An overview of in vitro and ex vivo CF disease after they enter human clinical trials. In order to improve the success
models rate of the drug development it is mandatory to use models as close
as possible to human pathophysiology. The recent developments of
Contribution 3D human tissue models and of microscale engineering technologies
to create an organ-on-a-chip model represent attempts to get closer

39
to the human reality. In this field, researchers are making efforts di una mutazione. Utilizzando il modello delle cellule nasali, grazie
to build up a realistic respiratory epithelium in vitro to replicate anche ad un progetto finanziato dalla Fondazione ed approvato dal
airway diseases. Usually, airway epithelia are studied in vitro by Comitato Etico dell’Università di Napoli Federico II, abbiamo studiato
seeding bronchial or nasal epithelial cells on porous membranes l’effetto di alleli complessi nel gene CFTR (cioè più mutazioni sullo
and inducing their differentiation by placing the cells under air- stesso allele, ereditate dallo stesso genitore), e l’effetto di alcune
liquid interface conditions. Recently respiratory epithelium has been mutazioni che alterano lo splicing. Le cellule nasali in coltura prelevate
reproduced in a microfluidic device, so called Lung on chip. Such da un paziente possono servire anche a valutare l’effetto di farmaci
device reproduces both the lung’s alveolar-capillary interface and the (potenziatori, correttori o altri farmaci molecolari) sulla proteina
mechanical effects of breathing on that interface. Although epithelia CFTR specificamente alterata dalle mutazioni del paziente prima
on porous membranes as well as lung-on chip model are useful for di somministrare il farmaco al paziente stesso, selezionando così i
many applications, they do not recapitulate the crosstalk, existing in “responder” ed evitando di somministrare terapie prive di efficacia ai
vivo, between the epithelium and the underlying connective tissue. pazienti “non responder”. In questo caso, ad esempio, si può misurare
The latter has fundamental role on the differentiation and function i livelli di RNA messaggero di CFTR prima e dopo l’aggiunta di farmaci
of the epithelium and the response/adaptation to physiological che stimolano l’espressione del gene (il nostro gruppo di ricerca ha
stimuli and noxious events. In this perspective the IIT@CRIB lab prodotto dati sull’impiego del butirrato) oppure misurare l’attività della
established a novel tissue engineering approach to build-up organ proteina CFTR prima e dopo l’aggiunta di potenziatori o correttori.
in vitro succeeding in producing different organ models. Our
results clearly demonstrate the fundamental role of the connective • Romano M (Dip. Scienze Mediche, Univ. Chieti-Pescara)
tissue, developed with our tissue engineering strategy, in guiding in Human periodontal ligament stem cells: A novel CF disease
vitro epithelium morphogenesis. As proof of this, we succeeded in
model
producing functional skin tissues including follicle appendages and
able to perform and replicate skin sensory function. Primary cells from cystic fibrosis (CF) patients are paramount to study
CF pathogenesis and develop personalized therapeutics. Epithelial
• Sorio C (Dip. Patologia e Diagnostica. Univ. Verona) cells from nasal brushing or intestinal organoids are currently used for
these purposes. In alternative, somatic cells from CF patients can be
Monocyte as an in vitro model for CF disease reprogrammed to obtain inducible pluripotent stem cells (iPSC) that can
Since a seminal paper in 2006 by Di et al. that described a specific be differentiated into airway epithelial cells. These models, founded on
alteration of lung macrophages in cystic fibrosis a number of studies the concept that epithelial cells better represent the CF phenotype, suffer
revealed a series of dysfunctions in myeloid cells occurring in CF from some limitations related to complex isolation and differentiation
patients. Indeed, the inability to manage both the infection and procedures, limited lifespan and availability over time. Here, we propose
the excessive inflammatory response suggests that innate immune human adult stem cells from the periodontal ligament (hPDLSC) as a
system is dysfunctional in CF. Although there is a debate on whether novel model for CF research. Using western blotting, flow cytometry,
alteration in innate immunity in CF is an intrinsic abnormality or YFP and DiSBAC2(3) fluorescence, we established that hPDLSC express
the result of the interaction with host environment experiments on a biologically active CFTR and that CFTR expression and activity are
isolated cells and transplantation of WT bone marrow in CF mice reduced in CF-hPDLSC. In preliminary studies, the combination of
and, very recently, in newborn pigs indicate that an intrinsic defect CFTR modulators VX-770/VX-809 enhanced CFTR maturation and
is present in CF monocyte/macrophages and might contribute to the activity in CF-hPDLSC, to a similar extent as in nasal epithelial cells,
pathogenesis of the disease. Monocyte-derived macrophages from and in good agreement with the clinical response of the patients to these
CF individuals have been recently shown to be less capable to direct drugs. hPDLSC response to CFTR modulators did not vary after storage
toward a M2 phenotype, necessary to resolve inflammation and in liquid nitrogen nor over several replication cycles. Interestingly,
manage fibrosis suggesting that a homeostasis is impaired and once CF-hPDLSC showed severely impaired adipogenesis and significantly
a pro-inflammatory status is established the healing process with the delayed osteogenesis compared to normal hPDLSC. Collectively, our
return to the pre-inflammatory status is nearly impossible. If CFTR is results indicate that hPDLSC can represent a valuable tool for CF drug
expressed and has a role in these cells not only they become a target discovery, precision medicine and disease modeling. Their properties
of therapies but also they can be exploited as a potential biomarker can be summarized as follows: 1. Easy to obtain by minimally invasive
of disease. In the last years others and we are trying to find a suitable procedures; 2. No need for reprogramming and differentiation into
approach to be able to measure CFTR-associated parameters in epithelial cells; 3. Excellent proliferation rate; 4. Stored for indefinite
peripheral blood given the abundance and the easy access of these time and reused when necessary; 5. Helpful to investigate on the role of
cells in comparison with other CFTR-expressing ones. As of today CFTR in stem cell pathobiology.
there is no doubt that CF monocytes and macrophages are different
form the normal counterpart at various levels. Although this issue • Melotti P (Centro CF, Azienda Ospedaliera-Universitaria,
requires further studies to be fully appreciated it is expected to Verona)
contribute to a deeper understanding of the relationship among Intestinal organoids as a model of CF disease
different tissues especially in the CF lung environment. Alteration
Intestinal organoids are very appropriate for personalized medicine,
of integrin activation in monocytes we recently reported might, for
genotype/phenotype correlation, gene modifiers studies. A quantitative
example, contribute to explain the mechanism behind neutrophils
assay for measuring CFTR function in murine and human primary
accumulation in CF lung, a main feature of CF disease.
intestinal crypt-based tissues was established and then relevant
applications for cystic CF were developed. In Verona this model has
• Castaldo G (CEINGE Biotecnologie avanzate, Univ. Federico been set-up and utilized (FFCgrants#4/2013;3/2014;3/2015;7/2016)
II, Napoli) for better understanding the relevance for CFTR function of rare CFTR
Cellule epiteliali nasali: un modello ex-vivo per studiare mutations and CFTR function has been correlated with CFTR genotype
with capability of this model of detecting CFTR residual function in
l’effetto di mutazioni e di nuovi farmaci in pazienti con
single patients. Furthermore predictivity is based on correlation of the
Fibrosi Cistica effects of CFTR correctors/potentiators on organoids swelling and lung
Mediante brushing (utilizzando uno scovolino) è possibile prelevare function changes in CF patients during therapy. The use of intestinal
cellule epiteliali nasali e metterle in coltura; il prelievo è una organoids as a model of CF disease is consistent with the correlation
procedura non invasiva, indolore, che nelle mani di un esperto with intestinal current measurements (ICM, performed in Verona
otorino può essere praticata anche a bambini piccoli. Il vantaggio according to ECFS-SOP) in rectal biopsies utilized as source of stem
di questo modello è che sulle cellule di epitelio nasale è presente la cells capable of developing intestinal organoids in appropriate culture
proteina CFTR eventualmente mutata e quindi è possibile studiare conditions. They are sferoids long-term available, whose swelling
specificamente, nel paziente FC che porta un determinato genotipo, is CFTR dependent, due to fluids influx. Epithelial 2D cell cultures
l’effetto molecolare delle sue mutazioni (soprattutto quando si tratta di derived from intestinal organoids are shedding light in collaboration
mutazioni nuove). Per esempio, utilizzando la tecnica di RT-PCR si può with Hugo deJonge (EMC,Rotterdam,NL) on selective defects of
misurare la quantità di gene espresso (e questo serve a stabilire l’effetto anion transport mediated by CFTR with specific CF phenotypes, as
di mutazioni nelle regioni non codificanti del gene); oppure è possibile in the presence of mutations affecting bicarbonate transport but not
capire, attraverso una reazione di RT-PCR seguita da elettroforesi, se chloride described in patients affected by pancreatitis with preserved
una mutazione localizzata nelle regioni introniche (non codificanti) lung function. These cultures are models also for better understanding
del gene causi l’alterazione del processo di splicing che serve a mucus properties in CF (FFCgrant#12/2016). This model consists
“confezionare” un RNA e quindi una proteina CFTR normale. Inoltre of epithelial cells of single patients whose genotype, phenotype,
è possibile misurare l’attività di gating, cioè di trasporto della proteina response to drugs, microbioma, severity of disease, can be correlated
CFTR e stabilire in che percentuale questa attività è alterata per effetto with results available by several bioassays performed with organoids.

40
POSTER SESSION 2
CF MICROBIOLOGY/INFECTION
33. Development of inhalable particles for op- of the antimicrobial peptide M33. Proponents expect to get
results applicable in humans within a few years.
timal delivery of a potent antimicrobial mol-
ecule in P. aeruginosa infected lungs Sviluppo di particelle inalabili per la sommini-
strazione ottimale di una potente molecola anti-
Pini A1, D’Angelo I2
1
Dipartimento di Biotecnologia Medica, Università di Siena,
microbica nelle infezioni polmonari dovute a P.
2
Dipartimento di Scienze e Tecnologie Ambientali, Biologiche aeruginosa
e Farmaceutiche, Di.S.T.A.Bi.F., Seconda Università di Napoli Ragioni dello studio. Il peptide antimicrobico M33 è una
(FFC#17/2016, In progress) molecola attualmente in fase di sviluppo preclinico per la
messa a punto di un nuovo farmaco antibiotico per la cura
delle infezioni riscontrate nei pazienti di Fibrosi Cistica (CF).
Parallelamente allo sviluppo della molecola nella sua forma
libera, si stanno studiando sistemi di somministrazione più
adatti per potenziare la sua efficacia.
Ipotesi e obiettivi. L’ambiente broncopolmonare del pa-
ziente CF, ricco di muco e altri fattori patologici, potrebbe
inibire il normale raggiungimento del sito di infezione da
parte del peptide libero. L’utilizzo di polveri inalabili in cui
incapsulare la molecola e permettergli un ottimale raggiungi-
mento dei siti di infezione polmonari, è l’obiettivo di questo
progetto. Il lavoro sarà svolto in collaborazione tra due gruppi
di ricerca di Siena e Napoli.
Metodi essenziali e risultati preliminari. Durante il pri-
Alessandro Pini (secondo da destra), responsabile del progetto, mo anno il gruppo di Siena si è occupato della sintesi della
con i collaboratori e partner di ricerca Ivana d’Angelo, nel riquadro
molecola brevettata dall’Università di Siena nella forma non
coniugata e coniugata a Rodamina (Rhod) (composto fluore-
Background and rationale. The antimicrobial peptide scente, n.d.r.). Il gruppo di Napoli si è dedicato alla selezione
M33 is a molecule currently in preclinical development phase delle polveri e all’incapsulamento di M33 in esse, oltre alla
for the set up of a new antibiotic drug for lung infections in caratterizzazione in vitro dei composti ottenuti.
Cystic Fibrosis (CF) patients. Parallel to the preclinical devel- Il peptide M33 è stato prodotto secondo le procedure di
opment of the molecule as a free drug, we are studying the manifattura messe a punto in passato e incapsulato in nano-
most suitable delivery systems to enhance its effectiveness. particelle a base di PLGA(Acido poliglicolico) con PEG (Po-
Hypothesis and objectives. The environment of CF bron- lietilenglicole) (a due diversi pesi molecolari) per il rilascio
cho-pulmonary patient, rich of mucus and other pathological della molecola nel sito di infezione. Dopo l’incapsulamento,
factors, may inhibit the normal transport of the free peptide le nanoparticelle contenenti M33-Rhod sono state testate in
to the site of infection. Inhalable powders will be used for the modo da valutare varie proprietà in vitro, tra cui l’efficacia di
peptide encapsulation, in order to allow to M33 an optimal incapsulamento e la cinetica di rilascio. Inizialmente è stato
achievement of pulmonary infection sites. The work will be studiato il comportamento dei composti in condizioni ripro-
done in collaboration between two research groups from Si- ducenti l’ambiente fisiopatologico del polmone fibrocistico.
ena and Naples. Il miglior composto in termini di efficacia e tossicità in vitro,
Essential methods and preliminary results. During the sarà quindi valutato in vitro e in vivo attraverso test microbio-
first year of work the Siena group manufactured the mole- logici e applicazioni per aerosol in topi infettati nel polmone
cule patented by the University of Siena in Rhod-conjugated con il batterio P. aeruginosa.
peptide form and non-conjugated peptide form. The Naples Ricadute per la clinica. L’obiettivo di questo progetto è la
group worked on the selection of the powders and encap- messa a punto di una nuova formulazione e sistema di som-
sulation of M33 in them, in addition to the in vitro charac- ministrazione del peptide antimicrobico M33. I proponenti
terization of the compounds obtained by encapsulation. The si aspettano di ottenere risultati applicabili nell’uomo entro
M33 peptide was produced according to the manufacturing alcuni anni.
procedures developed in the past and encapsulated in PLGA-
based nanoparticles (NPs) conjugated with PEG at two dif-
ferent molecular weights, for the slow release of the molecule
into the site of infection. After encapsulation, NPs containing 34. Induction of viable but non-culturable
M33-Rhod were used in order to evaluate NPs properties in forms, possibly responsible for treatment fail-
vitro, such as the M33 encapsulation efficiency and release ure, in in vitro biofilms of Pseudomonas aeru-
kinetics. Initially, the behaviour of the compounds in condi-
tions reproducing the physio-pathological environment pres-
ginosa. Role of antibiotics and antibiotic con-
ent in the lung of CF patients was tested. The best compound centrations
in terms of efficacy and toxicity will then be evaluated for in
vitro and in vivo tests. For this aim, in vivo experiments in ani- Biavasco F
mals treatable by aerosol applications, will be developed to Dipartimento di Scienze della Vita e dell’Ambiente, Università
evaluate the effectiveness of the compound in mice infected Politecnica delle Marche (FFC#13/2017, New)
in the lungs with P. aeruginosa bacteria.
Spin-off for clinical purposes. The goal of this project is Background and rationale. Pseudomonas aeruginosa pul-
the development of a new formulation and delivery system monary infection is the main cause of morbidity and mortal-

41
e di mettere a punto saggi non colturabili affidabili per il loro
rilevamento.
Ricadute per la clinica. I risultati ottenuti contribuiranno
alla messa a punto di protocolli terapeutici più efficaci in gra-
do di evitare, o almeno ridurre consistentemente, la forma-
zione di biofilm batterici e di forme VBNC e di protocolli più
efficaci per la diagnosi microbiologica di infezione polmona-
re da P. aeruginosa.

35. Preclinical study of a host-directed therapy


based on Metformin and bioactive liposomes
Francesca Biavasco, seconda da destra, con i collaboratori del
progetto for the control of multidrug resistant P. aerugi-
nosa infection
ity in Cystic Fibrosis patients. The viable but non-culturable
Poerio N1, De Santis F1, Di Sano F1, Bragonzi A2, Lucidi V3,
(VBNC) state is a bacterial response to adverse environmental
Fraziano M1
conditions that gives rise to dormant bacterial forms. Growth 1
Dipartimento di Biologia, Università di Roma ‘’ Tor Vergata
in CF lung, which is characterized by high saline concentra-
‘’, Roma, Italia. 2 Unità di Infezioni e Fibrosi Cistica, Istituto
tions and oxygen depletion as well as the presence of toxic
Scientifico San Raffaele, Milano, Italia. 3 Unità Operativa
compounds (coming from antibiotic treatments) provides ideal
Complessa Fibrosi Cistica, Dipartimento di Medicina
conditions for viable but non-culturables forms (VBNC) induc-
Pediatrica, Ospedale Pediatrico Bambino Gesù, Roma, Italia
tion. VBNC forms have been implicated in chronic P. aerugi-
(FFC#14/2017, New)
nosa infections. Yet, their lack of growth in culture media and
the current unavailability of reliable, sensitive, and specific mo-
lecular techniques means they are difficult to detect.
Objectives. This project aims to: provide a clear descrip-
tion of the role of antibiotic treatment in the emergence and
persistence of VBNC P. aeruginosa forms through the study of
in vitro biofilms of P. aeruginosa; develop non-cultural assays
capable of detecting and counting VBNC P. aeruginosa cells
in patient samples in a reliable way.
Spin-off for clinical purposes. The results will contribute
to provide i) a reliable microbiological diagnosis of P. aerugi-
nosa infection through the representation of its actual pulmo-
nary colonization, also encompassing dormant form, and ii)
effective antimicrobial treatments capable of contrasting, or
at least containing, the development of biofilm and persistent
Maurizio Fraziano con collaboratrici del progetto
bacterial forms.

Ruolo degli antibiotici nell’induzione di forme vitali ma Background and Rationale. We have recently developed
non coltivabili (potenziali responsabili del fallimento novel apoptotic body like liposomes (ABL) loaded with se-
della terapia) di Pseudomonas aeruginosa in modelli di lected second lipid messengers able to enhance bactericidal
biofilm in vitro innate immunity, against multidrug resistant (MDR) pulmonary
Ragioni dello studio. L’infezione polmonare cronica soste- infections by simultaneously limiting inflammation. Moreover,
nuta da Pseudomonas aeruginosa, è la causa più frequente di Metformin (Met) has been recently reported to augment air-
morbidità e mortalità nei pazienti affetti da fibrosi cistica (CF). way surface hydration in in vitro models of Cystic Fibrosis (CF).
La difficoltà di eradicazione deriva principalmente dallo svi- Hypotesis and objectives. The main aim of this project
luppo di biofilm e di forme batteriche persistenti. Lo stato vitale is the development of a novel immunotherapeutic approach
ma non coltivabile (VBNC) è una forma di persistenza micro- based on bioactive liposomes in combination with Met aimed
bica attuata in risposta a condizioni sfavorevoli (es. basse tem- to enhance antimicrobial innate immune response, while si-
perature, carenza di nutrienti, presenza di sostanze tossiche). multaneously improving epithelial lung hydration and limiting
La capacità di sopravvivenza in forma VBNC, ampiamente do- the inflammatory response, as a further tool to control pulmo-
cumentata per molti batteri ambientali, è stata recentemente nary drug resistant infections in CF.
chiamata in causa come possibile responsabile dell’insorgenza Essential methods. Macrophages generated by periph-
di infezioni persistenti e croniche, caratterizzate dalla mancata eral monocytes derived from healthy donors and CF patients
eradicazione in seguito alla terapia antibiotica. Attualmente il will be infected with a panel of MDR P. aeruginosa clinical
gold standard per la diagnosi di infezione polmonare nei pa- isolates and stimulated with ABL loaded with phosphatidic
zienti CF si basa su tecniche colturali che non sono in grado acid (PA), phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI4,5P2),
di rilevare le forme VBNC, a causa dell’impossibilità di farle phosphatidylinositol 5-phosphate (PI5P), or phosphatidylin-
crescere nei comuni terreni di coltura. Per poter dimostrare il ositol 4-phosphate (PI4P) alone or in combinations with
loro coinvolgimento nelle infezioni polmonari croniche e in- Met. Intracellular bacterial viability, ROS generation, phago-
dividuare i fattori alla base della loro formazione risulta quindi some maturation and cytokine production will be evaluated
di primaria importanza avere a disposizione affidabili metodi by CFU assay, fluorometry, confocal microsc opy and ELISA,
diagnostici non colturali. respectively. Finally, the best therapeutic formulation will be
Obiettivi. In questo progetto ci proponiamo, utilizzando validated in vivo in murine models of CF after acute infection
modelli di biofilm batterici in vitro, di valutare il ruolo di di- with P. aeruginosa.
verse concentrazioni di antibiotici nello sviluppo di biofilm e Preliminary results. We have recently described that ABLs
nell’insorgenza e persistenza di forme VBNC di P. aeruginosa loaded with PA or PI5P significantly enhanced bactericidal

42
response of macrophages from CF patients and of BAL cells Mangoni ML1, Ferrera L2
from patients with pneumonia caused by different bacterial 1
Dipartimento di Scienze Biochimiche, Università La
pathogens, irrespective of bacterial species and multidrug re- Sapienza, Roma, 2U.O.C Genetica Medica, Istituto G. Gaslini)
sistance (Sci. Rep., 2017; 7:45120). Finally, our unpublished (FFC#15/2017, New)
results show that the bacterial uptake of macrophages treated
with the CFTR inhibitor INH172 and of CF macrophages was
impaired in comparison with control macrophages and that
this activity may be improved by stimulation with ABLs.
Expected results and their significance. The expected re-
sults of the present project will allow the development of nov-
el anti-microbial strategies and approaches to treat inflamma-
tion and improve lung surface hydration in CF lung infections.

Studio pre-clinico di un nuovo approccio im-


munoterapeutico basato sulla combinazione
Metformina e liposomi bioattivi per il controllo
delle infezioni causate da P. aeruginosa antibio-
Maria Luisa Mangoni, a sinistra seduta, con i ricercatori di labora-
ticoresistenti. torio e Loretta Ferrera, partner del progetto, nel riquadro
Ragioni dello studio. Abbiamo recentemente sviluppato
dei liposomi simili a corpi apoptotici (apoptotic body like lipo-
Background and rationale. Pseudomonas aeruginosa is
somes, ABL) caricati con secondi messaggeri lipidici in grado
the most prevalent lung bacterial pathogen in cystic fibrosis
di potenziare la risposta antimicrobica innata nei confronti di
(CF) causing severe tissue damage and failure of respiratory
patogeni batterici farmaco-resistenti (MDR) limitando la rispo-
functions. It is difficult to eradicate, mainly due to its resis-
sta infiammatoria. Inoltre, è stato dimostrato come la Metfor-
tance to most available antibiotics and ability to form biofilms.
mina (Met), farmaco già in uso con altre indicazioni terapeu-
We identified a short-sized antimicrobial peptide (AMP) from
tiche, sia in grado di aumentare, in modelli in vitro di fibrosi
frog skin (21 amino acids), Esc(1-21), which rapidly kills P.
cistica (FC), l’idratazione di cellule epiteliali bronchiali umane.
aeruginosa with a membrane-perturbing activity that prevents
Ipotesi e obiettivo. L’obiettivo di questo progetto è di va-
bacteria from developing resistance. Recently, we designed
lidare, in modelli in vitro e in vivo, una nuova formulazione
a diastereomer of Esc(1-21), more stable, less cytotoxic and
immunoterapeutica, basata su liposomi bioattivi e Met, come
more efficient in stimulating migration of bronchial epithelial
strumento per il controllo di infezioni causate da ceppi batte-
cells and presumably in promoting recovery of the bronchial
rici MDR di P. aeruginosa.
epithelium integrity. In addition, the diastereomer was more
Metodi. Macrofagi generati da monociti del sangue perife-
efficient in reducing lung bacterial burden in mouse models
rico di donatori sani e pazienti FC saranno infettati in vitro con
of P. aeruginosa lung infection, upon a single intratracheal (i.t)
un pannello di isolati clinici MDR di P. aeruginosa e stimolate
administration. However, conceiving AMPs for local delivery
con gli ABL caricati con acido fosfatidico (PA), fosfatidilinosito-
to the lungs, adequate airway delivery strategies are needed
lo 4,5- bisfosfato (PI4,5P2), fosfatidilinositolo 5- fosfato (PI5P),
to promote their transport to the infection site.
o fosfatidilinositolo 4-fosfato (PI4P), da soli o in combinazione
Hypothesis and objectives. Main objectives are (i) the
con Met. La vitalità batterica, la maturazione fagosomale, e
production of polymeric nanoparticles (NPs) to achieve an
la produzione di citochine sarà valutata tramite saggi di CFU
effective pulmonary administration of Esc(1-21) and/or its
(Unità Formanti Colonie), fluorimetria, microscopia confocale,
diastereomer and to assist the peptide diffusion through the
ed ELISA. La formulazione terapeutica in grado di fornire i mi-
bronchial mucus; (ii) the evaluation of toxicity and antimicro-
gliori risultati in vitro sarà infine validata in vivo, in un modello
bial efficacy of peptide-loaded NPs (in comparison to the free
di infezione acuta di P. aeruginosa, su topi CFTR -/-.
peptides) for treatment of P. aeruginosa-induced respiratory
Risultati preliminari. Abbiamo recentemente dimostrato
infection, upon i.t. instillation. (iii) studies on the molecular
che gli ABL caricati con PA o PI5P potenziano la risposta
mechanism underlying the wound healing activity of the se-
antimicrobica di macrofagi FC e da cellule derivate da BAL
lected AMPs and their effects on epithelial ion channels.
di pazienti con polmoniti causate da patogeni batterici an-
Essential methods. A multidisciplinary approach combin-
tibiotico-resistenti. Inoltre, alcuni nostri risultati preliminari,
ing biochemical, cell biology, microbiological, drug delivery
dimostrano che macrofagi trattati farmacologicamente con
techniques and preclinical testing in mouse models to explore
l’inibitore per il CFTR e macrofagi FC hanno una ridotta ca-
the efficacy and safety profile of the selected peptides and
pacità di fagocitosi e che tale attività può essere almeno in
peptide-loaded NPs for treatment of lung infections, upon i.t.
parte ripristinata dalla stimolazione con ABL.
administration.
Risultati attesi e loro significato. I risultati che ci atten-
Preliminary results. Preliminary data have indicated that
diamo consistono nell’identificazione di una formulazione
both peptides do not alter the permeability of CF airway epi-
immunoterapeutica, basata su liposomi bioattivi in combina-
thelial model system. The preparation of polymeric NPs en-
zione con Met, somministrabile per via aerosolica e in grado
capsulating Esc(1-21) is in progress.
di potenziare la risposta antimicrobica nei confronti di P. ae-
Expected final results and their significance. These stud-
ruginosa MDR, limitando al tempo stesso la risposta infiam-
ies are expected to yield a peptide-based drug to defeat P.
matoria e favorendo l’idratazione dell’epitelio bronchiale.
aeruginosa lung infection and to promote healing of the bron-
chial epithelium in CF. Furthermore, the development of nan-
oformulations should optimize peptide delivery at lung, upon
36. Frog skin-derived peptides for treatment of i.t. instillation. These latter should also provide a sustained
Pseudomonas aeruginosa lung infection and release of the peptide to the site of infection at effective con-
centrations with minimal side-effects.
bronchial epithelial repair: advanced in vitro
and in vivo characterization and development Peptidi da pelle di rana per il trattamento di in-
of polymeric nanoparticles for lung delivery fezioni polmonari da Pseudomonas aeruginosa e

43
riepitelizzazione della mucosa bronchiale: carat-
terizzazione in vitro ed in vivo e sviluppo di na-
noparticelle polimeriche per la loro veicolazione
a livello polmonare
Ragioni dello studio. Pseudomonas aeruginosa è il bat-
terio predominante nei polmoni di pazienti con fibrosi cisti-
ca (FC) causando gravi danni al tessuto polmonare e perdita
delle funzioni respiratorie. È molto difficile da debellare sia
a causa della sua acquisita resistenza agli antibiotici correnti
e perché in grado di formare biofilm. Finora abbiamo iden-
tificato un peptide antimicrobico (AMP) da pelle di rana di
piccole dimensioni (21 amminoacidi), l’Esc(1-21), che rapi-
damente uccide P. aeruginosa con un’azione membranolitica Eliodoro Pizzo, terzo da sinistra, con i collaboratori di ricerca
che limita lo sviluppo di resistenza. Recentemente, abbiamo
disegnato un suo analogo (diastereomero) più stabile e meno
citotossico; più efficace nello stimolare la migrazione di cel- tracellular substances that serve as a biofilm matrix. Biofilms
lule bronchiali e presumibilmente nel ripristinare l’integrità display a high resistance to killing by most antimicrobial com-
dell’epitelio bronchiale. Tale diastereomero è risultato essere pounds and this high level of resistance depends on multiple
anche più efficace nel ridurre la carica batterica in model- factors associated with adaptive changes in gene expression
li murini di infezione polmonare acuta da P. aeruginosa, in accompanying the biofilm growth state and the inherent
seguito ad una singola somministrazione intratracheale (i.t). properties of biofilm structures that act as physical barrier to
Tuttavia, lo sviluppo di adeguate forme farmaceutiche per antibiotic penetration. For this reason new drugs, alternative
inalazione è cruciale al fine di favorire il raggiungimento del to conventional antibiotics, are needed to combat specifically
bersaglio terapeutico a livello polmonare. biofilm forming pathogens. At this regard, Host Defence Pep-
Ipotesi e obiettivi. Principali obiettivi del Progetto sono: (i) tides (HDPs), are a valuable attractive both for their selective
la produzione di nanoparticelle polimeriche (NPs) per ottimiz- toxicity and multi-immunomodulatory properties.
zare la somministrazione di Esc(1-21) e/o del suo diastereome- Hypothesis and objectives. During FFC project #20/2014,
ro a livello polmonare e la loro diffusione attraverso il muco analyzing a library of two thousands secreted human proteins,
bronchiale; (ii) la valutazione di tossicità ed efficacia antimi- we have identified and studied several new human cryptic
crobica dei peptidi sia liberi che incapsulati in NPs, per il trat- HDPs never analyzed so far. Among these, three peptides
tamento delle infezioni polmonari da P. aeruginosa mediante (GVF27, HVA36 and IMY47) show significant anti-biofilm and
somministrazione i.t.; iii) studi dei meccanismi molecolari che anti-inflammatory properties. Starting from a well-established
sottendono l’attività riepitelizzante dei peptidi selezionati e dei structural characterization and in vitro antibiofilm properties
loro effetti sui canali ionici delle cellule epiteliali. of the three peptides, we intend to explore their therapeutic
Metodi essenziali. Impiego di un approccio multidisci- potential in cell-based and pre-clinical models of CF.
plinare coinvolgente tecniche biochimiche, microbiologiche, Preliminary results. All three cryptic peptides show signif-
cellulari e test preclinici in modelli murini per esplorare il icant antimicrobial activities on a broad spectrum of bacteria
profilo di efficacia e tollerabilità dei peptidi selezionati e del- (including some CF clinical isolates), very promising antibio-
le NPs contenenti il peptide in seguito a somministrazione i.t. film properties (both on pre-formed and attached biofilm),
Risultati preliminari. Dati preliminari hanno indicato che strong affinity for endotoxins as LPS and LTA (in particular
entrambi i peptidi non alterano la permeabilità dell’epitelio GVF27), immunomodulatory properties on LPS induced mu-
bronchiale FC. Inoltre, è in corso la preparazione di nanopar- rine macrophages (GVF27 and HVA36) and ability to syner-
ticelle polimeriche contenenti il peptide Esc(1-21). gistically act with common antibiotics (HVA36).
Risultati finali attesi e loro significato. Si prevede che tali Essential methods. The general aim of the project will be
studi consentano lo sviluppo di un nuovo farmaco a base pursued through 3 main phases. During the first part of this
peptidica contro l’infezione polmonare da P. aeruginosa ed in project we will deeply investigate the antimicrobial activity of
grado di accelerare la guarigione dell’epitelio bronchiale in GVF27, IMY47 and HVA36 alone or in combination with an-
FC. Si prevede anche che la produzione di nanoformulazio- tibiotics on 14 CF P.aeruginosa clinical isolates. Subsequently
ni possa ottimizzare la somministrazione ed il trasporto del the best compounds will be assayed for their antibiofilm activ-
peptide in polmoni FC permettendone un graduale rilascio a ity both on abiotic surface and on FC epithelial bronchial cells
livello del sito di infezione e prolungandone l’efficacia tera- both by static and flow co-colture experiments. Finally our ef-
peutica riducendo gli effetti indesiderati, in seguito ad instil- forts will be dedicated exclusively to explore the ability of the
lazione intratracheale. best HDP or HDP/combinations to alleviate disease severity
in preclinical FC model.
Expected results and their significance. Antibiotic treat-
ment alone is often inadequate to overcome biofilm infections
37. Pre-clinical effectiveness of three human in cystic fibrosis. We are confident that novel anti-biofilm drugs
cryptic anti-biofilm peptides (GVF27, HVA36 of human origin will crucially contribute, alone or combined
and IMY47): efficacy against lung pathogens with antibiotics, to improvement of the treatment of CF lung
disease opening up new possibilities for therapeutic strategies.
and studies in animals
Pizzo E Analisi preclinica di tre peptidi antibiofilm di ori-
Dip. Biologia, Università di Napoli “Federico II” gine umana (GVF27, HVA36 e IMY47): efficacia
(FFC#16/2017, New) contro patogeni polmonari e studi in vivo su mo-
Background and rationale. Microbial biofilms are the un- delli animali
derlying cause of persistent infections in Cystic Fibrosis lungs. Ragioni dello studio. I biofilm microbici sono la causa
The formation and maintenance of biofilms depends critically fondamentale delle infezioni persistenti in fibrosi cistica. La
on the presence of bacteria-to-bacteria interconnecting ex- formazione dei biofilm dipende criticamente dalla presenza

44
di sostanze extracellulari che interconnettono i batteri in una
sorta di matrice. I biofilm presentano un’elevata resistenza
alla maggior parte dei composti antimicrobici e questo eleva-
to livello di resistenza dipende da più fattori associati a cam-
biamenti adattivi nell’espressione genica che accompagnano
lo stato di crescita del biofilm e le proprietà intrinseche delle
strutture dei biofilm che agiscono come barriera fisica alla
penetrazione antibiotica. Per questo motivo sono necessari
nuovi farmaci, alternativi agli antibiotici convenzionali, per
combattere in modo specifico gli agenti patogeni che forma-
no biofilm. A questo proposito, i peptidi di difesa dell’ospite
(HDP) sono una risorsa preziosa per la loro tossicità selettiva
e le molteplici proprietà immunomodulatorie.
Ipotesi e obiettivi. Durante il progetto FFC#20/2014, Stefano Sabatini, terzo da sinistra, con i collaboratori
analizzando un archivio di duemila proteine umane di se-
crezione, abbiamo individuato e studiato diversi nuovi HDP
criptici umani mai analizzati finora. Tra questi, tre peptidi M. avium EPIs and improve their activity. The new synthesized
(GVF27, HVA36 e IMY47) presentano significative proprietà molecules will be tested in our multistep screening protocol that
anti-biofilm e antinfiammatorie. Partendo da una approfondi- firstly entails the evaluation against S. aureus and M. smegmatis
ta caratterizzazione strutturale e dalle proprietà antibiofilm in strains and then cytotoxicity on human cell lines. For the best
vitro dei tre peptidi, intendiamo esplorare il loro potenziale compounds further studies against different M. avium strains
terapeutico in modelli cellulari e in vivo. will be carried out. Iterative cycles of optimization will drive
Risultati preliminari. Tutti e tre i peptidi criptici mostrano the hit-to-lead development and lead compound(s) obtained
importanti attività antimicrobiche su un ampio spettro di bat- will be submitted to an in silico ADMET profiling procedure
teri (inclusi alcuni isolati clinici), proprietà antibiofilm molto oriented to better assess those parameters that can positively
promettenti, forti affinità per endotossine come LPS e LTA (in influence a future aerosol formulation.
particolare GVF27), proprietà immunomodulatorie su ma- Preliminary results. Our experience in fighting antimicro-
crofagi murini trattati con LPS (GVF27 e HVA36) e capacità bial resistance led to the identification of 2-phenylquinolines
di agire sinergicamente con antibiotici (HVA36). as S. aureus NorA EPIs. Some 2-phenylquinolines inhibit also
Metodi. L’obiettivo generale del progetto sarà perseguito M. avium EPs restoring the activity of macrolides. Toward
attraverso tre fasi principali. Durante la prima parte di questo the identification of new potent M. avium EPIs, we exploited
progetto verificheremo attentamente l’attività antimicrobica a classic medicinal chemistry design based on merging be-
di GVF27, IMY47 e HVA36 da soli o in combinazione con tween: i) chemical features of the natural isoflavone biocha-
antibiotici su isolati clinici di P. aeruginosa. Successivamente nin A, a known M. smegmatis EPI and, ii) some structural key
i migliori agenti verranno analizzati per la loro attività anti- elements, selected considering the SAR of our 2-phenylqui-
biofilm sia in vitro sia su cellule bronchiali epiteliali isolate nolines EPIs. Thus, a new set of 3-phenylquinolones was syn-
da pazienti. Infine i nostri sforzi saranno dedicati esclusiva- thesized and tested against different M. avium strains. Some
mente a esplorare in un modello preclinico la capacità dei derivatives resulted potent M. avium EPIs able to significantly
migliori peptidi o della loro combinazione con antibiotici. boost the activity of macrolides and fluoroquinolones.
Risultati attesi e loro significato. Il trattamento antibiotico Expected final results and their significance. The final task
da solo è spesso inadeguato per superare le infezioni da biofilm of the project is to provide lead compound(s), active as EPIs,
in fibrosi cistica. Siamo fiduciosi che i nuovi farmaci anti-bio- to be co-administered, or eventually co-formulated, with mac-
film di origine umana contribuiranno in maniera determinan- rolides in future pre-clinical studies.
te, da soli o in combinazione con gli antibiotici, a migliorare il
trattamento della malattia polmonare in fibrosi cistica, aprendo Identificazione di nuovi inibitori delle pompe di
nuove possibilità per le strategie di intervento terapeutico. efflusso in grado di contrastare le infezioni da
micobatteri non tubercolari nei pazienti con fi-
brosi cistica
38. Identification of new efflux pumps inhibi- Ragioni dello studio. I micobatteri non tubercolari (MNT)
tors able to contrast nontuberculous myco- sono patogeni difficili da trattare talvolta associati a gravi in-
bacterial infections in cystic fibrosis patients fezioni croniche nei pazienti con fibrosi cistica (FC). I ceppi
M. avium causano quasi la metà delle infezioni da MNT e
Sabatini S sono in grado di sviluppare rapidamente resistenza a causa
Dipartimento Scienze Farmaceutiche, Università degli Studi della sovraespressione di pompe di efflusso (PE) in grado di
di Perugia (FFC#17/2017, New) estrudere dalla cellula antimicobatterici come i macrolidi.
Ipotesi e obiettivi. Lo scopo di questo progetto è di svi-
Background and rationale. Nontuberculous mycobacte- luppare nuovi e potenti inibitori delle PE (IPE) in grado di
ria (NTM) are difficult-to-treat pathogens associated with seri- migliorare l’attività degli antimicobatterici su ceppi resistenti
ous chronic infections in cystic fibrosis (CF) patients. Causing di MNT in pazienti affetti da FC.
nearly an half of the NTM infections, M. avium strains quickly Metodi essenziali. In questo progetto ci proponiamo di
develop multidrug resistance due to the overexpression of ef- studiare la relazione attività-struttura (RAS) dei nuovi IPE di
flux pumps (EPs) able to extrude antimycobacterials, such as M. avium a struttura 3-fenilchinolonica e migliorarne l’atti-
macrolides. vità. Le nuove molecole progettate e sintetizzate saranno te-
Hypothesis and objectives. The main aim of this project is state nel nostro protocollo di saggi multistep che comporta
to develop new and potent mycobacterial EP inhibitors (EPIs) inizialmente la valutazione su ceppi di S. aureus e M. smeg-
that boost the activity of failing antimycobacterials against re- matis, poi la citotossicità sulle linee cellulari umane e infine
sistant NTM strains on CF patients. l’attività su alcuni ceppi di M. avium. I cicli iterativi di otti-
Essential methods. We aim to extensively characterize the mizzazione guideranno lo sviluppo ed i composti più pro-
Structure-Activity Relationship (SAR) of the 3-phenylquinolone mettenti saranno sottoposti a studi computazionali orientati

45
a valutare i parametri che possono influenzare positivamente Results. Within the QTL locus, 14 protein-coding genes
una futura formulazione di aerosol. were candidates for involvement in P. aeruginosa pneumonia.
Risultati preliminari. Lo studio ha avuto inizio dall’os- To translate our results to humans, a genotyped cohort (Cana-
servazione che alcuni IPE di NorA (una categoria di pompe dian CF Gene Modifier) with clinical microbiological data for
cellulari, n.d.r.) (dello S. aureus a struttura 2-fenilchinolinica P. aeruginosa infection was used for identification of candidate
sono in grado di inibire anche le PE del M. avium ripristinan- genes. We assessed regional association evidence using the age
do l’attività di alcuni antimicobatterici (macrolidi). Attraverso at the first P. aeruginosa infection; this phenotype provides a
un approccio classico di chimica farmaceutica è stata proget- relevant analogue to survival time in murine studies. Genetic-
tata una nuova serie di derivati 3-fenilchinolonici allo scopo association analysis on the syntenic human locus on chromo-
di identificare nuovi potenti IPE di M. avium. Il nuovo nucleo some 1 identified two single-nucleotide polymorphisms of one
3-fenilchinolonico deriva dalla fusione tra: i) le caratteristiche modifier gene that were significantly associated with age at first
chimiche dell’isoflavone naturale biocanina A, un noto IPE di P. aeruginosa infection. Validation in other cohorts and func-
M. smegmatis e ii) alcuni elementi strutturali chiave selezionati tional validation in model systems are ongoing.
considerando la RAS degli IPE precedentemente identificati. Spin-off for research & clinical purposes. Our results
I composti ottenuti sono stati saggiati su diversi ceppi di M. showed that: 1) P. aeruginosa infection is affected by host ge-
avium ed alcuni derivati sono stati in grado di aumentare no- netic factors; 2) discovery of murine modifier genes may gener-
tevolmente l’attività sia dei macrolidi che dei fluorochinoloni. ate information that is relevant to human disease progression.
Risultati finali attesi e loro significato. Lo scopo del pro-
getto è di identificare composti attivi come IPE da sommini- Geni Modificatori legati alla malattia polmonare
strare, anche eventualmente in co-formulazione, con macro- da Pseudomonas aeruginosa in fibrosi cistica
lidi in futuri studi preclinici.
Ragioni dello studio. Le infezioni da P. aeruginosa nei pa-
zienti con fibrosi cistica (FC) sono associate ad un declino
delle funzione polmonare con una estrema variabilità clinica.
39. Cystic fibrosis modifier genes related to Questo apre la domanda circa quali altri loci genetici oltre al
Pseudomonas aeruginosa lung disease CFTR possano contribuire alla gravità della malattia e varia-
zione individuale. Utilizzando una nuova popolazione muri-
Loré NI1, Sipione B1, He G2, Strug L2, Alessandro M3, na caratterizzata da genotipi altamente diversificati abbiamo
Provezza L4, Lombardo A3, Cabrini G4, Bragonzi A1 mappato un locus sul cromosoma murino 3 che influenza la
1
Infection and Cystic Fibrosis Unit, Division of Immunology, gravità dell’infezione polmonare da P. aeruginosa.
Transplantation and Infectious Diseases, IRCCS - San Raffaele Ipotesi e obiettivi. I geni modificatori identificati nella po-
Scientific Institute, Milan, Italy, 2 Division of Biostatistics, Dalla polazione murina saranno validati come fattori di rischio per
Lana School of Public Health; University of Toronto, Toronto, l’infezione di P. aeruginosa e la gravità della malattia.
Canada, 3 San Raffaele Telethon Institute for Gene Therapy Metodi. La validazione sarà effettuata: 1) in sistemi mo-
(SR-Tiget), IRCCS San Raffaele Scientific Institute, Milan, Italy, dello che prevedono la modifica del gene con CRISPR/Cas9
4
Azienda Ospedaliera Universitaria Integrata Verona, Verona delle linee cellulari; 2) in coorti di pazienti CF esaminando le
Italy, (FFC#15/2016, In progress) Bio-banche disponibili.
Risultati. All’interno del locus del coromosoma 3 murino,
sono stati identificati 14 geni modificatori candidati per l’in-
fezione da P. aeruginosa. Per traslare i nostri risultati sull’uo-
mo e validare geni candidati è stata utilizzata una coorte ge-
notipizzata (Canadian CF Gene Modifier) e fenotipizzata per
l’infezione da P. aeruginosa. L’associazione genotipo/fenotipo
è stata condotta considerando l’età alla prima infezione da P.
aeruginosa; questo fenotipo fornisce un rilevante analogo al
tempo di sopravvivenza negli studi murini. L’analisi genetica
di associazione ha identificato sul cromosoma 1 umano due
polimorfismi a singolo-nucleotide di un gene modificatore
significativamente associati all’età della prima infezione da
P. aeruginosa. La validazione in altre coorti e la convalida
funzionale nei sistemi modello sono in corso.
Alessandra Bragonzi, seconda da sinistra, con i collaboratori del Possibili ricadute per ricerca e clinica. I nostri risultati
progetto
hanno dimostrato che: 1) l’infezione da P. aeruginosa è in-
fluenzata da fattori genetici dell’ospite; 2) la scoperta di geni
Background and rationale. The outcomes of P. aeruginosa modificatori nel modello murino può fornire informazioni ri-
infections in patients with cystic fibrosis (CF) are difficult to levanti per la progressione della malattia umana.
predict and extremely variable, with the severity of the pul-
monary conditions ranging from mild to life-threatening. This
opens the question which other genetic loci in addition to the 40. A longitudinal metagenomic analysis to
CFTR can contribute to the clinical variation. By using the CC
lines as a novel and high genetically diverse mouse resource uncover microbial signatures of lung disease:
population and models of infection established by our group, unraveling host-microbial community interac-
we map a quantitative trait locus (QTL) on murine chromo- tions in humans and animal models
some 3 that affect the severity of P. aeruginosa lung infection.
Hypotesis and objectives. Candidate modifier genes with- Bevivino A1, Mengoni A2, Segata N3
in the identified QTL will be validated as risk factors for Pseu- 1
Department for Sustainability of Production and Territorial
domonas aeruginosa infection and disease severity. Systems, ENEA, Italian National Agency for New Technologies,
Essential methods. Validation is carried out: 1) in model Energy and Sustainable Economic Development, Casaccia
system including gene editing with CRISPR/Cas9 of cell lines; Research Center, Rome, Italy; 2Department of Biology,
2) in CF patients cohorts by exploring available BIO-banks University of Florence, Florence, Italy; 3Centre of Integrative

46
Biology, University of Trento, Trento, Italy (FFC#19/2017, New) dynamics and can give us a set of tools to unlock the potential
of microbiome-based personalized medicine in major disease
areas including CF (Rogers et al. 2017). In particular, animal
studies will also assist in the development of microbiome ma-
nipulation of lung microbiome aimed to restore “healthy” mi-
crobial communities.

Un’analisi metagenomica longitudinale per sco-


prire le firme microbiche della malattia polmo-
nare: verso la comprensione della complessità
delle interazioni ospite-microbiota negli esseri
umani e in modelli animali
Ragioni dello studio. La metagenomica (insieme dei ge-
nomi di ogni organismo presente in un determinato cam-
Annamaria Bevivino con i collaboratori di ricerca pione ambientale o clinico, n.d.r.) sta facilitando la nostra
comprensione del microbioma (l’insieme di microorganismi
che convivono con l’organismo umano, n.d.r.) presente nelle
Background. Metagenomics is facilitating our understanding vie aeree dei pazienti con fibrosi cistica (FC). Tuttavia, pochi
of microbial communities present in CF airways (Losada et al. hanno analizzato l’intero insieme dei geni microbici e la loro
2016). However, few studies have investigated the overall gene relazione con lo stato di malattia polmonare del paziente.
functions harbored by the resident microbial populations and Per comprendere a pieno le relazioni funzionali tra micro-
their relation to patient’s lung disease status (Lim et al. 2014; bioma polmonare e malattia polmonare sono inoltre cruciali
Bacci et al. 2017). In addition, no data are present on animal i modelli animali, da relazionare con i dati del microbioma
models, which are crucial to complement human data and de- umano, e quindi permettere di sviluppare nuove terapie per il
lineate mechanisms of microbiome dynamics and also assist in trattamento di pazienti con FC.
the development of new therapies to treat patients with CF. Ipotesi e obiettivi. L’obiettivo principale di questo pro-
Hypothesis and objectives. The general aim is to provide getto è la comprensione più approfondita della dinamica del
a more in-depth understanding of the lung microbiome in microbioma polmonare negli esseri umani e nei modelli ani-
humans and animal models. The specific aims of this pro- mali. Gli obiettivi specifici di questa proposta sono: analiz-
posal can be summarized as follows: individuate microbiome zare la composizione del microbioma e delle sue modifiche
composition and changes related to severe decline of the in relazione all’avanzamento della malattia nel corso dello
human CF disease in the longitudinal study; investigate the studio longitudinale; valutare l’influenza dello stato di esa-
influence of external factors such as antibiotic therapy and cerbazione e trattamento antimicrobico; identificare nuovi
respiratory exacerbation; Identify key microbiome signatures indicatori biologici dello stato clinico del paziente; moni-
and novel biomarkers (pathogenic species/strains, taxa, SNPs, torare la dinamica del microbioma polmonare nei topi FC
transcripts, virulence factors and, antibiotic resistance genes) con infezione cronica da Pseudomonas aeruginosa, e della
related to patients’ status; evaluate the dynamics of the lung risposta infiammatoria dell’ospite.
microbiome in wild type and CF mice, in the naïve status and Metodi essenziali. Nel precedente progetto pilota
after chronic infection with Pseudomonas aeruginosa, with (FFC#14/2015), ventuno soggetti con FC erano stati arruolati
the aim to explore the possibility to therapeutically manipu- nello studio e seguiti nel corso di 15 mesi. Nel presente progetto
late the lung microbiome communities. verrà completata l’analisi bioinformatica delle sequenze meta-
Methods. In the pilot project FFC#14/2015, twenty-one genomiche di questi pazienti e verrà effettuata un’analisi statisti-
subjects with CF were enrolled in this study and followed over ca per valutare il grado di associazione con il loro stato clinico.
a 15-month period. Now, we will complete the bioinformatics Verrà studiato il microbioma polmonare in topi CFTRtm1UN-
analysis of the microbiome dynamics on the airway microbi- CTgN (FABP-CFTR) e wild type congenici, mediante estrazione
ome in CF patients and perform statistical analysis to com- del DNA, sequenziamento genomico del gene 16S rRNA con
pute odd ratio and association parameters of particular gene piattaforma Illumina MiSeq e analisi bioinformatica.
or taxa in relation to the clinical status of CF patients with Risultati preliminari. Il primo obiettivo è stato quello di
airway’s microbiota. We will characterize the lung microbiota definire la variazione del microbiota delle vie aeree dei pa-
of CFTRtm1UNCTgN (FABP-CFTR) and their wt congenic mice zienti con CF nel tempo, durante i periodi di stabilità clinica,
by performing genomic DNA extraction from separate lobes con l’avvenimento di esacerbazioni polmonari e con il tratta-
and trachea, 16S rRNA gene sequencing using the Illumina mento antibiotico. È stata osservata una differente distribuzio-
MiSeq platform, and bioinformatic analysis. ne tassonomica, sia nei campioni seriali dello stesso paziente
Preliminary results. The first step was to define the vari- che tra i campioni dei diversi pazienti esaminati. I risultati
ability of CF airway microbiota over time, during clinical preliminari suggeriscono che i batteri patogeni FC mostrano
changes, and with antibiotic treatment. Taxonomy distribu- un’elevata resilienza al trattamento antibiotico. I polmoni dei
tion inferred from metagenomics data was quite heterogene- pazienti FC sono colonizzati in maniera selettiva sia dai prin-
ous both across patients and within time points of the same cipali agenti patogeni FC che dai patogeni emergenti, sugge-
patient. Preliminary results revealed an extraordinary resil- rendo che un singolo ceppo, che ha iniziato a colonizzare le
ience of the main CF pathogens to antibiotic treatment. Hi- vie aeree, continua a sopravvivere e persistere nel polmone
erarchical clustering based on microbial strain-level profiling del paziente FC.
of marker genes detected from metagenomics samples pro- Risultati attesi e loro significato. L’analisi del microbioma
duced one cluster for each patient, containing all time points umano nel tempo, in pazienti con infezione cronica da Pseu-
including those sampled through one or more exacerbation domonas aeruginosa, permetterà di individuare nuovi biomar-
events, suggesting that a single strain, which started it, contin- catori microbici della malattia polmonare. In particolare, lo
ues to survive and thrives in the lung of the CF patient. studio della composizione del microbioma polmonare murino
Expected results and their significance. The possibility to permetterà di porre le basi per lo sviluppo di nuovi approcci
analyze the microbiome dynamics in CF airways will permit to basati sulla manipolazione del microbioma polmonare ai fini
discover novel biomarkers involved in the pulmonary disease del ripristino di una comunità microbica “stabile e sicura”.

47
PLENARY SESSION 6
IS THERE REALLY A WAY TO CONTAIN OR PREVENT CF INFLAMMATION?
41. Interfering with glycosaminoglycans dur- analysed. Efficacy studies demonstrated that C3 and C23 sig-
nificantly inhibited markers of inflammation induced by acute
ing Pseudomonas aeruginosa chronic lung and chronic lung infection in murine models. In addition, they
infection: pre-clinical exploitation of a novel significantly reduced P. aeruginosa burden during chronic lung
therapeutic strategy for cystic fibrosis infection. Analysis in human respiratory samples showed that
sGAG, including HS, are present in the airways of CF patients
Lorè NI1, Sipione B1, Veraldi N2, Riva C1, Cariani L3, Scalzi and they correlate with markers of inflammation and tissue
E2, Melessike M1, Francesco V1, Girelli D3, Spagnuolo L1, damage, while CS and HA were almost undetectable.
Bragonzi A1, Colombo C4, Naggi A2 and Cigana C1 Spin-off for research & clinical purposes. These data sup-
1
Division of Immunology, Transplantation and Infectious port the further evaluation of C3 and C23 as novel therapeu-
Diseases, IRCCS San Raffaele Scientific Institute, Milano, Italy, tic molecules to counteract excessive inflammation induced
2
Istituto di Ricerche Chimiche e Biochimiche “G. Ronzoni”, by P. aeruginosa pulmonary infections in CF patients.
Milano, Italy, 3 Cystic Fibrosis Microbiology Laboratory,
Fondazione IRCCS Ca’ Granda, Ospedale Maggiore Policlinico, Valutazione pre-clinica dell’efficacia di compo-
Milano, Italy, 4 Cystic Fibrosis Center, Fondazione IRCCS
sti che competono con i glicosaminoglicani pol-
Ca’ Granda, Ospedale Maggiore Policlinico, Milano, Italy
(FFC#18/2016, Completed) monari nel ridurre l’infiammazione e il danno al
tessuto causati dall’infezione cronica da Pseudo-
monas aeruginosa
Ragioni dello studio. L’infezione cronica da P. aeruginosa
danneggia il tessuto polmonare anche attraverso la produzio-
ne di particolari molecole strutturali dette glicosaminoglicani
(GAG). Nel precedente progetto (FFC#14/2013) avevamo in-
dividuato una diversa composizione di alcuni GAG nel tessu-
to polmonare di topi FC rispetto ai non FC e identificato due
polisaccaridi solfatati (PS), denominati C3 e C23, in grado di
contrastarne l’attività.
Ipotesi e obiettivi. Abbiamo ipotizzato che altre specie di
GAG possano essere coinvolte nel danno polmonare in mo-
delli murini. Inoltre ci siamo prefissi di validare e ottimizzare,
sempre in modelli murini, il trattamento con i due PS risultati
Cristina Cigana, seconda da destra, con i collaboratori e Annama-
ria Naggi (nel riquadro), partner del progetto promettenti.
Metodi. È stata valutata la quantità e la composizione di
specifici GAG sia in modelli murini FC e non-FC di infezione
Background. P. aeruginosa chronic infections cause ex- polmonare da P. aeruginosa sia in campioni respiratori ottenuti
aggerated inflammation and tissue damage in the airways of da pazienti FC. L’efficacia di due PS, selezionati da modifica-
cystic fibrosis (CF) patients (Yonker et al, 2015). We previ- zione chimica di un noto farmaco anticoagulante (eparina) con
ously found that P. aeruginosa long-term respiratory infection effetto sull’infiammazione, è stata valutata nei modelli murini
in mice induced high levels of sulphated glycosaminoglycans di infezione polmonare acuta e cronica da P. aeruginosa.
(GAG) (Cigana et al, 2016), well-known constituents of the Risultati. L’infezione cronica con P. aeruginosa induce un au-
lung extracellular matrix (Reeves et al, 2011). In addition, we mento di alcune specie di GAG, in particolare l’eparan solfato e
found that two polysaccharides (PS), namely C3 and C23, l’acido ialuronico, nei polmoni murini. I GAG, ed in particolare
selected from a library of PS with attenuated anticoagulant l’eparan solfato, sono presenti anche nei campioni respiratori
properties (Veraldi et al, 2015), competed with endogenous umani e correlano con marcatori di infiammazione e di danno
GAG reducing inflammation and tissue damage in mouse tessutale. Abbiamo confermato in modelli murini di infezione
models of P. aeruginosa infection. cronica che i PS C3 e C23 inibiscono in modo significativo mar-
Hypothesis and objectives. We aimed to define how P. catori di infiammazione indotti da P. aeruginosa. Sono inoltre in
aeruginosa chronic infection and CFTR deficiency affect the grado di ridurre la quantità di batteri nelle vie aeree.
levels and sulphation of specific GAG species and to optimize Possibili ricadute per ricerca e clinica. I risultati ottenuti
PS administration for efficacy studies. dimostrano che C3 e C23, competono con i GAG nel tessuto
Methods. Levels of specific GAG species were measured polmonare inibendo l’infiammazione e la capacità di P. ae-
by HPLC-MS and ELISA in CF and non-CF mice during P. aer- ruginosa di organizzarsi in biofilm, un aggregato di batteri e
uginosa chronic lung infection and in human respiratory sam- loro prodotti che li protegge sia dalle difese dell’ospite sia da-
ples. The biodistribution and pharmacokinetic of the two most gli antibiotici. Questi dati supportano l’ipotesi che i PS possa-
promising PS were measured in murine plasma and lungs at no offrire prospettive terapeutiche significative nell’infezione/
different times of administration. PS efficacy was tested. infiammazione polmonare cronica FC.
Results. During chronic colonization, mice infected with P.
aeruginosa showed higher levels of sGAG and, in particular,
heparin/heparan sulphate (hep/HS) and hyaluronic acid (HA),
compared to control mice. Differently, chondroitin sulphate 42. Phosphodiesterases type-4 (PDE4) inhibi-
(CS) was undetectable in murine samples. Interestingly, CF tors and β 2-adrenergic agonists to reduce
mice showed the presence of different hep/HS chains. Phar- neutrophilic lung inflammation in cystic fi-
macokinetic studies on C3 and C23 showed that C3 reached
a peak concentration in the lung after eight hours from subcu- brosis. Preclinical studies and identification of
taneous administration, while C23 was low at all time-points biomarkers of efficacy

48
Totani L1, Piccoli A1, Concetta Amore1, Angelo Di Santo1, treatment of BPCO and psoriasis, and new and perhaps more
Giuseppe Dell’Elba1, Roberto Plebani2,4, Pecce R2,4, Lanuti selective compounds are in advanced clinical experimenta-
P2,3, De Fino I6, Ranucci S6, Rossi A6, Moretti P5, Marchisio tion. Our preclinical studies indicate that these drugs can be
M2,3, Bragonzi A5, Romano M2,4, Evangelista V1 also tested in CF patients.
1
Laboratory of Vascular Biology and Pharmacology, Fondazione
Mario Negri Sud, Santa Maria Imbaro (CH), 2Department of Inibitori di fosfodiesterasi tipo 4 (PDE4) e ago-
Medical, Oral and Biotechnological Sciences, G. D’Annunzio
University of Chieti-Pescara, 3Department of Neurosciences,
nisti • 2-adrenergici per ridurre l’infiammazione
Imaging and Clinical Sciences, G. D’Annunzio University of polmonare nella fibrosi cistica. Studi preclinici e
Chieti-Pescara, 4Center on Aging Sciences and Translational identificazione di bio-marcatori di efficacia.
Medicine (CeSI-MeT), G. D’Annunzio University of Chieti- Ragioni dello studio. Il danno polmonare, nella fibrosi cisti-
Pescara, 5Cystic Fibrosis Center, S. Liberatore Hospital, Atri ca (FC), si sviluppa come conseguenza di una cronica infiam-
(TE), 6 S. Raffaele Scientific Institute, Milano (FFC#16/2013, mazione che coinvolge principalmente i leucociti neutrofili.
Completed) Ipotesi e obiettivi. Il progetto è basato su precedenti studi
che dimostrano che il blocco di fosfodiesterasi tipo-4 (PDE4)
attiva segnali che controllano l’attività dei neutrofili e si propo-
ne 3 obiettivi: 1) Definire l’effetto di inibitori di PDE4, in vitro,
su neutrofili di pazienti FC. 2) Testarne l’efficacia e i potenziali
effetti collaterali in un modello di infezione da Pseudomonas
aeruginosa (PA) nel topo. 3) Identificare marcatori di efficacia.
Metodi. I pazienti FC sono stati reclutati al “Centro Re-
gionale Fibrosi Cistica, Ospedale di Atri”. Inibitori di PDE-4
testati nello studio: rolipram, roflumilast (R), il suo metabolita
attivo, roflumilast-N-Oxide.
Risultati. Gli studi in vitro dimostrano che gli inibitori di
PDE4 bloccano la liberazione di DNA sotto forma di “neutro-
phil extracellular traps” (filamenti di DNA del nucleo estrusi
Virgilio Evangelista, secondo da sinistra, con i collaboratori di nell’ambiente extracellulare, n.d.r.) , preservano l’integrità
ricerca cellulare e riducono il rilascio di microvescicole da parte di
neutrofili di soggetti normali e di pazienti FC. L’effetto inibito-
rio è maggiore nei neutrofili di pazienti FC rispetto ai neutro-
Background. Lung disease, in cystic fibrosis (CF), devel- fili normali. Gli studi in vivo, confermano che il trattamento
ops over time because of neutrophilic inflammation. How- con R si associa ad una significativa riduzione dell’accumulo
ever, current therapies for CF lack of specific approaches to di neutrofili e di DNA libero nelle vie respiratorie dei topi,
counteract exaggerated recruitment and tissue damaging ac- dopo 5 giorni dall’infezione. Inoltre, la misura giornaliera dei
tivities of neutrophils migrated into the lungs. pesi mostra che i topi nel gruppo trattato con R recuperano
Hypothesis and objectives. Our previous studies, indicat- più rapidamente il peso rispetto agli altri gruppi, a conferma
ed that PDE4 blockade controls neutrophil activities, relevant di un miglior stato di salute, statisticamente significativo al
to the pathogenesis of CF pulmonary disease . The first aim quinto giorno dall’infezione.
of this project is to define, in vitro, the effect of PDE4 inhibi- Possibili ricadute per ricerca e clinica. Lo studio in vitro
tors, alone or in combination with 2-adrenergic agonists, on fornisce un robusto supporto meccanicistico all’ipotesi che
neutrophils from CF patients. The second aim is to test the inibitori di PDE4 possano controllare attività dei neutrofili ri-
efficacy and potential side effects in mice subjected to Pseu- levanti per il danno polmonare in FC, suggerendo anche una
domonas aeruginosa (PA) chronic infection. speciale sensibilità dei neutrofili FC a questa classe di farmaci.
Essential methods. CF patients were recruited at the “Cen- Gli studi nel modello animale confermano l’efficacia nei con-
tro Regionale Fibrosi Cistica, Ospedale di Atri”. Drugs tested fronti dell’infiammazione neutrofilica, senza aumentare la su-
in the study were: rolipram and roflumilast (R), selective scettibilità all’infezione. Dal punto di vista delle implicazioni
PDE4 inhibitors and formoterol (F), a • 2- adrenergic agonist. cliniche, è importante sottolineare che inibitori di PDE4 sono
Results. In vitro experiments demonstrated that PDE4 in- stati recentemente approvati per il trattamento della BPCO e
hibitors curbed neutrophil extracellular traps (NETs) forma- per il trattamento della psoriasi. Altri inibitori sono in fase di
tion, preserved cellular integrity, reduced micro-vesicle re- sperimentazione clinica. I nostri studi preclinici supportano l’i-
lease (MV) by healthy and CF neutrophils challenged with potesi di testare l’efficacia di questi inibitori nella FC.
endotoxin. The efficacy of PDE4 inhibitors was increased by
F. Notably, pharmacological effects were greater in normal
neutrophils treated by CFTRInh-172 as well as in neutrophils
isolated from CF patients, compared to untreated normal 43. A systematic investigation of miglustat-
neutrophils. In the mouse model of PA chronic infection, in- derivative iminosugar clusters as possible anti-
tratracheal administration of R was associated with a signifi-
cant reduction of neutrophils and free-DNA accumulation in
inflammatory agents for Cystic Fibrosis lung
the BAL at 5 days, but not at 28 hours of infection. Notably, disease
R-treated mice showed a significant improvement in weight
recovery compared to vehicle-treated mice. Munari S1, Loberto N2, Compain P3, D’Alonzo D4,
Spin-off for research & clinical purposes. Our study pro- Guaragna A4, Palumbo G4, Lampronti I5, Prandini P1,
vides, for the first time, mechanistic support to the concept Provezza L1, Santangelo A1, Tamanini A1, Rossi A6,
that PDE4 blockade control neutrophil activities inducing Bragonzi A6, Sonnino A2, Lippi G1, Cabrini G1, Aureli M2
lung damage in CF. Notably, in vivo studies confirmed the and Dechecchi MC1
efficacy of PDE4 inhibitors to control neutrophilic inflamma- 1
Laboratory of Molecular Pathology, Department of Pathology
tion and improve the overall health state of infected animals. and Diagnostics, University Hospital of Verona, Italy
From the clinical point of view, it is important to remark that 2
Department of Medical Biotechnology and Translational
selective PDE4 inhibitors have been recently approved for the Medicine, University of Milano, Italy 3Laboratoire de Synthese

49
Organique et Molecules Bioactives ECPM-Université Louis Ragioni dello studio. Nonostante i recenti successi nella
Pasteur - Strasbourg - France; 4Department of Chemical cura della FC, servono ancora terapie per rallentare in tutti i
Sciences, University Federico II, Napoli, Italy; 5Department pazienti il declino della funzione polmonare. Gli sfingolipidi
of Life Sciences and Biotechnology, University of Ferrara, (SLs) sono cruciali nelle infezioni delle vie aeree, quindi l’uso
Italy; 6CFaCore, Infection and CF Unit, San Raffaele Scientific di inibitori può migliorare la risposta infiammatoria. In pre-
Institute, Milano, Italy (FFC#22/2015, Completed) cedenti progetti supportati da FFC, abbiamo dimostrato che
l’iminozucchero miglustat ha un effetto anti-infiammatorio in
cellule bronchiali FC e in modelli animali. Ci siamo foca-
lizzati sul metabolismo degli SLs, in particolare sull’enzima
b-glucosidasi 2 (GBA2), coinvolto nel segnale infiammatorio
attivato da P. aeruginosa e bersaglio del miglustat.
Ipotesi e obiettivi. Gli iminozuccheri hanno molti van-
taggi sia per la buona biodisponibilità per via orale che per
l’attività immuno-modulatoria. Il nostro scopo è stato quello
di valutare una serie di derivati del miglustat come possibili
farmaci anti-infiammatori per FC.
Metodi. Abbiamo studiato iminozuccheri multivalenti, L
iminozuccheri e miscele di L e D enantiomeri, in termini di ef-
fetti sulla risposta infiammatoria e inibizione di GBA2. Per la
prima volta abbiamo analizzato in vivo l’effetto della miscela
Maria Cristina Dechecchi, prima da sinistra, con alcune collabo- racemica composta dal miglustat e dal suo L enantiomero in
ratrici e Massimo Aureli, partner del progetto
un modello animale di infezione polmonare.
Risultati. Analoghi multivalenti del miglustat e le miscele
Background. Anti-inflammatory drugs to ameliorate air- racemiche di iminozuccheri N-alchilati, mostrano attività anti-
way host defense that can be applied broadly to CF patients infiammatoria in cellule bronchiali FC a dosaggi molto bassi
are still needed. Protective inflammatory response during (nano molari) e sono potenti inibitori dell’enzima GBA2 sen-
airway infection are mediated by sphingolipids (SLs); so SL za avere effetti tossici. Per la prima volta abbiamo dimostra-
metabolism could be modified to benefit host defense. In this to che la combinazione a basse dosi del miglustat e del suo
regard several inhibitors have been proposed. The iminosugar enantiomero L è più potente rispetto al miglustat da solo ed
miglustat produces an anti-inflammatory effect in CF bron- ha un effetto anti-infiammatorio anche in cellule respiratorie
chial cells, by targeting b-glucosidase 2 (GBA2). Iminosugars di pazienti FC. Inoltre quando la combinazione di queste
are attractive carbohydrate mimics and represent lead targets molecole viene somministrata in topi C57Bl/6NCr migliora la
for developing new drugs for many diseases. capacità degli animali di resistere all’infezione batterica.
Hypothesis and objectives. To better exploit the benefits of Possibili ricadute per ricerca clinica. Questi dati confer-
iminosugars, a pressing challenge is to identify similar chemi- mano il potenziale terapeutico del miglustat e dei suoi analo-
cal compounds, able to reduce the inflammatory response to ghi strutturali. I risultati della combinazione di piccole dosi di
P.aeruginosa at low dosage and limited adverse effects. This miglustat e del suo enantiomero L rappresentano una novità
study was aimed to identify more efficient miglustat analogues rilevante in ambito farmacologico, in quanto la maggiore ef-
with anti-inflammatory activity and selective GBA2 action. ficacia a dosaggi minori riduce i possibili effetti collaterali.
Methods. We focused on multivalent iminosugars, on L en- Questo studio è un punto di partenza per lo sviluppo di trat-
antiomers, and on racemic mixtures composed by D and L en- tamenti innovativi in grado di ridurre specificamente l’infiam-
antiomers. The effects of these compounds on inflammatory mazione polmonare senza compromettere le difese.
response and cell toxicity in CF bronchial cells and murine
models of lung infection were studied. Glycohydrolase activ-
ity was tested in parallel.
Results. Nanomolar concentrations of monovalent and
44. Mitochondrial quality control machinery:
multivalent DNJ iminosugars and racemic mixtures of N- a role in the P. aeruginosa-triggered inflamma-
alkylated iminosugars produced an anti-inflammatory effect tory response in Cystic Fibrosis
in CF bronchial cells. Combination of low doses of miglustat
and its L enantiomer was more potent than miglustat alone and Marchi S1, Patergnani S1, Sbano L1, Bragonzi A2, Cabrini G3,
reduced the inflammatory response to P. aeruginosa also in CF Pinton P1 and Rimessi A1
primary cells. Analysis of D and L iminosugars demonstrated 1
Dept of Morphology, Surgery and Experimental Medicine,
that L enantiomers were more specific than D for GBA2. No Section of Pathology, Oncology and Experimental Biology,
toxicity was observed both in vitro and in vivo. Combination Laboratory for Technologies of Advanced Therapies (LTTA),
of low doses of miglustat and its L enantiomer administered University of Ferrara, 2Laboratory of Infection and Cystic
to C57Bl/6NCr mice 24 hours before bacterial inoculum im- Fibrosis; San Raffaele Scientific Institute, Milano, Italy,
proved the capability to resist P. aeruginosa infection. 3
Laboratory of Molecular Pathology, Department of Pathology
Spin-off for research & clinical purposes. These results and Diagnostics, University-Hospital of Verona, Italy
confirm that DNJ iminosugars are effective in reducing the (FFC#20/2015, Completed)
inflammatory response to P.aeruginosa in CF bronchial cells.
Our novel findings in vivo give a new insight into therapeutic Background. The chronic airway Pseudomonas aeruginosa
approaches for managing respiratory infections by using race- (P. aeruginosa) infection is a common pathological manifes-
mic mixtures of N-alkylated iminosugars that can be regarded tation associated with an excessive inflammatory response in
to improve effectiveness even at low dosage and to address Cystic Fibrosis (CF). Our data showed that alterations to mi-
selectively more specific targets. tochondrial activity, promoted by pathogens, were sufficient
to exacerbate the inflammatory response in CF, suggesting the
hypothesis that airway cells use the mitochondrial stress re-
Uno studio sistematico di iminozuccheri, derivati sponses to potentiate inflammation when pathogens perturb
del miglustat, come possibili farmaci anti-infiam- monitored mitochondrial processes. Normally, invading patho-
matori per la malattia polmonare in Fibrosi Cistica gens are cleared through a process called xenophagy, which

50
degradare selettivamente mitocondri alterati in cellule stressa-
te, agendo come un meccanismo di controllo di qualità mito-
condriale insieme al mitochondrial unfolded protein response
(mtUPR), una risposta trascrizionale allo stress che promuove
la sopravvivenza cellulare attraverso il recupero di mitocondri
alterati. Il recupero e il mantenimento di una popolazione di
mitocondri sani è essenziale per la vitalità cellulare, suggeren-
do che un declino del macchinario di controllo della qualità
mitocondriale potrebbe influenzare la suscettibilità cellulare
all’infiammazione.
Obiettivo. L’obiettivo generale del progetto è stato inda-
gare sul ruolo delle risposte mitocondriali allo stress in CF,
come risposte adattative all’infezione batterica. In particolare,
Alessandro Rimessi, primo a sinistra, con i collaboratori in cellule umane epiteliali bronchiali sono stati esaminati: il
contributo di mitofagia e xenofagia; la relazione tra mitofagia
e mtUPR nel contrastare il danno mitocondriale; il ruolo del
sequesters and degrades portions of the cytosol, including the segnale Ca2+, influenzato dal canale CFTR, in questi processi.
bacteria. A similar mechanism, called mitophagy, has the car- Risultati. In questi anni abbiamo dimostrato che il canale
dinal role of selective degradation of altered mitochondria in CFTR influenza il flusso mitofagico, alterando il segnale di
stress cells, acting as mitochondrial quality control mechanism amplificazione mediato da Parkin. In cellule CF, la riduzione
together with the mitochondrial unfolded protein response della degradazione selettiva di mitocondri alterati promuove
(mtUPR), a transcriptional stress response that promotes cell l’attivazione dell’inflammasoma NLRP3, peggiorando ulte-
survival through the recovery of defective mitochondria. The riormente la risposta mitofagica e infiammatoria. L’accumulo
recovery and maintenance of a healthy mitochondrial popula- di mitocondri alterati promuove l’abnormale attivazione di
tion is essential to cellular viability, suggesting that a decline mtUPR e il reclutamento della risposta integrata allo stress,
in the mitochondrial quality control machinery could set the entrambe responsabili dell’amplificazione di segnali pro-in-
susceptibility of cells to inflammation. fiammatori. Difetti nella mitofagia emersi in cellule polmo-
Objective. The overall goal of this project was to inves- nari CF impattano anche sulla risposta xenofagica, favorendo
tigate on the role of mitochondrial stress responses in CF, as l’accumulo di batteri nella cellula.
adaptive response to pathogen infection. Possibili ricadute per ricerca e clinica. La comprensione
Study plan. In particular, in human airways cells was ex- molecolare di queste sofisticate risposte allo stress mitocon-
plored: the contribution of mitophagy and xenophagy; the re- driale ha contribuito a definire un approccio terapeutico pre-
lationship between mitophagy and mtUPR to counteract the ventivo focalizzato a preservare l’omeostasi mitocondriale e
mitochondrial damage; the role of Ca2+ signaling, influenced limitare l’amplificazione della risposta infiammatoria.
by CFTR channel, in these processes.
Results. In these years we have demonstrated that CFTR
channel influences the mitophagic flux, affecting the Parkin-
mediated amplify signal. In CF cells the reduction of selective
45. Impact of anti-Staphylococcus aureus
degradation of altered mitochondria promoted NLRP3 inflam- treatment on Pseudomonas aeruginosa-in-
masome activation, worsening further the mitophagic and in- duced lung damage
flammatory response. The accumulation of dysfunctional mi-
tochondria in CF cells promoted abnormal mtUPR activation Riva C1, Cigana C2, Gona F1, Baldan R1, Alcala’-Franco B2,
and the recruitment of the integrated stress response, both Melessike M2, Bragonzi A2, Cirillo DM1
responsible of the amplification of pro-inflammatory signals. 1
Emerging Bacterial Pathogens Unit, IRCCS San Raffaele
The defects in mitophagy emerged in CF airway cells impact Scientific Institute, Milano, Italy, 2 Infections and Cystic
also on the xenophagic response, favoring the accumulation Fibrosis Unit, IRCCS San Raffaele Scientific Institute, Milano,
of invading bacteria. Italy (FFC#15/2015, Completed)
Spin-off for research & clinical purposes. The molecular
comprehension of these sophisticated mitochondrial stress
responses has contributet to define a preventive therapeutic
approach focused to preserve the mitochondrial homeostasis
and limit the amplification of inflammatory response.

Il macchinario di controllo della qualità mito-


condriale: un ruolo nella risposta infiammatoria
inescata da P. aeruginosa in Fibrosi Cistica
Ragioni dello studio. L’infezione cronica polmonare da
Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) è una comune ma-
nifestazione patologica associata a eccessiva risposta infiam-
matoria in Fibrosi Cistica (CF). Nostri dati mostravano che al-
terazioni all’attività mitocondriale promosse da patogeni erano Daniela Maria Cirillo, prima a destra, con le collaboratrici del
sufficienti ad esacerbare la risposta infiammatoria in CF, sug- progetto
gerendo l’ipotesi che cellule polmonari usano le risposte allo
stress mitocondriale per potenziare l’infiammazione quando Background. The incidence and prevalence of S. aureus
i patogeni perturbano controllati processi mitocondriali. Nor- (SA) are increasing in the cystic fibrosis (CF) population, with
malmente, i patogeni che invadono una cellula sono eliminati methicillin-resistant SA (MRSA) being on the rise. Although SA
attraverso un processo chiamato xenofagia, la quale sequestra is a common pathogen in CF is still unknown which impact
e degrada porzioni di citoplasma che includono il batterio. Un SA plays in the progression of the CF lung disease and if SA
simile meccanismo, chiamato mitofagia, ha il ruolo cardine di primes the way for P. aeruginosa (PA) infection. Furthermore

51
the benefit of methicillin-susceptible SA (MSSA) or MRSA ni polmonari inizialmente indotte dall’aggressiva infezione di
eradication needs to be defined. SA, poi il danno polmonare è peggiorato dall’infezione di PA
Hypothesis and objectives. Our main question was che induce un aumento nel richiamo dei leucociti a livello
whether the early treatment of SA infection may benefit CF bronchiale e parenchimale.
pulmonary disease. For this reason we established murine Possibili risultati per la ricerca clinica. Questi esperimen-
models of chronic lung infection to define the impact of dif- ti suggeriscono che l’infezione di SA influenza la patogenicità
ferent SA treatment strategies on PA colonization and the pro- di PA e topi pre-infetti da SA, trattati e non trattati, risultano
gression of pulmonary disease. entrambi colonizzati da PA. E’ necessario, quindi, approfon-
Methods. SA (Newman) and PA (PA14) reference strains dire il danno polmonare indotto dall’infezione da SA e l’effet-
were used to establish chronic co-infection in C57Bl/6NCr to del trattamento di SA sulla successiva colonizzazione di PA
mice. Different protocols of amoxicillin/clavulanate (AC) e sulla patogenesi polmonare che fornirà un nuovo target per
administration were tested in mice infected by SA. After SA trattare i pazienti FC infettati da MSSA o da MRSA.
infection and antibiotic treatment mice were infected by PA.
Mice were monitored for body weight, mortality and lungs
were processed for bacterial count, inflammatory response
and histological analysis.
46. CFTR-defective biliary cells from human
Results. Treatment with 200 mg/Kg of AC was effective in induced pluripotent-stem cells (iPSC) as a
containing SA infection with a decrease of SA bacterial load model to study the role of innate immunity in
and inflammatory response up to 26 days from infection. cystic fibrosis liver disease
However, both infection and inflammation were not com-
pletely resolved in this model. The capacity of SA pre-infec- Strazzabosco M
tion to increase PA colonization was not affected by anti-SA Dipartimento di Medicina Clinica, Università di Milano-
treatment in murine lungs. Histopathology revealed that the Bicocca (FFC#24/2015, Completed)
antibiotic did not resolve completely the lung damage that
was worsen by the PA infection able to increase leukocytes
recruitment at both bronchial and parenchymal levels.
Spin off for research and clinical purpose. In mouse mod-
el, we reveal that: 1) SA infection influences the pathogenicity
of PA; 2) anti-SA antibiotic treatment decreased significantly
bacterial burden but was not able to eradicate chronic infec-
tion; 3) PA colonization was not affected by anti-SA treat-
ment. This would point towards a thorough assessment for
the need of treatment against S. aureus in CF patients.

Impatto del trattamento anti-Staphylococcus au-


reus sul danno polmonare indotto da Pseudomo-
nas aeruginosa
Mario Strazzabosco con una ricercatrice del progetto
Ragioni dello studio. L’incidenza e la prevalenza di in-
fezione da parte di S. aureus sono in aumento nei pazienti
affetti da fibrosi cistica (FC). Nonostante SA sia un patogeno Background. CFTR is expressed by the biliary epithelium
comune nei pazienti FC non è noto quale sia il suo impatto (i.e cholangiocytes) of the liver. Progressive clinical liver dis-
nella progressione della malattia polmonare e se SA possa ease (CFLD) occurs in about 10% of cystic fibrosis (CF) pa-
favorire l’infezione da parte di P. aeruginosa (PA). Inoltre è an- tients and represents the third leading cause of death. Unfor-
cora da stabilire se l’eradicazione dei ceppi di SA meticillino- tunately, a cure is not yet available. Defective CFTR function
sensibili (MSSA) e meticillino-resistenti (MRSA) sia vantaggio- impairs the ability of specialized liver cells to produce bile in
sa per i pazienti affetti da FC. the proper amount and quality. This was thought to cause liv-
Ipotesi e obiettivi. Il nostro studio si basa sul valutare se er damage, however we have recently described that lack of
il trattamento precoce dell’infezione di SA possa contenere CFTR has a profound impact on the defense mechanisms that
la malattia polmonare. Per questo motivo abbiamo realizzato normally protect the biliary system from infections (Toll-like
modelli murini di infezione cronica per comprendere l’im- receptor innate immunity). However, the relevance of these
patto del trattamento di SA sulla colonizzazione di PA e sulla mechanisms in humans remains unknown.
progressione della malattia polmonare. Hypothesis and objectives. We sought to use induced plu-
Metodi. I ceppi di riferimento di SA (Newman) e di PA ripotent stem cells (iPSC)-derived human cholangiocytes as a
(PA14) sono stati utilizzati per infettare cronicamente i topi model to understand the cellular pathophysiology of biliary
C57Bl/6Ncr. L’antibiotico amoxicillina + acido clavulanico epithelial cells in CF and the translational value of the above
(AC) è stato somministrato ai topi per studiare l’effetto sull’in- observations.
fezione da SA. Successivamente all’infezione e al trattamento Essential methods. We have devised a novel protocol for
antibiotico anti-SA i topi sono stati infettati con PA. I topi the differentiation of human iPSC into polarized monolay-
sono stati analizzati per la perdita di peso, la mortalità e i ers of cholangiocytes from normal and homozygous DF508
loro polmoni sono stati processati per la conta batterica, la CFTR individuals.
risposta infiammatoria e l’analisi istologica. Results. iPSC-cholangiocytes reproduced the polarity and
Risultati. Durante l’infezione di SA e la super-infezione di the secretory function of the biliary epithelium. PKA/c-AMP
PA abbiamo osservato che PA14 non interferisce con l’effica- mediated fluid secretion was impaired in • F508 cholangio-
cia di 200 mg/Kg di AC nel ridurre la carica batterica di New- cytes and negligibly improved by VX-770 and VX-809, two
man e la risposta infiammatoria fino a 26 giorni di infezione. small molecule drugs used to correct and potentiate • F508
Abbiamo però valutato che l’efficacia dell’antibiotico non CFTR. Moreover, • F508 cholangiocytes showed increased
condiziona la capacità della pre-infezione di SA di aumen- phosphorylation of SFK (Src kinase family) and TLR4 and
tare l’abilità di PA di stabilire l’infezione cronica. L’analisi pro-inflammatory changes including increased NF-kB activa-
istologica dimostra inoltre che l’antibiotico contiene le lesio- tion, secretion of pro-inflammatory chemokines (i.e MCP-1

52
and IL8), as well as alterations of the F-actin cytoskeleton. sperimentali di derivazione umana dove poterli studiare.
Treatment with Src inhibitor (PP2) decreased the inflamma- Ipotesi e obiettivi. L’obiettivo del nostro studio è quello di
tory changes and improved cytoskeletal defects. Inhibition of applicare la tecnologia delle cellule staminali umane indotte
SFK along with administration of VX-770 and VX-809 success- (iPSC), alla ricerca di strategie terapeutiche per la CFLD.
fully restored fluid secretion to normal levels. Metodi essenziali. Abbiamo messo a punto un protocollo
Spin-off for research and clinical purposes. Our findings per differenziare cellule biliari da iPSC derivate da individui
have strong translational potential and indicate that, in regard sani e da un paziente con mutazione • F508.
of CFLD, targeting Src kinase and decreasing inflammation Risultati. I nostri risultati mostrano che le cellule diffe-
may increase the efficacy of pharmacological therapies aimed renziate dalle iPSC riproducono morfologicamente e funzio-
at correcting the basic • F508 defect. These studies also dem- nalmente le cellule biliari umane adulte. Il confronto delle
onstrate the promise of applying iPSC technology to perform cellule sane con le mutate, mostra che le cellule mutate pre-
studies on the efficacy of new drugs for CFLD and possibly sentano un difetto secretorio significativo che è solo margi-
applicable to other organs (i.e. lung, pancreas, intestine). nalmente corretto dal trattamento con VX-770 e VX-809, due
composti in uso in clinica per correggere il difetto • F508.
Differenziamento di cellule biliari umane con Inoltre le cellule biliari mutate mostrano una elevata attiva-
CFTR mutato da cellule staminali pluripotenti in- zione delle tirosina chinasi Src e del TLR4, accompagnata
da un fenotipo pro-infiammatorio (attivazione di NF-kB e
dotte (iPSC) come modello per studiare il ruolo
secrezione di IL8 e MCP-1) e una alterata distribuzione del
dell’immunità innata nella malattia epatica asso- citoscheletro di F-actina. Il trattamento con un inibitore della
ciate a fibrosis cistica. chinasi Src mostra un effetto protettivo sull’infiammazione e
Ragioni dello studio. CFTR è espresso dalle cellule ristabilisce l’organizzazione del citoscheletro. Inoltre il trat-
dell’epitelio biliare del fegato. Una grave complicanza in tamento combinato con l’inibitore di Src e VX-770 e VX-809
fibrosi cistica (FC), è la malattia epatica (CFLD), le cui cause mostra un drammatico miglioramento del difetto secretorio.
patogenetiche non sono ancora note e una cura non è an- Possibili ricadute per ricerca e clinica. I nostri studi han-
cora disponibile. Utilizzando un modello murino di FC, ab- no importanti implicazioni terapeutiche e suggeriscono che il
biamo in precedenza dimostrato che la mancanza di CFTR trattamento combinato con inibitori di Src e i composti cor-
nell’epitelio biliare ha un profondo impatto sui meccani- rettori della mutazione • F508 diminuisce l’infiammazione e
smi che dell’immunità innata (recettori Toll-like, TLR) che ripristina la funzione secretoria biliare. Questi studi dimostra-
in condizioni normali, proteggono il sistema biliare dalle no inoltre la validità del modello iPSC per screening di farma-
infezioni. Tuttavia, la rilevanza di questi meccanismi nel ci per l’epitelio biliare e facilmente estendibile ad altri organi
paziente non è attualmente nota poiché mancano modelli come pancreas, epitelio polmonare e intestino.

POSTER SESSION 3
TOWARDS CF BASIC DEFECT THERAPY
47. SpliceFix: fixing splicing defects in the
CFTR gene through CRISPR/Cas9 technology

Maule G1, Petris G1, Carlon M2, Arosio D3, Debyser Z2,
Cereseto A1
1
Centre for Integrative Biology (CIBIO), University of
Trento, Via Sommarive 9, 38123 Trento, Italy, 2Laboratory
for Molecular Virology and Gene Therapy, Department of
Pharmaceutical and Pharmacological Sciences, KU Leuven,
Belgium, 3Institute of Biophysics, National Research Council
and Bruno Kessler Foundation, 38122 Trento, Italy (FFC
#1/2017, New)
Anna Cereseto, responsabile del progetto
Background. A class of mutations causing Cystic Fibro-
sis are localized in intronic regions of the CFTR gene (3272-
26A>G and 3849+10KbC>T) leading to splicing defects. We Preliminary results. Preliminary analysis of the minigene
designed a gene therapy strategy aiming at re-establishing transcripts after Cas9 editing revealed that different sgRNAs
proper CFTR splicing and expression through the deletions of generated the proper splicing pattern, corresponding with
the mutated intronic sequences by exploiting an innovative the expected intronic deletion. Selected sgRNAs were then
CRISPR/Cas9 approach. tested in Caco-2 cells expressing endogenous CFTR protein
Objective. With this project, we aim to develop Splice-Fix, showing that Cas9/sgRNAs induced the expected intronic
a novel therapeutic approach based on latest technologies of deletion without transcripts alteration. This technology will
“genome editing”, for Cystic Fibrosis (CF) treatment. These be adapted to viral vectors and applied to model organoids
techniques are cutting edge developments of recently discov- derived from patients’ primary cells. Finally, we will use novel
ered enzymes able to “cut and paste” the cellular DNA with sensitive Chloride sensor to test the efficacy of the CRISPR/
unprecedented precision. Cas9 genome editing.
Essential methods. To test the CFTR splicing repair strategy Spin-off for research and clinical purposes. The power of
via CRISPR/Cas9, we generated minigene-constructs which this approach is permanent correction of endogenous gene
efficiently modeled the 3272-26A>G and 3849+10KbC>T without modification of gene coding sequence.
CFTR splicing defects.

53
SpliceFix: riparare difetti di splicing del gene the domains of the CFTR-F508del involved in interaction with
CFTR tramite tecnologia CRISPR/Cas9 correctors. In addition, to clarify the molecular mechanisms
that cause the wrong assembly of the mutated protein, we
Ragioni dello studio. Una delle classi di mutazioni che will study the existing structural differences between binding
causano la Fibrosi Cistica coinvolge regioni introniche del sites for the native and mutated proteins.
gene CFTR (3272-26A>G and 3849+10KbC>T), dando la Essential methods. For this purpose, we have designed
possibilità di eliminare tali mutazioni per delezione tramite expression experiments of CFTR fractions, as well as cross-
le recenti tecnologie di “genome editing”. linking and limited proteolysis assays.
Obiettivo. Con il presente studio ci proponiamo di stu- Preliminary results. During the first year of activity we
diare un approccio innovativo basato sull’utilizzo di CRISPR/ have developed cDNA constructs that express the individual
Cas9 per ripristinare il corretto splicing di CFTR. domains of CFTR, or combinations thereof, and we have op-
Metodi esenziali. Per studiare strategie di riparo mediate timized their expression in mammalian cells. Our task during
il sistema CRISPR/Cas9, abbiamo generato dei costrutti con- the second year will be to systematically analyze the expres-
tenenti dei minigeni che riproducono in maniera efficiente le sion of the various CFTR fragments and their modification by
mutazioni 3272-26A>G and 3849+10KbC>T. the correctors.
Risultati preliminari. Nostri dati preliminari dimostrano Spin-off for research. We are confident that the results we
che i trascritti dei minigeni vengono prodotti in maniera cor- get will provide useful information both for designing new and
retta dopo il taglio generato da CRISPR/Cas9 in combinazione more effective correctors and for better understanding of the
con sgRNA suggerendo quindi un taglio corretto nella zona structural defects of the F508del-CFTR causing the disease.
intronica contenente le mutazioni. Alcuni sgRNA selezionati
sono stati analizzati anche nelle cellule modello Caco-2 che
esprimono CFTR a livello endogeno dimostrando che l’intro- Difetti di assemblaggio della proteina CFTR-
ne viene tagliato come previsto dal sistema CRISPR/Cas9 sen- F508del mutata; meccanismi di recupero dell’e-
za generare alterazioni dei livelli fisiologici di CFTR. Questa spressione della proteina CFTR-F508del mutata;
strategia di genome editing verrà successivamente valutata in correttori e siti di legame dei correttori
organoidi derivanti da pazienti affetti da Fibrosi Cistica in se-
guito alle mutazioni qui studiate. Infine prevediamo di utiliz- Ragioni dello studio. La fibrosi cistica (FC) è causata da
zare un metodo di indagine sensibile di funzionalità di CFTR mutazioni della proteina CFTR; la delezione della fenilalanina
che si basa su di un sensore fluorescente per il Cloro. in posizione 508 della proteina (F508del), che causa errori nel
Possibili ricadute per ricerca e clinica. Il sistema di geno- ripiegamento della proteina, è la mutazione con la maggior
me editing proposto con il presente progetto offre il vantaggio frequenza. Negli ultimi anni sono stati identificati alcuni ‘cor-
di correggere permanentemente le alterazioni di splicing che rettori’ che si sono rivelati capaci di rimediare i difetti strutturali
sono causate da alcune mutazioni introniche senza alterare della CFTR-F508del, aumentandone parzialmente l’espressio-
le sequenze geniche codificanti (esoni). ne a livello della membrana plasmatica, ma purtroppo, i siti di
legame e il meccanismo d’azione dei correttori sono tuttora
ignoti, limitando lo sviluppo di molecole più efficaci.
Obiettivi. L’obiettivo principale di questo progetto è
48. Identification of the binding sites of CFTR quello di identificare i domini della CFTR-F508del coinvolti
correctors nell’interazione con i correttori. Inoltre, per chiarire i mec-
canismi molecolari che causano l’errato assemblaggio della
proteina mutata, studieremo le differenze strutturali esistenti
Amico G, Baroni D and Moran O tra i siti di legame per i correttori della proteina nativa e di
Istituto di Biofisica, CNR, Genova (FFC#8/2016, In progress) quella mutata.
Metodi essenziali. A questo scopo, abbiamo disegnato
esperimenti di espressione di segmenti della CFTR, di ‘cross-
linking’ e di proteolisi limitata.
Risultati preliminari. Durante il primo anno di attività ab-
biamo messo a punto i costrutti di cDNA che codificano i
singoli domini della CFTR, o combinazioni di essi, e abbiamo
ottimizzato la loro espressione in cellule di mammifero. Il
nostro compito durante il secondo anno sarà quello di ana-
lizzare sistematicamente l’espressione dei diversi frammenti
della CFTR e la loro modificazione da parte dei correttori.
Possibili ricadute per la ricerca. I risultati forniranno in-
formazioni utili sia per il disegno di nuovi e più efficaci cor-
rettori, sia per una maggiore comprensione dei difetti struttu-
rali della F508del-CFTR che causano la malattia.
Oscar Moran con collaboratrici del progetto

Background. Cystic fibrosis (FC) is caused by CFTR pro- 49. New generation trimethylangelicin (TMA)
tein mutations; the deletion of phenylalanine at position 508 analogues for selective modulation of defec-
of the protein (F508del), which causes errors in folding the tive CFTR or inflammation
protein, is the mutation with the highest frequency. In recent
years, some ‘correctors’ have been identified that have been Chilin A
shown to remedy the structural defects of the CFTR-F508del, Dipartimento di Scienze del Farmaco, Università di Padova
partially increasing the expression at the plasma membrane (FFC#1/2016; In progress)
level; however, unfortunately the binding sites and the mech-
anism of action of the correctors are still unknown, limiting Background and rationale. TMA (4,6,4’-trimethylangeli-
the development of more effective molecules. cin) is a potentiator and corrector of mutated CFTR protein,
Objectives. The main objective of this project is to identify with anti-inflammatory activity useful CF lung disease. Con-

54
potenziatore CFTR, modulatore di infiammazione) e privi di
fototossicità e mutagenicità. Attraverso i nuovi composti sarà
possibile ottenere migliori informazioni sulle caratteristiche
strutturali di TMA cruciali per l’azione antiinfiammatoria e/o
modulatoria di CFTR, sia per dimostrare la possibilità di sepa-
rare le diverse attività, sia per consentire una terapia persona-
lizzata a seconda dello stato di progressione della patologia
(con molecole fornite o prive di attività antiinfiammatoria,
oltre all’effetto correttore o potenziatore di CFTR).
Metodi essenziali. Gli obiettivi del progetto saranno arti-
colati in 5 fasi: 1) progettazione e sintesi di nuovi analoghi di
TMA; 2) analisi di fototossicità e mutagenicità; 3) test dell’a-
zione antiinfiammatoria; 4) test degli effetti sulla modulazio-
Adriana Chilin, responsabile ne di CFTR; 5) definizione di relazioni struttura-attività per ca-
del progetto
pire i requisiti strutturali necessari ad ottenere selettivamente
proprietà antinfiammatorie, proprietà modulatorie di CFTR o
cerns raised on the potential phototoxicity and mutagenicity attività duale anti-infiammatoria/modulatrice di CFTR.
of the parent TMA molecule opened a new pharmaceutical Risultati preliminari. Nel primo anno è stata preparata
pipeline aimed to differentiate the three biological effects of una serie di nuovi analoghi di TMA con modifiche strutturali
TMA and exclude both the potential safety risks. nelle posizioni 4 e 6 del nucleo furocumarinico. Tra questi,
Hypothesis and Objectives. The major objective of the pro- sono stati identificati alcuni composti con proprietà di cor-
ject is to synthesize and test new generation TMA analogues rezione di CFTR e/o inibizione di NF-kB, ma privi di muta-
with selective and alternative biological effects (as F508del genicità e fototossicità. È in corso di studio il meccanismo
CFTR correctors, F508del CFTR potentiators or inflammatory dell’azione di correzione di CFTR.
down-modulators) without phototoxicity and mutagenicity. Risultati attesi. Identificazione dei determinanti strutturali
The newly synthesized compounds will allow deriving better che indirizzano le tre attività biologiche della TMA, allo scopo
structure-activity relationships on both the biological activities di trovare nuove molecole con migliore attività antiinfiamma-
on inflammation and CFTR modulation depending on particu- toria e/o di correzione della funzione CFTR, ma con trascurabi-
lar structural features on the TMA scaffold. These new findings le fototossicità e mutagenicità, da utilizzare in studi preclinici.
will facilitate a personalized therapy according to the stage of
progression of lung disease of each CF patient, providing the
option of associating an anti-inflammatory effect besides the
key activity of rescuing and potentiating CFTR. 50. Optimization of a new lead promoting the
Essential methods. The goals of the project can be out- readthrough of nonsense mutations for the
lined in 5 sections: 1) design and synthesis of new TMA ana- CFTR rescue in human CF cells
logues; 2) evaluation of the phototoxicity and mutagenicity;
3) test of the anti-inflammatory activity; 4) test of the effects Lentini L, Melfi R, Baldassano S, Tutone M, Di Leonardo A,
as CFTR function modulation; 5) derivation of structure-activ- Pace A, Pibiri I
ity relationships aimed at a full comprehension of the struc- Department of Biological, Chemical and Pharmaceutical
tural features required to obtain selective anti-inflammatory Sciences and Technologies (STEBICEF), University of Palermo
properties, selective CFTR modulatory properties and dual (FFC#3/2017, New)
anti-inflammatory/CFTR modulatory activity.
Preliminary results. In the first year a series of new TMA
analogues were synthesized with structural modification in
the 4 and 6 position of the furocoumarin nucleus. Among
them, some compounds were identified exhibiting CFTR
correction and/or NF-kB inhibition, without any mutagenic-
ity and phototoxicity. The mechanism of CFTR correction of
these compounds is under investigation.
Expected results. Identification of the structural deter-
minants that drive the three biological activity of the parent
TMA, in order to find novel candidates with improved anti-
inflammatory and/or CFTR function modulating properties
(and negligible sude effects) for pre-clinical studies.

Analoghi di trimetilangelicina (TMA) di nuova Laura Lentini, terza da destra, con collaboratori del progetto
generazione come modulatori selettivi di CFTR
o di infiammazione Background and rationale. Cystic Fibrosis patients with
Ragioni dello studio. TMA (4,6,4’-trimetilangelicina) è nonsense mutations in the CFTR gene have frequently a more
un potenziatore e correttore della proteina CFTR mutata, severe form of the disease. Nonsense mutations represent
con attività antiinfiammatoria utile per fibrosi cistica, attivo about 10% of the mutations that affect the CFTR gene and they
a bassissime concentrazioni. Preoccupazioni riguardo a po- are frequently associated to the classical F508del mutation. A
tenziale fototossicità e mutagenicità di TMA hanno dato il potential treatment for this genetic alteration is to promote the
via alla ricerca di nuovi analoghi di TMA che presentino se- translational readthrough of premature termination codons
lettivamente una delle tre attività e siano privi dei potenziali (PTCs) by Translational Read-Through-Inducing Drugs (TRIDs).
effetti collaterali. Hypothesis and objectives. Our objective is to evaluate the
Ipotesi e obiettivi. L’obiettivo principale di questo proget- functionality of the CFTR channel after treatment with a new
to è la sintesi e lo studio di una nuova generazione di analo- molecule that we individuated in a precedent FFC project, and
ghi di TMA con effetti terapeutici selettivi (correttore CFTR, the activity of new lead molecules in cells stably expressing

55
a nonsense-CFTR-mRNA (ns CFTR) in CF cellular model sys- attività di superamento delle mutazioni di stop associata all’e-
tems. We want also to study the supramolecular interactions spressione della proteina CFTR in cellule di epitelio FC.
among TRIDs, CFTR mRNA and the ribosomal A-site to identify Risultati finali attesi e loro significato. I nostri studi po-
the biological target and the mechanism of action. tranno ottenere la convalida di una molecola con una buona
Essential methods. QSAR, carried out on the basis of our attività readthrough per il recupero della funzione di CFTR.
preliminary results, will allow to achieve lead optimization L’approccio preclinico rivelerà precocemente gli eventuali ef-
and synthesize then a small library of analogs to be tested and fetti tossici associati alla molecola in vivo.
compared to the Lead. We will mutagenize the CFTR cDNA
by introducing the most diffuse nonsense mutations. Subse-
quently, FRT cells engineered with the vector expressing mu-
tagenized nsCFTR, and nonsense-CF-human broncoepithelial 51. Pharmacophore and pharmacokinetic fil-
cells will be grown in the air-liquid culture system to repro- tering tools guiding for the design and synthe-
duce in vitro the epithelial organization. CFTR expression af- sis of novel thiazole-containing and VX-809
ter treatments with our molecule will be evaluated by biomo-
lecular techniques. CFTR activity will be revealed by specific hybrid derivatives as F508del correctors
CFTR-functionality assays. Finally, in vitro-in vivo (Zebrafish
model) analyses of the safety profile for the set of synthesized Liessi N1, Cichero E2, Pesce E3, Pedemonte N3, Salis A1,
molecules will complete the study. Arkel M4, Damonte G1,4, Spallarossa A2, Brullo C2, Fossa
Preliminary results. We screened the activity of sever- P2 and Millo E1,4
al molecules synthetized by us in a precedent FFC project 1
Center of Excellence for Biomedical Research (CEBR),
(FFC#1/2014), identifying some molecules that showed high University of Genoa, Genoa, Italy, 2Department of Pharmacy,
readthrough activity associated to the expression of the CFTR Section of Medicinal Chemistry, University of Genoa,
protein in nonsense CF immortalized cells. Genoa, Italy, 3U.O.C. Genetica Medica, Istituto Giannina
Expected final results and their significance. We are con- Gaslini, Genoa, Italy, 4Department of Experimental Medicine,
fident that our findings will provide the validation of mole- Section of Biochemistry, University of Genoa, Genoa, Italy
cules with readthrough activity for the recovery of the CFTR (FFC#6/2017, New)
function. Moreover, our pre-clinical study will assess the pres-
ence of toxic effects caused by the molecules in vivo.

Ottimizzazione di una nuova molecola per il su-


peramento delle mutazioni di stop e il recupero
della proteina CFTR in cellule umane FC
Ragioni dello studio. Le mutazioni nonsenso (anche note
come mutazioni stop) rappresentano circa il 10% delle mu-
tazioni che interessano il gene CFTR. Pazienti affetti da fi-
brosi cistica che presentano questo tipo di mutazioni hanno
una forma più grave della malattia. Spesso tali mutazioni si
trovano anche associate alla classica • F508. Un trattamento
potenziale di questa alterazione genetica è quello di promuo-
vere la trans-lettura dei codoni di terminazione prematuri Enrico Millo, responsabile del progetto, con una collaboratrice
(PTCs) mediante uso di farmaci oggi noti come TRIDs (Trans-
lational Read-Through-Inducing Drugs).
Ipotesi e obiettivi. L’obiettivo di questo studio è quello Background. In cystic fibrosis patients, the function of
di ottimizzare una nuova molecola individuata da noi in un CFTR is lost. Defective function of this channel can be caused
precedente progetto FFC e valutare la funzionalità del canale by a variety of mutations with F508del being the most com-
CFTR dopo il trattamento con essa e i suoi analoghi in sistemi mon. The primary defects can be treated with drug-like
modello cellulari di fibrosi cistica. small molecules, known as “CFTR modulators”. During the
Metodi essenziali. Introdurremo 5 delle più diffuse muta- last years, several efforts have been performed to identify
zioni di stop che interessano il gene CFTR all’interno di un new active modulators. The most promising data came from
gene (cDNA) CFTR che verrà inserito in cellule CFTR negati- high-throughput screening (HTS) strategies, towards the dis-
ve. Su tali sistemi modello e su cellule derivate da pazienti af- covery of thiazole-containing correctors. In previous studies,
fetti da FC verrà valutata la presenza e la funzionalità del ca- we identified a class of compounds called aminoarylthiazoles
nale dopo trattamento con i nostri farmaci. Inoltre, mediante (AATs) that potentially correct the CF basic defect and also
dinamica molecolare e docking cercheremo di individuare showed a strong synergic effect when combined with VX809.
il bersaglio biologico di tali farmaci al fine di migliorarne la Hypothesis and objectives. This project is aimed to ad-
performance. dress the effectiveness of performing QSAR analyses to guide
La tecnica QSAR (relazione quantitativa struttura-attività, the search of thiazole-containing derivatives as F508del
n.d.r.), sulla base di dati preliminari, ci consentirà di realizza- modulators. A limited number of selected descriptors will be
re l’ottimizzazione delle nostre nuove molecole e sintetizzare used as filtering tools for the design of novel thiazole-based
una piccola libreria di analoghi da testare. Cellule contenenti derivatives. The main objectives of our project are to identify
un gene CFTR mutato saranno utilizzate come sistema model- new compounds, belonging both to the family of AATs and of
lo in vitro per lo studio della funzionalità del canale. Tale atti- VX-809 analogues, which have the ability to correct the CFTR
vità sarà analizzata mediante saggi specifici e tramite la misura protein defect caused by F508del.
delle correnti del cloro. Infine per completare lo studio, saran- Essential Methods. In an attempt to construct more ac-
no condotti dei test pre-clinici in vitro ed in vivo (Zebrafish) per tive molecules, it was thought to generate chemically hybrid
stabilire il profilo di sicurezza del set di molecole sintetizzate. compounds, merging a portion of VX809 merged to the thia-
Risultati preliminari. Abbiamo analizzato l’attività di di- zole scaffold. Novel AAT analogues will be designed, synthe-
verse molecole da noi sintetizzate in un precedente progetto sized and tested in functional and biochemical assays on CF-
FFC, identificando molecole che hanno mostrato un’elevata BE41o- cells expressing F508del-, in order to further explore

56
the chemical space around the thiazole ring and the related per lo studio di nuovi correttori. Ci aspettiamo infatti di iden-
corrector ability. tificare nuovi derivati ibridi contenenti porzioni tiazoliche e
Preliminary results. We evaluated various AATs with the di VX-809 in grado di stimolare il trasporto di cloruro nelle
interesting ability to improve both the trafficking and the gating cellule epiteliali.
of mutant CFTR and different AAT-VX-809 hybrid derivatives
with corrector properties. The new molecules were tested in
functional and biochemical assays showing a promising correc-
tor activity. These findings prompt us to deepen our synthetic 52. RNF5 inhibitors as potential drugs for
efforts around the privileged-scaffold of the thiazole ring, merg- Cystic Fibrosis basic defect
ing key moieties of the well-known corrector VX-809.
Expected final results and their significance. We expect Pedemonte N1, Cavalli A2
to identify novel thiazole-containing and VX-809 hybrid deriv- 1
U.O.C Genetica Medica, Istituto Giannina Gaslini, Genova,
atives able to stimulate chloride/bicarbonate transport in CF 2
Dipartimento di Farmacia e Biotecnologie, Università di
epithelial cells by correction of mutant CFTR. Such molecules Bologna (FFC#9/2017, New)
may represent lead compounds for the development of drugs
that correct the basic defect in CF patients.

Analisi farmacoforica per la progettazione e sin-


tesi di nuovi derivati tiazolici e ibridi di VX-809
come correttori della mutazione F508.
Ragioni dello studio. Nei pazienti affetti da fibrosi cistica,
si osserva una compromessa funzionalità nel normale tra-
sporto di ioni cloruro e bicarbonato nelle cellule epiteliali
di vari organi. La correzione del difetto di base può essere
ottenuta ripristinando la funzione della proteina CFTR mu-
tata attraverso l’uso di opportune sostanze denominati mo-
dulatori. Negli ultimi anni sono stati compiuti diversi sforzi
per identificare nuovi modulatori efficaci del canale. I dati Nicoletta Pedemonte, prima a sinistra, con le collaboratrici di
ricerca e, nel riquadro, il partner del progetto Andrea Cavalli
più promettenti sono stati ottenuti da strategie di screening
di librerie di molecole (HTS), portando alla scoperta di al-
cune classi di correttori, tra cui derivati a struttura tiazolica. Background. The most frequent mutation in cystic fibrosis,
In precedenti studi, abbiamo individuato una classe di com- F508del, causes the arrest of the maturation of CFTR protein.
posti chiamati aminoariltiazoli (AAT) in grado di correggere Correctors are able to rescue F508del-CFTR. Correctors could
il difetto di base del canale e di mostrare effetto sinergico in act directly on CFTR or by modulating other proteins thus lead-
combinazione con VX809. ing to beneficial effects on CFTR maturation. Several proteins
Ipotesi e obiettivi. I principali obiettivi del progetto ri- have already been identified that could represent useful drug
guardano la progettazione e sviluppo di nuovi correttori far- targets for a CF therapy based on modulation of alternative tar-
macologici per F508del-CFTR, il mutante più frequente nei gets. One of the most promising proteins is the ligase RNF5.
pazienti malati di fibrosi cistica. Il nostro lavoro si baserà Hypothesis and objectives. In vitro RNF5 silencing causes
sullo studio dei principali gruppi farmacoforici (gruppi fun- a significant F508del-CFTR rescue additive/synergic with
zionali disposti nelle tre dimensioni spaziali, n.d.r.) presenti the effect of the investigational drug VX-809. RNF5 loss in
nei correttori più promettenti finora descritti in letteratura, al F508del-CFTR transgenic animals ameliorated intestinal mal-
fine di guidare la sintesi ed ottimizzazione di nuove mole- absorption as evidenced by changes in body weight, and re-
cole appartenenti alla classe degli AAT. L’individuazione di duced fecal excretion of biliary acids, and concomitantly led
nuovi composti si baserà sull’ideazione di strutture ibride tra to an increase in CFTR activity in intestinal epithelial cells. In
gli aminoariltiazoli e VX809, contenenti gruppi che mimano vitro and in vivo experiments clearly demonstrate that RNF5
alcuni gruppi funzionali di tali prototipi ma che siano farma- could constitute a strong target for the development of novel
cologicamente più attive. therapies for CF.
Metodi essenziali. Al fine di costruire molecole più pro- Methods. Improved RNF5 inhibitors will be developed by
mettenti, saranno sintetizzate librerie di composti, unendo screening commercially available analogs and by synthesizing
alla struttura base di tipo tiazolico alcuni sostituenti tipici di novel analogs. The knowledge of the structure-activity rela-
VX809. I nuovi analoghi saranno progettati, sintetizzati e te- tionship will help us to improve efficacy and potency of RNF5
stati in analisi funzionali e biochimiche su linee cellulari che inhibitors. The efficacy of RNF5 inhibitors on mutant CFTR
esprimono F508del. In questo modo sarà possibile esplorare will be assessed by electrophysiological techniques on bron-
lo spazio chimico attorno all’anello tiazolico e la relativa ef- chial epithelia derived from patients with one/two copies of
ficacia in termini di attività correttrice. F508del or other mutations with trafficking defect.
Risultati preliminari. Ad oggi abbiamo valutato sia strut- Preliminary Results. By using a computational approach,
ture aminoariltiazoliche sia alcuni derivati ibridi rispetto a in our previous project we identified one compound, called
VX-809, aventi un’ interessante capacità di migliorare la 2A2 that efficiently inhibits RNF5 ligase activity and rescue
funzionalità della proteina CFTR mutata. Le nuove molecole F508del-CFTR in immortalized human bronchial cells. The
sono state testate in saggi funzionali e biochimici mostrando aim of our proposal is now to identify optimized RNF5 inhibi-
una promettente attività correttrice. Tali risultati suggeriscono tors and to evaluate their efficacy on rescuing CFTR activity in
di proseguire con la sintesi di ulteriori analoghi aventi strut- epithelia from CF patients.
tura tiazolica, variamente modificati con sostituenti del noto Spin-off for research & clinical purposes. These stud-
correttore VX-809. ies point to potential use of RNF5 as a novel target for
Risultati finali attesi e loro significato. L’obiettivo finale F508del-CFTR, by identifying drug-like small-molecules with
del nostro progetto è l’identificazione di piccole molecole in optimized activity as RNF5 inhibitors. It is a general opin-
grado di correggere il difetto di base nella terapia della fibrosi ion that combination therapies will be required to maximize
cistica oltre a fornire un modello computazionale attendibile F508del-CFTR rescue. Thus, the development of novel thera-

57
pies, focused on the rescue of the basic defect, by using mul-
tiple approaches, represents a priority for the improvement
of life conditions of CF patients.

Gli inibitori di RNF5 quali potenziali farmaci per


il difetto di base in fibrosi cistica
Ragioni dello studio. La mutazione più frequente nei pa-
zienti con fibrosi cistica è la delezione della fenilalanina 508
(F508del), che causa un blocco nella maturazione della pro-
teina. Molecole chiamate correttori possono recuperare la
proteina F508del-CFTR, agendo direttamente su CFTR oppure
modulando altre proteine che influiscono sulla maturazione di
CFTR. Sono state identificate diverse proteine che possono co- Loretta Ferrera, al centro, con collaboratrici di ricerca
stituire nuovi bersagli farmacologici per la terapia della fibrosi
cistica. Una delle proteine più interessanti è la ligasi RNF5.
Ipotesi e obiettivi. I nostri studi hanno dimostrato che, in tions, changes in the pH in the airway surface liquid (ASL) of
modelli cellulari, la soppressione di RNF5 causa il recupero CF patients occur. Therefore, direct treatment of airways with
del mutante F508del-CFTR, additivo con l’effetto del correttore bicarbonate would determine an increase of the pH with the
VX-809 (lumacaftor), mentre nei modelli animali, la soppres- consequent beneficial action in the thickness of the mucus.
sione di RNF5 determina un miglioramento del malassorbi- Hypothesis and objectives. The aims of the project are: 1)
mento intestinale, come evidenziato da cambiamenti nel peso to examine whether the mutant CFTR rescue by lumacaftor
corporeo e dalla ridotta perdita di acidi biliari nelle feci, e un is correlated with the bicarbonate transport and pH modi-
aumento della attività di CFTR nell’epitelio intestinale. Questi fications in the ASL; 2) to investigate if the treatment with
dati dimostrano che RNF5 può costituire il bersaglio per lo bicarbonate modify the mucin secretion and water reabsor-
sviluppo di nuove terapie farmacologiche per la fibrosi cistica. tion in the ASL; 3) to verify the direct role of airway pH on the
Metodi. La ricerca di migliori inibitori di RNF5 procederà viscoelastic properties of the ASL mucus.
testando sia analoghi disponibili commercialmente sia analo- Essential methods. We apply bicarbonate directly to the
ghi sintetizzati dai nostri gruppi. La conoscenza di come l’at- apical surface of epithelial models, or alter enzymatically the
tività del composto varia al variare della sua struttura chimica bicarbonate cell production. We use primary bronchial cells
ci aiuterà nel disegnare composti più efficaci. L’efficacia dei monolayers from normal subjects and CF patients. Water reab-
composti nel recuperare CFTR verrà analizzata attraverso sortion, pH, ASL protein concentration and microrheological
metodi elettrofisiologici su epiteli derivati da pazienti con properties, measured by the displacement of fluorescent na-
una o due copie di F508del o altre mutazioni che causano nobeads, characterises the properties of the ASL. Bicarbonate
un difetto simile. treatment is compared with the lumacaftor corrector treatment.
Risultati Preliminari. Attraverso un approccio di tipo Preliminary results. Our results clearly indicate that either
computazionale, nel corso del progetto precedente abbiamo the treatment with lumacaftor and with bicarbonate signifi-
identificato un composto, chiamato 2A2, che inibisce l’atti- cantly improve the properties of the mucus.
vità di ligasi di RNF5, e migliora la maturazione di F508del, Expected final results and their significance. Data ob-
in cellule bronchiali umane immortalizzate. Lo scopo della tained in this work will be usefull for the design strategies for
nostra proposta è di ottimizzare gli inibitori di RNF5 e di va- CF treatment patients using inhaled bicarbonate, and improve
lutarne l’efficacia nel recuperare l’attività di CFTR su epiteli the protocols that are been used in a clinical trial. Noteworthy,
derivati da pazienti con fibrosi cistica. bicarbonate might represent a mutation-independent and low
Possibili ricadute per ricerca e clinica. Questi studi sono cost therapy to clear out the mucus that accumulates in the
mirati all’utilizzo di RNF5 come nuovo bersaglio farmacolo- airways, reducing the risk of infections and improving lung
gico per la F508del-CFTR, attraverso l’identificazione di ini- function.
bitori, al fine di massimizzare il recupero di F508del-CFTR.
Lo sviluppo di nuove terapie basate su approcci molteplici, Proprietà del muco delle vie aeree in fibrosi cisti-
consentirà il miglioramento delle condizioni di vita dei pa-
zienti con fibrosi cistica. ca: modifiche dovute a cambiamenti nell’attività
di CFTR e dopo applicazione di bicarbonato
Ragioni dello studio. La maggior parte dei problemi dei
pazienti colpiti da fibrosi cistica (FC) dipende dalla presenza
53. Properties of airway mucus in cystic fibro- di un muco molto denso e difficile da eliminare con la tos-
sis: their modification by changes in the activity se. Noi abbiamo recentemente dimostrato che le proprietà
of CFTR and after application of bicarbonate viscoelastiche del muco FC possono migliorare dopo l’appli-
cazione diretta di lumacaftor. Così noi possiamo ipotizzare
Ferrera L che l’effetto del lumacaftor possa essere determinato da una
(U.O.C. Genetica Medica, Istituto Giannina Gaslini, Genova) aumentata secrezione di bicarbonato dovuta al recupero di
(FFC#12/2016, In progress) F508d-CFTR. E’ stato suggerito che come conseguenza del-
la alterazione del trasporto anionico mediato dalla proteina
Background and rationale. Most of the problems of pa- CFTR mutata, possono avvenire cambiamenti nel pH del li-
tients affected by cystic fibrosis (CF) depend on the accumu- quido sulla superficie delle vie aeree (ASL) nei pazienti CF.
lation of a very thick mucus, which is difficult to eliminate. We Quindi, l’applicazione diretta delle vie aeree con bicarbona-
have recently demonstrated that the viscoelastic properties of to potrebbe determinare un aumento del pH con conseguen-
CF mucus improve with the direct application of lumacaftor. te azione sullo spessore del muco.
Thus, we hypothesise that the effect of lumacaftor could be Ipotesi e obiettivi. Ci proponiamo quindi di: 1) capire se
due to the increased secretion of bicarbonate across the il recupero della proteina mutata da parte del lumacaftor è
rescued F508d-CFTR. It has been suggested that as a conse- correlato con il trasporto di bicarbonato e con i cambiamenti
quence of anionic transport dysfunction due to CFTR muta- di pH in ASL; 2) studiare se il trattamento con bicarbonato

58
modifica la secrezione di mucina e il riassorbimento di ac- machinery controlling proteostasis and in this way small mol-
qua in ASL; 3) verificare il ruolo diretto del pH delle vie aeree ecules targeting this pathway signalling can be potent cor-
sulle proprietà viscoelastiche del muco. rectors of F508del-CFTR proteostasis. So here we identify the
Metodi essenziali. Trattiamo le cellule applicando diretta- molecular mechanism of action of this pathway and also iden-
mente il bicarbonato sulla superficie apicale di epiteli model- tify repositionable drugs targeting this pathway as correctors
lo o modificando la produzione cellulare di bicarbonato con to rescue F508del-CFTR.
opportuni enzimi. Usiamo monostrati di cellule bronchiali Essential methods. 1) We have used transcriptional pro-
primarie differenziate e derivate da soggetti normali e da pa- filing (microarrays or RNA-seq) under conditions when the
zienti FC. Il riassorbimento di acqua, il pH, la concentrazione MLK3 pathway was downregulated to understand the mo-
di proteine in ASL e le proprietà microreologiche, misurate lecular changes that can be correlated with the rescue of
tramite lo spostamento di nanobiglie fluorescenti, caratteriz- F508del-CFTR.
zano lr proprietà di ASL. Il trattamento con bicarbonato viene 2) We have identified appropriate small molecules or
paragonato con l’effetto del lumacaftor. combinations of them targeting MLK3 pathway and rescue
Risultati preliminari. I nostri risultati indicano che il trat- F508del-CFTR in model systems.
tamento con lumacaftor e con bicarbonato migliorano le pro- Preliminary results. MLK3 pathway. By transcriptional
prietà del muco. profiling we identified Insulin induced gene – 1 (INSIG-1) to
Risultati finali attesi e loro significato. I dati ottenuti da be an essential downstream executor of the proteostasis con-
questo lavoro saranno utili per progettare strategie per il trat- trol by MLK3 pathway. Specifically, we found that INSIG-1
tamento di pazienti FC usando bicarbonato inalato, e per mi- binds to CFTR and targets it to endoplasmic reticulum associ-
gliorare i protocolli da usare nelle sperimentazioni cliniche. ated degradation possibly via the ubiquitin ligase gp78. IN-
Fatto importante, il bicarbonato può rappresentare una tera- SIG-1 has a well-established role in cholesterol homeostasis,
pia mutazione-indipendente e a basso costo per fluidificare where it regulates the proteostasis of cholesterol biosynthesis
ed eliminare il muco che si accumula nelle vie aeree, ridu- enzymes in a sterol dependent manner. On the contrary, the
cendo così il rischio di infezioni e migliorare la funzionalità proteostasis regulation of CFTR by INSIG-1 was cholesterol
polmonare. independent thus uncovering a novel mechanism of action
of INSIG-1. We also screened several clinically approved (or
safety approved after crossing Phase I trials) MLK3 pathway
inhibitors as potential correctors of F508del-CFTR proteosta-
54. Understanding the mode of action of reg- sis and found 3 active compound that restored proteostasis
ulatory pathways controlling F508del- CFTR of F508del-CFTR as measured by biochemical maturation
proteostasis and developing drugs that rescue assays. Among these 3 drugs, one of them restored also the
chloride conductance in the F508del-CFTR expressing cells to
F508del-CFTR by targeting these pathways levels comparable to that of VX-809.
synergistically In addition, we also evaluated the mechanism of action
of RNF215, an uncharacterized ubiquitin ligase identified in
Parashuraman R, Subramanian A, Hegde R and Luini A our earlier analysis, whose depletion exert a potent correc-
IBP, CNR, Naples, Italy (FFC#6/2016, In progress) tor activity. We found that RNF215 directly binds to F508del-
CFTR to target it to degradation. RNF215 downregulation also
potently restored the chloride conductance in the F508del-
CFTR expressing cells.
Expected final results and their significance. These analy-
ses provide insights into CF pathology; provide specific targets
to control F508del-CFTR proteostasis and also efficient small
molecules regulators that can rescue F508del-CFTR. The ap-
proach precisely encapsulates the mission of CF Foundation
to develop innovative pharmacological approaches to correct
or compensate the deficiency of functional CFTR.

Comprensione e “targeting” delle vie di regola-


zione che controllano la proteostasi di F508del-
Il gruppo di ricerca di Alberto Luini (quinto da sinistra)
CFTR
Ragioni dello studio. La fibrosi cistica (CF) è causata da
mutazioni nel regolatore transmembrana della conduttanza
Background and rationale. Cystic fibrosis (CF) is caused della CF (CFTR). La mutazione più frequente (F508del-CFTR)
by mutations in CF transmembrane conductance regulator provoca un folding (conformazione) non corretto della protei-
(CFTR). The most frequent mutation (F508del-CFTR) results in na mutante che porta alla sua ritenzione e degradazione in-
the misfolding of the mutant protein that leads to its intracel- tracellulare. Sono stati identificati diversi composti correttori
lular retention and degradation. Several corrector compounds che ripristinano la proteostasi (meccanismo che controlla la
have been identified that restore the proteostasis of the mutant sintesi, conformazione e degradazione della proteina mutan-
protein. We recently identified the molecular changes associat- te. Recentemente abbiamo identificato i cambiamenti mole-
ed with these corrector drugs that contributed to the rescue of colari associati a questi farmaci correttori, che evitano la de-
the mutant protein from degradation. These changes included gradazione della proteina mutante. Queste modifiche hanno
modulation of the activity of several signaling pathways and incluso la modulazione dell’attività di diversi pathways del
also ubiquitin ligases. Among the signaling pathways, one cen- segnale e anche l’ubiquitina ligasi. Tra i pathways del segnale,
tred on Mixed Lineage Kinase 3 (MLK3) potently controlled uno basato su Lineage Kinase 3 Mixed (MLK3) controllava in
the proteostasis of CFTR. We are analyzing and targeting these maniera forte la proteostasi della CFTR. Laddove è possibile,
pathways with suitable drugs, when possible. stiamo analizzando e bersagliando questi pathways con far-
Hypothesis and objectives. We propose that MLK3 path- maci idonei.
way acts on CFTR proteostasis by modulating the levels of Ipotesi e obiettivi. Noi proponiamo che il pathway MLK3

59
agisca sulla proteostasi di CFTR e che quindi la modulazione
del macchinario che controlla la proteostasi e delle piccole
molecole che agiscono in questo pathway possa essere un
potente correttore della proteostasi di F508del-CFTR. Quindi
abbiamo identificato il meccanismo molecolare di azione di
questo pathway ed identificato anche i farmaci riposizionabi-
li che mirano a correggerlo in modo da ripristinare F508del-
CFTR.
Metodi essenziali. 1) Abbiamo utilizzato profili trascri-
zionali (microarray o RNA-seq) in condizioni di sottorego-
lazione del pathway MLK3 per comprendere i cambiamenti
molecolari che possono essere correlati con il ripristino di
F508del-CFTR. 2) Abbiamo identificato piccole molecole ap-
propriate o loro combinazioni che mirano al pathway MLK3 Luis Juan Vincente Galietta, responsa-
bile del progetto
e ripristinano F508del-CFTR in sistemi di modelli.
Risultati preliminari. Mediante l’analisi di profili trascrizio-
nali abbiamo identificato il gene indotto da insulina (INSIG-1) lers of protein quality. They recognize CFTR with the F508del
come un esecutore essenziale a valle del controllo della pro- mutation as a defective protein and hence attach ubiquitin,
teasasi mediante il percorso MLK3. In particolare, abbiamo a sort of molecular tag that causes protein degradation. Im-
scoperto che l’INSIG-1 si lega a CFTR e lo guida verso la via di portantly, deubiquitinases (DUBs) remove the ubiquitin tag
degradazione associata al reticolo endoplasmatico attraverso and therefore save proteins from degradation. There are ap-
l’ubiquitina ligasi gp78. L’INSIG-1 ha un ruolo ben consolidato proximately 100 different DUB types in human genome. Our
nell’omeostasi del colesterolo, dove regola la proteostasi degli aim is to identify the UBLs and DUBs that determine the fate
enzimi di biosintesi del colesterolo in maniera dipendente da- of mutant CFTR.
gli steroli. Al contrario, la regolazione della proteostasi di CFTR Methods. We will use cells expressing CFTR protein with
da parte di INSIG-1 è indipendente dal colesterolo scoprendo the F508del mutation. Using gene silencing, we will turn off
così un nuovo meccanismo di azione di INSIG-1. Abbiamo the cellular DUBs, one at a time, and look at the effect on
anche selezionato diversi inibitori del pathway MLK3 clinica- mutant CFTR. The DUBs that are important for CFTR will be
mente approvati (o approvati dalla sicurezza dopo la fase I) a way to identify the corresponding UBLs. Indeed, each DUB
come potenziali correttori della proteostasi di F508del-CFTR e inside the cell usually associates with one or more UBLs as
trovato 3 composti attivi che hanno ripristinato la proteostasi di molecular partners.
F508del-CFTR misurata dai saggi di maturazione biochimica. Preliminary results. We have screened a commercial li-
Tra questi 3 farmaci, uno ha ripristinato anche la conduttanza brary containing siRNAs against 97 DUBs with the functional
di cloro nelle cellule che esprimono F508del-CFTR a livelli pa- assay based on the halide-sensitive yellow fluorescent protein.
ragonabili a quelli di VX-809. Inoltre, abbiamo valutato anche The hits from the screening are under evaluation.
il meccanismo d’azione di RNF215, una ubiquitina ligasi non Expected results and spin-off. The identification of pro-
caratterizzata, identificata nelle nostre precedenti analisi, la cui teins that control mutant CFTR degradation will be important
eliminazione esercita una potente attività correttiva. Abbiamo to design novel pharmacological strategies. Indeed, drugs
scoperto che RNF215 si lega direttamente a F508del-CFTR per that increase the activity of DUBs and/or decrease the activ-
indirizzarla alla degradazione. La riduzione della regolazione ity of UBLs could favor the efficacy of CFTR correctors.
di RNF215 ha anche potenzialmente ripristinato la conducibi-
lità del cloro nelle cellule che esprimono F508del-CFTR. Identificazione di deubiquitinasi e ubiquitina-li-
Risultati finali attesi e loro significato. Queste analisi
forniscono approfondimenti sulla patologia CF; forniscono gasi che influenzano la correzione della proteina
obiettivi specifici per controllare la proteostasi di F508del- CFTR mutata
CFTR e anche efficienti piccole molecole regolatrici che Ragioni del progetto. La fibrosi cistica (FC) è una malat-
possono ripristinare F508del-CFTR. Lo studio racchiude pre- tia genetica causata dalla perdita di funzione della proteina
cisamente la missione della Fondazione CF per sviluppare CFTR. La mutazione più frequente nei pazienti FC è F508del.
approcci farmacologici innovativi per correggere o compen- Recentemente sono stati sviluppati dei farmaci, chiamati
sare la carenza di CFTR funzionale. correttori, per il trattamento dei pazienti con la mutazione
F508del. Tuttavia, i correttori attualmente a disposizione han-
no efficacia limitata.
55. Identification of deubiquitinases and ubiq- Ipotesi e obiettivi. La nostra ipotesi è che la proteina
CFTR mutata, nonostante il trattamento con correttori, sia in
uitin ligases that affect mutant CFTR rescue gran parte eliminata a causa di proteine intracellulari chiama-
te ubiquitina-ligasi (UBL). Le UBL agiscono da controllori; ri-
Musante I, Scudieri P, Renda M, Genovese M, Galietta LJV conoscono la proteina CFTR con la mutazione F508del come
Telethon Institute of Genetics and Medicine (TIGEM), un difetto di produzione e attaccano alla proteina stessa l’u-
Pozzuoli (NA) (FFC#2/2017, New) biquitina, una specie di etichetta molecolare che ne deter-
mina l’eliminazione. È importante notare che esistono anche
Background and rationale. Cystic fibrosis (CF) is a genetic proteine con azione contraria. Queste sono le deubiquitinasi
disease due to lack of function of the CFTR protein. The most (DUB), ne esistono circa 100, che rimuovono l’ubiquitina sal-
frequent mutation in CF is F508del. Recently, novel drugs, vando le proteine dalla degradazione. Il nostro obiettivo è
named correctors, have been developed to treat patients with l’identificazione delle UBL e delle DUB che determinano il
F508del mutation. However, such drugs have limited effi- destino della proteina CFTR mutata.
cacy. Metodi. Per il nostro studio utilizziamo cellule in coltura
Hypothesis and objectives. Our hypothesis is that mutant che esprimono la proteina CFTR con la mutazione F508del,
CFTR protein is still degraded to a large extent, despite the sia linee cellulari ingegnerizzate sia cellule primarie bronchiali
treatment with correctors, due to the activity of intracellular ottenute in precedenza da pazienti. Attraverso una tecnica di
proteins named ubiquitin ligases (UBLs). UBLs act as control- silenziamento genico effettueremo lo spegnimento delle DUB,

60
una per volta, e valuteremo l’effetto sulla proteina CFTR mu- Preliminary results. By following such strategy, we already
tata. L’identificazione delle DUB importanti per CFTR saranno produced different organ models featured by endogenous ma-
un passo importante per poi scoprire le UBL. Infatti ciascun trix. Our results clearly demonstrate the fundamental role of the
tipo di DUB si associa specificamente con una o più UBL. connective tissue in guiding in vitro epithelium morphogenesis.
Risultati preliminari. Abbiamo effettuato un primo scre- Moreover, in preliminary results by using lung fibroblasts we
ening in cui abbiamo silenziato la maggior parte delle DUB succeeded in developing a connective airway tissue (CAT) in
conosciute. Il silenziamento di alcune di queste ha prodotto which human lung fibroblasts were embedded in their own
un effetto sulla proteina CFTR mutata. Sono in corso esperi- ECM replicating the architecture found in the native tissue.
menti per la conferma dei risultati. Moreover, we succeeded in obtaining a muco-ciliated differ-
Possibili ricadute. Le informazioni ottenute potranno es- entiated epithelium by performing ALI (Air Liquid Interface)
sere utilizzate per lo sviluppo di nuove terapie farmacolo- culture of normal human bronchial epithelium cells on the CAT.
giche. Si può infatti ipotizzare lo sviluppo di farmaci mirati Spin-off for research & clinical purposes. A novel in vitro
che, promuovendo l’attività di DUB e/o inibendo l’attività di CF model to predict and monitor the potential efficacy of new
UBL, abbiano l’effetto desiderato di proteggere la CFTR favo- therapies finalized to correct the CFTR defect.
rendo l’azione di correttori.
Un nuovo modello di fibrosi cistica in chip mi-
crofluidico per lo studio dei meccanismi patoge-
56. A novel Full Thickness Cystic Fibrosis mod- netici e la valutazione di strategie terapeutiche
el on a microfluidic chip to study pathogenic Ragioni dello studio. Recentemente, nella mission dell’in-
mechanisms and evaluate therapeutic strategies gegneria dei tessuti rientra quella di ricreare tessuti/organi pa-
tologici per fornire agli studiosi e a clinici una piattaforma
Netti P1, di Bernardo D2 in vitro, sostitutiva del modello in vivo, su cui studiare l’e-
1
The Center for Advanced Biomaterials for Healthcare, CRIB, voluzione di una patologia ed eventualmente testare nuovi
Istituto Italiano di Tecnologia, Napoli, 2Centro di Ricerca approcci terapeutici. In questo contesto, disporre di un tes-
Interdipartimental sui Biomateriali – Università degli Studi di suto respiratorio funzionale in vitro, darebbe la possibilità di
Napoli Federico II (FFC#8/2017, New) comprendere i meccanismi patogenetici che sono alla base
delle malattie respiratorie croniche e di sviluppare nuove e
appropriate strategie terapeutiche.
Ipotesi e obiettivi. I modelli attualmente esistenti di epi-
telio respiratorio mancano della componente connettiva fal-
lendo nel riprodurre il crosstalk (“colloquio”, n.d.r.) fisiolo-
gico tra tessuto connettivo e cellule epiteliali che in vivo ha
importanti implicazioni sul differenziamento e sulla funzione
dell’epitelio nonché sulla risposta/adattamento a stimoli fisio-
logici e agenti esterni dannosi. L’obiettivo di questo progetto è
di indurre il differenziamento muco-ciliare di cellule epitelia-
li estratte da pazienti affetti da fibrosi cistica, su un connettivo
di tessuto polmonare, al fine di costruire in vitro un modello
patologico, utilizzabile sia per studiare la patofisiologia della
malattia che per testare nuove strategie terapeutiche.
Paolo Netti, primo da destra, con i collaboratori del progetto Metodi essenziali. La strategia utilizzata si basa su un nuo-
vo approccio di ingegneria dei tessuti detto “bottom-up” che
si basa su produrre tessuti micrometrici, utilizzando cellule e
Background and rationale. Elucidation of the pathogenic microscaffold (microimpalcature, n.d.r.) e poi assemblarli in
mechanisms that underlie chronic respiratory diseases and bireattori (dispositivi che permettono la crescita autonoma di
development of appropriate therapeutic strategies require rel- cellule, n.d.r.) opportunamente progettati. Il macrotessuto ri-
evant in vitro models that reproduce the most important as- sultante è costituito da cellule e matrice extracellualre endoge-
pects of the tissue/organ in vivo. We established a novel tissue na. Su di esso viene indotta la crescita dell’epitelio polmonare
engineering approach to build-up organ in vitro, based on attraverso coltura all’interfaccia aria/liquido. La progettazione
the production of a responsive and adaptive connective tis- di un chip microfluidico renderà possibile la coltura tessutale
sue. Such physiological environment promotes the crosstalk in condizione fluidodinamiche controllate e opportunamente
between epithelium and the underlying extracellular matrix modulate per favorire il differenziamento epiteliale bronchiale
(ECM) and has important consequences on the differentia- nonché la misura on-line di parametri elettrofisiologici.
tion and function of the epithelium and the response/adapta- Risultati. Risultati preliminari mostrano come l’approccio
tion to physiological stimuli and noxious events. che si intende seguire in questo progetto permette lo svilup-
Hypotesis and objectives. We propose to build up a full po di organi istologicamente e funzionalmente competenti
thickness airway tissue in-vitro model of cystic fibrosis (CF) in cui il tessuto connettivo ha un ruolo fondamentale nello
disease (FT_CF), by following the tissue engineering strategy sviluppo di epiteli funzionali (epidermide, cervice, epitelio
that we developed, in order to assess the efficacy of novel intestinale).
therapeutic treatments such as small molecules and gene/cell Possibili ricadute per ricerca e clinica. Lo sviluppo di un
therapy. Moreover, we plan to design a microchip for FT_CF tessuto respiratorio in vitro offre nuove prospettive nel testing
culture, differentiation and molecules testing. pre-clinico e trova ampie applicazioni nell’area della ricerca
Essential methods. The experimental activity of the pro- tossicologica, della ricerca virale, nello studio di infiammazio-
posed project will include the following step: engineering ni e fibrosi e nello sviluppo di nuovi farmaci. L’inserimento,
of full thickness airway CF tissue (FT_CF); morphological inoltre, del tessuto in un chip di microfluidica, renderà possibi-
characterization and Single-cell transcriptomics analysis of le la coltura tessutale in condizione fluidodinamiche controlla-
FT_NA and FT_CF; integration of the FT_CF in a microfluidic te e opportunamente modulate per favorire il differenziamento
chip; validation of the FT_CF to assay the efficacy of thera- epiteliale. Inoltre il chip potrà essere dotato di sensori per la
peutic strategies misura on-line di parametri elettrofisiologici (TEER, pH).

61
57. Dissecting the potency of human Mesoan- functional CFTR. In vivo and ex vivo electrophysiological tests
demonstrated that engrafted mMABs recovered CFTR func-
gioblasts to differentiate into CFTR-expressing tional activity in CFTR-deficient mouse models.
epithelial cells: a step forward to an innovative Spin-off for research & clinical purposes. This project
cell-based therapy for Cystic Fibrosis disease may represents a major advance over other cell-based thera-
peutic strategy for CF. This first study on human MABs will
Messina G demonstrate their ability to express functional CFTR, rescuing
Dipartimento di Bioscienze, Università degli Studi di Milano chloride ions transport in CF epithelia and possibly differen-
(FFC#5/2017, New) tiating into epithelial like cells. The results obtained from this
proposal will make these cells eligible for a clinical translation
in human CF patients as a cell based therapy.

Caratterizzazione dei Mesoangioblasti umani per


una nuova terapia cellulare della Fibrosi Cistica
Ragioni dello studio. La Fibrosi Cistica (FC) è la malattia
genetica causata da diverse mutazioni nel gene CFTR. Seb-
bene numerosi progressi terapeutici abbiano migliorato l’a-
spettativa di vita dei pazienti affetti da FC, purtroppo ad oggi
il trapianto polmonare rimane l’unica opzione risolutiva. Le
terapie cellulari e geniche stanno emergendo come nuovo
potenziale approccio curativo per diverse malattie genetiche,
Graziella Messina, terza da destra, con i collaboratori di ricerca
anche se la loro efficacia nella FC non è ancora stata dimo-
strata. I mesoangioblasti (MAB) sono progenitori cellulari
adulti associati ai vasi che hanno dimostrato negli ultimi anni
Background. Since the CFTR gene was cloned in 1989, un importante potenziale terapeutico nella cura di una severa
several strategies for correction of CF lung disease have been patologia genetica muscolare.
explored. Among these, cell-based approaches are under in- Ipotesi e obiettivi. Abbiamo dimostrato, in precedenti
vestigation. Endogenous lung stem and progenitor cells have studi eseguiti su modelli murini di FC, il potenziale dei MAB
been studied although their contribution in the amelioration murini per una terapia cellulare della FC. Partendo da questi
of chronic lung diseases is still debated. Stem cell-based ap- risultati, l’obiettivo di questo progetto è quello di caratterizza-
proaches to treat CF have not achieved the efficiencies of re i mesoangioblasti umani in termini di espressione e attività
delivery and engraftment needed for therapy. The reasons funzionale del canale CFTR, fornendo così tutti gli elementi
rely on the low cell engraftment in the lungs after systemic necessari per traslare questo innovativo approccio terapeuti-
administration and on the small percentage of differentiated co ai pazienti affetti da FC.
cells in airway epithelia and in the even less percentage of Metodi essenziali. Differenti popolazioni di MAB uma-
CFTR expression. ni saranno studiati per valutare l’espressione proteica e fun-
Hypothesis and objectives. During our recent works on zionale del canale CFTR in sistemi di co-coltura con cellule
a class of mouse progenitor cell derived from vessel, named bronchiali di pazienti affetti da FC. L’attività del CFTR dei MAB
mesoangioblasts (mMABs), we observed that mMABs, when nell’epitelio FC sarà valutata tramite saggi elettrofisiologici.
systemically transplanted in healthy and CF mice distributed Risultati. Recentemente abbiamo osservato che MAB mu-
throughout lung, trachea and intestinal epithelium over-time. rini iniettati per via sistemica in modelli animali di FC sono
The aim of this project is to evaluate for the first time the po- in grado di colonizzare le vie aeree e l’intestino, portando ad
tency of human mesoangioblast to correct the CFTR defect un recupero funzionale dell’attività del CFTR. Inoltre, i MAB
and to contribute to lung homeostasis. The whole study can nelle vie aeree differenziano in cellule epiteliali partecipando
be considered a crucial step to definitively develop a cell- alla omeostasi del polmone.
based therapy for patients affected by CF. Possibili ricadute per ricerca e clinica. Ci si aspetta di
Essential methods. Different populations of human MABs dimostrare in modo definitivo che i mesoangioblasti uma-
(hMABs) will be tested for the expression of CFTR. hMABS will ni esprimono il canale CFTR e che, all’interno dell’epitelio
be co-cultured with human bronchiolar epithelial cells from malato, siano in grado di contribuire al recupero funzionale
healthy control or CF patients bearing severe mutations of dell’attività del canale stesso. Così come già mostrato per i
CFTR (F508del, N1303K), to evaluate their ability to differenti- MAB murini, valuteremo anche se i MAB partecipano alla ri-
ate into epithelium and to express of a functional CFTR (by generazione dell’organo. Considerato che il trapianto di me-
Ussing chamber), thus mimicking the in vivo environment. soangioblasti è in fase di sperimentazione clinica in pazienti
Results. In our previous studies, we showed that murine affetti da Distrofia Muscolare di Duchenne, questo progetto
mMABs engrafted airways and intestine of different CF mouse fornirà il tassello necessario a dimostrare con evidenze im-
models, up to 6 months upon a single injection. mMABs under portanti il potenziale reale ed efficace dei MAB per una tera-
specific stimuli differentiate into epithelial cells and express a pia cellulare nella FC.

62
APPENDICES
Appendix 1

Publications and congress communications from the studies


funded by Italian CF Research Foundation 2002-2017
Pubblicazioni e comunicazioni congressuali dagli studi finanziati
dalla Fondazione Ricerca FC dal 2002 al 2017
1. CFTR PATHOPHYSIOLOGY AND THERAPY OF THE BASIC DEFECT
Fisiopatologia CFTR e terapie del difetto di base

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– Milano), Olga Zegarra (Lab. Gen. Molec. - Ist. Gaslini – Genova) tunno dei Ricercatori Italiani per la fibrosi cistica – 14-15 novembre
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• • FFC Project#2/2002 “Evaluation of efficiency efficacy and safety of la fibrosi cistica – 19-20 novembre 2004, Verona
CFTR-gene delivery mediated by lentivirus vectors in model sys-
tems of cystic fibrosis airway epithelium” Massimo Conese (Ist. per • • FFC Project#1/2003 “CFTR regulation by protein-protein interac-
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tor” 3rd European Conference & Practical Course 14-26 June 2004,
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- Copreni E. et al. “Trasferimento genico mediato da un vettore len- - Moran O. et al. “Binding site of activators of the cystic fibrosis trans-
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63
- Moran O. et al. “A quantitative description of the activation and in- • • FFC Project#13/2003 “Biochemical and physiopathological aspects
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30 April – 3 May 2004 Tomar Portugal;
- Moran O. et al. “A quantitative interpretation of the activation and • • FFC Project#3/2004 “Natural and synthetic amino acids as chemi-
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• • FFC Project#3/2003 “Screening of drugs approved for human use Publications
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- Spirlì C. et al. “Glibenclamide stimulates fluid secretion in rodent porters 2006, Parma 6-9 September 2006.
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tance regulator-indipendent mechanism” Gastroenterology. 2005 pendent on actin cytoskeleton interaction with ezrin and NHERF1”
Jul;129(1):220-33 European CF Conference, Belek, Turkey, 13-16 June 2007; J. of Cys-
- Strazzabosco M. et al. “Diferentially expressed adenylyl cyclise iso- tic Fibrosis June 2007, vol. 6, suppl. 1:S7
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- Fiorotto R, et al. “Ursodeoxycholic acid stimulates fluid secretion in Lecce 19-21 Sept. 2007; Acta Physiologica, vol. 191, suppl. 657
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64
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10.1111/jcmm.12303. and quality control system as a novel therapeutic strategy for Cystic
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noarylthiazole derivatives as correctors of the chloride transport de-
fect in cystic fibrosis” Eur J Med Chem. 2015 Jun 24;99:14-35 • • FFC Project #1/2013 “Mechanism of action of trimethylangelicin
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Epithelial Cells by Bacterial Pyocyanin” PLoS One. 2015 Jun (Dip. di Bioscienze, Biotecnologie e Biofarmaceutica, Università di
29;10(6):e0131775 Bari)
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28 Marzo 2015, Algarve, Portugal NHERF1” Pflugers Arch 2014 Mar 5
- Pesce E. et al. “Aminoarylthiazoles as correctors and potentiators - Favia M. et al. “Trimethylangelicin promotes the functional rescue
for mutant CFTR” 1st Italian CF Young Investigator Meeting, January of mutant F508del CFTR protein in cystic fibrosis airway cells” Am
16th - 17th 2015, Rome, Italy J Physiol Lung Cell Mol Physiol 2014;May 9
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defective CFTR/ENaC function and tightness of CF airway epithelial cortical cAMP/PKA signaling via ezrin phosphorylation and cyto-
cells upon coculture: involvement of gap junctions” 1st Italian CF skeleton organization” J Cell Sci, 2016 Jan 28
Young Investigator Meeting, January 16th - 17th 2015, Rome, Italy - Laselva O. et al. “The investigational Cystic Fibrosis drug Trimeth-
- Pesce E. et al. “Strategies to correct the chloride transport defect ylangelicin directly modulates CFTR by stabilizing the first mem-
in cystic fibrosis” New frontiers in basic science of cystic fibrosis, brane-spanning domain” Biochemical Pharmacology 2016 Sep 8.
Malta, ECFS Conference, 26-29 March 2014 pii: S0006-2952(16)30265-9
- Bellotti M. et al. “Development of small molecules to correct the Abstracts
defective chloride transport in cystic fibrosis” ECFC Basic Science, - Abbattiscianni AC. et al. “Role of small molecule F508del CFTR
Pisa, 2016 correctors on the cAMP/PKA/ezrin compartmentalization in pri-
- Pesce E, Bellotti M, Sondo E et all. “Aminoarilthiazoles as correctors mary CF-BE cells” 1st Italian CF Young Investigator Meeting January
and potentiators for mutant CFTR” 1th Italian CF Young Investigators 16th - 17th 2015, Rome, Italy
Meeting, January 16th-17th 2015, Rome - Laselva O. et al. “Trimethylangelicin (TMA) binds directly to puri-
fied WT-CFTR” NACF 2015
• • FFC Project#3/2012 “Study of the pathogenetic and therapeutic - Laselva O. et al. “Trimethylangelicin (TMA) promotes F508del.CFTR
role of the Epithelial Na+ channel (ENaC) in CF and CF-like dis- functional rescue in CF airways cells” New frontiers in basic science
ease” Marco Lucarelli (Dip. Biotecnologie cellulari ed Ematologia, of cystic fibrosis, Malta, ECFS Conference, 26-29 March 2014
Università “La Sapienza”, Roma), Cristina Bombieri (Dip. Scienze - Laselva O. et al. “Trimethylangelicin (TMA) promotes F508del-CFTR
della Vita e della Riproduzione, Università di Verona), Massimo Co- functional rescue in CF airway cells”, CF Basic science conference,
nese (Dip. Scienze Biomediche, Università di Foggia) Pisa, 2016
Abstracts - Laselva O. et al. “Intramolecular assembly disrupted by ΔF508 can
- Lucarelli M et al. “Espressione e metilazione dei geni ENaC” Con- be modulated by structurally unrelated compounds» 13th ECFS Ba-
gresso Società Italiana di Biochimica Clinica (SIBIOC), Roma 5-8 sic Science Conference, 30 March – 02 April 2016, Pisa, Italy
ottobre 2010. - Abbatiscianni AC, Favia M, Monterisi S, Casavola V “Role of small
- Lucarelli M. et al. “Expression and DNA merthylation of ENaC molecule F508delCFTR correctors on the cAMP/PKA/ezrin compart-
genes” European Cystic Fibrosis Conference (ECFC), Valencia 16-19 mentalization in primary CF-BE cells” 1th Italian CF Young Investiga-
June 2010 tors Meeting, January16th-17th 2015, Rome
- Castellani S. et al. “Study of the role of ENaC in cystic fibrosis: Ex- • • FFC Project#3/2013 “ΔF508-CFTR correctors deriving from com-
pression of ENaC subunits as an investigation tool of the interaction putational design and from safe natural compounds for a prompt
between CFTR and ENaC and therapeutic approaches by epigenetic clinical application» Mauro Mazzei (Dipartimento di Farmacia,

69
Università di Genova), Paola Fossa (Dip. di Farmacia, Università di Abstracts
Genova), Maria Pascale (Dip. di Farmacia, Università del Salento) - Lentini L. et al. “Premature termination codon 124 derivatives as a
Publications novel approach to improve the read-through of premature amber
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selected pharmacological correctors of the mutant CFTR chloride 86th SIBS National Congress, Palermo, Italy, 24-25 October 2013
channel” Future Med Chem. 2014;6(17):1857-68 - Pibiri I. et al. “Nonsense Mutation Readthrough Enhancement by
- Nieddu E. et al. “Phenylhydrazones as Correctors of a Mutant Cystic Variation of Fluorine Number and Position in a Series of PTC124
Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator” Arch Pharm 2016 Derivatives”, EFMC-ISMC 2014-XXIII International Symposium on
Feb;349(2):112-23 Medicinal Chemistry, Lisbon, Portugal - September 7-11, 2014
- Lentini L, Pibiri I, Melfi R et Al. “Integrated computational and
• • FFC Project #5/2013 “Vessel associated progenitor cells as a experimental approaches for the identification of new molecules
promising cell-based approach to treat cystic fibrosis disease” with readthrough activity on premature termination codons (PTCs)
Graziella Messina (Dip. di Bioscienze, Università degli Studi di in cystic fibrosis cells” IBIM-CNR: “Biotecnologie e ricerca di base
Milano) interdisciplinare e traslazionale in ambito biomedico”, presso il
Abstracts CNR di Palermo, Dicembre 2015
- Vezzali C. et al. “Vessel associated progenitor cells in the cell- - Lentini L, Pibiri I, Melfi R et Al. “Identification of new molecules
based therapy of the cystic fibrosis lung disease” 11th ECFS Basic with readthrough activity on premature termination codons (PTCs)
Science Conference, Malta, 26-29 March 2014 in cystic fibrosis cells (CFTR deltaF508/W1282X)” XIV Congresso
FISV, Roma 20-23 settembre 2016
• • FFC Project #6/2013 “Establishment of a semi-automated evalua- - Pibiri I, Lentini L, Melfi R et Al. “PTC124 and its derivatives: A ratio-
tion of CFTR function in blood cells for clinical applications” Clau- nal approach against nonsense” Convegno Nazionale della Divisio-
dio Sorio (Dip. di Patologia, Sez. Patologia generale, Università di ne di Chimica Organica della Società Chimica Italiana. 21 Settem-
Verona), Monica Averna (Dip. di Medicina Sperimentale, Università bre 2016-Venezia (Keynote)
di Genova), Mario R. Buffelli (Dip. Scienze Neurologiche e del Mo-
vimento, Università di Verona) • • FFC Project #2/2014 “ A systems biology approach to the correc-
Publications tion of Cystic Fibrosis: from building a network of proteostasis reg-
- Johansson J et al. “Detection of CFTR protein in human Leuko- ulatory pathways to combinatorial targeting. (A rational approach
cytes by Flow Cytometry” Cytometry 2014 Jul;85(7):611-20. doi: to develop novel drugs for the treatment of Cystic Fibrosis)” Alber-
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Abstracts e10365. doi: 10.7554
- Bavestrello M. et al. “Alterations of CF-PBMC induced by an in-
crease in [Ca2+]i” 1st Italian CF Young Investigator Meeting, January • • FFC Project#3/2014 “Testing CFTR in epithelial organoids for drug
16th - 17th 2015, Rome, Italy development and diagnosis of cystic fibrosis” Melotti Paola (Cen-
- Vercellone S. et al. “Measure of CFTR expression and function in tro Fibrosi Cistica, Azienda Ospedaliera Universitaria Integrata di
peripheral blood leukocytes” 1st Italian CF Young Investigator Meet- Verona), Hugo de Jonge (Gastroenterology & Hepatology, Erasmus
ing, January 16th - 17th 2015, Rome, Italy University Medical Center, Rotterdam)
- Vercellone S. et al. “Il test con flusso-citometria per identificare l’e- Abstracts
spressione di CFTR dopo trattamento con nuovi farmaci in linee - Caldrer S. et al. “CFTR in epithelial organoids: relevance for drug
cellulari epiteliali “39th European Cystic Fibrosis Conference, 8 – development and diagnosis of cystic fibrosis”, 1st Italian CF Young
11 June 2016, Basel, Switzerland Investigator Meeting, January 16th - 17th 2015, Rome, Italy
- Bavestrello M, Averna M, Pedrazzi M et all. “Alterations of CF-PBMC - Caldrer S. et al. “CFTR function in epithelial organoids” 10th Eu-
induced by an increase in [Ca2+]” 1th Italian CF Young Investigators ropean CF Young Investigator Meeting, Paris, 2016, February 10-12
Meeting, January16th-17th 2015, Rome .Oral Comunication
- Sorio C., et al. “Combined standardized and new CFTR functional
• • FFC Project#7/2013 “Nasal epithelial cells as a novel diagnostic tests for improving diagnosis” 13th ECFS Basic Science Conference,
approach for cystic fibrosis and CFTR related-disorders” Giuseppe 30 March – 02 April 2016, Pisa, Italy
Castaldo (CEINGE-Biotecnologie Avanzate scarl, Napoli) - Caldrer S. et al “Intestinal epithelial organoids contribute to combi-
Publications nation of functional tests supporting drug development and diagno-
- Terlizzi V. et al. “Genotype–phenotype correlation and functional sis” 13th ECFS Basic Science Conference, 30 March – 02 April 2016,
studies in patients with cystic fibrosis bearing CFTR complex alleles” Pisa, Italy
J Med Genet 2016;0:1–12. doi:10.1136/jmedgenet-2016-103985 - Sorio C. et al. “Una combinazione di test (sia standardizzati che nuo-
- Di Lullo AM, Scorza M, Amato F, Comegna M, Raia V “An “ex vi) per supportare la diagnosi FC e diagnosi incerte” 39th European
vivo model” contributing to the diagnosis and evaluation of new Cystic Fibrosis Conference, 8 – 11 June 2016, Basel, Switzerland
drugs in cystic fibrosis” Acta Otorhinolaryngologica Italica 2017 - Sorio C. et al. “Combining standardized and new CFTR functional
Jun;37(3):207-213. doi: 10.14639/0392-100X-1328 tests for diagnosis” 29th Annual North American Cystic Fibrosis
Abstracts Conference October 8-10, 2015, Phoenix, Arizona
- Scorza M. et al. “Nasal epithelial cells as a novel diagnostic ap- - Caldrer S. et al. “Intestinal epithelial organoids contribute to com-
proach for Cystic Fibrosis and CFTR relateddisorders” 1st Italian CF bination of CFTR functional tests supporting drug development and
Young Investigator Meeting, January 16th - 17th 2015, Rome, Italy diagnosis” 29th Annual North American Cystic Fibrosis Conference
October 8-10, 2015, Phoenix, Arizona
• • FFC Project #1/2014 “Identification and validation of novel mo- - Caldrer S, Baruzzia A, Vercellone S et all. “Studio del canale CFTR
lecules obtained by integrated computational and experimental su organoidi derivati da mucosa rettale per lo sviluppo di terapie
approaches for the read-through of PTCs in CF cells” Laura Lentini personalizzate e il supporto diagnostico in fibrosi cistica” XII Con-
(Dip. di Biologia, Scienze Chimiche e Farmaceutiche e Tecnologie greso Italiano Fibrosi Cistica, Salerno, 9-12 Novembre 2016
-STEBICEF, Sez. di Biologia Cellulare, Università di Palermo), Ivana
Pibiri (Dip. di Biologia, Scienze Chimiche e Farmaceutiche e Tecno- • • FFC Project#4/2014 “The molecular structure and the folding of
logie - STEBICEF, Sez. di Biologia Cellulare, Università di Palermo) the whole Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator
Publications (CFTR): correctors sites” Oscar Moran (Istituto di Biofisica, Consi-
- Pibiri I. et al. “Enhancement of premature stop codon readthrough glio Nazionale delle Ricerche - CNR, Genova)
in the CFTR gene by Ataluren (PTC124) derivatives” Eur J Med Publications
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Abstracts ENTIST WORKSHOP on “Stem cell niche: from basic science to
- Moran O, Pollock N, Satriano L, Zegarra-Moran O, Ford R et all clinical application” Pavia, Italy (May 8-10 2016)
“A small-angle x-ray scattering study of the wild type and mutant - Vezzali C, Celesti G, Bonfanti C et all. “Mesoangioblasts -vessel
F508del associated progenitor cells as a novel cell-based therapy for cystic
CFTR: a very thorough analysis” 13th ECFS Basic Science Conference, fibrosis” 14th ECFS Basic Science Conference, 29 March – 01 April
30 March – 02 April 2016, Pisa, Italy 2017, Albufeia, Portugal

• • FFC Project#8/2014 “Design and synthesis of improved analogs • • FFC Project#8/2015 “Dissecting the role of TG2 in cystic fibrosis
of trimethylangelicin (TMA) for personalized treatment of cystic pathogenesis: identification of possible novel therapeutic targets”
fibrosis” Roberto Gambari (Dip. di Scienze della Vita e Biotecnolo- Mauro Piacentini (Dipartimento di Biologia - Università di Tor Ver-
gie, Sez. di Biochimica e Biologia Molecolare, Università di Ferrara) gata, Roma), Luigi Maiuri (IERFC, Istituto Europeo per la Ricerca in
Adriana Chilin (Dip. di Farmaceutica e Scienze Farmacologiche, Fibrosi Cistica - Istituto Scientifico San Raffaele, Milano)
Università di Padova) Publications
Abstracts - Diaz-Hidalgo L. et al. “Transglutaminase type 2-dependent selective
- Lampronti I, Milani R, Manzione G et all “Anti-inflammatory activ- recruitment of proteins into exosomes under stressful cellular condi-
ity of novel 4,6,4’-trimethylangelicin’s analogues: Effects on the NF- tions” Biochimica et Biophysica Acta 1863 (2016) 2084–2092
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International Journal of Molecular Medicine, 38, S71-S71, 2016 nating Autophagy” Trends in Biochemical Sciences 2016 Oct 17.
pii: S0968-0004(16)30171-2. doi: 10.1016/j.tibs.2016.09.008
• • FFC Project#1/2015 “Relationship between mitochondria and - Rossin F, Villella V, D’Eletto M et all “TG2 regulates the heat shock
F508del-CFTR in Cystic Fibrosis” Anna Atlante (IBBE - Istituto delle response by the post-translational modification of HSF1”, Embo Re-
Biomembrane e Bioenergetica, CNR Bari) ports, submitted
Publications
- Atlante A. et al. “Mitochondria and Cystic Fibrosis Transmembrane • • FFC Project#9/2015 “Identification of molecular targets to reduce
Conductance Regulator Dialogue: Some News” J Bioenerg Bio- the side effect of gating potentiators on the F508del-CFTR plasma
membr DOI 10.1007/s10863-016-9663-y membrane stability” Anna Tamanini (Laboratorio di Patologia Mole-
colare, UOC Laboratorio Analisi sede di Borgo Trento, Dipartimento
• • FFC Project#2/2015 “RNF5/RMA1 ubiquitin ligase as a drug target di Patologia e Diagnostica - Azienda Ospedaliera Universitaria In-
for mutant CFTR rescue” Andrea Cavalli (Dipartimento di Farma- tegrata di Verona), Massimo Aureli (Dip. di Biotecnologia Medica e
cia e Biotecnologie - Università di Bologna) Nicoletta Pedemonte Medicina Traslazionale - Università di Milano)
(U.O.C. Genetica Medica - Istituto G. Gaslini, Genova) Publications
Abstracts - Schiumarini D, Loberto N, Mancini G et all. “Evidence for the in-
- Pedemonte N “Therapeutic potential of proteostasis modulation in volvement of lipid rafts and plasma membrane sphingolipid-hydro-
cystic fibrosis” 14th ECFS Basic Science Conference, 29 March – 1 lases in Pseudomonas aeruginosa infection of cystic fibrosis bron-
April 2017, Albufeira, Portugal chial epithelial cells” Mediators of Inflammation, submitted
Abstracts
• • FFC Project#3/2015 “Relationship between mitochondria and - Tamanini A., Loberto N., Mancini G. et all. “New molecular targets
F508del-CFTR in Cystic Fibrosis” Hugo de Jonge (Dipartimento di to reduce the side effect of potentiators on membrane stability of
Gastroenterologia ed Epatologia - Centro Medico, Erasmus Univer- rescued F508del CFTR protein in respiratory airways” The 30th An-
sity, Rotterdam), Sara Caldrer (Dip. di Patologia e Diagnostica, se- nual North American Cystic Fibrosis Conference, Orlando, Florida,
zione di Patologia Generale - Università di Verona) October 27–29,2016
Abstracts - Aureli M, Munari S, Mancini G et all. “vx-809 and vx-770 modu-
- Caldrer P. et al. “Una combinazione di test per studiare il funziona- late the sphingolipid pattern of bronchial epithelial cell lines: effect
mento di CFTR e favorire lo sviluppo di nuovi farmaci” 39th Europe- on CFTR plasma membrane stabilization” 14th ECFS Basic Science
an Cystic Fibrosis Conference, 8 – 11 June 2016, Basel, Switzerland Conference,29 March – 1 April 2017, Albufeira, Portugal
- Bijvelds M, Meijsen K, Peppelenbosch M et all “Chloride and bicar-
bonate transport in intestinal organoids: differential effects of CFTR • • FFC Project#1/2016 “New generation trimethylangelicin (TMA)
modulators and mutations” 17th Scientific Meeting “Organoids as analogues for selective modulation of defective CFTR or inflam-
models for disease and treatment in CF” September 21st + 22nd mation” Adriana Chilin (Dipartimento di Scienze Farmaceutiche e
2017 Schloss Waldhausen/Mainz Farmacologiche, Università di Padova)
Publications
• • FFC Project#5/2015 “The plant cytokine kinetin and its analogues - Lampronti I, Manzione MG, Sacchetti G et all “Differential Effects
as potential therapeutic agents to correct CFTR splicing defects” of Angelicines Analogues on NF-kB activity and IL-8 expression in
Stefano Duga (Università Humanitas, Milano) cystic fibrosis IB3-1cells” Mediators of Inflammation, Volume 2017
Publications (2017), Article ID 2389487
- Straniero L, Soldà G, Costantino L et all. “Whole-gene CFTR se- Abstracts
quencing combined with digital RT-PCR improves genetic diagno- - Chilin A, Marzaro G, Lampronti I et all. “New trimethylangelicin
sis of cystic fibrosis” J Hum Genet 2016 Dec;61(12):977-984. doi: analogues as modulators of defective CFTR” 14th ECFS Basic Sci-
10.1038/jhg.2016.101. ence Conference, 29 March – 01 April 2017, Albufeira, Portugal
- Chilin A “New generation trimethylangelicin (TMA) analogues
• • FFC Project#6/2015 “Evaluation of the biological and therapeutic for selective modulation of defective CFTR or inflammation” 14th
properties of mesoangioblasts-vessel associated progenitor cells in Convention of FFC investigators in Cystic Fibrosis, 24-26 novembre
the cell based therapy of the cystic fibrosis disease” Graziella Mes- 2016, Garda, Verona
sina (Dipartimento di Bioscienze - Università degli Studi di Milano)
Abstracts • • FFC Project#3/2016 “MicroRNA Therapeutics in CF: Targeting
- Bonfanti C. et al. “Mesoangioblasts - vessel associated progenitor CFTR and inflammation networks (MicroRNA-CF)” Roberto Gam-
cells- engraft epithelial tissues and express functional CFTR chan- bari (Dipartimento di Scienze della vita e Biotecnologie, Sezione di
nel: prospects and promise for a cell therapy for Cystic Fibrosis” Biochimica e Biologia Molecolare, Università di Ferrara)
10th Stem Cells, Cell Therapies and Bioengineering in Lung Biology Abstracts
& Lung Disease Conference; University of Vermont, Burlington VT, - Bergamini G, Calcaterra E, Tridello G et all. “Sviluppo di un test
USA (July 27-30, 2015) della funzione CFTR in vivo: Misurazione in singole ghiandole sudo-
- Vezzali C. et al. “Mesoangioblasts -vessel associated progenitor ripare umane mediante immagini della sudorazione dipendente dal
cells- engraft epithelial tissues and express CFTR channel: prospects canale difettoso in fibrosi cistica rispetto a quella indipendente” XXII
and promise for a cell therapy for Cystic Fibrosis” International So- Congresso Italiano Fibrosi Cistica, Salerno, 9-12 Novembre 2016
ciety for Stem Cell Research (ISSCR) Annual Meeting, San Francisco
CA, USA (June 22-25, 2016) • • FFC Project#4/2016 “Development of a PI3Kγ-derived peptide as a

71
novel F508del-CFTR potentiator” Alessandra Ghigo (Dipartimento • • FFC Project#11/2016 “Myriocin potential as a phenotype-mo-
di Biotecnologia Molecolare e Scienze della Salute, Università di difyingt herapeutical in cystic fibrosis” Paola Signorelli (Diparti-
Torino) mento di Scienze della Salute, Ospedale San Paolo, Università di
Abstracts Milano)
- Ghigo A, Murabito A, Ren K et all. “Targeting PI3Kγ scaffold func- Publications
tion to activate airway CFTR, limit lung inflammation and promote - Caretti A, Vasso M, Bonezzi FT et all “Myriocin treatment of CF lung
bronchorelaxation in cystic fibrosis” 14th ECFS Basic Science Con- infection and inflammation: complex analyses for enigmatic lipids”
ference,29 March – 01 April 2017, Albufeira, Portugal Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol 2017 Aug;390(8):775-790.
- Ghigo A, MurabitoA, Ren K et all “Targeting PI3Kγ scaffold func-
tion to activate airway CFTR, limit lung inflammation and promote • • FFC Project#TFCF “Task Force for Cystic Fibrosis”, Luis Galietta
bronchorelaxation in cystic fibrosis” North American Cystic Fibrosis (Lab. Genetica Molecolare, Ist. “G. Gaslini”, Genova), Tiziano Ban-
Conference 2017 - Indianapolis (USA) – November 2-4, 2017 diera (Istituto italiano di tecnologia, Genova)
Publications
• • FFC Project#5/2016 “Implementation of a new imaged-controlled - Sondo E. et al. “Evaluation of a systems biology approach to identify
sweat test for in vivo quantification of CFTR function: value for pharmacological correctors of the mutant CFTR chloride channel”
diagnosis and efficacy of new therapies” Teresinha Leal (Centro di Journal of Cystic Fibrosis 2016 Jul;15(4):425-35. doi: 10.1016/j.
Lovanio per Tossicologia e Farmacologia Applicata-LTAP, Istituto jcf.2016.02.009.
di Ricerca Clinica e Sperimentale-IREC, Università Cattolica di Abstracts
Lovanio), Stefano Ceri (Dipartimento di Elettronica, Informazione e - Pedemonte N. et al. “Task force for CF: an Italian drug discovery
Bioingegneria, Università di Milano); Nguyen-Khoa Thao (Necker- project to identify novel correctors and potentiators of F508del-
Enfants Malades Hospital, AP-HP Laboratory of General Biochem- CFTR” 12th ECFS Basic Science Conference, 25-28 Marzo 2015,
istry, Paris) Algarve, Portugal
Publications - Pedemonte N. et al. “Task Force for CF an Italian drug discovery
- Bergamini G, Tridello G, Calcaterra E et all “Ratiometric sweat se- project to identify novel correctors and potentiators of F508del-
cretion optical test in cystic fibrosis, carriers and healthy subjects” CFTR”, 29th Annual North American Cystic Fibrosis Conference,
Journal of Cystic Fibrosis, submitted October 8-10, 2015, Phoenix (Arizona)
- Bandiera T, Pedemonte N, Caci E. et al. “Task Force for Cystic Fi-
Abstracts brosis: identification of novel F508del-CFTR modulators” 13th ECFS
- Teresinha L., Viphonephom P., Hoyep Tchanchou A. et al. “False- Basic Science Conference, 30 March – 02 April 2016, Pisa, Italy
positive beta-sweat secretion test” The 30th Annual North American - Galietta L. “Scoperta di nuovi farmaci: il panorama della ricerca
Cystic Fibrosis Conference, Orlando, Florida, October 27–29, 2016 accademica” 39th European Cystic Fibrosis Conference, 8 – 11 June
- Calcaterra E, Tridello G, Leal T et all. “Sviluppo di un test della fun- 2016 | Basel, Switzerland”
zione CFTR in vivo: misurazione in ghiandole sudoripare umane
mediante immagini della sudorazione dipendente dal canale di- • • FFC Project#TFCF 2 “Task Force for Cystic Fibrosis 2”, Luis Galietta
fettoso in fibrosi cistica rispetto a quella indipendente” Congresso (Lab. Genetica Molecolare, Ist. “G. Gaslini”, Genova), Tiziano Ban-
Nazionale SIFC, 9-11 Novembre 2016, Salerno diera (Istituto italiano di tecnologia, Genova)
- Bergamini G, Calcaterra E, Ceri S et all “Testing CFTR function in Abstracts
vivo by imaged ratiometric measurement of beta adrenergic/cho- - Bandiera T, Pedemonte N, Caci E et all. “Task Force for Cystic Fibro-
linergic sweat rate in human sweat glands” 17th Scientific Meeting sis: identification of novel F508del-CFTR modulators” 13th Bascic
“”Organoids as models for disease and treatment in CF, September Science Conference, 30 March-2 April 2016, Pisa
21st + 22nd 2017 Schloss Waldhausen/Mainz
- Leal T, Noel S, Bergamini G et all “Topical eye treatment with • • FFC Project#TFCF 3 “Task Force for Cystic Fibrosis 3”, Luis Galietta
β-blocker abolishes sweat secretion triggered by intradermal isopren- (Lab. Genetica Molecolare, Ist. “G. Gaslini”, Genova), Tiziano Ban-
aline plus aminophylline: a clinical observation” ECFS 40th European diera (Istituto italiano di tecnologia, Genova)
Cystic Fibrosis Conference, 7-10 Giugno 2017, Siviglia, Spagna Abstracts
- Bertozzi F, Bandiera T, Di Fruscia P et all “Task force for cystic fibro-
• • FFC Project#7/2016 “Human intestinal organoids for detecting sis (TFCF): discovery and characterization of potent F508del-CFTR
CFTR rescue molecules in human plasma samples” Paola Melotti modulators” 14th ECFS Basic Science Conference, 29 March – 1
(Centro Fibrosi Cistica, Azienda Ospedaliera Universitaria Integrata April 2017, Albufeira, Portugal
di Verona) - Bandiera T, Sorana F, Berti F et all “Discovery and characterization
Abstracts of potent F508DEL-CFTR correctors” North American Cystic Fibrosis
- Caldrer S, Baruzzi A, Vercellone S et all “Intestinal epithelial organ- Congress (NACFC), November 2-4, 2017, Indianapolis
oids contribute to supporting drug development and diagnosis” 17th
Scientific Meeting “Organoids as models for disease and treatment in
CF” September 21st + 22nd 2017 Schloss Waldhausen/Mainz”

2. GENETICS
Genetica
• • FFC Project#4/2003 “Identification of CF modifier genes by family - Castaldo G. et al. “Phenotypic discordance in three siblings affected
studies and microarray analysis” Giuseppe Novelli (Dipart. Biopa- by atypical cystic fibrosis with the F508del/D614G genotype” J Cyst
tologia e Diagnostica per imm. - Univ. Tor Vergata RM), Pierfranco Fibros. 2006 Aug;5(3):193-5
Pignatti (Ist. Biol. Genetica – Dip. Materno Infantile - Univ. Verona), - Gambardella S. et al. “Gene expression profile study in CFTR mu-
Francesco Salvatore (Dipart. Bioch. e Biotec. Mediche – Univ. Fede- tated bronchial cell lines” Clin Exp Med (2006) 6:157-165
rico II – Napoli) Abstracts
Publications - Gambardella S. et al. “CAP70 as a possible modifier gene of Cystic
- Groman J. D. et al. “Variation in a Repeat Sequence Determines fibrosis phenotype” 54th Annual Meeting Toronto, Canada October
Whether a Common Variant of the Cystic Fibrosis Transmembrane 26 – 30 2004
Conductance Regulator Gene is Pathogenic of Benign” Am. J. Hum. - Gambardella S. et al. “Different CFTR genotypes induce dissimilar ex
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– an update” Future Medicine – Pharmacogenomics, 2004 Oct., 5 - Gambardella S. et al. “Different CFTR genotypes induce dissimilar
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- Salvatore D. et al. “Isolated elevated sweat chloride concentrations in Conference, Crete, Greece 22-25 June 2005;
the presence of the rare mutation S1455X: an extremely mild form of - Gambardella S. et al. “Differenti genotipi CFTR causano un diverso
CFTR dysfunction” Am J Med Genet A. 2005 Mar 1;133A(2):207-8 adattamento dell’espressione genica in linee cellulari FC” VIII Con-

72
gresso Nazionale S.I.G.U. – Domus de Maria (CA) 28-30 settembre The American Society of Human Genetics, 54th Annual Meeting,
2005; Toronto, Canada, October 26-30, 2004;
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the IVS8-5T mutation in the CFTR gene is pathogenic or benign” VI in pazienti CF originari del sud Italia” 37° Congresso Nazionale SI-
Congresso Nazionale S.I.G.U. – Verona 24-27 settembre 2003; BIOC (Società Italiana di Biochimica Clinica e Biologia Molecolare
- Belpinati F. et al. “Geni modificatori in fibrosi cistica” V Congresso Clinica), 11-14 ottobre 2005, Roma;
Nazionale S.I.G.U. – 5° Congresso Nazionale S.I.G.U. Verona 24- - Tomaiuolo R. et al. “Screening di varianti geniche di geni modula-
27 settembre 2002; tori in pazienti con fibrosi cistica con fenotipo epatico” Poster - 37°
- Belpinati F. et al. “Geni modificatori del fenotipo polmonare in Fi- Congresso Nazionale Società It. Biochimica Clinica e Biologia Mo-
brosi Cistica” 6° Congresso Nazionale S.I.G.U. Verona 24-27 set- lecolare Clinica, Roma 11-14 Ott. 2005
tembre 2003; - Cardillo G. et al. “Varianti geniche di SLC26A3 in pazienti con fi-
- Gambardella S. et el. “CAP70: nuovo gene modificatore del fenoti- brosi cistica con mutazioni non note nel gene-malattia” Poster - 37°
po nella Fibrosi Cistica?” 7° Congresso Nazionale S.I.G.U. 2004 Congresso Nazionale Società It. Biochimica Clinica e Biologia Mo-
lecolare Clinica, Roma 11-14 Ott. 2005
• • FFC Project#5/2003 “Molecular pathology of CFTR pre-mRNA - Tomaiuolo R. et al. “Screening of large rearrangements in the CFTR
splicing. Diagnostic and therapeutic aspects” Franco Pagani (IC- gene in cystic fibrosis patients from Southern Italy” 15th Internation-
GEB – Trieste) al Conference on Laboratory Medicine and 12h European Confer-
Publications ence of Clinical Molecular Biology, 11-12 novembre 2005, Napoli;
- Buratti E. et al. “Nuclear factor TDP-43 Ninds to the Polymorphic - Tomaiuolo R. et al. “Screening di macrodelezioni del gene CFTR in
TG Repeats in CFTR Intron 8 and Causes Skipping of Exon: A Func- pazienti CF” IX Congresso Nazionale S.I.G.U. – Lido di Ve nezia –
tional Link with Disease Penetrance” Am. J. Hum. Genet. 74:1322- 8-10 novembre 2006
1325, 2004 - Raia V. et al. “La mutazione D1152H si associa a forme non clas-
- Amaral M. D. et al. “Quantitative methods for the analysis of CFTR siche di CF” XII Congresso italiano della Fibrosi Cistica, Firenze,
transcripts/splicing variants” Journal of Cystic Fibrosis 3 (2004) 17- 23-25 novembre 2006
23;
- Zuccatto E. et al. “An Intronic Polypyrimidine-rich Element Down- • • FFC Project#7/2004 “The Cystic Fibrosis mutation spectra in Italy:
stream of the Donor Site Modulates Cystic Fibrosis Transmembrane regional distribution and the European framework” Alberto Piazza
Conductance Regulator Exon 9 Alternative Splicing” The Journal (Dipart. Genetica e Biochimica - Univ. Torino)
of Biological Chemistry – Vol 279, No. 17, Issue of April 23, pp. Abstracts
16980-16988, 2004 - Riccardino F. et al. “Geografia (e storia) delle mutazioni della Fibro-
- Pagani F. et al. “Synonumys mutations in CFTR exon 12 affect splic- si Cistica: l’Italia in un contesto europeo” 8° Congresso Nazionale
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distribution” Journal of Cystic Fibrosis 4 (2005) S3-S10;
• • FFC Project# 6/2003 “Assessing the possible utilization of CFTR-
M470V genotyping for CF risk determination” Pierfranco Pignatti • • FFC Project# 8/2004 “CF: characterization of the unknown muta-
(Ist. Biol. Genetica – Dip. Materno Infantile - Univ. Verona), Carlo tions in Italian patients and assessment of their pathogenic role”
Castellani (Centro FC – Ospedale Civile Maggiore - Verona), Gui- Maria Cristina Rosatelli, (Dipart. Scienze Biom. e Biotecn. Lab. Ge-
do Modiano (Dipart. Biologia “E. Calef” Università di Roma -Tor netica Molecolare - Univ. Cagliari), Franca Dagna Bricarelli (Lab.
Vergata) Genetica Umana - Osp. Galliera Genova), Alberto Bonizzato (Cen-
Publications tro FC – Ospedale Civile Maggiore – Verona), Manuela Seia (Lab.
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Most variants are associated with the M470 allele in several Eu- Genetica Medica - Univ. Trieste)
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Cf mutations with the M470 allele” Journal of Cystic Fibrosis 6 fibrosis mutations in Sardinia: implications for population screen-
(2007) 15 – 22. ing” J. Mol Diagn. 2006 Sep; 8(4):499-503
Abstracts
- Pignatti P. F. et al “Assessing the possible utilization of CFTR-M470V • • FFC Project#9/2004 “Selection and functional characterization
genotyping for CF risk determination” Congresso ASHG 26 – 30 ot- of CFTR intronic sequence variations potentially causing atypical
tobre 2004; forms of CF: modulation of CFTR alternative splicing?” Roberto
- Pompei F. et al. “Determinazione del possibile utilizzo del polimor- Strom (Dipart. Biotecnologie Cellulari ed Ematologia - Univ. La Sa-
fismo CFTR-M470V per la determinazione del rischio di Fibrosi Ci- pienza Roma), Serena Quattrucci (Centro FC Regione Lazio, Dipart.
stica” Congresso SIGU 13 – 16 ottobre 2004; Pediatria - Univ. La Sapienza Roma), Fernando Mazzilli (Dipart. Fi-
siopatologia Medica - Univ. La Sapienza Roma)
• • FFC Project#5/2004 “Screening of CFTR gene rearrangements in Publications
Italian CF patients” Giuseppe Castaldo (CEINGE - Biotec. Avanzate - Lucarelli M. et al. “A 96- well formatted method for exon and exon/
s.c.a.r.l. - Univ. Federico II Napoli), Carlo Castellani (Centro FC – intron boundary full sequencing of the CFTR gene” Anal. Biochem.
Ospedale Civile Maggiore – Verona), Cristina Bombieri (Ist. Biol. 2006 Jun 15; 353(2): 226-35
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687 – 689;
- Salvatore D. et al. “Cystic fibrosis presenting as metabolic alkalosis • • FFC Project#10/2004 “Genome-wide identification of target genes
in a boy with the rare D579G mutation” Journal of Cystic Fibrosis 3 for the design of non-conventional antibiotics against cystic fibro-
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- Tomaiuolo R. et al. “Epidemiology and a novel procedure for large Biotecnologie - Università di Milano)
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tients: a multicentric Italian study” J Cyst Fibrosis 7 (2008) 347–351 - Rusmini R. et al. “A shotgun antisense approach to the identification
Abstracts of novel essential genes in Pseudomonas aeruginosa” BMC Micro-
- Bombieri C. et al. “Ricerca di riarrangiamenti del gene CFTR in pa- biol. 2014 Feb 5;14:24
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13-15 ottobre 2004, Pisa; • • FFC Project#14/2005 “New approaches for noninvasive prenatal
- Bombieri C. et al. “Screening of CFTR gene rearrangements in Ital- diagnosis of cystic fibrosis by fetal DNA analysis in maternal plas-
ian CF patients” Poster: Molecular Basis of Mendellan Disorder – ma” Laura Cremonesi (Unità di Genomica per diagnosi di patologie

73
umane - Fond. Centro San Raffaele del Monte Tabor, Milano), Ga- Publications
briella Restagno (S.S. di Diagnostica Molecolare e Test genetici inte- - Baralle M. et al. “Influence of Friedrich Ataxia GAA noncoding re-
grati - Dip. Patologia Clinica dell’ A.O.O.I.R.M. – S. Anna, Torino), peat expansion on Pre-mRNA processing” Am J Hum Genet 83, 77-
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Publications 28, June 2008, 3850-3860.
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designed to improve sensistivity for the identification of fetal pater- in severe factor VII deficiency” Blood, 111, 5, 2681-4.
nally inherited sequences in maternal plasma” Clin Chem Lab Med
2009, 47:818-823 • • FFC Project#3/2008 “Genetic factors influencing pulmonary dis-
- Mari C. et al. “Application of pyrosequencing to the identification ease in Cystic Fibrosis (CF) patients” Paolo Gasparini (Dip. Scienze
of sequence variations in the cystic fibrosis transmembrane conduc- dello Sviluppo e Riproduttive - Università di Trieste), Giulio Cabrini
tance regulator gene.” Clin Chem Lab Med 2009; 47:1051-4 (Lab. Patologia Molecolare - Azienda Ospedaliero - Universitaria -
Verona)
• • FFC Project#15/2005 “Splicing Affecting Genomic Variants in Publications
CFTR: Diagnostic and Therapeutic Aspects” Franco Pagani (ICGEB, - Crovella S. et al. “A polymorphism in the 5’ UTR of the DEFB1 gene
Trieste) is associated with the lung phenotype in F208del homozygous Ital-
Publications ian cystic fibrosis patients” Clin Chem Lab Med 2011;49(1):49-54
- Youhna M. A. et al. “TDP43 depletion rescues aberrant CFTR exon
9 skipping” FEBS Letters 580 (2006) 1339-1344. • • FFC Project#4/2008 “Search of novel regulatory elements in the
- Raponi M. et al. “Reduced splicing efficiency induced by synony- promoter region of CFTR gene” Pietro Pucci (CEINGE - Biotec.
mous substitutions may generate a substrate for natural selection of Avanzate s.c.a.r.l. - Univ. Federico II Napoli)
new splicing isoforms: the case of CFTR exon 12” Nucleic Acids Publications
Research, 2007, Vol. 35, No. 2, pp. 606-613 - Giordano S. et al. “Molecular and functional analysis of the large 5’
promoter region of CFTR gene revealed pathogenic mutations in CF
• • FFC Project#5/2006 “Mechanisms of recruitment of adult bone and CFTR-related disorders” J Mol Diagn. 2013 May;15(3):331-40
marrow-derived cells to normal and cystic fibrosis airway epithe- Abstracts
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- Eisenhauer P. et al. “Endogenous distal airway progenitor cells, lung Conference, Milano, June 22-25, 2009.
mechanics, and disproportionate lobar growth following long-term - Lo Presti A. et al. “Ricerca di mutazioni nel promotore del gene
post-pneumonectomy in mice” Stem Cells 2013 Jul;31(7):1330-9 CFTR in soggetti affetti da Fibrosi Cistica” XII Congresso Nazionale
di Genetica Umana: - SIGU - Torino, 8th -11th November 2009
• • FFC Project#24/2006 “Characterization of the unknown mutations - Iannone C et al “Identification of novel CFTR expression regulatory
in Italian patients and assessment of their pathogenic role: a pre- elements” ITPA 2010 - Florence, 9 th -12 th June 2010
requisite for prevention of Cystic Fibrosis by carrier screening and - Giordano S. et al. “Il ruolo del promotore del gene CFTR: da ele-
prenatal diagnosis” Maria Cristina Rosatelli, (Dipart. Scienze Biom. mento regolativo a possibile protagonista della patogenesi della
e Biotecn. Lab. Genetica Molecolare - Univ. Cagliari), M. Baffico malattia” 42° Congresso Nazionale SIBioC. Riassunti Poster Biochi-
(Ospedali Galliera, Laboratorio di Genetica, Genova), Carlo Castel- mica Clinica, 2010, vol. 34, n. 5, pag 419, n°061 - Rome, 5th – 8th
lani (Centro FC – Ospedale Civile Maggiore - Verona), Manuela Seia October 2010
(Lab. Genetica Molecolare ICP – Milano)
Publications • • FFC Project# 5/2008 “Feasibility of a screening program for the pre-
- Faa V. et al. “A Synonymous Mutation in the CFTR Gene Causes an conceptional identification of Cystic Fibrosis carriers in Sardinian
Aberrant Splicing in an Italian Affected by a Mild Form of Cystic population” Maria Cristina Rosatelli, (Dipart. Scienze Biom. e Bio-
Fibrosis” J Mol Diagn. 2010 May;12(3):380-3. Epub 2010 Feb 26 tecn. Lab. Genetica Molecolare - Univ. Cagliari)
Publications
• • FFC Project#19/2007 “Molecular analysis of genes encoding CFTR - Faa V. et al. “A Synonymous Mutation in the CFTR Gene Causes
interactors of SLC26 family in CF patients” Giuseppe Castaldo (CE- Aberrant Splicing in an Italian Patient Affected by a Mild Form of
INGE - Biotec. Avanzate s.c.a.r.l. - Univ. Federico II Napoli) Cystic Fibrosis” J. Mol Diagn. 2010 May; 12(3):380-383
Publications - Coiana A. et al. “Preconceptional identification of cystic fibrosis car-
- Elce A. et al. “Three novel CFTR polymorphic repeats improve segre- riers in the Sardinian population: a pilot screening program”, J Cyst
gation analysis for cystic fibrosis” Clin Chem. 2009 Jul;55(7):1372-9 Fibros. 2011 May;10(3):207-11
- Amato F. et al. “Extensive molecular analysis of patients bearing
CFTR-related disorders” J Mol Diagn. 2012 Jan;14(1):81-9. Epub • • FFC Project# 9/2009 “Molecular pathology of the pre-mRNA splic-
2011 Oct 20. ing machinery in cystic fibrosis: mechanistic aspects and therapeu-
- Tomaiuolo R. et al. “An MBL2 haplotype and ABCB4 variants modu- tic approaches” Franco Pagani (International Centre for Genetic En-
late the risk of liver disease in cystic fibrosis patients: a multicentre gineering and Biotechnology, ICGEB, Trieste)
study.” Dig Liver Dis. 2009 Nov;41(11):817-22. Epub 2009 May 20. Publications
Abstracts - Goina E. et al. “Approaches to study CFTR pre-mRNA splicing de-
- Elce A. et al. “Direct sequencing of CSTs in Cystic Fibrosis patients fects” in Amaral MD & Kunzelmann K (Ed.),Cystic Fibrosis, Methods
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- Tomaiuolo R. et al. “Molecular analysis of genes encoding CFTR - Alanis E. F. et al. “An exon-specific U1 small nuclear RNA (snRNA)
interactors of SLC26 family in CF patients: preliminary results” 13th strategy to correct splicing defects” Hum Mol Genet. 2012 Jun
Italian Cystic Fibrosis Conference, Milan, 30 Nov. – 2 Dec. 2007, J. 1;21(11):2389-98
Cyst Fibrosis 2008; 7, suppl. 3: pp. S12-S13 Abstracts
- Elce A. et al. “L’analisi di tre nuovi marcatori polimorfici del gene CFTR - Alanis E. F. et al. “Shift U1 snRNAs Targeted to an Intronic Splicing
rende più efficiente l’analisi molecolare indiretta della fibrosi cistica” Silencer correct aberrant CFTR exon 12 skipping” 8th European Cys-
XI Congresso nazionale SIGU, 23-25 novembre 2008, Genova tic Fibrosis Society Basic Science Conference, Tirrenia, Italy, Mar.-
- Elce A. et al. “La caratterizzazione di tre nuovi polimorfismi nel Apr. 2011
gene CFTR permette il potenziamento dell’analisi di linkare nella - Alanis E. F. et al. “Shift U1 snRNAs targeting to ISS in splicing correc-
fibrosi cistica” XIV Congresso italiano della fibrosi cistica – IV Con- tion” 2nd International EURASNET Conference on Alternative Splic-
gresso SIFC, Torino 27-29 novembre 2008 ing, Granada, Spain, Feb.-Mar. 2011
- Alanis E. F. et al. “Defective Donor Splice Sites: Molecular analysis
• • FFC Project#20/2007 “Evaluation of desease causing mutations in and therapeutic approaches” EURASNET Focus Meeting on RNA
CFTR co-transcriptional splicing units: diagnostic and therapeutic Mis-Splicing, Cambridge, UK, Churchill College, Univ. Of Cam-
aspects” Franco Pagani (ICGEB – Trieste) bridge, Jul. 2010

74
• • FFC Project#3/2010 “An induced pluripotent stem cell (iPS)-based • • FFC Project# 8/2011 “A field study in an area of extensive carrier
approach for the repopulation and phenotypic correction of cystic screening for cystic fibrosis” Carlo Castellani (Centro Regionale FC,
fibrosis airway epithelium” Roberto Loi (Dip. Scienze Biomediche, Azienda Ospedaliera Universitaria,Verona), Luigi Picci (Clinica Pe-
Università di Cagliari) diatrica, Azienda Ospedaliera, Padova)
Abstracts Abstracts
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duced pluripotent stem cells (iPSCs) from airway epithelium” 36th cystic fibrosis: a complex relationship” Presentazione a European
European Cystic Fibrosis Conference (ECFC), Lisboa, 12-15 June, Society of Human Genetics Conference, Milan 2014
2013 - Castellani C. et al. Poster “Population carrier screening reduces
dramatically Cf incidence: evidence from a twenty years’ experi-
• • FFC Project#6/2011 “CFTR mRNA analysis as a key step to under- ence” 28th North American Cf Conference, Atlanta October 9-11
stand the role of CFTR gene mutations in cystic fibrosis disease 2014
expression” Stefano Duga (Dip. Biologia e Genetica per le Scienze - Castellani C. et al. Poster “Population carrier screening impairs
Mediche, Università di Milano) positive predictive value of CF newborn screening: evidence from
Publications a twenty years’ experience” 28th North American CF Conference,
- Costantino L. et al. “Fine characterization of the recurrent c.1584 Atlanta October 9-11 2014
+18672A>G deep-intronic mutation in the cystic fibrosis transmem-
brane conductance regulator gene” Am J Respir Cell Mol Biol. 2013 • • FFC Project# 9/2011 “Cystic fibrosis: to screen or not to screen?
May;48(5):619-25 Involving citizens’ jury in decision on carrier screening” Paola
Abstracts Mosconi (Ist. Ricerche Farmacologiche Mario Negri, Lab. for Medi-
- Rusconi D. et al. “Fine characterization of the recurrent c1584+ cal Research and Consumer Involvement), Carlo Castellani (Centro
18672A>G deep-intronic mutationin the CFTR gene” European Hu- Regionale FC, Azienda Ospedaliera Universitaria, Verona)
man Genetics Conference 2012 Publications
- Mosconi A. et al. “Cystic fibrosis: to screen or not to screen? Involv-
• • FFC Project#7/2011 “New strategies for clinical application of non- ing a Citizens’ jury in decisions on screening carrier” Health Expec-
invasive prenatal diagnosis of cystic fibrosis based on the analysis tations doi:10.1111/hex.12261
of fetal mutated alleles in maternal plasma” Maurizio Ferrari (Lab.
Biologia Clinica Molecolare e Citogenetica, Università Vita-Salute • • FFC Project#9/2014 “Cystic fibrosis modifier genes related to Pseu-
HSR, Milano), Marina Cretich (Ist. di Chimica del Riconoscimento domonas aeruginosa lung disease” Alessandra Bragonzi (Unità di
Molecolare, CNR, Milano) Infezioni e Fibrosi cistica, Divisione di Immunologia, Trapianti e Ma-
Abstracts lattie infettive, Istituto Scientifico San Raffaele, Milano), Iraqi Fuad
- Galbiati S. et al. “Non-invasive prenatal diagnosis of genetic dis- (Clinical Microbiology and Immunology, Tel Aviv University)
eases by advanced technologies” 3rd Congress of the European So- Publications
ciety of Predictive Medicine (EUSPM), 9th- 10th March 2013, Riolo - Lorè NI. et al. “Host genetic diversity influences the severity of Pseu-
Terme (RA), Italy domonas aeruginosa pneumonia in the Collaborative Cross mice”
- Galbiati S. et al. “Non-invasive prenatal diagnosis of genetic dis- BMC Genet. 2015 Aug 28;16:106
eases by advanced technologies” Clinical Biochemistry (2012) Abstracts
doi:10.1016/j.clinbiochem. 2013.05.030 - Lorè NI. et al. “Host genotype influences Pseudomonas aeruginosa
- Galbiati S. et al. “Noninvasive prenatal diagnosis of cystic fibrosis” susceptibility in the Collaborative Cross and inbred mouse popula-
EUROMEDLAB, Milano, 19-23 May 2013 tions”, 28th Annual North American Cystic Fibrosis Conference –
- Galbiati S. et al. “Fetal DNA in maternal plasma: a noninvasive tool Georgia, October 9-11, 2014
for prenatal diagnosis of genetic diseases by COLD-PCR and In- - Cigana C. et al. “Pseudomonas aeruginosa adaptation as a potential
novative Microarray Substrates” International Meeting on Cell-free risk factor to the progression of cystic fibrosis airway disease in mice
DNA, Copenhagen, 2013, 20th- 21st and humans”, 38th ECFS Conference, Brussels, Belgium, 10-13 June
2015

3. MICROBIOLOGY / INFECTION
Microbiologia / Infezione
• • FFC Project#4/2002 “Taxonomy and virulence markers of B. cepa- Pseudomonas aeruginosa in a chronic lung infection model for
cia strains associated with respiratory infections in patients with Cystic Fibrosis” Alessandra Bragonzi (Istituto per il trattamento
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76
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Univ. Sacro Cuore – Roma), Mauro Nicoletti (Dipart. Scienze Sanità colari e Biotecnologie - Univ. Milano), Alessandra Bragonzi (Istituto
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cistica” Congresso Società Italiana di Microbiologia (SIM), Genova Bragonzi (Ist. per il Trattamento speriment. della FC - Osp. San Raf-
15-18 ottobre 2006. faele – Milano)
Publications
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Università di Milano), Laura Cipolla (Dipartimento Biotecnologie D’Annunzio” Pescara), Ersilia Fiscarelli (Osp. Pediatrico “Bambin
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genomics of P. aeruginosa RP73: defining host-bacterial interactions cyclic-di-GMP affects biofilm formation in Escherichia coli”, Corto-
in a persistent lifestyle” NACFC 2012, Orlando, Florida, USA na, Procarioti 2010, 14-15 April 2010, Cortona (AR) (oral presenta-
tion)
• • FFC Project#11/2009 “Community-acquired MRSA and hospital- - Antoniani D. et al. “Discovery of novel inhibitors of bacterial bio-
acquired MRSA in cystic fibrosis patients: a multicentre study film formation targeting enzymes involved in the metabolism of the
regarding antibiotic susceptibility, epidemiology, natural history second messenger cyclicdi- GMP” 14th International Biotechnology
and clinical relevance” Silvia Campana (Dipart. Pediatria – Centro Symposium and Exhibition, 14-18 September 2010, Rimini (oral
Fibrosi Cistica - Ospedale Meyer – Firenze) presentation)

81
- Stelitano V. et al. “Characterization of proteins from Pseudomonas Group-15th Annual Meeting, Praga (Repubblica Ceca), 13-16 Aprile
aeruginosa involved in c-di-GMP turnover” 36th FEBS Congress 2011.
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(oral presentation) Burkholderia cenocepacia” I discepoli di Adriano Buzzati-Traverso:
- Stelitano V. et al. “In vitro characterization of the two HD-GYP la Genetica Molecolare tra Università e CNR, Pavia, 24 Maggio
phosphodiesterases from Pseudomonas aeruginosa involved in c-di- 2011.
GMP-dependent biofilm formation” EMBO Meeting 2011, Vienna - Buroni S. et al., “Deciphering the role of RND efflux transporters in
(Austria) 10-13 September 2011 (poster presentation) Burkholderia cenocepacia” FEMS 2011, 4th Congress of European
- Stelitano V. et al. “In vitro characterization of the two HD-GYP Microbiologists, Geneva (Switzerland), 26-30 Giugno 2011.
phosphodiesterases from Pseudomonas aeruginosa involved in c- - Bazzini S. et al., “New insight into Burkholderia cenocepacia
di-GMP-dependent biofilm formation” 29° SIMGBM meeting 20-23 RND efflux systems” SIMGBM 29th Annual Meeting, Pisa, 21-23
September 2011, Pisa (poster presentation) Settembre 2011.
- Rinaldo S. et al. “Inhibition of bacterial biofilms: new molecular - Perrin E. et al., “In silico analysis of RND superfamily in the
strategies targeting diguanylate cyclase” 29° SIMGBM meeting 20- Burkholderia genus” SIMGBM 29th Annual Meeting, Pisa, 21-23
23 September 2011, Pisa (poster presentation) Settembre 2011.
- Papaleo M.C. et al., “Analyzing the role of RND efflux transporters
• • FFC Project#14/2009 “In vivo characterization of a novel branched in Burkholderia cenocepacia: a proteomic analysis” SIMGBM 29th
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Biologica, Università di Siena) Sapienza, Roma
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- Pini A. et al. “A novel tetrabranched antimicrobial peptide that neu- • • FFC Project#16/2009 “In vitro and in vivo studies of novel antimi-
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- Pini A. et al. “A novel tetrabranched antimicrobial peptide that neu- lulare - The Medical School University of Newcastle)
tralizes bacterial lipopolysaccharide and prevents septic shock in Publications
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Peptides February 28-March5 2010, Ventura, CA, USA thiourea hydrochloride and novel structurally related compounds
- Pini A. et al. “A novel tetrabranched antimicrobial peptide that neu- against multi-drug resistant bacteria including Pseudomonas aeru-
tralizes bacterial lipopolysaccharide and prevents septic shock in ginosa and Burkholderia cepacia complex” Int J Antimicrob Agents.
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tralizes bacterial lipopolysaccharide and prevents septic shock in target in cystic fibrosis pathogens?” In: Thorax: British Thoracic Soci-
vivo” 31st European Peptide Symposium, 5-7 September 2010, Co- ety Winter Meeting. 2010, Westminster, UK: BMJ Group
penhagen, DK - Carnell S. et al., “The bacterial cytoskeleton – a new antimicrobial
target in cystic fibrosis pathogens?” International Burkholderia cepa-
• • FFC Project#15/2009 “The role of RND transporters in Burkhold- cia Working Group Annual Meeting, Prague, April 2011
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- Buroni S. et al., “The role of RND efflux transporters in Burkholderia • • FFC Project#10/2010 “Exploring thermostable quorum quenching
cenocepacia life” International Burkholderia cepacia Working lactonases to counteract bacterial infections in cystic fibrosis” Gi-

82
useppe Manco (Istituto di Biochimica delle Proteine CNR, Napoli); – 15th annual meeting. Praga, 13-16 Aprile 2011
Davide Andrenacci (Istituto di Genetica e Biofisica CNR, Napoli) - Longo F. et al., “Picking up novel Pseudomonas aeruginosa
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- Mandrich L. et al. “Exploring thermostable quorum quenching lac- Burkholderia cenocepacia. FEMS 2011- 4th Congress of European
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onases (5PON), July 15-18 2012, Columbus, Ohio, USA. (Poster)
P56 • • FFC Project #10/2011 “Pulmonary delivery of inhaled peptido-
- Porzio E. et al. “Quorum quenching activity of archaeal lactonases mimetic as novel antibiotics to control Pseudomonas aeruginosa
against Pseudomonas aeruginosa in a Drosophila infection mode” infection in murine models” Alessandra Bragonzi (Infection and
2015 1 International Symposium on Quorum Sensing Inhibition. Cystic Fibrosis Unit, Division of Immunology, Transplantation and
Santiago de Compostela, Spain Infectious Disease, San Raffaele Scientific Institut, Milano), Daniel
Obrecht (Polyphor Ltd, Switzerland)
• • FFC Project #13/2010 “Pseudomonas aeruginosa lipopolysaccha- Abstracts
ride cell surface transport is a target process for developing new - Bragonzi A. et al., “Evaluation Of Efficacy of POL7001 Against Pseu-
antimicrobials” Alessandra Polissi (Dip. Biotecnologie e Bioscien- domonas aeruginosa in Lung Infection Models” 35th European Cys-
ze, Università Milano-Bicocca), Martino Bolognesi (Dip. Scienze tic Fibrosis Conference- 6-9 June 2012, Dublin
Biomolecolari e Biotecnologie, Università di Milano), Gianni Dehò
(Dip. Scienze Biomolecolari e Biotecnologie, Università di Milano), • • FFC Project #11/2011 “Design, synthesis, in vitro biological evalua-
Francesco Peri (Dip. Biotecnologie e Bioscienze, Università Milano- tion and anti-biofilm activity of new beta-lactam and linezolid-like
Bicocca) Cristina De Castro (Dip. Chimica Organica e Biochimica, compounds as potential antibacterial agents against Staphylococ-
Università di Napoli), Luca De Gioia (Dip. Scienze Biomolecolari e cus aureus infections in cystic fibrosis patients” Clementina Elvezia
Biotecnologie, Università di Milano) Cocuzza (Dip. Medicina Clinica e Prevenzione, Università di Mila-
Publications no-Bicocca), Lisa Cariani (Fond. IRCCS Ca’ Granda, Osp. Maggio-
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betalactams as antibacterial agents: facing antioxidant activity of N-
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holderia genus” Future Microbiol. 2013 Jul;8:923-37 inhalable Niclosamide and Flucytosine formulations” Livia Leoni
(Dip. di Scienze, Università “Roma Tre”), Francesca Ungaro (Dip. di
• • FFC Project#12/2012 “Naturally occurring antimicrobials to Farmacia, Università di Napoli Federico II), Francesco Imperi (Dip.
counteract lung infections in cystic fibrosis patients: Cecropin A- di Biologia e Biotecnologia, Università “La Sapienza”, Roma), Ersilia
Melittin (CA-M) hybrid peptides and polymixins” Alba Silipo (Dip. Fiscarelli (Ospedale e Ist. di ricerca “Bambin Gesù”, Lab. Microbio-
Scienze Chimiche, Università “Federico II”, Napoli), Giovanni Di logico fibrosi cistica, Rome)
Bonaventura (Dip. Scienze Biomediche, Università Chieti-Pescara) Publications
Publications - D’Angelo I. et al. “Improving the efficacy of inhaled drugs in cystic
- Di Lorenzo F. et al. “Persistent cystic fibrosis isolate Pseudomo- fibrosis: challenges and emerging drug delivery strategies” Adv Drug
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Società Italiana di Spettroscopia Neutronica (SISN), Milano 11-12 motes pyoverdine-dependent iron uptake and virulence in Pseudo-
Settembre 2013. monas aeruginosa” 1st Italian CF Young Investigator Meeting January
- Silipo A. “STD NMR as a tool for studying protein-ligand interac- 16th - 17th 2015, Rome, Italy
tions”, PhD Lecture in Gliwice, Department of Organic Chemistry, - Costabile G., d’Angelo I., Miro A. et al. “Inhalable hyaluronan/man-
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France, COST Training School nell’ambito della COST Action - Costabile G., d’Angelo I., Mitidieri E. et al. “Repositioning 5-flucy-
BM1003. http://www.cost-bm1003.info/ tosine for anti-virulence therapy of Pseudomonas aeruginosa lung
infections: development of inhalable hyaluronan/ mannitol dry pow-
• • FFC Project#13/2012 “Role of high affinity zinc transporters in ders Micro and Nanotechnologies to overcome biological barri-
Pseudomonas aeruginosa ability to colonize the inflamed cystic ers” Thematic workshop of Controlled Release Society Italy Chapter.
fibrosis lung” Andrea Battistoni (Dip. Biologia, Università Tor Ver- Naples 2015, November 12-14 th
gata, Roma) - Costabile I., d’Angelo I., D’Emmanuele R. et al. “Drug reposition for
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- D’Orazio M. et al. “Pseudomonas aeruginosa capability to colonize development of inhalable formulations” XXIII National Meeting on
the CF lung may be favored by its remarkable ability to recruit zinc Medicinal Chemistry, Salerno, 2015 September 6-9
under conditions of limited metal availability” Journal of Cystic Fi-
brosis Suppl Goteborg 13, S3 • • FFC Project#11/2013 “Inhalable dry powders for chemically-mod-
- D’Orazio M. et al. “The capability of Pseudomonas aeruginosa to ified human Cationic AntiMicrobial Peptides (CAMPs): moving to-
recruit zinc under conditions of limited metal availability is affect- ward in vivo application” Eugenio Notomista (Dip. Biologia, Uni-
ed by inactivation of the ZnuABC transporter” Metallomics. 2015 versità di Napoli “Federico II”), Francesca Ungaro (Dip. di Farmacia,
Jun;7(6):1023-35 Università di Napoli Federico II)
Abstracts Publications
- D’Orazio M. et al. “Pseudomonas aeruginosa capability to colonize - d’Angelo I. et al. “Improving the efficacy of inhaled drugs in cystic fi-
the CF lung may be favored by its remarkable ability to recruit zinc brosis: Challenges and emerging drug delivery strategies” Adv Drug
under conditions of limited metal availability” Poster presented at Deliv Rev 2014 Aug 30;75C:92-111
the ECFS 2014 Meeting, Goteborg Abstracts
- D’Orazio M. et al. “Involvement of Enzymes of the Protein Disul- - d’Angelo I. et al. “Nano-Embedded Microparticles for Lung Delivery
phide Isomerase Family in the Interaction of Burkholderia ceno- of Antimicrobial Peptides against P. Aeruginosa Infections: Over-
cepacia with Epithelial Cells” ECFS Basic Science Conference, coming Lung Barriers” In: 2nd International Conference on Nan-
Malaga 2013 otechnology in Medicine, University College London, Royal Free
Hospital Campus, United Kingdom 26-28 February 2014. Selected
• • FFC Project#17/2012 “The role of vascular endothelium in cystic as oral presentation
fibrosis inflammation” Mario Romano (Dip. Scienze Biomediche, - d’Angelo I. et al. “Inhable dry powders for local administration of
Università Chieti-Pescara, Lab. Medicina Molecolare), Licia Totani antimicrobial peptides against P. aeruginosa: overcoming lung barri-
(Dip. Farmacologia Traslazionale, Consorzio “Mario Negri” Sud, ers” International Conference and Workshop on Biological Barriers,
Chieti), Marco Marchisio (Dip. Medicina e Scienze dell’Invecchia- 16-21 February, 2014, Saarland University, Germany
mento, Università Chieti-Pescara), Paolo Moretti (Centro FC, Tera- - Pane K., Cafaro V., Avitabile A. et al. “Development of new carrier
mo) protein for AMPs production” 5th International Meeting on Anti-mi-
Publications crobial Peptides, Burlington House, London. 7-8 September, 2015
- Pierdomenico AM et al. “MicroRNA-181b regulates ALX/FPR2 re-
ceptor expression” J Biol Chem. 2015 Feb 6;290(6):3592-600 • • FFC Project#12/2013 “Preclinical development of the antimicrobial
peptide M33 and onset of regulatory procedures for clinical trials”
• • FFC Project#8/2013 “Exploring pyrazinamide derivatives as novel Alessandro Pini (Dip. di Biotecnologie Mediche, Università di Siena)
Pseudomonas aeruginosa inhibitors: unexploited antibacterial Publications
molecules for a new antibiotics target” Federica Briani (Dip. di - Brunetti J. et al. “A Novel Phage-Library-Selected Peptide Inhibits
Bioscienze-Università degli Studi di Milano) Human TNF-• Binding to Its Receptors» Molecules 2014: 19:7255-
Abstracts 7268
- Bergamini G. et al. “Azitromycin effect on lung inflammation in- - FalcianiC. et al. «Site-specific pegylation of an antimicrobial peptide
duced by Pseudomonas aeruginosa released proteases as shown by increases resistance to Pseudomonas aeruginosa elastase» Amino-
in vivo imaging in IL-8 transiently transgenized mice” 28th Annual Acids 2014; 45(5):1403-1407
North American Cystic Fibrosis Conference, Atlanta, October 9-11, - Brunetti J. et al. “In vitro and in vivo efficacy, toxicity, bio-distribu-
2014 tion and resistance selection of a novel antibacterial drug candi-
date” Sci Rep. 2016 May 12;6:26077. doi: 10.1038/srep26077
• • FFC Project#10/2013 “Anti-virulence therapy against Pseudomonas - Ceccherini F. et al. “Antimicrobial activity of levofloxacin-M33 pep-

85
tide conjugation or combination” MedChemComm 2016,7,258 Publications
Abstracts - d’Angelo I. et al. “Overcoming barriers in Pseudomonas aeruginosa
- Brunetti J. et al. “A novel synthetic antimicrobial peptide.A new lung infections: Engineered nanoparticles for local delivery of a cat-
weapon for multidrug resistant bacteria?” 14th Naples Workshop ionic antimicrobial peptide” Colloids Surf B Biointerfaces. 2015 Aug
on Bioactive Peptides, June 12-14, 2014 22;135:717-725
- Roscia G. et al. “In vitro and in vivo characterization of a novel Abstracts
synthetic antimicrobial peptide for lung infections and sepsis” 1st - Avitabile A. e al. “The activation peptide of human pepsinogen is an
Italian CF Young Investigator Meeting, January 16th - 17th 2015, antimicrobial peptide” IMAP Meeting 2015
Rome, Italy - Pane K. et al. “Development of new carrier protein for AMPs pro-
duction” IMAP Meeting 2015
• • FFC Project#10/2014 “Investigating the airway microbiome in
cystic fibrosis patients with a severe decline in lung function: an • • FFC Project#16/2014 “Lactoferrin-loaded niosomes in reducing
opportunity for a personalized microbiomebased therapy” Bevi- inflammation and infection of cystic fibrosis airways” Francesca
vino Annamaria (Technical Unit for Sustainable Development and Berlutti (Dip. Sanità Pubblica e Malattie infettive, Università “La Sa-
Innovation of Agro-Indsutrial System, ENEA Casaccia Research pienza”, Roma)
Center, Lab. Microbiology, Rome), Alessio Mengoni (Dip. Biologia, Abstracts
Università di Firenze), Giovanni Taccetti (Dip. di pediatria, Centro - Valenti P. et al. “Aersolized lactoferrin reduces inflammation and
FC, Ospedale “A. Meyer”, Firenze), Ersilia Vita Fiscarelli (Labora- infection in a mouse model of cystic fibrosis lung infection” XIIth
torio Microbiologia, Ospedale “Bambin Gesù”, Roma), Alessandra International Conference on Lactoferrin, Structure, Function and Ap-
De Alessandri (Dip. di Scienze Pediatriche, Centro FC, Università di plications 2-6 Novembre 2015, Nagoya Japan
Genova, Istituto “G. Gaslini”)
Abstracts • • FFC Project#14/2014 “TRPA1 channels as novel molecular targets
- Bacci G. et al. “Exploring the airway microbiome of cystic fibrosis for anti-inflammatory therapies in CF lung” Francesca Berlutti (Dip.
patients: an opportunity for a personalized microbiome-based ther- Sanità Pubblica e Malattie infettive, Università “La Sapienza”, Roma)
apy” 1st Italian CF Young Investigator Meeting, January 16th - 17th Abstracts
2015, Rome, Italy - Cabrini G. et al. “Intracellular calcium mobilization as amplifier
- Bevivino A. “Taxonomic and functional analysis of the aiarway sam- of the inflammatory response in CF bronchial epithelial cells” 13th
ples from cystic fibrosis patients with lower and higher pulmonary ECFS Basic Science Conference, 30 March – 02 April 2016, Pisa,
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ber 21-23, 2015 Institute Pasteur, Paris - Cabrini G. et al. “Intracellular calcium mobilization and the in-
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tinguish between patients with lower and higher pulmonary func- nual North American Cystic Fibrosis Conference, Orlando, Florida,
tion decline”, 38th ECFS Conference, Brussels, Belgium, 10-13 June October 27–29, 2016
2015
- Bacci G. et al. “Taxonomic and functional metagenomic analysis • • FFC Project#18/2014 “GSH inhalation therapies in CF: how useful,
of sputum samples from stable cf patients with lower and higher how safe? Set-up of a CF murine model for monitoring of inflam-
pulmonary function decline”, NACFC 2015 mation in vivo and assessment of convenient alternatives” Ales-
sandro Corti (Dip. di Ricerca Traslazionale NTMS - Lab. Patologia
• • FFC Project#11/2014 “Development and preclinical testing of a Generale, Università di Pisa)
novel antimicrobial peptide to treat Pseudomonas aeruginosa-in- Abstracts
duced lung infections” Maria Luisa Mangoni (Dip. di Scienze Bio- - Corti A. et al. “Increasing levels of sputum gamma-glutamyltransfer-
chimiche, Università “La Sapienza”, Roma) ase may be a contraindication to glutathione inhalation therapies in
Publications cystic fibrosis” 3rd Joint Meeting of Pathology and Laboratory Medi-
- Cappiello F. et al. “Esculentin-1a-Derived Peptides Promote Clear- cine. 4-6 October 2016 - Montesilvano (Pescara), Italy
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of Cystic Fibrosis Patients and Lung Cell Migration: Biochemical ma-glutamyltransferase in cystic fibrosis airways on glutathione in-
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10.1038/s41598-017-08361-8. Abstracts
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peptide Esculentin-1a(1-21)NH2 and its Diastereomer Esc(1-21)-1c: 2015 5th International Meeting on Antimicrobial Peptides Burling-
Correlation with their antipseudomonal and cytotoxic activity” BBA ton House, London September 7-8, 2015
– Biomembranes 1859 (2017) 2327–2339 - Pane K. et al. “Development of new carrier protein for AMPs pro-
Abstracts duction” IMAP 2015, 5th International Meeting on Antimicrobial
- Luca V. et al. “Anti-Pseudomonal activity of the amphibian antimi- Peptides Burlington House, London September 7-8, 2015
crobial peptide Esculentin (1-21) and plausible mode of action”, - Avitabile A. et al. “The activation peptide of human pepsinogen is an
FISV 2014-XIII Congress (Pisa, 24-27 September) antimicrobial peptide” IMAP 2015, 5th International Meeting on An-
- Mangoni ML et al. “Esculentin-1a(1-21) and its diastereomer: frog timicrobial Peptides, Burlington House, London September 7-8, 2015
skin-derived peptides with anti-Pseudomonal activities” Oral Pre- - Pane K. et al. “A novel carrier protein for AMPs production” 5th
sentation at RegPep Symposium 2016, Rouen July 2016. France Antimicrobial International Meeting on Antimicrobial Peptides, Bur-
- Mangoni ML, McDermott AM, Di YP “Derivatives of the frog-skin lington House 7th-8th September 2015
peptide esculentin-1a with promising activity against infections in- - Verrillo M. et al. “Recombinant production and labelling of peptides
duced by Pseudomonas aeruginosa” Boulder Peptide Symposium, with N-terminal cysteine residue” 15th Naples Workshop on Bioac-
25-28 September, 2017, Boulder Colorado (US) tive Peptides. June 23-25, 2016, Naples, Italy
- Bosso A. et al. “Cryptic anti-microbial peptides in human secretory
• • FFC Project#12/2014 “Inhalable dry powders for chemically-mod- proteins: the case of H11• (235-261).” 15th Naples Workshop on
ified human Cationic AntiMicrobial Peptides (CAMPs): moving to- Bioactive Peptides. June 23-25, 2016, Naples Italy
ward in vivo application” Eugenio Notomista (Dip. di Biologia, Uni- - Pane K. et al. “Novel antimicrobial weapons hidden in human sec-
versità di Napoli “Federico II”), Francesca Ungaro (Dip. di Farmacia, retoma” Altant Conference May 18-20, 2016 Utrecht, Netherlands
Università di Napoli “Federico II”) - Verrillo MV. et al. “Efficient production and labeling of recom-

86
binant peptides endowed with a N-terminal cysteine residue” pathological complexity of Pseudomonas aeruginosa respiratory in-
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- Zanfardino A. et al. “Two new cryptic antimicrobial peptides iden- 7–10 June 2017
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Rome, Italy to unravel the complexity of the lung infections” 14th ECFS Basic
Science Conference, 29 March – 01 April 2017, Albufeira, Portugal
• • FFC Project#21/2014 “Resolvin D1 for Targeting Chronic Lung
Inflammation and Infection in Cystic Fibrosis” Antonio Recchiu- • • FFC Project#12/2015 “Anti-inflammatory and anti-bacterial activ-
ti (Dip. di Scienza Clinica e Sperimentale e Centro di Eccellenza ity of bovine lactoferrin administered by aerosol in airways infec-
sull’Invecchiamento-CeSI, Università “G. d’Annunzio”, Chieti-Pe- tions of pre-clinical wt and CF mouse models” Francesca Berlutti
scara) (Dip. di Salute Pubblica e Malattie Infettive - Università La Sapienza,
Publications Roma)
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mography for high resolution quantitative Fe mapping in inflamed
• • FFC Project#23/2014 “Mechanisms and clinical implications of cells” 13th International Conference on X-Ray Microscopy, 15-19
endothelial dysfunction in cystic fibrosis” Mario Romano (Dip. di August 2016, Oxford, United Kingdom
Scienze Sperimentali e Cliniche, Lab. di Medicina Molecolare, Uni-
versità G. D’Annunzio, Chieti-Pescara) • • FFC Project#14/2015 “Investigating the airway microbiome in
Publications cystic fibrosis patients with a severe decline in lung function: an
- Plebani R, Tripaldi R, Lanuti P et all. “Establishment and long-term opportunity for a personalized microbiome-based therapy” Anna
culture of human cystic fibrosis endothelial cells” Laboratory Inves- Maria Bevivino (Unità Tecnica per lo Sviluppo e Innovazione del
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- Totani L, Plebani R, Piccoli A et all “Mechanisms of endothelial cell le Nuove Tecnologie, Energie e Sviluppo Economico Sostenibile,
dysfunction in cystic fibrosis” Biochimica et Biophysica Acta 2017 Laboratorio di Microbiologia, Centro Ricerche Casaccia, Roma),
Aug 25. pii: S0925-4439(17)30293-4 Alessio Mengoni (Dip. di Biologia, Università di Firenze); Giovanni
Taccetti (Dip. di Pediatria, Centro fibrosi cistica, Firenze), Ersilia Vita
• • FFC Project#24/2014 “The role of Glucocerebrosidase GBA2 in Fiscarelli (Ospedale dei Bambini, Istituto di Ricerca Bambino Gesù,
cystic fibrosis lung inflammation: from molecular mechanism to Lab. di Microbiologia per fibrosi cistica), Alessandra De Alessandri
therapeutic strategies” Sandro Sonnino (Dip. di Biochimica Medica (Centro Fibrosi Cistica, Dip. di Scienze Pediatriche, Pneumologia e
e Medicina Traslazionale, Università di Milano) Allergologia - Istituto G. Gaslini, Genova)
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- Schiumarini D. et al. “Involvment of glycosphingolipid -hydro- Basic Science Conference, 30 March – 02 April 2016, Pisa, Italy
lase in the inflammatory response to Pseudomonas aeruginosa in - Bacci G. et al. “Studio del microbioma delle vie aree FC in pazienti
cystic fibrosis” 39th ECFS Conference, Basilea, 8-11 June 2016 con diverso andamento polmonare” 39th European Cystic Fibrosis
- Riunione dei Giovani Biochimici dell’Area Milanese, Gargnano, Conference, 8 - 11 June 2016, Basel, Switzerland
2016 - 13th ECFS Basic Science Conference, 30 March – 2 April - Bacci G, Armanini F, Taccetti G et all. “Longitudinal metagenomic
2016, Pisa, Italy analysis of the airways of patients with cystic fibrosis to uncover mi-
- Schiumarini D, Loberto N, Bassi R et all. “Pseudomonas aeruginosa crobial signatures of lung disease progression” 40th European Cystic
infection induces alterations in plasma membrane lipid composition Fibrosis Conference, Seville, Spain, 7–10 June 2017
in cystic fibrosis airway cells: molecular mechanisms and therapeu-
tic options for CF lung pathology” 14th ECFS Basic Science Confer- • • FFC Project#16/2015 “Development of metallo-enzyme inhibitors
ence,29 March – 01 April 2017, Albufeira, Portugal to overcome P. aeruginosa antibiotic-resistance in cystic fibrosis
patients” Sandra Gemma (Dipartimento di Biotecnologia, Chimica
• • FFC Project#10/2015 “A CF, IL-8 transgenic mouse model for the e Farmacia - Università di Siena), Jean-Denis Docquier (Dip. di Bio-
in vivo, long-term monitoring of the anti- inflammatory role of tecnologia Medica - Università di Siena)
metallo-protease inhibitors and antibiotics with mechanisms of ac- Publications
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di Patologia e Diagnostica, sezione di Microbiologia - Università di from high-throughput docking to broad-spectrum inhibitors”,
Verona) Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry DOI:
Abstracts 10.3109/14756366.2016.1172575
- Sandri A et all. “Monitoraggio in vivo dell’infiammazione polmona-
re in topi CFTR-/-” 39th European Cystic Fibrosis Conference, 8 – 11 • • FFC Project#17/2015 “Phage therapy against Pseudomonas aeru-
June 2016, Basel, Switzerland ginosa infections in cystic fibrosis patients” Daniela Erica Ghisotti
- Sandri A, Stellari F, Boschi F “Matrix metalloprotease inhibitors as (Dipartimento di Bioscienze - Università degli Studi di Milano)
anti-inflammatory therapy in Pseudomonas aeruginosa lung infec- Abstracts
tion” 14th ECFS Basic Science Conference, 29 March – 1 April - Ghisotti D., Forti F., Briani F. “Phage therapy against Pseudomo-
2017, Albufeira, Portugal nas aeruginosa infections in cystic fibrosis patients” Phage Therapy
World Congress 2016, Parigi, 2-3 giugno 2016
• • FFC Project#11/2015 “Genetically diverse mice as innovative mo-
del for cystic fibrosis” Nicola Ivan Lorè (Divisione di Immunologia, • • FFC Project#19/2015 “Inhalable formulations of new molecules ef-
Trapianti e Malattie Infettive - Istituto Scientifico San Raffaele, Mi- fective against Burkholderia cenocepacia: from in vitro to in vivo
lano) applications” Giovanna Riccardi (Laboratorio di Microbiologia Mo-
Abstracts lecolare, Dipartimento di Biologia e Biotecnologie Lazzaro Spallan-
- Lorè N, Sipione B, Mott R et all. “Host genetic traits influence the zani, Pavia), Francesca Ungaro (Dip. di Farmacia - Università degli
severity of respiratory infections by Pseudomonas aeruginosa” The Studi Federico II, Napoli)
30th Annual North American Cystic Fibrosis Conference, Orlando, Publications
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- Israyilova A, Buroni S, Forneris F et all. “Biochemical Character- treatment of Pseudomonas aeruginosa pulmonary infection” Paolo
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against Burkholderia cenocepacia Infections” PLoS ONE 2016 Nov ca e Virologia - Università di Roma Tre, Roma)
29;11(11):e0167350. doi: 10.1371/ Publications
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cepacia Infections in Cystic Fibrosis Patients: Drug Resistance its Pseudomonas aeruginosa Growth by Targeting Cytochromes”
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- Buroni S., Brackman G., Scoffone VC. et al. “New antivirulence study” Dalton Trans 2017 May 30;46(21):7082-7091
compounds affecting Burkholderia cenocepacia quorum sensing in
vitro and in vivo” XX International Burkholderia cepacia Working • • FFC Project#16/2016 “Phage therapy against Pseudomonas aeru-
Group, Columbus USA, 27-30 Aprile 2016 ginosa infections in cystic fibrosis patients” Daniela Erica Ghisotti
- Scoffone VC, Gislason AS, Hogan AM et all “Fighting burkholderia (Dipartimento di Bioscienze, Università di Milano)
cenocepacia through a new promising bactericidal molecule” 7th Abstracts
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- Scoffone VC, Fumagalli M, Spiga L et all “Molecular investigations monas aeruginosa infections in Cystic Fibrosis patients” Convegno
on the quorum sensing synthase CepI of Burkholderia cenocepacia” SIMGBM, 17-20 Settembre 2017, Palermo
XXXII SIMGBM Congress, September 17-20, 2017, Palermo

4. INFLAMMATION
Infiammazione
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