DETERMINACION DE CAFEINA EN PEPSI Y COCA-COLA POR

CROMATOGRAFIA LIQUIDA (HPLC)

Facultad de ciencias. Universidad del Valle.

Por medio de cromatografía liquida o (HPLC) se determino la concentración de cafeína

en dos muestras una de pepsi y otra de coca-cola, para ello se utilizo el método de
curva de calibración en donde se prepararon estándares desde 8 hasta 64 ppm de
cafeína. Los resultados obtenidos fueron % de cafeína en pepsi y % de cafeína en
coca-cola.

DATOS, CALCULOS Y RESULTADOS

Tabla 1. Datos obtenidos en la práctica para la determinación de cafeína

Concentración Tiempo de
(ppm) Área retención (S)
8
8
8
16
16
16
32
32
32
48
48
48
64
64
64
Pepsi
Coca-cola
 Gráfica 1. Curva de calibración
CONDICIONES
CROMATOGRAFICAS

Tabla 2. Condiciones cromatográficas

 REGRESIÓN LINEAL PARA LA
Vol.: 20 L Filtro: 0,45m DETERMINACIÓN DE LA
Flujo: 1 mL/min Fase móvil: 50-50 CONCENTRACIÓN DE LAS
Columna: C-18 = 275 nm MUESTRAS

A pesar de que con los datos obtenidos

con los patrones se puede hacer la
curva de calibración, es necesario
 PROMEDIO DE LAS AREAS DE tratar estadísticamente los datos
LOS PATRONES obtenidos, para así poder hallar la
recta que mejor se ajuste a los datos y
Para realizar la curva de calibración se de ella poder determinar la
tomaron 5 patrones de 8, 16, 32, 48, concentración de cafeína en las
64ppm, a los cuales se les muestras.
determinaron las áreas por duplicado,
los datos obtenidos, se reportaron en
la tabla 1, después con esos datos se
determino el promedio de las áreas
para cada muestra.

Medias de las áreas para los

Tabla 3.
estándares
Concentración Área
8
16
32
48
64

Con estos datos se construye la curva

de calibración, la cual es

Curva de calibracion para la determinacion de

cafeina

5000 y = 53,353x + 32,662

4000 R2 = 0,9986
3000
Area

2000
1000
0
0 20 40 60 80 100
Concentracion (ppm)
Tabla 5.Variables estadísticas de la línea de regresión obtenida para la curva de calibración
 CURVA DE CALIBRACION POR MINIMOS CUADRADOS
Estándar Xi Yi (Xi-X*) (Xi-X*)2 (Yi-Y*) (Yi-Y*)2 (Xi-X*)(Yi-Y*)
1 8 -25,6 655,36
2 16 -17,6 309,76
3 32 -1,6 2,56
4 48 14,4 207,36
5 64 30,4 924,16

Σ 168 0 2099,2 0 9349659,47 174997,2

X* 33,6
De la misma manera se hace para la
Con los datos de la tabla 5 se procede coca-cola Y= 1942.9 y X= 35.80
a hallar la pendiente y el intercepto de ppm, con este dato se saca la
la línea recta que mejor se ajusta a los concentración de cafeína en la coca-
datos cola

obtenido
Tabla 6. Pendiente, intercepto y R2
mediante regresión lineal
Pendiente
Intercepto
R2
Desviación de la
pendiente
De aquí obtenemos que la ecuación de
la recta es y = ¿?x + ¿?, a partir de
esa ecuación y teniendo en cuenta la
dilución hecha podemos hallar la
concentración de cafeína en las
muestras, para ello despejamos X de
la ecuación de la recta y reemplazamos
Y por el promedio de áreas obtenido el
la tabla 4.
X= Y –
Para la pepsi Y=, por lo tanto
X=39.07 ppm, pero como se
tomaron 5 mL y se diluyeron hasta 25
mL, se debe tener en cuenta esta
dilución, así que la concentración de
cafeína en la pepsi es:
39.070 mg x 25 = 195.35 ppm
L 5
35.80 mg x 25 = 179.00 ppm
L 5
Estos datos expresados en mg/100ml
(% P/V) de solución son:
Pepsi: 19.535 %
Coca-cola: 17.900%
DISCUSION Y ANALISIS
En la practica se hizo la determinación
de cafeína (ver figura) en dos
muestras, una era pepsi y la otra coca-
cola, para esta determinación se utilizo
la cromatografía de líquidos de alta
eficacia o HPLC, esta técnica es una de
las mas ampliamente utilizada en
determinaciones analíticas, esto se
debe a que es muy sensible, exacta y
reproducible.
Figura 1. Estructura de la cafeína
Dentro de esta cromatografía, se
encuentra la cromatografía de reparto,
la cual se divide en cromatografía
liquido-liquido y fase unida
químicamente, esta última se parte en
dos fase inversa y fase normal, en este
caso se utilizo la de fase inversa, en
ella el recubrimiento enlazado tiene un
carácter no polar.
Para esta cromatografía se utilizo una
columna C18, se denomina así por que
la cadena R que posee el relleno es un
n-octadecilo. En fase inversa los
grupos hidrocarburos de cadena larga
se alinean al uno junto al otro y en
perpendicular a la superficie de la
partícula, formando así una estructura
semejante a la de una brocha, a
demás en este tipo de columnas la
elusión se lleva a cabo con una fase
móvil de elevada polaridad como es el
caso de una disolución acuosa con
disolventes como metanol.
Al iniciar las determinaciones se
trabajo inicialmente una composición
en la fase móvil de 75-25 es decir 15
de agua y 25 de metanol, si embargo
cuando se tomo el cromatograma este
demoro mucho tiempo, la causa de
este retraso es debida a que si se
necesitan tiempos de retención cortos,
la polaridad del analito debe ser
parecida a la de la fase móvil, pero
como se estaba agregando mucha
agua, que es el compuesto mas polar
de todos los que se utilizan, el analito
tenia mas afinidad por la fase
estacionaria, por lo tanto tendía a
quedarse mas tiempo en la columna,
luego cuando se cambio la fase a 50-
50, la polaridad de la fase móvil bajo
un poco, lo que hizo que el analito
saliera mas rápido, por la afinidad que
este poseía ya con la fase móvil. Sin
embargo se debe tener en cuenta que
la afinidad entre el analito y la fase
móvil no puede ser demasiada, ya que
esto causaría tiempos de retención
demasiado cortos, lo cual no es bueno,
lo mejor es tratar de buscar una fase
móvil que sea más afín al analito que
la fase estacionaria, pero sin exceder
esta afinidad.
Entonces una vez introducida la
muestra, la fase estacionaria, se
comporta como una brocha,
deteniendo los compuestos mas
voluminosos y pesados, sin embargo,
debido a la afinidad que tiene el analito
por la fase móvil, este solo demora un
tiempo determinado dentro de la
columna, después de ese tiempo, este
sale y genera la señal, la cual se refleja
como un pico, al cual se le determina
el área.
Este método es muy preciso y exacto,
sin embargo hay factores que pueden
producir errores, como el tamaño de
las moléculas, la presión interna de la
columna, pH superiores a 7.5, entre
otros.
PREGUNTAS
1 ¿Cuál es la composición de la
columna C18 usada en la práctica?
Explique.
R/ La columna C18 se compone de
Hypersil ODS, un grupo silano (Si-OH)
se esterifica con un alcohol R-OH
donde R es el grupo Octadesil (–
(CH2)7CH3). Por ser extremadamente
no-polar es utilizado en cromatografía
de fase reversa.
2. ¿Si usted posee la opción de
realizar un análisis por HPLC o
cromatografía de gases, cuál de
los dos métodos recomienda?
¿Por qué?
R/ Recomendaría el método de
acuerdo a la muestra que tenga por
analizar. Si lo que deseo analizar son
muestras volátiles, de bajo peso
molecular o no termolábiles lo ideal es
trabajar con cromatografía gaseosa,
pero si lo que busco es separar
especies no volátiles, con pesos
moleculares altos o termolábiles, tales
como aminoácidos, proteínas, ácidos
nucleicos, hidrocarburos,
carbohidratos, fármacos, antibióticos,
etc., lo más conveniente es trabajar
con cromatografía líquida HPLC.
Cabe aclarar que ambas
cromatografías pueden servir para
compuestos con propiedades
intermedias con respecto a las
requeridas en las dos cromatografías,
pero para determinar cual de las dos
técnicas se adapta más o da un
resultado mejor es conveniente
comprobarlos experimentalmente. Pero
si se trata de buscar la economía la
cromatografía gaseosa es más
indicada, ya que la líquida requiere el
uso de solventes de calidad HPLC, que
son costosos y esto lo que más se
gasta en este tipo de cromatografía.
3 ¿Explique por qué en HPLC
realizar la cuantificación con
curva de calibración es precisa
mientras que en cromatografía
gaseosa es aconsejable realizarla
con el uso de un patrón interno?
R/ La reproducibilidad con que se
puede introducir la muestra en la
columna es un factor limitante en la
precisión de las medidas tanto en
cromatografía gaseosa como en HPLC.
En cromatografía gaseosa es
aconsejable utilizar un patrón interno
ya que el volumen de muestra que se
inyecta no es preciso y de esta manera
con ayuda de ese patrón se logran
minimizar los errores por inyección.
Por el contrario en HPLC no es
necesario el uso de este patrón ya que
la muestra se inyecta utilizando bucles
de muestra los cuales permiten la
elección del tamaño del volumen que
deseo inyectar.
CONCLUSIONES
 La cromatografía de HPLC es un
método muy efectivo a la hora de
determinar concentraciones de
compuestos en soluciones muy
complejas, además es reproducible y
repetitivo
 La afinidad de analito hacia la fase
móvil o estacionaria determina el
tiempo de retención del mismo en la
columna, por eso se debe tener mucho
cuidado a la hora de determinar la
composición de la fase móvil.
 Es muy importante manejar el
tamaño de las partículas que van a ser
introducidas en la columna, ya que
partículas demasiado grandes
causarían un taponamiento de la
columna, lo cual seria muy grave.
BIBLIOGRAFIA
 SKOOG, D. Holler, F., Principios de
Análisis Instrumental, quinta edición,
Editorial McGraw-Hill, 2001, Madrid
España, capitulo 28.
Suspender la sospechada amina en
una disolución de hidróxido sódico.
Al añadir cloruro de
benceno sulfonilo
cloruro de p-toluensulfonilo
Se añade una disolución de 2 - naftol