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ESERCITAZIONE ISTOLOGIA

Dalla scorsa lezione sappiamo che il limite invalicabile del potere risolutivo del microscopio ottico
è rappresentato fondamentalmente dalla lunghezza d’onda della luce utilizzata che deve essere
nel campo del visibile, quindi in un range di lunghezze d’onda a partire da 380 nm del violetto a
circa 750 nm, un range abbastanza ristretto considerando che poi la massima sensibilità
dell’occhio umano si ha per lunghezze d’onda intorno ai 500 nm.

Sulla base della formula di Abbe, che stabilisce il potere di risoluzione, ne deriva che abbassando la
lunghezza d’onda aumenta il potere di risoluzione. La scoperta che gli elettroni hanno delle
radiazioni di lunghezze d’onda bassissime, dell’ordine inferiore al nanometro, ha fatto ipotizzare la
costruzione di elementi che utilizzassero al posto della luce visibile un fascio di elettroni per
produrre immagini ad alta risoluzione. Sullo sviluppo di queste nuove tecniche poggiano le basi
della microscopia elettronica, che permette l’osservazione di campioni con ingrandimenti e
risoluzione superiori alla microscopia ottica ordinaria.

Principalmente esistono due microscopi elettronici: microscopio elettronico a trasmissione (TEM)


che fa una sorta di radiografia del tessuto ed il microscopio elettronico a scansione (SEM) che fa
una foto del tessuto. Il TEM dà immagini bidimensionali e permette di visualizzare l’ultrastruttura
della cellula, come ad esempio la disposizione degli organuli, fino a distinguere le macromolecole
che vanno a comporre gli organelli. Il SEM invece ha come risultato una foto, quindi dà immagini
tridimensionali ed è utilizzato soprattutto per studiare la forma delle cellule e la superficie esterna.

L’immagine a sinistra è in microscopia


ottica. Con un microscopio a luce ad
alto ingrandimento si ottiene
un’immagine di questo genere: i
dettagli, l’ultrastruttura, e le
componenti subcellulari di questo
tessuto epiteliale e connettivo non
possono essere colti. Semplicemente
utilizzando due coloranti, come in
questo caso ematossilina ed eosina, si
crea un contrasto nucleo citoplasma
che consente al massimo di stabilire
qual è la forma delle cellule. Qui si può dire che è un epitelio cilindrico, la forma dei nuclei, quali
sono i rapporti reciproci delle cellule. Più di questo non si può dire in microscopia ottica, quindi è
semplicemente un’analisi strutturale e morfologica del tessuto nel suo insieme.
Laddove si ha il bisogno si analizzare cosa c’è effettivamente dentro queste cellule, quali organuli e
come questi sono distribuiti, si deve ricorrere al microscopio elettronico a trasmissione (TEM).
Queste sono due immagini messe a confronto, stesso ingrandimento e stessa identica cellula, una
con il microscopio ottico e l’altra con il microscopio elettronico, con potere di risoluzione
decisamente superiore perché utilizza un fascio di elettroni invece che un fascio di luce visibile.
Utilizzando il microscopio ottico con questo ingrandimento si nota che la risoluzione è bassissima
perché aumentando enormemente l’ingrandimento non si riescono a cogliere più dettagli, ma
l’immagine si fa ancora più confusa, a dimostrazione che da solo l’ingrandimento non serve a nulla
se non è associato ad un potere risolutivo elevato. L’immagine di microscopia elettronica a
trasmissione, ma anche con l’utilizzo del SEM, è in bianco e nero, in varie tonalità di grigio.

L’immagine è creata, in particolare nel TEM, dagli elettroni che riescono ad attraversare il
preparato, mentre altri, incontrando delle strutture che si definiscono elettrondense, vengono
deviati ed escono dal fascio e non contribuiscono alla creazione dell’immagine, dando delle zone
nere nell’immagine vista. Le zone scure si definiscono elettrondense e sono costruite
artificialmente, perché questa cellula in realtà è stata colorata, (anche se qui si tratta di una
colorazione relativa) in modo da rendere delle strutture più elettrondense di altre, di modo che il
fascio di elettroni incontrando queste strutture viene deviato, non riesce a raggiunge lo schermo e,
quindi, non contribuisce alla creazione dell’immagine.
Quindi queste zone sono scure alla vista, mentre le zone che chiare sono quelle in cui
effettivamente gli elettroni hanno attraversato la struttura biologica ed hanno raggiunto lo
schermo.
È un immagine in qualche modo contrastata artificialmente così come d’altronde lo è l’immagine
visibile al microscopio ottico, dove la colorazione istologica descritta in precedenza serviva
semplicemente a creare un contrasto tra nucleo e citoplasma, per capire la forma delle cellule, le
sue dimensioni ecc.
Lo stesso scopo è alla base della microscopia elettronica: la “colorazione”, in realtà consiste in
un’addizione di alcuni metalli pesanti ad alcune strutture biologiche per aumentarne la densità e,
in definitiva, serve per aumentare il contrasto dell’immagine.

Struttura di un microscopio elettronico


a trasmissione

Il TEM è composto da un cilindro metallico che


può essere alto fino a due metri, all’interno del
quale non ci sono delle lenti perché le lenti con
cui è costruito un microscopio ottico non sono
in grado di far deviare il percorso degli elettroni,
quindi ci vogliono dei dispositivi che funzionano
come la lente dell’obiettivo dell’oculare.
In realtà tali dispositivi generano dei campi
elettromagnetici che, agendo sulla carica
elettrica dell’elettrone, sono in grado di
deviarne e di farne convergere il flusso.
All’interno del tubo metallico è presente un
filamento metallico, posto proprio in cima al
tubo, costituito da un metallo pesante,
generalmente tungsteno, che per un effetto
termoelettrico (riscaldato) emette elettroni.
Questo fascio di elettroni emesso viene
accelerato da una differenza di potenziale perché questo filo metallico funziona come un catodo.
Più in basso, nelle immediate vicinanze, c’è un anodo. Viene impressa una forte accelerazione del
fascio di elettroni, che incontra una prima lente elettromagnetica che funge da condensatore che
fa convergere questo fascio sul preparato. Attraversando il preparato, alcuni elettroni verranno
deviati nel loro percorso, incontrando delle strutture elettrondense, altri invece riusciranno ad
attraversare il preparato. Successivamente il fascio che riesce ad attraversare il preparato viene
fatto passare attraverso una lente elettromagnetica che funziona da obiettivo, poi c’è una lente
intermedia e infine una lente che è una specie di oculare che proietta e dilata questo fascio su uno
schermo fluorescente o su una lastra fotografica.

Il preparato verrà prodotto con particolari tecniche, poiché sono necessari degli accorgimenti in
quanto si lavora con strutture piccolissime. La salvaguardia dell’ultrastruttura della cellula nel caso
dell’allestimento di un preparato per la microscopia ottica non è poi così importante, perché non si
sarebbe visto nulla degli organuli. A meno che non si voglia fare in microscopia ottica uno studio
enzimatico o di istochimica per andare a vedere una certa proteina, il mantenimento
dell’organizzazione della cellula non è poi così importante, invece, è importante il mantenimento
dell’architettura generale del tessuto.

Un discorso diverso si deve fare per l’allestimento del preparato per la microscopia elettronica: è
importantissimo che gli organuli all’interno della cellula non vengano dislocati, cioè che
mantengano la loro posizione e naturalmente bisogna utilizzare una serie di precauzioni.
Si lavora con materiale molto più piccolo e le fettine sono molto più sottili, siamo nell’ordine dei
nanometri, mentre nel preparato per la microscopia ottica siamo nell’ordine dei micron.
Una fettina all’interno della scatola dei preparati istologici è dello spessore di 5-10 micron, mentre
per la microscopia ottica siamo nell’ordine dei 20, al massimo 100 nanometri. Si tratta di fettine
sottilissime e poste non su un vetrino porta-oggetto, ma su una piattaforma su cui è collocato un
vetrino metallico piccolissimo, dei diametro al massimo di 3mm, solitamente di rame. Di solito
vengono poste 3 fettine che sono quelle che poi vengono attraversate dal fascio di elettroni.

Di seguito le caratteristiche:
- il potere di penetrazione degli elettroni è molto maggiore rispetto a quello del microscopio
ottico (sezioni di 0,02-0,1 micron);
- la risoluzione teorica sarebbe addirittura inferiore al nanometro, in realtà quella raggiungibile è
nell’ordine di 1 nm, mentre il limite di risoluzione del microscopio ottico è di 0,2 micron, un
migliaio di volte superiore;
- l’ingrandimento teorico sarebbe di un milione di volte, ma gli ingrandimenti effettivamente
raggiungibili con una buona risoluzione sono nell’ordine di 150.000, al massimo 250.000 volte,
sempre superiore all’ingrandimento utile di 500 volte per il microscopio ottico.

Microscopio elettronico a scansione


Per quanto riguarda il microscopio elettronico a
scansione, questo scatta una foto della cellula. Con
il SEM abbiamo sempre immagini in chiaroscuro in
varie tonalità di grigio.
Questo microscopio ha un potere di risoluzione
inferiore rispetto al TEM e produce ingrandimenti
inferiori, infatti il limite di risoluzione è di 10nm
rispetto ad 1 nm del TEM. Anche gli ingrandimenti
prodotti sono al massimo fino a 100.000 volte. Il
funzionamento del SEM è più complicato, si tratta
sempre di un tubo metallico con dimensioni minori
rispetto al TEM e c’è il solito filamento che
costituisce il catodo di tungsteno che emette per
effetto termoelettrico il fascio di elettroni accelerati
da una differenza di potenziale, c’è una lente
elettromagnetica, una bobina, che funge da
condensatore e poi c’è uno scanner che fa deviare
questo fascio di elettroni e gli fa analizzare tutta la
superficie del campione punto per punto, in tutte le
direzioni.
In realtà, mentre nella microscopia elettronica a
trasmissione gli elettroni che poi effettivamente
contribuiscono alla creazione dell’immagine sono
quelli trasmessi attraverso il preparato, nel
microscopio elettrico a scansione l’immagine viene costruita dagli elettroni che in qualche modo
vengono riflessi dalla superficie del preparato con una certa energia e si chiamano elettroni
secondari. Non hanno un’energia mai superiore a 50eV .
Questi elettroni ontribuiscono alla formazione dell’immagine perché sono analizzati attraverso c’è
un software altamente complesso che utilizza le informazioni ricostruendo un’immagine
tridimensionale. È un microscopio che, a confronto con un altro strumento che fa più o meno lo
stesso tipo di analisi, lavora molto velocemente, anche se è costoso perché già solo l’allestimento
del preparato richiede tutta una serie di procedure particolari.

In sintesi:
• Il Microscopio Elettronico a Scansione sfrutta la generazione di un fascio elettronico ad alta energia
nel vuoto.
• Il fascio viene focalizzato da un sistema di lenti e deflesso per scandire una area del
campione. Il fascio viene fatto spostare da punto a punto attraverso la superficie da
esaminare dando origine ad elettroni riflessi ed elettroni secondari. Questi ultimi vengono
usati per formare l’immagine
• L’interazione fascio-campione genera vari segnali che vengono acquisiti da opportuni
detectors e successivamente elaborati fino a formare una immagine a livelli di grigio

Il SEM dà indicazioni sulla morfologia della superficie del campione, sulla sua composizione
chimico-fisica, su eventuali contaminazioni delle superfici e sulla misura dei potenziali superficiali.
  MO SEM TEM

Range di 1-1000 10-10000 1000-1000000


ingrandimento

Risoluzione      

Ordinaria 5mm 0,1mm 5 nm

Per osservazioni
accurate 0,2mm 20nm 1nm

Limite 0,2 mm 1nm 0,2 nm

Profondità di 0,1mm a limitata allo


campo 10x 10mm a 10x spessore del film

1mm a limitata allo


  100x 1mm a 100x spessore del film

richiede il
vuoto richiede il vuoto
Ambiente versatile (0,03Pa) (0,03Pa)

Allestimento di un preparato per la microscopia elettronica a scansione

Mentre l’allestimento del preparato per il TEM è molto simile, se non identico, nelle fasi
all’allestimento del preparato per la microscopia ottica, salvo che alcune sostanze sono diverse, il
procedimento per la preparazione del campione adatto per il SEM è completamente diversa. Il
campione viene sempre fissato, però poi viene essiccato e viene rivestito da una lamina di un
metallo pesante ed il processo si chiama proprio metallizzazione, perché questo tipo di strumento
può analizzare solamente materiali conduttori o semiconduttori, per cui deve essere rivestito da
una lamina metallica. Il materiale biologico può essere anche digerito e si esamina solamente la
forma e quel che rimane è il templato o lo stampo.
Entrambi questi microscopi lavorano sempre su cellule e tessuti morti, mai cellule viventi o in
coltura, perché all’interno degli strumenti deve essere creato il vuoto, sia nel TEM che nel SEM,
altrimenti gli elettroni incontrando le particelle di aria verrebbero continuamente deviati dal loro
percorso. Il vuoto viene creato con una pompa. Questo è un limite di questi strumenti.

Allestimento di un preparato per microscopia elettronica a trasmissione

Alcuni passaggi delle tecniche di preparazione sono state precedentemente accennate , come
l’utilizzo dei fissativi. La glutaraldeide tra le aldeidi è usata per la microscopia elettronica.
Naturalmente il pezzettino di tessuto deve essere ridotto a porzioni piccolissime, rispetto a quello
utilizzato per l’allestimento di un vetrino in un microscopio ottico (ricordare il pezzo di tessuto
immerso in un tubo da centrifuga che abbiamo fatto scorrere tra i banchi). I campioni di tessuto
sono un decimo delle dimensioni del pezzettino visto.
Per quanto riguarda i fissativi, è importante il mantenimento dell’ultrastruttura della cellula, in
quanto non ci devono essere dislocazioni di organuli e proteine. Ne deriva l’utilizzo delle aldeidi,
tra cui la glutaraldeide, che hanno proprietà non coagulanti, cioè non fanno precipitare le
proteine all’interno della cellula ma creano una sorta di reticolo tridimensionale per cui le proteine
rimangono intatte nella loro struttura all’interno della cellula, mantenendo anche alcuni gruppi
antigenici esposti e attività enzimatiche.
La prefissazione con glutarldeide è seguita anche da una postfissazione con un sale di un metallo
pesante, in questo caso il tetrossido di osmio, che è una sostanza molto volatile solubile nei lipidi e
va a colorarli in nero, quindi abbiamo un doppio risultato: il tetrossido di osmio si lega ai gruppi
basici di alcuni amminoacidi , tanto è vero che i preparati in genere fissati con tetrossido di osmio
(questo ragionamento vale anche per la microscopia ottica) poi difficilmente di legano e
reagiscono con i coloranti acidi perché i gruppi basici vengono legati al tetrossido di osmio. Questo
spiega il perché non è possibile colorare con un colorante acido questi gruppi una volta che sono
stati trattati con tetrossido di osmio. Il tetrossido di osmio segue quindi la glutaraldeide e in più
colora in nero i lipidi, sciogliendosi in essi, essendo liposolubile.

Dopodiché si deve includere il pezzettino, poiché le fettine che si ottengono sono ancora più sottili
di quelle per la microscopia ottica, quindi per indurire il pezzettino e poterlo affettare, questo deve
essere ancora più duro della paraffina. In questo caso non si utilizza paraffina, ma si utilizzano dei
materiali sintetici molto duri che sono le resine epossidiche, come l’araldite e l’epon, che sono
vendute sottoforma monomerica, quindi sono liquide a temperatura ambiente e poi vengono fatte
polimerizzare aggiungendo una piccola quantità di un catalizzatore ad alte temperature,
esattamente il contrario di quello che succedeva per la paraffina, che è una cera allo stato solido a
temperatura ambiente che viene fatta fondere in una stufa a 40°C, 50°C e poi riportata a
temperatura ambiente polimerizzava con il pezzetto dentro sottoforma di cera.
Queste resine allo stato monomerico sono liquide e poi vengono mescolate perché in realtà si
creano delle soluzioni aggiungendo una piccola quantità di catalizzatore e in stufa viene posta in
due fasi a temperature prima 35°C e poi 60°C e fatta polimerizzare. Il risultato è la formazione di
un materiale resinoso duro con il pezzettino dentro.

Successivamente bisogna effettuare il taglio. Naturalmente, come per la microscopia ottica, il


passaggio precedente all’inclusione deve essere sempre la disidratazione perché , come la
paraffina, queste resine sono insolubili in acqua, quindi bisogna togliere l’acqua dal campione. Da
qui in poi il procedimento è uguale a quelli già visti per la preparazione in microscopia ottica: si
fanno sempre i soliti passaggi in alcol. Si parte dall’alcol 50% ,poi 70%, 90% e si fanno due passaggi
in alcool assoluto al 100% e poi, differentemente dalla microscopia ottica, in cui l’ultimo passaggio
è in xilolo, che è il solvente per la paraffina ( cioè permetteva alla paraffina di permeare il tessuto),
nella microscopia elettronica il solvente per queste resine epossidiche è l’ossido di propilene.
I tempi per la disidratazione sono molto più brevi, addirittura si fa in ghiaccio, quindi le vaschette
con tutti gli alcoli servono ad evitare la degenerazione del tessuto poiché siamo a basse
temperature.

Ricapitolando : disidratazione, passaggio in ossido di propilene equivalente allo xilolo e poi


inclusione.
Nell’inclusione si mette questo pezzettino piccolo di tessuto in provettine, capsulette simili alle
capsule medicinali o in provettine di dimensioni equivalenti che hanno la punta conica o
piramidale. Si riempiono di queste resine liquide, ci si mette dentro il pezzettino e si mette poi in
stufa a polimerizzare con questo catalizzatore che accelera la reazione. I tempi sono abbastanza
lunghi per l’inclusione, dalle 24 alle 48 ore, sostituendo almeno una volta la resina, come si
sostituiva anche la paraffina. Il contenitore poi viene affettato insieme alla resina e al preparato
stesso e non viene rimosso. Ne vengono fatte delle sezioni sottilissime di massimo 20 o 100 nm,
che vengono disposte su queste grigliette di 3 mm di diametro, reticoli generalmente di rame,
materiale conduttore. Questa volta non abbiamo più il microtomo come affettatrice ma
l’ultramicrotomo che è sempre uno strumento dotato di un braccio metallico all’estremità del
quale si monta questa capsuletta contenete il tessuto incluso.
Mentre nel microtomo per la microscopia ottica il braccio
metallico portante la lama è di tipo rotativo, con una
manovella che permette al braccio di fare dei movimenti
oscillanti per andare ad incidere sulla lama,
nell’ultramicrotomo si ha una lama di vetro usa e getta
oppure delle lame fatte di schegge di diamante,
naturalmente non usa e getta, che si posso riaffilare e durano
molto a lungo e creano queste sezioni sottilissime.
Si creano anche qui dei nastrini che si dispongono in una
vaschetta montata sotto la lama e le fettine restano tutte
adese l’una all’altra. I nastrini cadono in questa vaschetta e
sulla superficie di questa acqua distillata si distendono.
Successivamente vengono prelevate con delle pinzette piccole dalla la punta ricurva che
mantengono una retina metallica. Le fettine vengono ripescate con questo suddetto retino.
Le fettine aderiscono e possono essere riportate sul preparato in più
sezioni, in base alle dimensioni del’organo. Il tutto viene fatto sotto il
controllo di un microscopio ottico, poiché le strutture sono piccolissime
e non è possibile eseguire i passaggi ad occhio nudo. Gli spostamenti
del braccio metallico dell’ultramicrotomo non sono regolati
meccanicamente da una manovella ma avvengono per dilatazione
termica, cioè il braccio si dilata e fa dei piccoli spostamenti e va ad
incidere su questa lama. Non c’è bisogno della chiusura, ma il
campione viene lasciato essiccare poiché aderisce spontaneamente a
questa grata metallica.

L’ultima fase è la colorazione, sempre con lo scopo di aumentare il contrasto tra le strutture, in
tonalità di grigio molto contrastato. Con il microtomo prima di formare le sezioni fini
effettivamente utilizzate per l’osservazione, che possono essere anche di 20-40nm, si possono
produrre preliminarmente delle fettine che si dicono semifini, che possono arrivare al massimo a
2micron, utilizzando però non la modalità dilatazione termica ma un’affettatura meccanica
dell’ultramicrotomo. Generalmente la preparazione di fettine semifini serve per fare un’analisi
generale a quel pezzetto di tessuto per vedere se effettivamente ha tutte le caratteristiche adatte
per essere affettato per la microscopia elettronica, poiché i procedimenti sono molto costosi.

In sintesi, per la preparazione del tessuto abbiamo:


− Fissazione in glutaraldeide
− Postfissazione in tetrossido di osmio
− Disidratazione con alcol (o acetone)
− Passaggio in ossido di propilene (solvente per le resine)
− Inclusione in plastiche acriliche o resine epossidiche
-- Taglio all’ultramicrotomo in sezioni di 20-40 nm
-- Aumento del contrasto con coloranti elettronici come acetato
di uranile o citrato di piombo
La colorazione positiva è quella
che crea contrasto fra le
diverse strutture all’interno
della cellula. Questa è una
porzione di una cellula e si
vedono i mitocondri e tutte
quelle strutture membranose
come il reticolo
endoplasmatico rugoso. Se il
tessuto o la cellula non
l’avessimo colorato o
contrastato, in microscopia
elettronica non avremmo visto
nulla di tutto ciò, questo
perché la capacità delle
strutture biologiche, quindi
delle molecole, di far deviare gli elettroni, dipende dal numero atomico degli elementi che
costituiscono queste molecole: più è alto il numero atomico, più l’atomo è pesante e più
l’elemento è capace di far deviare il fascio di elettroni.
Il problema dei tessuti biologici è che sono costituiti nella maggior parte da carbonio, ossigeno e
idrogeno, tutti elementi con basso numero atomico. Questi elementi sono omogeneamente
distribuiti e la loro capacità di far deviare gli elettroni è praticamente nulla. Quindi la colorazione
ha lo scopo di aumentare il contrasto utilizzando dei materiali pesanti come uranio, piombo e oro
che si vanno a legare preferenzialmente su alcune strutture della cellula e del tessuto
aumentandone fortemente la densità e quindi la capacità di far deviare gli elettroni.
Questi metalli si legano particolarmente agli acidi nucleici per evidenziare meglio il nucleo, le
strutture membranose e ad alcuni organuli, i quali diventano scuri perché il fascio di elettroni
andandoli a colpire incontra questi metalli pesanti ed il fascio viene deviato e non raggiungerà più
lo schermo.
Invece le strutture chiare corrispondono alle zone in cui non si è legato il metallo pesante e quindi
gli elettroni sono riusciti ad attraversare queste strutture e sono zone illuminate, in cui il fascio di
elettroni ha raggiunto lo schermo e ha creato un’immagine chiara.
La colorazione consiste quindi semplicemente nell’addizione di materiali pesanti ad alcune
strutture per aumentarne la densità. Questa è la colorazione positiva, ma esiste anche la
colorazione negativa in microscopia elettronica che ha come risultato finale il negativo di una foto.
In realtà si immerge il tessuto in un sale di un metallo pesante che si va a depositare nelle zone che
trova vuote (supponiamo una macromolecola formata da tante subunità, in cui nelle zone le
subunità sono sovrapposte e in altre lasciano punti vuoti ed il metallo si va a depositare nei punti
vuoti), dove le zone scure non sono quelle elettrondense dove c’è maggiore densità, ma in realtà
sono quelle dove non c’è la molecola. Le zone chiare sono quelle invece dove la molecola ha
impedito la deposizione del sale del metallo pesante e quindi possono essere attraversate da
elettroni.
Seconda parte

Minuto 35.45

Questa è la colorazione positiva, adesso vedremo quando si utilizza e per studiare cosa. Però esiste
per la microscopia elettronica anche la colorazione negativa, ecco perché questa si chiama
positiva, altrimenti basterebbe dire “colorazione”. Ecco questi sono tutti esempi di colorazione

positiva: questo è un batterio.


Ritornando indietro, ecco, questi sono i due coloranti utilizzati nella colorazione della microscopia
elettronica, quindi vi dicevo metalli pesanti uranio e piombo in soluzioni saline acquose , l’acetato
di uranile si usa per primo, si lega generalmente alla cromatina ed evidenzia bene e poi citrato di
piombo in successione, prima l’uno e poi l’altro.

Vedete in realtà questa è la retina e questa è la goccia quindi guardate le dimensioni, una goccia
va a coprire ampiamente tutto il preparato. Questa è la colorazione positiva e queste sono le
immagini corrispondenti.
La colorazione negativa è quella che vi dicevo viene utilizzata per studiare generalmente strutture
macromolecolari come la parete di un virus
oppure questa è il collagene,

cioè macromolecole o strutture macromolecolari complesse in cui le molecole costituenti hanno


un ordine ben preciso, si dispongono geometricamente con un ordine ben preciso lasciando spazi
vuoti, per cui poi la disposizione di questo sale di metallo pesante mette bene in evidenza questa
disposizione. Vedete queste bande scure e chiare, sono fibrille di collagene, strutture fibrose
proteiche presente nella matrice di tutti i connettivi, conferiscono delle caratteristiche molto
importanti di resistenza alla tensione, alla torsione.
Il tessuto diventa resistente alle forze perché ci sono queste fibrille, ogni fibrilla in realtà è formata
da tante proteine collagene disposte in un ordine ben preciso.
Siccome le molecole si sovrappongono in questo modo, testa-coda in tante file lasciando delle
zone vuote e delle zone in cui sono tutte sovrapposte tra loro, il sale di metallo pesante come il
fosfo-tungsteno si va a depositare, in realtà, nelle zone vuote e quindi la fascia, la banda scura
corrisponde ai punti in cui non c’è la molecola di collagene, la banda chiare,invece, ai punti dove
c’è. È esattamente il contrario di quello che succedeva prima, dove c’è la molecola con maggiore
densità abbiamo l’immagine scura, qui è il contrario. La colorazione negativa è come il negativo di
una foto, quindi si utilizza per studiare l’organizzazione di strutture macromolecolari soprattutto.
L’ombreggiatura (solo un cenno) è un’altra tecnica che si utilizza per la microscopia elettronica e
serve per aumentare il contrasto e mettere in risalto il rilievo di alcune molecole, macromolecole.
Si mette il campione, la fettina di tessuto in una camera sottovuoto dove, con un certo angolo di
incidenza, viene fatto vaporizzare un metallo pesante, ad esempio il platino ecc e questo si
deposita con un certo angolo su quella certa macromolecola, per cui un lato della macromolecola
avrà uno spesso strato di questo sale, un altro di meno. Questo crea un’immagine che da l’idea del
rilievo, un’immagine tridimensionale che si può osservare su questo esempio:
Questa rappresenta molecole di miosina ombreggiate al platino, ci dà l’idea del rilievo di queste
molecole nonché della loro forma e distribuzione. In alcuni casi quando il materiale sotto questo
strato di platino o di altri metalli è troppo spesso per essere osservato al microscopio elettronico a
trasmissione, esso viene digerito con reagenti, soluzioni alcaline e rimane solamente l’impronta di
quello che era.
Il congelamento-frattura, invece, è un’altra tecnica utilizzata in microscopia elettronica per
studiare le membrane sostanzialmente, cioè la composizione, la struttura delle membrane
biologiche in particolare la membrana plasmatica che sapete essere composta, come tutte le altre
membrane degli altri organelli interni alla cellula, da due strati fosfolipidici in cui sono immerse,
più o meno profondamente, delle proteine.

Con questo congelamento-frattura, vediamo dalle immagini, la cellula, il tessuto in generale, viene
congelato alla temperatura dell’azoto liquido, temperatura bassissima intorno ai 180°C- 190°C, ( vi
avevo detto, anche come tecnica di fissazione per la microscopia ottica, che, con le temperature
bassissime si impedisce che l’acqua contenuta nelle cellule cristallizzi, che formi dei cristalli
grossolani che possono alterare la struttura della cellula) e si ha la vetrificazione cioè la formazione
di microcristalli che non alterano la struttura. Dopo aver congelato il tessuto, si incide con delle
lame particolari tra i due strati fosfolipidici della membrana che vengono separati. La maggior
parte delle proteine rimarrà solamente su una delle due facce della membrana, nell’altra
rimarranno le impronte tipo suolo lunare; entrambe le superfici verranno ombreggiate al platino:
si fa evaporare il metallo pesante con un certo angolo e questo si andrà a depositare sulle
strutture con spessori diversi, su un lato e sull’altro, dando immagini tridimensionali. consente di
studiare la tomografia delle proteine di membrana. La tecnica del congelamento-frattura consente
di studiare la tomografia delle proteine di membrana che vengono osservate al TEM dopo
ombreggiatura.
La tabella mette semplicemente a confronto i vari passaggi per l’allestimento del preparato per la
microscopia ottica ed elettronica, come già detto finora. Dopo la colorazione nella microscopia
ottica c’è la chiusura con il vetrino coprioggetto e quindi, come detto la volta scorsa, questi vetrini,
questi preparati che avete nelle scatole, possono rimanere conservati perfettamente con tutte le
loro caratteristiche anche per molti anni mentre quelli per la microscopia elettronica sono molto
più delicati e durano molto poco perché non sono coperti. Naturalmente tutte queste fasi che vi
ho descritto di disidratazione, colorazione vengono sempre fatte in ambienti protetti dalla polvere,
da tutto quello che può andare a inficiare la riuscita, che può alterare la struttura, l’ultrastruttura
tessutale.
Ora faccio cenno ad altri microscopi che vengono utilizzati in istologia.

Il microscopio a forza atomica è uno strumento che, più o meno, ci consente di effettuare lo stesso
tipo di analisi del microscopio a scansione, quindi di analizzare soprattutto le superfici di cellule di
tessuti, dando rispetto a quello anche informazioni aggiuntive e avendo rispetto al SEM alcuni
vantaggi e alcuni svantaggi. Innanzitutto vediamo, grossolanamente, come funziona visto che è
uno strumento molto complesso.
Alla base del funzionamento dello strumento c’è una leva metallica dotata di una certa flessibilità
all’apice della quale viene montata una punta molto acuminata, metallica, generalmente di silicio;
un raggio laser, colpendo questa leva, fa sì che la punta esamini punto per punto la superficie di un
campione, come la superficie di cellule in coltura ecc..
Di queste superfici posso studiare sia la tomografia come farebbe un SEM oppure la forma delle
cellule, come sono distribuite, ma anche le interazioni tra molecole. All’apice della punta infatti si
possono attaccare con dei linker appositi delle molecole, ad esempio un ormone x, l’insulina, e
vado a studiare l’interazione dell’ormone insulina con il suo recettore. Quindi ogni volta che
l’ormone insulina trova il suo recettore ci saranno delle forze attrattive per cui la levetta e la punta
vengono attirate verso il tessuto; le deflessioni di questa leva vengono registrate dall’apparecchio
che le traduce poi in un’informazione: forza di legame, tomografia distribuzione del recettore, ecc.
quindi questo strumento viene utilizzato per studiare semplicemente la morfologia di una
superficie o addirittura le interazione tra 2 molecole: ormone-recettore, fattore di crescita-
recettore (ti dice dove sta distribuito questo recettore nel tessuto, con quali forze interagisce e si
lega al suo ligando), quindi dà una serie di informazioni molto importanti. Rispetto al SEM che
consente l’analisi di superfici più ampie di 1mm × 1mm, il limite di questo microscopio è che può
analizzare superfici più piccole, al massimo di 100µ×100µ, quindi dimensioni di almeno dieci volte
inferiori. Anche la profondità del campione varia: per il microscopio a forza atomica è dell’ordine
del micron, nel caso del SEM abbiamo l’analisi di materiali più spessi, più erti. La velocità di analisi
è un’altra differenza: questo strumento procede molto lentamente mentre il SEM consente delle
analisi molto più rapide. Il vantaggio per eccellenza di questo strumento rispetto al SEM è che,
come dicevo prima, il SEM opera sottovuoto, in un ambiente in cui è stato creato il vuoto, per cui
non puoi immettere materiale vivente, cellule viventi, colture in vitro mentre il microscopio a forza
atomica lavora all’aria e quindi questo gli consente di vedere tomografia, interazioni in cellule
viventi. Quindi non devi fare alcun tipo di manipolazione al tuo materiale, non lo devi fissare,
colorare, ecc. mentre abbiamo visto che per il SEM lo devi metallizzare e devi innanzitutto
uccidere il tessuto. Questa è una differenza importantissima di questo strumento, tra l’altro meno
costoso ma più lento del SEM.
Ora facciamo un rapido cenno ad alcuno tecniche che si utilizzano ancora in istologia. Vi avevo
detto la volta scorsa che l’istologia moderna non si limita più all’analisi descrittiva, morfologica
delle strutture di base, dell’organizzazione di base di un tessuto ma si avvale di alcune tecniche che
consentono di dare risposte a dei quesiti relativi a dei correlati funzionali della struttura e
dell’organizzazione di un tessuto e con l’aiuto di queste tecniche posso ricavare alcune
informazioni. Allora le colture cellulari non sono certo una prerogativa dell’istologo, come già
detto prima, le colture cellulari sono lo strumento per eccellenza di un qualunque ricercatore di un
qualunque ambito scientifico quindi genetista, anatomico, patologo, biologo, istologo, fisiologo,
non c’è alcun ricercatore che non utilizzi le colture cellulari, cellule viventi di tessuti umani o
animali che , in contenitori appositi sterili si continuano a riprodurre e si mantengono vive. Esse
rappresentano uno strumento duttile importantissimo che ci consente di studiare come
rispondono certi tipi di cellule e certi tessuti al trattamento con un farmaco in termini di crescita,
in termini di espressione di una qualche proteina; consentono di studiare il funzionamento di una
pompa di membrana, di fare qualunque cosa. Quindi, pur essendo sistemi semplificati rispetto
all’animale da esperimento, perché le cellule sono state estratte dall’animale e mantenute in un
ambiente estremamente semplificato rispetto all’organismo in toto in quanto vengono a mancare
tutte le influenze degli ormoni, di tutto quello che c’è in un organismo completo in cui le cellule
sono bombardate da tutta una serie di informazioni che vengono a mancare in una piastra di
coltura, le informazioni che si possono ottenere da questi sistemi semplificati sono sempre
importantissime, sono preliminari in qualunque studio. Ad esempio in uno studio che tratta
l’utilizzo di un farmaco chemioterapico o antitumorale si fa, come prima tappa, sempre uno studio
sulle cellule in vitro, poi sull’animale e infine si applica all’uomo. Quindi sono la tappa preliminare
per qualsiasi tipo di analisi tu voglia fare. Per la preparazione delle colture si preleva da un animale
da laboratorio o, se si tratta di tessuti umani, durante una biopsia, un’operazione chirurgica si
prende un pezzettino di tessuto e, questo tessuto, animale o umano, viene innanzitutto
frammentato con un bisturi in pezzetti piccolissimi e posto poi in un contenitore di vetro, una
beuta contenente una soluzione di un enzima, generalmente la tripsina, enzima proteolitico che
scinde i legami tra le cellule separandole. Le cellule così separate vengono centrifugate in modo da
concentrarle, si aspira la tripsina lasciando solo il pellet (insieme delle cellule) che viene sciolto in
un solvente che è il terreno di coltura. Successivamente le cellule vengono disposte in un
contenitore sterile, trasparente e tondo, la piastra, capsula di Petri. Le cellule epiteliali, ad
esempio, dopo un po’ aderiranno spontaneamente alla base di questa piasta, se invece sono
cellule del sangue rimarranno in sospensione. Sembra che siano a secco, ma in questi contenitori è
presente del liquido( che è il loro terreno di coltura) contenente tutti gli ormoni, i fattori di
crescita; inoltre, si aggiunge sempre del siero animale che contiene una miscela ricchissima di
ormoni, fattori di crescita, sali minerali, vitamine, tutto ciò che serve alle cellule per mantenersi in
vita e per continuare a modificarsi. Questi terreni di coltura sono rossi generalmente, liquidi e
rossi perché si aggiunge ai terreni un indicatore di ph, il rosso fenolo che ci fa capire se il ph si
mantiene intorno alla neutralità, perché sia la molarità di questi terreni che il ph (7.4-7.5) devono
essere vicino a quelli dei fluidi umani. Le cellule in questa piastra di coltura si divideranno,
continueranno a crescere con un ritmo che è specifico del tessuto di cui fanno parte, quindi ci
sono tessuti come quello epiteliale in cui le cellule si riproducono più rapidamente e altri tessuti in
cui le cellule si riproducono molto lentamente. Comunque dopo un certo numero di giorni
occuperanno tutta la superficie a disposizione nella piastra, si dice che hanno raggiunto la
confluenza e allora si ritorna di nuovo al passaggio precedente: si staccano con la tripsina dal
fondo della piastra (la tripsina non solo le stacca dal substrato ma le separa anche tra loro) e poi le
si suddivide in altre piastre in modo da espandere in qualche modo la coltura. La coltura ottenuta
direttamente dal pezzettino di tessuto si chiama coltura primaria, cioè quella che deriva
direttamente dal tessuto. Una volta fatta la successiva tripsinizzazione si parlerà di sub-coltura o
coltura secondaria. Naturalmente si può andare avanti, se si tratta di tessuti normali, animali o
umani, generalmente le cellule possono subire un numero molto limitato di questi passaggi che vi
ho appena descritto ( 5-10) e poi cominciano a diventare senescenti, cioè rallentano sempre di più
il loro ritmo di moltiplicazione e smettono di crescere e la coltura non può essere più utilizzata,
tipico dei tessuti normali. Può accadere che, durante questi passaggi, le cellule a volte
spontaneamente accumulino un certo numero di mutazioni che le rendono in qualche modo
immortali, cioè come se si trasformino, diventino immortali e si riproducano all’infinito. Questa
trasformazione la si può indurre, cioè se si vuole una coltura che duri in eterno, nei secoli dei
secoli, la puoi trasformare, la rendi immortale, la tratti con agenti trasformanti, metilanti, cioè
sostanza chimiche che inducono trasformazioni nella cellula in modo che la si immortalizzi. Oppure
spontaneamente immortali sono le cellule che derivano da tessuti tumorali, quindi se si utilizza
come campione di un tessuto, un tessuto tumorale le cellule che si otterranno non andranno
incontro a senescenza purtroppo ma si riprodurranno all’infinito. Tutte le cellule che in un modo o
nell’altro, in uno di questi 3 modi che vi ho detto, raggiungono questa condizione di immortalità,
danno luogo a quelle che si chiamano colture stabilizzate, una linea stabilizzata. Ci sono comunque
linee stabilizzate di tessuti normali sui cui posso fare un numero limitato di passaggi e poi linee
stabilizzate immortali che hanno la capacità di riprodursi indefinitamente. Le linee sono in
commercio, esistono dei cataloghi di tantissime case produttrici italiane ed estere da cui tu puoi
acquistare qualsiasi linea, ad esempio la linea del cancro del pancreas umano oppure di carcinoma
della mammella di topo. Ci sono tutte le linee possibili ed esistono delle banche apposite, la più
famosa è la ATCC (American type colture collection), banca di linee cellulari da cui tu puoi
acquistare qualunque linea, da tessuto tumorale, normale, umano, animale come quello di topo,
ratto ma anche altro. Quando arrivano in laboratorio le si paga, e si possono fare tutti gli
esperimenti che si vuole e si crea una piccola banca propria. Tutti gli istituti hanno dei bidoni,
grossi bidoni metallici che contengono azoto liquido e queste cellule, ad altissima concentrazione,
dentro piccole provette immerse nell’azoto liquido si mantengono indefinitamente, poi quando
servono le si scongela, le si mette nel terreno di coltura e le cellule riprendono a crescere. Tutti
questi passaggi appena descritti devono essere fatti in ambiente rigorosamente sterile per evitare
contaminazioni microbiche di ogni genere e quindi si lavora sotto cappe sterili (sono come stufe
grandi dove si mettono solo le mani all’interno, ci si siede davanti, protetti da vetri e si inseriscono
solo le mani); esistono sia cappe chimiche che servono a proteggere l’operatore da vapori di
sostanza tossiche, chimiche e non si usano per produrre colture sia cappe a flusso laminare, cappe
sterili in cui l’aria che passa all’interno viene depurata attraverso una serie di filtri per cui si crea un
ambiente sterile. C’è un flusso continuo di aria attraverso i filtri, si lavora solo con le mani
nell’ambiente sterile e tutti questi passaggi descritti devono essere fatti là sotto. Le cellule si
mantengono a crescere in stufe chiamate incubatori simili da fuori a frigoriferi ma al contrario dei
frigoriferi all’interno si hanno 37°C di temperatura, aria con il 5% di CO2 e 95% circa di umidità.
Queste sono le condizioni ottimali per far crescere qualunque tipo cellulare, indipendentemente
dal tessuto. Quindi crescono in incubatori e le si manipola sotto cappe a flusso laminare, sterili.
Sono strumenti essenziali per qualunque ricercatore perché puoi studiare tutto ciò che vuoi,
dall’espressione di un gene ad un farmaco sulla crescita, dal funzionamento di enzimi ad altro
ancora. Sono strumenti molto duttili anche se molto semplificati perché si sta parlando di
esperimenti in vitro rispetto all’ “in vivo”. Infatti se si devono pubblicare i risultati di un
esperimento, di un lavoro su una rivista scientifica generalmente i risultati ottenuti in vitro sulle
cellule, a meno che non siano risultati straordinariamente innovativi come la scoperta del gene
“X”, si devono sempre confermare su un animale in vivo, in quanto le obiezioni che sorgono da
molte riviste riguardano il fatto che l’esperimento è stato condotto su una linea cellulare che non
rappresenta un organismo nel suo complesso e quindi è richiesta una conferma in vivo. Ci sono
comunque lavori importantissimi pubblicati su riviste scientifiche prestigiose come Nature, Science
che sono stati condotti sulle linee cellulari, proprio sulle cellule.

In quest’immagine vediamo un contenitore, non


una capsula di Petri, ma una bottiglietta, vedete proprio con il tappo come una vera bottiglia in cui
le cellule crescono sul fondo su un liquido rosso, il terreno di coltura come vi dicevo e queste linee
cellulari non possono essere osservati con un microscopio ottico ma con un microscopio sempre a
luce visibile che si chiama invertito. Come avete notato la posizione della lampada di illuminazione
rispetto agli obiettivi è invertita, cioè gli obiettivi sono sotto il tavolino porta-vetrini, porta-oggetto.
Sotto ci sono gli obiettivi e sopra la lampada di illuminazione per evitare il problema dello spessore
del contenitore; l’obiettivo va sotto dove le cellule sono adese alla superficie della piastra perché
altrimenti da sopra lo spessore del contenitore sarebbe troppo ampio per consentire all’obiettivo
di mettere a fuoco. Anche la distanza di lavoro tra la lampada illuminatrice e la piastra è molto
ampia anche di 20 centimetri perché ci possono essere contenitori anche più grandi di questo,
quindi ha uno spazio di lavoro abbastanza grande; esso produce ingrandimenti al massimo fino a
1000volte quindi troviamo 4x 10x, ingrandimenti di 400,500 volte raramente di 1000. Ecco il
microscopio invertito che spesso è anche dotato di un dispositivo detto a contrasto di fase che
aumenta il contrasto senza bisogno di colorazione, infatti le cellule in coltura, essendo vive, non
possono essere colorate perché per altro la colorazione prevedrebbe quasi sempre la fissazione e
molti coloranti sono comunque tossici, citotossici. Le cellule viventi non possono quindi essere
colorate. Le strutture biologiche, come abbiamo già detto oggi, hanno indici di rifrazione diversi,
nel senso che la luce che le va a colpire subisce deviazioni diverse a seconda della densità
molecolare, quindi le strutture biologiche di un tessuto, di un campione hanno indici di rifrazione
diversi. Nel condensatore di questi microscopi invertiti a contrasto di fase c’è un sistema di lenti
che amplifica notevolmente questa variazione di fase quando la luce, già divisa in due fasi diverse,
incontra il campione e viene ulteriormente suddivisa e quindi aumenta il contrasto, agendo
semplicemente sulla diversità di indice di rifrazione delle strutture e sulle diversità di fase della
luce. È un escamotage per aumentare il contrasto senza colorare le cellule, per cui quando osservi
le cellule in coltura vedi delle immagini simili a quelle della microscopia elettronica, non proprio
nere ma grigio scuro e grigio chiaro che ti danno l’idea di dove si trova il nucleo ecc..I coloranti
istologici sono in genere citotossici anche se a noi interessa poco perché li usiamo su cellule già
uccise, fissate, ci sono però un ristretto gruppo di coloranti “vitali” che in realtà non sono tossici
per le cellule e potrebbero essere iniettati in animali vivi per colorare determinate strutture. La
colorazione vitale è quella che si fa nell’animale vivo, intero altrimenti si parla di colorazione sovra-
vitale se si fa sul tessuto già estratto dall’animale. Questi tipi di coloranti non sono citotossici e
possono colorare vitalmente certi tipi di cellule e sono:
Alizarina: colora la matrice extracellulare del tessuto osseo in rosso;
Bleu trypan, Bleu Pirrolo, Litio Carminio: Coloranti che vengono assunti vitalmente da cellule che
fagocitano, i fagociti. Sono cellule capaci di effettuare la fagocitosi, si tratta prevalentemente di
alcuni tipi di globuli bianchi del sangue; queste cellule fagocitano questi coloranti grazie a una
proprietà chiamata granulopessia. Il trypan bleu, per esempio, anche se un po’ in disuso perché si
è scoperto che è tossico per l’uomo come tante altre sostanza che abbiamo sempre utilizzato, è
una sostanza che viene utilizzata quando si lavora sulle colture cellulari per controllare la vitalità
delle cellule ma al contrario: mentre normalmente il trypan bleu viene assunto solo dai fagociti ma
non dalle altre cellule, quando tratti le cellule vive sul vetrino con questo colorante, solo le cellule
morte che hanno un’alterata permeabilità di membrana assorbono il trypan bleu e vengono
evidenziate come morte. Le altre cellule che non lo assumono perché non hanno capacità
fagocitiche sono cellule vive. È tossico per l’operatore ed è stato vietato l’utilizzo se non con
determinate diluizioni;
Bleu di Metilene: colora vitalmente gli assoni delle cellule nervose;
Rosso Neutro: colora specificamente i granuli di alcuni globuli bianchi, i granulociti sempre
vitalmente
Verde Janus: è un colorante elettivo per i mitocondri in verde.
Per quando riguarda la citochimica e l’istochimica si parla in generale di reazioni citochimiche e
istochimiche oppure anche di colorazioni cito e isto, è la stessa cosa. Mentre abbiamo visto che le
colorazioni istologiche si basavano sull’utilizzo di due o tre coloranti (se erano tricromiche) basici
o acidi che si andavano a legare a strutture basiche o acide del tessuto creando contrasto, adesso
si utilizzano dei reagenti che, andando a creare con determinate strutture del tessuto una vera e
propria reazione chimica, determinano poi la formazione di un prodotto di reazione colorato nato
dalla reazione con certe categorie di molecole. E parliamo delle 4 categorie di molecole organiche
presenti nei tessuti: acidi nucleici, proteine, lipidi e zuccheri. Quindi le reazioni o colorazioni
istochimiche ( la differenza tra isto e citochimica è legata al fatto che in citochimica lavori sulle
cellule in coltura, in istochimica lavori sul tessuto nel suo complesso) consentono di andare a
identificare, topograficamente dove nel tuo tessuto si trova un lipide o una proteina generica non
un particolare lipide X ecc.. Consente di stabilire la posizione, la collocazione di certe molecole
all’interno di un tessuto o, eventualmente, anche una certa quantificazione relativa, avendo due
tessuti a confronto, e stabilendo dove c’è una maggiore quantità di lipidi, ecc. Lo scopo
dell’istochimica è quello di andare a individuare queste molecole ma, ripeto, non uno zucchero
preciso, il ribosio o il fruttosio, ma la presenza generica delle molecole. Utilizza le stesse reazioni
della biochimica solo che quest’ultima estrae le proteine dal tessuto mentre qui lavori in situ e
evidenzi direttamente dove si trovano queste sostanze senza bisogno di estrazione.
Non dovete sapere tutte le reazioni istochimiche ma alcune si come la PAS che è la più importante
per individuare gli zuccheri all’interno di un tessuto. Uno dei vostri preparati, quello dell’intestino
tenue è colorato con la PAS e serve proprio per evidenziare in quel preparato di intestino il muco
all’interno delle cellule perché il muco è costituito da una glicoproteina che si chiama mucina, dal
contenuto zuccherino e quindi si colora con la PAS. La sigla PAS vuol dire “Acido Periodico di Shiff”
e indica una procedura in due passaggi molto semplici: prima il tessuto lo si fa reagire con l’acido
periodico che, tendendo conto che gli zuccheri, i monosaccaridi hanno una serie di ossidrili liberi
legati ai carboni, ossida i gruppi ossidrilici ad aldeidici; i gruppi aldeidici vengono fatti reagire con il
reattivo di Shiff che altro non è se non fucsina basica fatta reagire con acido solforoso formando
leucofucsina. Ricordate almeno il nome fucsina basica. Il reattivo di Shiff si andrà ad addizionare a
questi gruppi aldeidici colorandoli in rosso, rosso magenta. Dovunque ci siano dei particolari
polisaccaridi neutri ( perché nei polisaccaridi non neutri i gruppi ossidrilici spesso sono occupati e
non possono dare luogo a queste reazioni) essi si coloreranno in rosso magenta, quindi il muco
delle cellule degli epiteli, le membrane basali, ecc. Mentre nei preparati con ematossilina ed
eosina non vediamo proprio la membrana basale perché, pur essendo molto ricca di zuccheri,
glicoproteine, gli zuccheri non reagiscono né con l’eosina né con l’ematossilina, invece, con la PAS,
si colora bene,così come il glicocalice.

Ecco questo è un epitelio intestinale o comunque un qualsiasi epitelio in cui sono presenti cellule
mucipare, il cui citoplasma è colorato in rosso, sono anche chiamate cellule caliciformi perché
assumono, in realtà è un artefatto, una forma a calice con la base sottile e la porzione apicale
dilatata dove si accumula muco che si colora in rosso magenta.
TERZA PARTE

La reazione con colorazione di Feulgen serve per identificare invece un’altra reazione istochimica,
che serve per identificare il DNA, non l’RNA. Si basa sugli stessi reagenti più o meno della reazione
della PAS, ma cambia il primo passaggio, anche se la sostanza è la stessa. Il tessuto viene
sottoposto ad un’idrolisi blanda acida con acido cloridrico, che serve ad interrompere i legami tra il
desossiribosio (lo zucchero del DNA) e le purine, che interrompono questi legami, si liberano i
gruppi ossidrilici del desossiribosio che in ambiente acido con acido cloridrico si ossidano, così
come accadeva nel caso precedente quando si ossidavano ad aldeidi. A questo punto il tessuto si
fa reagire con il reattivo di Schiff (che è sempre la fucsina basica che è stata fatta reagire con acido
solforoso) che lo colora in rosso, e così si evidenzia il DNA. Quindi è più o meno simile alla reazione
PAS, soltanto che lì c’era l’ossidazione con acido periodico e qua c’è l’acido cloridrico, che tra
l’altro scinde anche i legami purine-desossiribosio. La reazione si dice di Feulgen dal nome del
fisiologo tedesco che l’ha messa a punto. L’RNA non si colora perché sul carbonio 2 c’è un ossidrile
del ribosio che impedisce l’idrolisi ad opera dell’acido cloridrico e quindi non si possono liberare gli
ossidrili. I termini colorazioni istochimiche o reazioni istochimiche sono equivalenti, potremmo
usare sia l’uno che l’altro. Questa reazione o colorazione evidenzia quindi solo il nucleo, tutto il
resto del citoplasma rimane incolore.
Per quanto riguarda le colorazioni per i lipidi sono da ricordare solo i nomi di alcuni coloranti dato
che ce ne sono molti. In principio si utilizzano delle sostanze solubili nei lipidi, che andando ad
interagire chimicamente con questi determinano la formazione di prodotti di reazioni colorati. Una
reazione ad esempio molto usata per mettere in evidenza i lipidi è l’olio rosso, che sarebbe in
realtà oil red oil (espresso con la sigla o.r.o.), che è sciolto in una soluzione di alcol etilico e etere.
Naturalmente essendo alcoli, i lipidi dove ci sono nel tessuto a contatto con questi si sciolgono e
poi l’olio rosso precipita sostituendosi al posto dei lipidi e rilascia questo tipo di colorazione. E’
chiamato olio rosso, ma in realtà il prodotto di reazione colorato è di un rosso mattone, più
marroncino che rosso. Invece rossa è la colorazione sudan III o sudan IV, in cui la reazione porta ad
un colore tra il rosso e l’arancio. Il sudan black porta invece ad un prodotto di reazione nero. Poi
c’è anche il blu nilo, ce ne sono molte di colorazioni per i lipidi.
Naturalmente volendo andare a fare una reazione istochimica per i lipidi (è un dettaglio di quello
detto prima) non devo andare ad allestire il preparato così come abbiamo visto in precedenza per
la microscopia ottica, perché nei passaggi in alcol e nelle varie disidratazioni naturalmente negli
alcoli si sciolgono i lipidi e poi non sono più colorabili. Per questo se si vuole studiare la
collocazione o la presenza di eventuali lipidi nel tessuto devo ricorrere ad altre tecniche, per
esempio il congelamento. Qui invece di fissare il tessuto con aldeidi o altro, lo fisso congelandolo,
evitando tutti i passaggi di disidratazione per inclusione e così via, affettando direttamente il
tessuto con una particolare affettatrice che si chiama questa volta criostato, perché è sempre un
microtomo qualunque con la differenza che lavora in una camera a freddo a -20 °C. Così il
pezzettino congelato e fissato è affettato direttamente senza aver bisogno dell’inclusione, dato che
il congelamento lo ha già reso duro: in questo modo è salvaguardata la presenza di lipidi, dato che
in caso contrario ogni volta che facessi un passaggio in alcol li farei sciogliere. Per questo motivo
nei preparati istologici che posseggono lipidi, ad esempio nel tessuto adiposo, per esattezza
nell’ipoderma, ossia nella parte più profonda della cute, possiamo notare molte cellule adipose e
un reticolato vuoto, una sorta di rete a maglie vuota, contenente degli spazi detti nella
microscopia ottica otticamente vuoti. In realtà in questi spazi vuoti ci sarebbero state delle gocce
lipidiche che avrebbero occupato tutto lo spazio, se i lipidi (in questo caso i trigliceridi) non fossero
stati sciolti o solubilizzati durante tutti i passaggi per allestire il preparato, lasciando l’impronta di
quella che era la goccia lipidica. Se invece l’avessimo voluta andare a studiare, avremmo dovuto
congelare il tessuto e non fissarlo con le tecniche di routine.
L’immunoistochimica è una branca dell’istochimica che si avvale non di reagenti che producono
una reazione chimica, ma di un anticorpo, che va ad individuare proteine specifiche, dato che gli
anticorpi generalmente si legano a proteine o glicoproteine. Generalmente l’anticorpo si compra,
perché ci sono in commercio anticorpi contro qualsiasi cosa, e così come per le linee cellulari
esistono dei cataloghi dove ognuno può scegliere uno specifico anticorpo. Se ad esempio si cerca
un anticorpo antirecettore di qualcosa (“pincopallino”), si prende il catalogo e si compra.
Altrimenti si può ottenere l’anticorpo immunizzando l’animale, ossia gli viene data quella proteina
per la quale si vuole l’anticorpo iniettandogliela (se la proteina non è di quell’animale), l’animale
produrrà spontaneamente anticorpi contro quella proteina, si prende il siero dell’animale e si
ricava l’anticorpo. L’immunofluorescenza è l’immunoistochimica in cui la rivelazione del segnale,
cioè dove si trova quella specifica proteina, ci è data da una molecola fluorescente che è coniugata
all’anticorpo. Esiste un metodo diretto, in realtà poco usato:

Possiamo vedere una proteina X e degli anticorpi prodotti contro questa proteina X, cioè anticorpi
capaci di riconoscerla e legarla. Ora si vuole sapere in questo tessuto, in questa sezione istologica
dove è localizzata la proteina X, se c’è e quanta ce n’è, dato che con questo metodo è possibile
effettuare anche una certa quantizzazione, anche se non è del tutto quantitativo. Quindi si coniuga
all’anticorpo specifico una certa molecola che consenta poi di visualizzare la reazione antigenica,
altrimenti il procedimento sarebbe inutile. Dunque all’anticorpo si legano sempre degli enzimi (per
esempio perossidasi) o delle molecole fluorescenti, dette fluorofori, che emettono fluorescenza se
colpite da luce ultravioletta, oppure qualcosa che ci consenta di rilevare l’avvenuta reazione tra
l’anticorpo e la proteina. Ad esempio se utilizzo legato all’anticorpo l’horseradish peroxidase, devo
dargli poi il suo substrato perossidasi che sarà l’acqua ossigenata, verrà prodotta una sostanza
marrone che ci mostra la posizione della proteina X. Se utilizzo invece legato all’anticorpo un
fluoroforo, ossia una molecola che se colpita da luce di bassa lunghezza d’onda la riemette a
lunghezza d’onda superiore nel visibile (quindi a seconda della sua capacità di emissione nel rosso,
nel giallo, nel verde si avrà un segnale diversamente colorato), avrò diversi colori.
L’immunoistochimica si può operare anche a livello di microscopia elettronica coniugando
all’anticorpo questa volta un metallo pesante (dato che è l’unico modo per vedere la reazione al
microscopio elettronico), come una particella di oro o un altro qualsiasi metallo pesante, che al
microscopio elettronico si vedrà come un puntino nero. Il metodo indiretto è invece quello più
utilizzato:
La proteina X e l’anticorpo specifico per la proteina, chiamato anche anticorpo primario,
reagiscono in tessuto e si legano. Nel passaggio successivo, dopo dei lavaggi con un tampone, si fa
reagire l’anticorpo specifico con un secondo anticorpo, detto anticorpo secondario per l’appunto,
che è specifico per il primo anticorpo e non per la proteina, cioè riconosce e si lega all’anticorpo
primario. E’ questo anticorpo secondario che ha legato un enzima (es. perossidasi) o un fluoroforo,
e si lega al primario in più di un sito di legame, amplificando il segnale: è questo il motivo per cui si
utilizza maggiormente il metodo indiretto rispetto al metodo diretto. Infatti si ha un’amplificazione
del segnale, cioè il secondario, legandosi in più di un punto al primario, è molto più intenso
rispetto a quello che otterrei con il metodo diretto, e perciò si usa soprattutto per proteine poco
espresse, cioè presenti in basso numero nel tessuto, che produrrebbero segnali molto deboli con il
metodo diretto. Il metodo indiretto è quindi utilizzato per amplificare il segnale dell’anticorpo e
per rendere più visibili le proteine. Se si utilizza un fluoroforo, non si può utilizzare un microscopio
ottico ma un microscopio a fluorescenza, cioè un microscopio in cui il campione è colpito da luce
non generalmente nel visibile, ma di solito con luce ultravioletta. Il fluoroforo, colpito da luce
ultravioletta, trasmette a lunghezza d’onda maggiore, nel visibile, con differenti colori a seconda
della sua trasmissione. Questa è l’immunofluorescenza. In questo caso si è utilizzato un anticorpo
specifico per una proteina del citoscheletro:

Ci sono dei microscopi a fluorescenza un po’ più complessi, chiamati microscopi confocali a
scansione laser, in cui possono essere fatti degli studi di immunofluorescenza (in cui l’anticorpo è
associato a un fluoroforo) e di colocalizzazione, cioè utilizzare due reazioni contemporanee con
due anticorpi con fluorofori che emettono colori diversi, ottenendo due molecole visibili allo stesso
tempo nella stessa sezione istologica. Questo microscopio però non è tanto utilizzato per la
colocalizzazione, ma per superare il problema dello spessore del preparato (problema comune
nella microscopia): infatti lo spessore del campione è un limite importante per una buona visione
dell’immagine, nel senso che lo spessore deve essere minimo e che è impossibile mettere a fuoco
contemporaneamente tutti i punti del preparato. Infatti un solo piano ottico è messo a fuoco in un
determinato ottico, gli altri punti sopra e sotto il tuo che non sono messi a fuoco disturbano la tua
visione dell’immagine. Tramite questo microscopio questo problema è però risolto, grazie ad un
sistema complesso di specchi riflettenti: si fa passare infatti un raggio laser attraverso un forellino
microscopico, che analizza tutti i punti di un certo piano ottico del campione, e poi di tutti i piani
ottici compresi nello spessore del preparato, escludendo però nella costruzione delle immagini
tutti quei punti che non sono messi a fuoco, dando un’immagine molto nitida su sfondo nero
(come nella normale fluorescenza) che esprime esclusivamente i punti messi a fuoco. Inoltre con
dei software appositi è possibile ricostruire la struttura tridimensionale del campione: vengono
infatti analizzati tutti i piani della sezione istologica creando un’immagine qualitativamente bella e
tridimensionale a fluorescenza.