ECOFISIOLOGIA VEGETAL

Ante los distintos factores de estrés que tienen que soportar durante las fases de la
micropropagación, todas las plantas producidas en recipientes con escaso intercambio
gaseoso, pueden manifestar alteraciones en su estructura anatómica, morfológica y fisiológica.

Estas respuestas, tendrán mayor o menor incidencia dependiendo de la especie e

incluso de la variedad.

La hiperhidricidad también descrita como vitrificación, suculencia

o translucencia es uno de los principales factores limitantes en la propagación de plantas
mediante cultivo de tejidos.

Los cultivos que sufren este proceso tienen una apariencia brillante, translúcida, con hojas
frágiles y su morfología indica un exceso de contenido en agua.

La hiperhidricidad es un problema frecuente en

cultivos, y varía su intensidad con la especie, la variedad y
las condiciones de cultivo

factores que contribuyen al desarrollo de la hiperhidricidad

elevada humedad en el recipiente y la presencia de agua libre en los substratos

control de la hiperhidricidad
disminuyendo la humedad relativa del recipiente
reduciendo los niveles de citoquininas
incrementando la concentración de agar
cambiando la composición del medio de cultivo
reduciendo la temperatura

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Existen estrategias para controlar el ambiente en los
sistemas de micropropagación ya sea en cultivos heterótrofos, mixótrofos o autótrofos que van
a depender de distintos factores como la especie, el número de transplantes requerido o el precio
final de la planta

La forma más sencilla de

modificar el ambiente in vitro, consiste en utilizar ventilación por difusión en
los recipientes de cultivo, cambiando el sistema de cierre por un material permeable
o incorporando filtros en el recipiente que aumentan la tasa de ventilación,
disminuye la humedad relativa y eleva la disponibilidad de CÜ2 durante el fotoperíodo.

La introducción de CÜ2 en los recipientes permitió observar que la tasa de fotosíntesis

neta está directamente relacionada con la concentración de CÜ2, irradiancia y temperatura,
observando valores análogos a las obtenidas en invernadero con el mismo tipo de plantas
ventajas

Determinación de las tasas de intercambio de gases en el interior de un

recipiente de cultivo
La concentración de CÜ2 en un recipiente de cultivo depende de la tasa de intercambio
gaseoso, del medio de cultivo, de las características físicas del recipiente de cultivo, así
como de la concentración de gas y flujo de aire existente en el exterior de los recipientes.

Se han desarrollado ecuaciones para explicar las relaciones del ambiente gaseoso en el
interior del recipiente, las cuales pueden ser aplicadas a todos
los constituyentes del ambiente de un recipiente de cultivo (CÜ2, Ü2, CiHt y NI)

la tasa de intercambio puede ser definida como la cantidad (ya que el volumen de un gas
puede ser expresado en moles o gramos para una temperatura dada) de flujo de un gas por
unidad de tiempo hacia el interior.

Fujiwara y Kozai, proponen emplear

la relación:
NV=N'V, donde N' es la tasa de intercambio y V el
volumen del recipiente sin medio ni material
vegetal.

Para determinar N' se recomienda utilizar la ecuación de Seidel (2), empleando un

gas trazador para determinar los cambios que se producen en la concentración de dicho gas
en los recipientes vacíos a lo largo del tiempo.
N'= 1/T [(Ci-Cout)/(C2-CoUt)] donde Cout se supone constante, €2 la concentración inicial y Ci la
concentración transcurrido un tiempo T.

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Fotosíntesis de plantas cultivadas in vitro
En algunas especies, la tasa fotosintética es especialmente baja, probablemente a causa del
marchitamiento que se produce al extraer las hojas del recipiente para proceder a su
medida

los valores de fotosíntesis neta observados

com respecto a la irradiancia o a la concentración de COi, son similares a los que
presentan las plantas ex vitro

En otras especies, el incremento de irradiancia aumenta la respuesta fotosintética

El aparato fotosintético y sus actividades enzimáticas

La actividad Ribulosa-l,5-bifosfato carboxilasa (Rubisco) disminuye al aumentar la concentración de
sacarosa en el medio de cultivo
Además, las actividades Rubisco y Fosfoenolpiruvato
carboxilasa (PEPC), se ven claramente afectadas al aumentar la concentración relativa de
oxígeno en el interior de la atmósfera de los recipientes de un 5% a un 21%

El estudio de las enzimas Rubisco o PEPC puso de

manifiesto que las actividades varían durante las distintas fases de cultivo,
incrementándose en el inicio de los cultivos y disminuyendo al final

Las actividades pueden estar condicionadas por los reguladores del

crecimiento empleados en cada fase de la micropropagación.

Fotosíntesis en el interior de los recipientes

en los recipientes de cultivo con baja tasa de intercambio gaseoso, se pueden observar
marcadas fluctuaciones diarias de la concentración de Co2 en su interior.
la liberación de Co2 durante la respiración que provoca un incremento de su concentración
al final del período oscuro, depende de las especies, tamaño de tallos o plantas, estado de
desarrollo, etc.
los explantos precisan de una fuente de energía
exógena que se incorpora al medio de cultivo.

los explantos clorofílicos tienen, la capacidad fotosintética restringida debido a las bajas
concentraciones de CÜ2 en el recipiente de cultivo durante el fotoperíodo

el nivel de heterotrofía, mixotrofía o autotrofía dependerá, de la capacidad fotosintética de

la especie en cultivo, de la composición del medio, volumen y formas de los recipientes, y
del sistema de cierre de dichos recipientes.

concentraciones de azúcar superiores a un 3% disminuyen la fotosíntesis ,la respuesta

fotosintética frente a distintas concentraciones de CÜ2 y de sacarosa, parece indicar que el
desarrollo del aparato fotosintético depende principalmente de la concentración de CÜ2
existente en los recipientes de cultivo .

Normalmente, los explantos cultivados en medios con sacarosa acumulan grandes

cantidades de almidón en los cloroplastos debido a la baja exportación de azúcares fuera
de la hoja

Utilización del potencial fotosintético durante las fases de micropropagación

1. Las hojas de explantos/tallos/plantas in vitro tienen capacidad

fotosintética
2. La capacidad fotosintética está restringida por una baja concentración de
CÜ2 durante el fotoperíodo
3. Existe un crecimiento obligadamente heterótrofo o mixótrofo
4. La actividad Ribulosa-1,5-bifosfato carboxilasa (Rubisco) y la
fotosíntesis neta disminuyen al aumentar la
concentración de sacarosa por encima del 2%
5. Una elevada irradiancia no aumenta la tasasfotosintética si la
concentración de CÜ2 es limitante
6. Las plantas crecen más rápidamente bajo condiciones de autotrofía, con
elevada irradiancia y CÜ2, que en
condiciones de hetera- o mixotrofía
7. El crecimiento inicial bajo condiciones autótrofas es mayor para
explantos con hojas de mayor área y
elevada capacidad fotosintética
8. La composición del medio de cultivo definida para la micropropagagión
hetera- o mixótrofa no es
adecuada para la micropropagación autótrofa
9. La falta de renovación del aire en el interior de los recipientes (además
de la baja concentración de CÜ2
también limita la fotosíntesis)
10. La renovación del aire sea por difusión o ventilación forzada promueve
la fotosíntesis y el crecimiento

Sistemas de medida de fotosíntesis in vitro

La fotosíntesis de las plantas producidas in vitro, fue analizada utilizando una pequeña cámara
de asimilación con una sistema de aire forzado bajo condiciones ambientales controladas.

la medida de la fotosíntesis neta in situ puede diferir de la obtenida en una cámara de asimilación
con idéntica concentración de COi, irradiancia, y temperatura a las del interior del recipiente.

Sistemas alternativos para medir fotosíntesis in situ han sido desarrollados en donde se utiliza
analizadores de infrarrojos para medir el CÜ2,

en muchas ocasiones la tasa fotosintética no refleja los valores reales que se obtendrían con una
ventilación natural por difusión.

la fotosíntesis neta de explantos y plántulas en cultivo de tejidos, en situaciones de

ventilación forzada, es superior a la que se obtiene con ventilación por difusión.

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las necesidades culturales de las plantas durante el transplante, dependerán de la
especie y de las condiciones previas de cultivo.

Causas del fracaso en el trasplante y aclimatación de las plantas obtenidas

in vitro
\. Factores que contribuyen a una excesiva pérdida de agua:
> Baja funcionalidad estomática
^ Excesiva transpiración cuticular
> Pobre transporte de agua a través de las raíces
2. Factores que afectan a la fotosíntesis
3. Débil protección del sistema radicular en el transplante

El análisis de la pérdida de agua de hojas escindidas muestra que la deshidratación es

significativamente más baja en plantas cultivadas en invernadero que en las plantas
cultivadas in vitro.
hay una relación positiva entre el crecimiento en condiciones de baja humedad

Preaclimatación durante las distintas fases de producción de planta in vitro

La preaclimatación ha sido desarrollada principalmente con cultivos
heterótrofos y consiste en la disminución de la humedad relativa mediante diversas técnicas.

El método más sencillo para preaclimatar plantas, consiste en destapar

los recipientes varios días antes del paso a suelo de las plantas (

la apertura de los recipientes no plantea

graves problemas de contaminación durante la semana que permanecen abiertos.

Cuando las plantas enraizan y son preaclimatadas en medios gelificados deben ser
cuidadosamente lavadas con agua a la que se
puede añadir un fungicida, eliminando los restos de substrato adherido a las raíces, ya que
pueden inducir el crecimiento de organismos patógenos

Control de la humedad relativa durante las distintas fases de producción in vitro

Con el descenso de la humedad relativa se pretende aumentar la funcionalidad
estomática, incrementar la deposición de ceras epicuticulares, y mejorar la
supervivencia tras la transferencia a suelo.

A) Soluciones salinas saturadas y desecantes:

El uso de desecantes ha sido empleado por distintos autores para disminuir la HR dentro
de los recipientes de cultivo aunque la utilización de desecantes plantea el problema de que a
lo largo del cultivo la evaporación puede provocar una deshidratación del agar

la HR entre 85-90% en el recipiente de cultivo, permite afrontar la etapa de enraizamiento o

aclimatación en plantas de patata con un menor estrés
en el transplante a suelo.

B) Ventilación de los recipientes de cultivo mediante filtros:

La presencia de filtros, dependiendo de su composición, su diámetro y de las condiciones
exteriores de la cámara de cultivo, aumenta considerablemente la evaporación del agua en el
recipiente

Si se utilizan recipientes ventilados con filtros que presenten una tasa elevada de
evaporación, puede ser necesario compensar la pérdida de agua.

La elección de las tasas de ventilación mediante filtros depende de la

especie y de la fase de la micropropagación.

En general a menor HR le corresponde menor apertura y densidad

estomática de las plantas obtenidas en cultivo

Las plantas producidas en recipientes con filtros tienen una menor conductancia estomática, y
una respuesta más rápida ante cambios en la concentración de CÜ2, y en el paso de luz a
oscuridad.

C) Sistemas de ventilación forzada:

se han desarrollado recipientes que permiten realizar cultivos con soportes de poliéster o lana de
roca, ventilación forzada y reemplazar el medio de cultivo en el curso de la propagación.

D) Control del balance temperatura/humedad en el recipiente:

enfrían la parte basal del recipiente, en donde no sólo disminuyen la evaporación de agua del
substrato, sino que lo que se condensa, en vez de
hacerlo en las paredes del recipiente vuelve a caer al fondo, disminuyendo la
humedad relativa de la atmósfera del recipiente.

Aclimatación /// vitro mediante retardantes del crecimiento

La aplicación de retardantes del crecimiento facilita la aclimatación de plantas obtenidas
en recipientes no ventilados
Estos retardantes aumentan el grosor de la pared de las células guarda y la cantidad de ceras
epicuticulares, y disminuyen el tamaño de la hoja.
Los efectos obtenidos con paclobutrazol
(PBZ) son similares a los obtenidos reduciendo la humedad relativa, y muestran una cutícula
más gruesa e incrementan la tasa peso fresco/peso seco.

el descenso de la HR durante el cultivo, puede facilitar la apertura y

cierre de los estomas durante el transplante, aunque el funcionamiento estomático
es superior a las detectadas en plantas de invernadero.

En la aplicación de retardantes del crecimiento debe tenerse en cuenta que

dependiendo de la especie y de la concentración empleada, pueden inhibir el crecimiento
de los tallos formados in vitro,

Enraizamiento y Aclimatación
los tallos de calidad obtenidos durante las fases de multiplicación y/o elongación deben ser
enraizados.
Las condiciones en las cuales se realice el enraizamiento, sea in vitro o ex vitro, van a condicionar la
calidad final de la planta.

El enraizamiento tradicional in vitro dependiendo de las

especies, puede realizarse en dos fases (inducción, -con reguladores- y de expresión -sin
reguladores-), o en una fase de inducción in vitro y posterior expresión ex vitro.

El enraizamiento ex vitro también puede realizarse en dos fases, sin embargo la aplicación de
reguladores durante tiempos largos presenta dificultades

problemas descritos en el enraizamiento in vitro podemos

restringe el paso de agua desde las raíces al tallo,
condicionando el proceso de aclimatación.
la formación de raíces en medios gelificados, que en algunas especies son gruesas y poco
desarrolladas,en especies leñosas, donde la formación de raíces secundarias y
pelos absorbentes disminuye drásticamente en medios gelificados.

Cuando se combina enraizamiento y aclimatación, deben tenerse

en cuenta la HR, temperatura y luz.

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Humedad relativa
Dependiendo de las condiciones anatómico-fisiológicas de las plantas previamente
desarrolladas en condiciones in vitro, puede ser absolutamente necesario mantener una
elevada humedad relativa durante los días que siguen al transplante.
.
La pérdida de agua a través de los estomas y de la cutícula, conlleva la desecación de
las plantas durante la aclimatación
La mayoría de los laboratorios comerciales han evitado el uso de un sistema
automático de riegos para mantener una elevada humedad
porque, provoca un medio húmedo, y crea un ambiente favorable al crecimiento de algas, hongos y
bacterias por lo que se ha utilizado un sistema de niebla

Antitranspirantes
El uso de antitranspirantes para reducir la pérdida de agua durante la aclimatación
depende del producto y de la especie que se produce.
El ABA, aumenta la resistencia estomática en hojas de plantas obtenidas a partir
de semillas y en las nuevas hojas que se forman en las plantas ya aclimatadas.
CO2
La aplicación de concentraciones elevadas de CÜ2 para conseguir cultivos autótrofos y/o
una disminución de la humedad relativa
Las plantas transferidas a suelo para proceder a su aclimatación, presentan una conductancia adaxial
y abaxial muy elevada, que va descendiendo gradualmente durante la
aclimatación a condiciones ex vitro.
Luz
Las hojas de plantas situadas bajo una iluminación demasiado intensa se vuelven
cloróticas por lo que se recomiendan aclimatar las plantas durante cuatro semanas con sombra

las plantas que se aclimaten con una mayor irradiancia, serán posteriormente más tolerantes

SE debe prestar atención a los fenómenos de fotoinhibición e incluso

destrucción de la clorofila por una excesiva iluminación de las plantas durante su
aclimatación

se suele impedir el acceso de luz solar directa sobre las plantas en aclimatación.y se pueden
mover gradualmente las plantas hacia un nivel lumínico superior y en algunas especies, es
importante controlar el fotoperíodo.

Suelo y recipientes
El medio de crecimiento y los recipientes de transplante son especialmente importantes en
el caso de microestaquillas que serán enraizadas y aclimatadas simultáneamente.

Para optimizar el enraizamiento se

utilizan medios uniformes y homogéneos, con pH adecuado, bien tamponados, reproducibles y
suficientemente porosos para favorecer un buen drenaje y
riego

Control fitosanitario
El control sanitario y la prevención de enfermedades a través de todo el proceso de
aclimatación es esencial en el éxito del transplante, ya que las plantas son susceptibles a las
enfermedades causadas por microorganismos.

Generalmente se utiliza una acción integrada de prevención sanitaria y aplicación de

pesticidas.

desinfectar o esterilizar
el medio, desinfectar los recipientes, soportes, accesorios y utensilios.

Temperatura
La temperatura del aire y el medio en el cual crecen las plantas se controlan normalmente
durante la aclimatación, calentando el ambiente en invierno y enfilándolo en verano.

Fertilización
Se añaden macro- y/o micronutrientes en el medio al cual se van a
transplantar las plantas.
Los fertilizantes pueden ser añadidos como abono a lo largo de la aclimatación, aunque se debe tener
en cuenta que en algunas especies la fertilización, preferiblemente foliar, es crítica en la
supervivencia de las plantas.