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Diagnosi delle infezioni virali

Diagnosi diretta: colture cellulari, determinazione di


antigeni virali e di acidi nucleici
Diagnosi indiretta: determinazione di anticorpi virali

Indagine sierologica:
TEST INDIRETTO, NON SI CERCA UNA COMPONENTE
DEL VIRUS, MA GLI ANTICORPI GENERATI CONTRO
ESSO
Oggi si preferiscono usare saggi tipo EIA, ELISA e RIA, basati sulla
reazione antigene-anticorpo.
Possibilità di automazione, altamente sensibili, specifici, analisi
quantitativa.
Possibilità di misurare l’aumento del titolo anticorpale durante l’infezione
(indice di infezione in atto).
Ove possibile si valutano la presenza di IgM che indicano solitamente
un’infezione recente o in atto.
Alternativa IgA, che offrono il vantaggio di non ricomparire nel siero
durante le reinfezioni.
Presenza di IgG, infezione pregressa, immunizzazione (vaccino, o
guarigione), ma anche infezione in atto.
Problema: difficoltà di individuare il sierotipo coinvolto nell’infezione in
famiglie di virus composite.
• Indagine virologica: ricerca nei materiali biologici del
virione o componenti di esso (proteine o acidi nucleici)
- Isolamento virale con crescita (secrezioni, biopsie, sangue) su colture
cellulari e successiva tipizzazione (giorni)
- Identificazione diretta (secrezioni, biopsie, sangue): ricerca di
antigeni virali tramite saggi immunoenzimatici (EIA) o radiometrici (RIA);
ricerca di acidi nucleici virali tramite Southern blot, Northern blot e
reazione di polimerizzazione a catena (PCR); identificazione diretta del
virus con tecniche di microscopia elettronica, immunofluorescenza (ore)

ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)


Il test permette di rivelare la presenza di anticorpi specifici contro i virus
o antigeni virali nel siero del paziente.
Un antigene virale è fissato su una piastra di plastica, viene aggiunto il
siero del paziente. Se il paziente presenta anticorpi contro l’antigene nel
siero, la reazione di interazione antigene anticorpo causerà l’emissione
di un segnale di rivelazione (fluorescenza, colorazione, emissione
radiazioni in base al tipo di test)
Nel test diretto viene determinata la presenza dell’antigene (semplice o a
sandwich), mentre nel test indiretto si rileva la presenza di anticorpi
verso un antigene.
Il saggio può essere competitivo o non competitivo.
Saggio competitivo: saggio immunochimico basato sulla competizione
tra analita e tracciante (costituente che segnala la reazione antigene-
anticorpo) per l’occupazione di un numero limitato di siti leganti
anticorpali: consiste in pratica nella misura dei siti non occupati
dall’analita.

Esempio per COVID 19

TAMPONE
Il tampone è un test virologico diretto. Da un campione prelevato
dal naso e/o gola viene cercato l’RNA del virus.
La sua positività dimostra la presenza dell‘infezione in corso

TEST SIEROLOGICO
Rivela la presenza di anticorpi contro il virus.
IgM+ IgG-: malattia in corso o molto recente
IgM+ e IgG+: malattia in fase di guarigione o di recente
acquisizione
IgM- IgG+: malattia superata con alta probabilità e non recente

quando IgG e IgM sono entrambe sono positive si fa il titolo anticorpale


o l’avidità delle IgG per vedere la loro affinità per l’antigene ( nelle
donne in gravidanza per CMV)
• Indagine sierologica: ricerca di anticorpi specifici diretti contro
antigeni virali (su siero di pazienti) con tecniche: western blot, saggi
immunoenzimatici (EIA o ELISA) o radiometrici (RIA), neutralizzazione,
fissazione del complemento, inibizione dell’emoagglutinazione (ore)
Riconoscimento della moltiplicazione virale in colture cellulari
• Attraverso l’effetto citopatico (evidenza diretta): comparsa di
alterazioni cellulari (necrosi, apoptosi, citofagia, agglutinazione cellulare,
formazione di sincizi). Osservabile al microscopio a piccolo
ingrandimento. Molto frequente.
• Attraverso evidenza indiretta (non apprezzabile all’osservazione
microscopica delle cellule): saggiando la presenza di potere
agglutinante nel liquido di coltura, la presenza di antigeni virali
(mediante immunofluorescenza), emoadsorbimento, interferenza,
ecc.
L’esame al microscopio elettronico permette sia la conta delle
particelle virali sia la loro caratterizzazione morfologica.

Coltivazione e titolazione dei Virus


Essendo i virus parassiti intracellulari obbligati, per poterne ottenere
la moltiplicazione in laboratorio è necessario disporre di cellule viventi
(animali da laboratorio o colture cellulari) sensibili e permissive.
I primi isolamenti di virus furono fatti coltivandoli in topini neonati
(mancanti ancora di difese immunitarie) o in embrioni di pollo.
• Nell’embrione di pollo i virus vengono inoculati attraverso appositi fori
praticati nel guscio, nei liquidi contenuti in una delle cavità (allantoidea o
amniotica) o sulla membrana corion-allantoidea. I virus crescono nelle
cellule delimitanti le cavità. La moltiplicazione virale si osserva in seguito
alla morte dell’embrione, o alla comparsa di potere agglutinante nei
liquidi embrionali o di lesioni sulla membrana. (virus dell’influenza,
poxvirus, virus erpetici)
• Il topino neonato viene ancora usato per l’isolamento di alcuni virus
(coxsackievirus, togavirus) e viene inoculato per via intracerebrale o
intraperitoneale. La moltiplicazione virale si appalesa con segni morbosi
(tremori,paralisi, rigidità) o morte dell’animale.

Le colture cellulari servono sia ad isolare e moltiplicare il virus, sia ad


osservare le alterazioni cellulari dovute all’infezione virale e a studiare i
meccanismi di replicazione e danno cellulare a livello biomolecolare

Metodiche Molecolari

• La rivelazione degli acidi nucleici virali è un altro


saggio che può essere utilizzato sia per verificare la
presenza di un virus in un determinato campione
biologico, sia per studiare in maniera dettagliata le fasi
del suo ciclo di replicazione.
Analisi qualitativa e quantitativa degli acidi nucleici virali:
viremia per HIV, HBV, HCV
Metodiche: PCR, RT-PCR, NASBA, real time PCR
Analisi genotipica delle resistenza ai farmaci in particolare per HIV,
HBV, HCV
Metodiche: sequenziamento DNA/RNA virale per gestire la terapia

Ricerca diretta degli acidi nucleici virali

• E’ possibile eseguire tale rivelazione se si seguono le


seguenti condizioni:
1) l’acido nucleico virale deve poter essere estratto dai
campioni biologici su cui si vuol eseguire il saggio (colture
cellulari, biopsie, siero, ecc.)
2) deve essere disponibile una sonda di acido nucleico per
l’identificazione del virus

IBRIDAZIONE

• Northern blot analisi effettuata su RNA (genomico o


RNAm).
• Southern blot analisi effettuata su DNA.
In entrambi i casi il saggio prevede estrazione, purificazione e
denaturazione del DNA o RNA e una corsa elettroforetica che
comporta la separazione degli acidi nucleici virali in base alla
loro lunghezza, seguita da un trasferimento su filtri idonei a far
avvenire la successiva fase di ibridazione.
(metodica poco usata)

Saggi di amplificazione degli acidi nucleici

• Reazione di amplificazione a catena (PCR) permette di


amplificare (DNA-polimerasi) un determinato frammento
di acido nucleico.
• Cicli ripetuti di denaturazione, ibridazione e
polimerizzazione fanno sì che la sequenza virale, se
presente, venga amplificata in maniera esponenziale.
• Trattando il materiale estratto con trascrittasi inversa per
trascrivere l’RNA in DNA, la PCR può essere usata anche
con virus a RNA (RT-PCR).
Una PCR può dare dei falsi positivi, con l’analisi qualitativa, con la pcr
real time si fa un’analisi quantitativa che mi dice n. copie di virus nel
campione, fondamentale per misurare la viremia.

Applicazioni cliniche per i test di


quantificazione virale

Il sistema di quantificazione del Citomegalovirus (CMV) è utile


per decidere quando iniziare la terapia preventiva in pazienti sottoposti a
trapianto di organi e per distinguere la malattia attiva da infezione
asintomatica.
I livelli di DNA per CMV possono predire lo sviluppo della malattia da
CMV attiva, con valori più alti di viremia aumentando il rischio di malattia
sintomatica.
Nel trapianto d'organo, la persistenza della carica virale di CMV, dopo la
somministrazione per diverse settimane di farmaci antivirali, è associata
con lo sviluppo di resistenza alla terapia.

Sequenziamento

Il sequenziamento dei prodotti amplificati può fornire una valida


informazione sia sull’identità di un virus il cui acido nucleico è stato
amplificato sia sulla presenza di mutanti virali associati a resistenza ai
farmaci antivirali.
La sua principale applicazione nella diagnostica virale è il rilevamento
del sottotipo virale (HBV, HCV, HPV,HIV) e della resistenza ai farmaci
anti-HIV e anti-HBV da campioni di plasma da pazienti trattati in
fallimento terapeutico.
OBIETTIVI DELLA TERAPIA ANTIVIRALE
1. prevenire la replicazione virale
2. eliminare i reservoirs
3. ripristinare il sistema immune
Attualmente abbiamo a disposizione numerosi classi di farmaci per il
trattamento di:
Influenza
Virus respiratorio sinciziale
Virus Herpes Simplex
Virus Varicella-Zoster
Epatiti virali
Citomegalovirus
HIV
HCV
Perchè continuare la ricerca sui farmaci antivirali?
1) Non esistono per molti virus vaccini efficaci
2) Alcuni virus mutano rapidamente
3) Fenomeni di riassortimento
4) Nuove ed emergenti patologie
5) Lo sviluppo dei vaccini richiede moltissimi anni
6) Patologie che provocano immunosoppressione
Un antivirale ideale deve essere
1. chimicamente e metabolicamente stabile
2. solubile in acqua
3. facilmente assorbito
4. prontamente biodisponibile ed avere un’emivita ottimale
NON DEVE ESSERE
tossico
carcinogenico
allergenico
mutagenico
teratogenico
I farmaci antivirali interferiscono con una specifica funzione, ad esempio
un enzima, indispensabile per consentire al virus di replicare.
Nel caso in cui interferisca con funzioni cellulari deve:
Essere cruciale per il virus ma non per la cellula o Uccidere
esclusivamente la cellula infetta
Mentre per i batteri esiste una vasta gamma di farmaci altamente
selettivi, per i virus a causa della loro capacità di replicare
esclusivamente in cellule dell’organismo ospite, lo sviluppo è più
complesso

Farmaci antivirali
Farmaci contro gli herpesvirus
Farmaci contro i virus influenzali
Farmaci contro HIV
Farmaci contro HCV
Farmaci contro HBV

PRIONI
Si tratta di proteine mal ripiegate capaci di indurre tale modificazione
anomala in altre proteine dello stesso tipo. A volte alle proteine può
essere associato anche una molecola di acido nucleico di piccole
dimensioni e comunque non in grado di codificare per la proteina di cui il
prione è formato. Pur essendo completamente diverse dai virus e dai
viroidi, i prioni sono raggruppati con questi elementi genetici per motivi
storici, poiché sono stati identificati come agenti infettivi costituiti da
proteine che sono in grado di infettare cellule nervose, causando
malattie neurodegenerative, come l’encefalopatia spongiforme bovina
(BSE) o malattia della mucca pazza, il kuru, la malattia di Creutzfeldt-
Jakob e lo scrapie delle pecore. Per la replicazione della proteina
patologica, il prione sfrutta il fatto che la cellula ospite contiene nel
proprio genoma un gene che codifica una proteina molto simile a quella
prionica, definita PrPc proteina prionica cellulare. I prioni riescono a
modificare tale proteina dell’ospite durante o dopo la sintesi e questi
cambiamenti influiscono sulla conformazione tridimensionale della
molecola proteica, provocandone l’alterazione della funzionalità e delle
caratteristiche biochimiche e trasformandola nella proteina patologica
responsabile della neurodegenerazione.
IL KURU
Malattia diffusa soprattutto nelle popolazioni della Nuova Guinea, dove
veniva praticato il cannibalismo, causata da una prima mutazione
spontanea avvenuta in un uomo che venne in seguito divorato dai suoi
simili contagiandoli.
BSE O MORBO DELLA MUCCA PAZZA
I primi casi di ‘’mucca pazza si manifestarono nel 1986, e crebbero
esponenzialmente a causa dell’utilizzo delle farine di origine animale
prodotte con carni di pecore infette da scrapie, date in pasto ai bovini.
Dopo questo primo salto di specie, nel 1996, ve ne fu un altro, poiché
vennero immesse su mercato carni di mucche infette, provocando la
nuova variante del morbo di CJ che colpisce l’uomo. Le malattie
prioniche sono difficilmente debellabili poiché distruggere tali proteine è
estremamente complesso. Resistono a: - Alte temperature: 360 °C -
Radiazioni