Uso da Cromatografia

Contracorrente no Isolamento
de Produtos Naturais de
Origem Vegetal e na
Purificação de Reações
Orgânicas.
Gilda G. Leitão
NPPN
 A Cromatografia contracorrente é....
...essencialmente, uma forma de cromatografia de
partição líquido-líquido, na qual a fase líquida estacionária é
retida no aparelho sem o uso de suportes sólidos.

z VANTAGENS DA TÉCNICA:
¾ Versatilidade: sistemas de solventes, fase móvel,
quantidade de amostra, tipo de amostra, etc.
¾ Rapidez e Eficiência do Método
¾ Boa Resolução
¾ Economia: colunas (teflon, aço inox), sistemas bifásicos
aquosos – água destilada
¾ Recuperação Total da Amostra – não há perda por
adsorção
¾ Recuperação da Atividade Biológica em fracionamentos
guiados por testes biológicos
 Princípio Fundamental:

Partição de um soluto entre duas fases líquidas

IMISCÍVEIS

• Extração líquido-líquido: uma única extração

não é suficiente
• Extração múltipla: EFICIENTE: possibilita
explorar pequenas diferenças nas
propriedades de partição (KD) de várias
substâncias envolvidas na separação
 Tipos de CCC:
9 Cromatografia Contracorrente de
Gotículas (DCCC)
9 Cromatografia Contracorrente de
Rotação Locular (RLCC)
9 Cromatografia Contracorrente
Centrífuga de Partição (CPC)
¾ Espiral (HSCCC)
¾ Cartucho (CPC)
Cromatografia Contra-corrente
de Gotículas
 Cromatografia Contra-
corrente de Rotação Locular
 Cromatografia Contra-corrente
Centrífuga de Partição (CPC)
Cartucho
Espiral (Coil)
Cromatografia Contracorrente
Centrífuga de Partição (CPC)
Espiral (HSCCC)
 Escolha de Sistemas de
Solventes:
Várias estratégias:
¾ Dados da Literatura
¾ Escolha do “melhor solvente”
¾ Diagramas de Fase
¾ Criação de um “Banco de Dados”
¾ Gradiente
¾ Pré-varredura por CLAE (H2O:ACN) –
J. Liq. Chrom. & Rel. Technol. 28(12&13), 2041-2051,
2005
 Escolha do Sistema de Solventes:
Placa de cromatografia em
camada fina, eluída com
sistema de solventes
Amostra adequado ou a fase
orgânica do sistema para
CCC que está sendo
testado

Iguais volumes das

duas fases !!! Superior Inferior

Procurar K=1 p/substâncias de interesse

 Exemplos de Isolamento de
Produtos Naturais de Origem
Vegetal:
z Separações Isocráticas:
¾ Triterpenos de Cabralea canjerana

z Separações por Gradiente:

¾ Flavonóides livres e glicosilados de
Siparuna guianensis
¾ Fenilpropanóides e iridóides glicosilados
de Stachytarpheta cayennensis
 Separações Isocráticas:
De Um Sistema Aquoso a um
Sistema não-aquoso:
Extrato em diclorometano de
folhas de Cabralea canjerana

Triterpenos damarânicos

atividade antimicobacteriana
e inibitória da atividade
ATPásica da enzima Pdr5p
 Separação do Extrato em
27
OH
26
Diclorometano:
21
H

19 18
C. canjerana
p. CH2Cl2
30
CCC
HO 2 C
29
820 mg

fr: 1-15 fr: 16-18 fr: 19-22 fr: 23-28 fr: 29-37 fr: 38-47 fr: 48-50 fr: 51-52 fr: 53-57
274,9 mg 17,9 mg 87,7 mg 147,0 mg 35,4 mg 31,7 mg 64,0 mg 43,3 mg 61,3 mg
ácido eichlerianico

Sistema:
Hex: AcOet: MeOH: H2O
1: 1,5: 2,5:1
Fase móvel=inferior,
2ml/min., 850RPM
Fase estacionária = superior
Rotação desligada no tubo:
40
KD=2
 Reprodutibilidade!
Refracionamento

1 3

4
2
 Refracionamento da Fase
Estacionária:
Sistema de solventes: Hexano/ACN/AcOEt 1/1/0,4

Fração 1-3 Fração 4-15 Fração 16-20 Fração 21-23 Fração 24-40

Refracionamento com o mesmo sistema de solventes:

11 frações
Fr 16-19 – derivado do Acido eichleriânico
Separação de flavonóides do extrato em
acetato de etila de folhas de Siparuna
guianensis (Siparunaceae):

Flavonóides de várias polaridades

GRADIENTE
 Gradiente não-linear em duas etapas

Fase móvel inferior, 2ml/min, 850 RPM,

Sf=0,83

Sistema de solvente A Sistema de solvente B

Hexano/ AcOEt/ MeOH/ H2O Hexano/AcOEt/MeOH/H2O
0,6 4,0 0,05 1,0 0,6 4,0 0,7 1,0

Tubos 1 – 10: fase A

Tubos 11 – 26: fase B
Tubos 27 – 50: coleta da fase estacionária, com a rotação
desligada
 OH

HO O
OH

Eluição por Gradiente:

OH

OH O

Ramnosil-Kaempferol Eluição Isocrática

Hex:AcOEt:BuOH:MeOH:H2O
0.6:4:1:0.05:1

Quercetina-7-O-rutinosídio Quercetina-3-O-rutinosídio

Leitão`, G.G. et al., J. Liq. Chrom. & Rel. Techniol., 28(12&13), 2041-2051, 2005
Fenilpropanóides e Iridóides
Glicosilados do Gervão-Roxo
Stachytarpheta cayennensis

Raízes usadas
na medicina
popular
 Otimização do Teor de BuOH no
Sistema de Solvente
AcOEt:BuOH:H2O

AcOEt:BuOH:H2O 1:X:1
A B

A: X= 0.2
B: X=0.5
S I S I A B C C: X=1.0

A: AcOEt:H2O 1:1
B: BuOH:H2O 1:1
S I S I S I
 AcOEt:BuOH:H2O 1:X:1, fase orgânica
como fase móvel, 2ml/min., 850RPM, SF =
78,7%

1.0
BuOH

0.5
0.2

0.05

16 32 42 54 70 Tube
 O

HO
O

Isoverbascosídio
HO O
HO

Martinosídio
O O OH
OH
O
HO OH OH
O OH HO
O OH
O O
O HO O
O
O O OH O O OH
HO OH HO OH

O O
O HO OH OH
HO OH
HO
HO

Verbascosídio

6 7 8 9 10 11 12 13 16 1718 19 20 21 22 23 26 27 28

O O
HO
5152 53 5455 56 5859 60 6162 63 64 65 66 67 68
O

Rotação desligada HO
OGlu

Leitão, G.G. et al., J. Liq. Chrom. & Rel. Technol., 28(12&13), Ipolamiida
2053-2060,2005
Purificação de Reações
Orgânicas.
™ Purificação da reação de preparação da
quinoxalina da nor-β-lapachona
™ Separação da quinoxalina da nor-β-
lapachona de seu N-óxido
™ Separação da fenazina da nor-β-
lapachona de seu N-óxido

9 problemas no isolamento tradicional por CC de gel de sílica

9 o produto mostrou elevado tempo de retenção

Silva, R.S.F., Leitão, G.G., Brum, T.B., Lobato, A.P.G., Pinto, M.C., Pinto,
A.V., J. Chrom. A, 1151 (1&2), 1978-202, 2007.
 ALTERNTIVA?

p o!
Tem nte!
lve
HSCCC s to d e S
o
G a
Purificação da Reação de Preparação
da Quinoxalina da nor-β-lapachona
O
N

O
NH2 N
H2N

24h-ta

O
O

Quinoxalina Sistema de solventes

Hexano/AcOEt/MeOH/H2O
1/1/1/1
Fase superior:móvel, 2ml/min.

Placa cromatográfica das frações

visualizada sob luz UV (365nm)
 Separação da Quinoxalina da nor-β-
lapachona de seu N-óxido
N N
N AMCPB N
O
2h, ta

Sistema de solventes: O O

Hexano/acetonitrila/MeOH 1/1/0,5
Fase móvel: superior, 2ml/min., 850RPM

Rotação desligada
Quinoxalina
N-óxido

28 30...... 56 58 60....
 Separação da fenazina da nor-β-
lapachona de seu N-óxido
O
N O N O
AMCPB

N 2h, ta N

fenazina
N-óxido

UV 365nm

Sistema de solventes: Hex/ACN/MeOH 1/1/0,5

fase móvel: superior, 2ml/min.
850RPM
 Conclusões:
z MÉTODO EFICIENTE
z RÁPIDO
z ECONÔMICO
z Ampla gama de utilização
z Versatilidade nos sistemas de
solvente e conseqüentemente no tipo
de amostra
 CCC2008
5th International Conference
on Counter-current
Chromatography
26 a 30 de julho de 2008
Rio de Janeiro
Brazil
Obrigada pela
atenção!!