UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA

“Júlio de Mesquita Filho”

Departamento de Química e Bioquímica
Curso de Licenciatura em Química

FABIO YANO
HEITOR FURLAN
TAINA DANIEL
THAOANE KITAYAMA

BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL
CINÉTICA ENZIMÁTICA

Presidente Prudente – SP
Jun/2020
1- INTRODUÇÃO
Com a exceção do grupo de moléculas de RNA catalíticas, todas as
enzimas são proteínas e sua atividade catalítica depende de suas
conformações nativas, a sua estrutura terciária e quaternária [1]. Elas ocupam
papel essencial para as reações biológicas, uma vez que precisam acontecer
em temperatura baixa, como a temperatura corporal humana de ~37°C [2], pH
fisiológico de ~7.4, próximo da neutralidade e meio aquoso, além disso,
comumente há a produção de intermediários instáveis carregados, ou a
necessidade de colisão de duas moléculas em uma orientação exata para a
eficiência de uma reação [1].

Essas reações incluem, por exemplo, a oxidação da glicose às

moléculas de CO2 que garante a manutenção energética do metabolismo de
seres aeróbicos e a ausência de catálise enzimática comprometeria todo esse
processo, tendo em vista que inúmeras reações químicas ocorrem
simultaneamente na célula em velocidade praticamente instantânea para
mantê-la viável [2]. As enzimas contornam as irregularidades das colisões e
todas as dificuldades que o ambiente biológico fornece, pois a reação ocorre
em um bolsão da enzima denominada de “sítio ativo” de maneira que os
resíduos de aminoácidos ao seu redor, permitem a delimitação para o sítio
ativo de forma a aumentar a especificidade da reação e a eficiência da mesma
[1].

Muitas vezes a enzima engloba p substrato retirando-o totalmente da

solução [1] e, em seguida, libera o produto da reação catalisada reconstituindo
sua conformação para agir sobre o próximo substrato. E a reação enzimática
pode ser escrita genericamente pela equação:

Equação 1: Ação enzimática genérica

No entanto, deve-se destacar que a catálise modifica a velocidade de

reação e não o equilíbrio da mesma. O que temos é que mesmo para uma
reação de caráter exergônica (∆G reação negativo) não ocorre necessariamente
instantaneamente [1], pois a velocidade está ligada à energia de ativação,
quanto maior a energia de ativação mais lenta é a reação, que, por sua vez,
depende da estabilidade do(s) intermediário(s). Sendo assim, catalisadores, em
geral, aumentam a velocidade das reações por diminuir a energia de ativação
[1]. Sobre os intermediários é sabido que podem existir mais de um, gerando
uma, duas ou mais etapas, mas para a determinação da velocidade total da
reação é importante saber qual etapa é a mais lenta, que necessita de mais
tempo para acontecer e, portanto, é a determinante para a reação.

Logo, encontrar um mecanismo que melhor represente a reação é algo

importante, uma vez que se descobre quais intermediários possíveis e qual é o
determinante para a velocidade pode-se fazer um estudo a respeito da
influência da concentração do substrato, como as alterações de pH,
concentração do catalisador enzimático e tempo de ação da enzima modificam
a velocidade da reação. Se tratando, essencialmente, da influência da
concentração do substrato sobre a velocidade, Victor Henri notou que o
comportamento não era linear mesmo com o aumento da concentração e
postulou que a formação de complexo enzima-substrato era a etapa
determinante da reação [1].

Leonor Michaelis e Maud Menten (1913) seguiram os estudos e

postularam que a reação era reversível e relativamente rápida (Equação 1),
também compreenderam que a concentração do substrato era um fator que
influenciava na velocidade de forma proporcional pois um aumento na
concentração desloca o equilíbrio para a formação de produtos que, nesse
caso, é o complexo ativado (enzima-substrato) [1].

A partir do conteúdo teórico postulado, foi possível encontrar uma

forma de calcular experimentalmente a constante KM, denominada constante
de Michaelis. A condição de ter a velocidade constante quando a concentração
do substrato está saturada é atingir a velocidade máxima (Vmáx) da reação [2]:
 Em condições ajustadas para que [S] = KM:

Interpreta-se que no momento em que a velocidade da reação atinge a

metade da velocidade máxima (V máx) temos que a concentração do substrato é
igual ao KM. E para obter os dados mais facilmente, um rearranjo na equação
fornece uma equação de primeiro grau que gera um gráfico de comportamento
linear:

E a partir disso, é possível se obter dados com medidas experimentais

que podem utilizar métodos espectroscópicos com apoio da lei de Lambert-
Beer, em que a absorbância é proporcional à concentração do analito e pode-
se aplicar métodos gráficos a fim de quantificar o que foi observado.

A invertase é um biocatalisador com alto potencial da transformação do

dissacarídeo de sacarose em um monossacarídeo como a glicose e a frutose,
originando xaropes de açucares invertidos. O xarope de frutose invertida é
utilizado como adoçante na indústria de alimentos e farmacêutica.

A invertase é encontrada primordialmente em leveduras,

especificamente na espécie Saccharomyces cerevisiae, invertebrados,
vertebrados, algas verdes, vegetais e fungos. A invertase possui uma
estabilização na faixa de pH entre 3,5 a 5,5, sendo utilizada em 65 a 75 °C
caso a solução de sacarose esteja concentrada, caso contrario a enzima vai
ser desnaturada.

Para estudar a atividade enzimática da invertase, que catalisa a

hidrólise do dissacarídeo sacarose para a obtenção da α-D-glicose e β-D-
frutose que estavam ligados por ligação glicosídica do tipo α (1→2) é possível
aplicar tudo o que foi explanado, determinando uma variável (pH, concentração
da enzima, tempo de incubação e etc.) e pode ser aplicado um reagente
colorimétrico como o DNS e na sequência fazer a determinação colorimétrica.
Sendo escolhida como objeto de estudo a concentração do substrato
(sacarose) há a possibilidade de aplicar os conceitos de Michaelis-Menten.

O DNS mencionado é a molécula orgânica de 3,5-dinitro-salicilato

usado para identificação de açúcares redutores, uma vez que a reação (figura
1) baseada na conversão do ácido 3,5-dinitrosalicílico em seu análogo
possibilita a determinação espectrofotométrica [3], sendo a espécie inicial de
coloração amarela e a reduzida laranja.

Figura 1– Reação da conversão do ácido 3,5-dinitrosalicílico em sua espécie

reduzida.

Fonte: Boletim de Pesquisa e Desenvolvimento – Embrapa [3].

Sabendo disso, há a possibilidade de estudar a catálise de reações que

gerem açúcares redutores em outros produtos, tendo em vista que quanto
maior a presença da coloração laranja maior a presença de açucares
redutores.

2- PARTE EXPERIMENTAL

Materiais e reagentes

-Enzima Invertase (0,1mg proteína/ mL)

-Tampão acetato 0,05 mol. L-1; pH 4,7

-Substrato: solução de sacarose 0,2 mol. L -1

- Solução de 3,5 di-nitro-salicilato

- Água deionizada

- Tampão acetato 0,05 mol. L-1 ; pH 4,7

- Tampão citrato-fosfato 0,05 mol. L-1 pH 2,0

- Tampão acetato 0,05 mol. L-1 pH 4,0

- Tampão acetato 0,05 mol. L-1 pH 5,0

- Tampão fosfato 0,05 mol. L-1 pH 6,0

- Tampão fosfato 0,05 mol. L-1 pH 7,0

- Tampão fosfato 0,05 mol. L-1 pH 8,0

- Tampão bicarbonato 0,05 mol. L-1 pH 9,0

- Solução de sacarose nas concentrações 0,01; 0,02; 0,05; 0,1 e 0,2 mol. L -1

Procedimentos experimentais

1- Efeito de concentração da enzima

Adicionou-se os reagentes mostrados na seção anterior, em 6 tubos de

ensaio seguindo as seguintes proporções:

Lembrando sempre que o último reativo a ser adicionado deveria ser a

enzima Invertase. Após serem homogeneizados, fez-se a leitura da
absorbância em espectrofotômetro em comprimento de onda 540nm.

2- Efeito do tempo de incubação

 Como neste caso desejava-se analisar o efeito do tempo sobre a
enzima, as adições dos reativos foram feitas nas quantidades e intervalos
constados na seguinte tabela:

Mais uma vez, lembrando de se adicionar a enzima por último, se

homogeneizou e se realizou medida em espectrofotômetro em comprimento de
onda 540nm.

3. Efeito do pH

Buscando-se verificar a influência do pH na atividade da enzima,

adicionou-se os reativos e a solução tampão aos 8 tubos, de acordo com a
seguinte relação:
 Por fim, homogeneizou-se e mediu-se a absorbância à 540nm.

4- Efeito da concentração de substrato

Nesse caso a variável a ser considerada seria a quantidade de

substrato, portanto, variou-se a concentração da solução de sacarose, as
devidas quantidades constam a seguir:
 Depois de homogeneizados, realizou-se medidas em
espectrofotômetro a 540nm.
Referências

[1] NELSON, D. L. e COX, M. M.. Princípios de Bioquímica de Leningher. 6ª Edição.

Editora Artmed. Porto Alegre - RS. 2014.

[2] CAMPBELL, M. K. e FARREL, S. O.. Bioquímica – Combo. 5ª Edição. Editora

Cengage Learning. São Paulo – SP. 2011.

[3] VASCONCELOS, N. M.; PINTO, G A S.; ARAGÃO, F. A. S.. Boletim de Pesquisa e

Desenvolvimento – Embrapa Agroindústria Tropical. Determinação de Açúcares
Redutores pelo Ácido 3,5-Dinitrosalicílico: Histórico do Desenvolvimento do Método e
Estabelecimento de um Protocolo para o Laboratório de Bioprocessos. Disponível
em: . Fortaleza – CE. 2013.