UNIVERSIDAD DE

GUANAJUATO

Laboratorio de Estructura de
Biomoléculas y CE

Presentan:
LAURA ALEJANDRA LÓPEZ VÁZQUEZ

XIMENA AGUADO GONZALEZ

YADIRA GARNICA SANTILLÁN

 EXTRACCIÓN Y SEPARACIÓN CROMATOGRÁFICA DE LÍPIDOS DE
UNA MUESTRA BIOLÓGICA

Objetivo: Confirmar las propiedades de los lípidos mediante su extracción y separación por
cromatografía en capa fina

Fundamento

A. Extracción de lípidos de una muestra biológica.

Los lípidos son un grupo heterogéneo de sustancias que tienen en común ser insolubles o muy
poco solubles en disoluciones acuosas y solubles en disolventes orgánicos. Por tanto, los
lípidos de una muestra biológica se pueden extraer tratándola con mezclas de
disolventes orgánicos en proporciones variables. La mezcla más común es
cloroformo/metanol/HCl, basada en el método desarrollado por Folch y cols (Folch et al., J
Biol Chem 1957, 226, 497) en proporción 2:1:0,0075 (v/v/v). Los lípidos extraídos se
encontrarán mayoritariamente en la fase clorofórmica y las sustancias hidrosolubles en la fase
acuosa, separándose con facilidad ambas fases por entrifugación. Si tomamos la fase
clorofórmica y eliminamos el cloroformo por evaporación, queda en el tubo el extracto de la
mezcla de lípidos que contiene la muestra biológica de partida.

B. Separación de las distintas especies lipídicas mediante cromatografía en capa fina (TLC)
La cromatografía es una técnica que se utiliza para separar e identificar los componentes de
una mezcla. Se basa en el reparto de cada compuesto entre una fase móvil y una fase
estacionaria. El reparto se produce sobre la fase estacionaria, que tiende a retener el
compuesto por adsorción. La fase móvil discurre a través de la fase estacionaria y tiende a
arrastrarlo (desorción). Los componentes de la mezcla se separan porque responden de forma
distinta a las fuerzas de adsorción/desorción. En la TLC la fase estacionaria es silicagel y la
fase móvil una mezcla de disolventes (eluyente). El eluyente se selecciona de acuerdo con los
lípidos que se desean separar: los lípidos neutros se separan con eluyentes apolares y los
lípidos cargados con eluyentes polares. Cada lípido migra a una distancia característica en
función de su polaridad que le hace identificable al compararlo con patrones. Los patrones
que más comúnmente se suelen utilizar son: 1) fosfatidilcolina (PL), 2) colesterol (CL), 3)
trioleína (TG); y 4) oleato de colesterol (CE) (Fig 3).

Reactivos
- Cloroformo.
- Metanol.
- KCl.
- HCl.
- Ácido acético.
- n-Heptano.
- Eter-diisopropílico.
- Tolueno.
- Patrones de lípidos (PL, CL, TG, EC)

Protocolo
A. Extracción de lípidos
1. Añadir 8 ml de la mezcla de extracción a un tubo de vidrio con la muestra biológica (2-3 mg).
Tapar el tubo.
2. Agitar durante 120 s en el vórtex.
3. Centrifugar durante 10 min a 3000 rpm a 4 ºC.
4. Con una pipeta Pasteur de vidrio trasvasar la fase inferior (fase clorofórmica) a un tubo
de cristal limpio.
5. Reextraer los lípidos de la fase acuosa y de la interfase al añadir otros 4 ml de la mezcla
de extracción. Tapar el tubo y agitar otros 120 seg.
6. Con una pipeta Pasteur de vidrio juntar la fase orgánica a la anteriormente extraída.
7. Añadir a la muestra clorofórmica un volumen de KCl 0,88% (p/v) equivalente a 1/3 de la fase
orgánica. Tapar el tubo y agitar durante 30 seg.
8. Centrifugar durante 10 min a 3 000 rpm.
9. Con la pipeta Pasteur trasvasar la fase inferior a un tubo grueso de vidrio limpio,
teniendo cuidado de no contaminar la muestra con la fase superior.
10. Evaporar el cloroformo en un rotavapor o en un baño de agua caliente. Usar campana de
extracción para evitar intoxicación con el solvente.
11. El extracto lipídico contenido en el tubo de vidrio se guarda tapado y en atmósfera
de nitrógeno a -20 ºC en el congelador.

B. Separación cromatográfica
1. El día anterior, lavar la placa en cloroformo:Metanol:Agua (60:40:10; v/v/v). Antes de iniciar el
experimento:
i. Activar la placa cromatográfica en una estufa a 80-100 °C durante 30 minutos para eliminar el
agua absorbida por el silicagel.
ii. Preparar una cubeta con la fase móvil o eluyente: n-heptano:éter
diisopropílico:ácido acético (70:30:2, v/v/v), con objeto de que se cree en el interior de la
cubeta una atmósfera saturada con el vapor del eluyente (equilibrado).
2. Adicionar 100 μl de tolueno al tubo con el extracto lipídico y pipetear suavemente
para resuspender el extracto lipídico.
3. Aplicar sobre la placa de silicagel, con distintas puntas de pipeta, 3 μl de cada patrón y de la
muestra por duplicado en carriles consecutivos (Figura 1). El disolvente en el que se
encuentra la muestra lipídica (tolueno) se elimina fácilmente al secar la aplicación. Todas las
manchas deben aplicarse a igual distancia del extremo de la placa (1,5 cm del borde inferior).
Marcar en la placa la posición que deberá alcanzar el frente de la fase móvil (a 9 cm del
borde inferior de la placa).
4. Introducir la placa en la cubeta cromatográfica (Figura 2) y esperar a que el frente
alcance la marca (a 9 cm del borde inferior.
5. Sacar la placa de la cubeta y en posición horizontal dejar que se seque en la campana
de extracción, utilizando un secador de mano.
6. Introducir la placa seca en una cubeta con CUSO4 al 10% (v/v) en ácido fosfórico al 8% (v/v)
durante aproximadamente 10 seg. Tras dejar secar se mantiene la placa a 200 ºC
en una estufa durante 2-3 min para que las manchas correspondientes a las distintas
especies lipídicas muestren un color marrón (Figura 3).

C. Identificación y cuantificación de la masa de las distintas especies lipídicas en la

muestra biológica
1. Escanear la imagen utilizando un scanner.
2. Marcar las manchas de las distintas especies lipídicas en el software Image J
y cuantificar la intensidad de las manchas de los distintos lípidos correspondientes a
los patrones y a las muestras biológicas.
3. Representar una recta de calibración en la que en el eje de ordenadas se represente
los nmol de cada uno de los lípidos y en el eje de abscisas la intensidad de cada una de
las manchas. Sacar la ecuación de la recta que pase por los puntos experimentales
(Figura 3). Interpolar la intensidad de cada uno de las manchas de los distintos lípidos
 de las muestras biológicas en las rectas de calibración correspondientes y obtener la
cantidad de cada uno de los lípidos de la muestra biológica.
4. Los datos de cantidad de cada uno de los lípidos se expresará por mg de proteína.
Los resultados que se obtuvieron para cuatro lípidos contenidos en la muestra problema son
los siguientes:
Determina la cantidad de cada uno de los lípidos presentes en la muestra por mg de proteína.
a) IODr = 0.450 en la gráfica del Oleato de colesterol (EC)

y = 0.207x + 0.0042
y = 0.207(0.450) + 0.0042
y = 0.09735 µg

0.09735 µg 100 μg
( )( ¿ = 3.245 µg ( 1 mg ) = 3.2 x 10−3 EC
μl −3
3 x 10 μg de proteína 1000 μg

b) IODr = 2.400 en la gráfica de trioleína (TG)

y = 0.952 x 2 - 0.2487x + 0.3067

y = 0.952(2.400¿2 – 0.2487(2.400) + 0.3067

y = 5.194 µg

5.194 100 µl
( )( ¿ = 1,731.3 µg ( 1 mg )= 1.73 mg TG
μl −3
3 x 10 µg de proteína 1000 μg

c) IODr = 1.30 en la gráfica de coleserol libre (CL)

y = 0.2374 x 2 – 0.126x + 0.0677

y = 0.2374(1.30¿2 – 0.126(1.30) + 0.0677
y = 0.305
0.305 μg 100 μl 1 mg
( )( −3 µg ) = 10.71 µg ( )= 0.010 mg CL
μl 3 x 10 de proteína 1000 μg

d) IODr = 0.580 en la gráfica de Fosfatidilcolina (PL)

y = 23.273x – 4.9451
y = 23.273(0.580) – 4.9451
y = 8.55

8.55 µg 100 µl 1 mg
( )( ) = 285 µg ( )= 0.258 mg PL
μl −3
3 x 10 µg de proteína 1000 μg

En conclusión se obtuvo 2 mg de lípidos en la muestra de 3 mg, esto puede ser

porque la muestra no contenía completamente lípidos sino otras sustancias
presentes que no se pueden detector con esta prueba.

Referencias
5.Extracción y análisis de lípidos (TLC) – Proyecto de Investigación Consultado en 13 de
septiembre, 2020, en la url
https://sites.google.com/site/proyectodislipemias/home/iii-fase-experimental/5-
extraccion-y-analisis-de-lipidos