INB-HIPR08-FLU

HISTOLOGÍA
INMUNOHISTOQUÍMICA CON REVELADO POR ANTICUERPOS ACOPLADOS
A FLUOROCROMOS
1. Objetivo. Establecer la metodología necesaria para la realización de la prueba
de inmunohistoquímica mediante el revelado con anticuerpos acoplados a
fluorocromos.

2. Alcance. Esta técnica es aplicable para el personal que proporciona el servicio

técnico en el área de histología del Instituto de Neurobiología, UNAM, Campus
Juriquilla.

3. Materiales y reactivos.

3.1 Materiales
 Cajas coplin
 Canastilla para laminillas
 Portaobjetos
 Cubreobjetos
 Plumón hidrofóbico
 Cámara húmeda
 Micropipetas

3.2 Reactivos
 Xileno
 Etanol absoluto
 Agua destilada
 Tritón X-100
 Citrato de Sodio dihidratado
 Cloruro de Sodio
 Cloruro de Potasio
 Fosfato de sodio (Na2HPO4)
 Fosfato de Potasio (KH2PO4)
 Tween 20
 Normal goat serum (NGS)
 Albúmina de suero bovino
 Anticuerpo primario
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4422381033 erios.histologia.inb@gmail.com
  Anticuerpo secundario acoplado a algún fluorocromo
 Vectashield
 Entellan
 Formalina

4. Equipo
 Campana de extracción de vapores
 Horno de calentamiento
 Placa de agitación
 Horno de microondas

5. Seguridad
Utilizar el siguiente equipo de protección personal:
 Bata de laboratorio
 Guantes de nitrilo
 Lentes de seguridad

6. Soluciones

6.1 Etanol:Xileno (50:50)

Reactivo Cantidad
Etanol absoluto 250 mL
Xileno 250 mL
Almacenar a temperatura ambiente. Cambiar la solución cada 10 tinciones.
6.2 Etanol al 96%
Reactivo Cantidad
Etanol absoluto 480 mL
Agua destilada Aforar a 500 mL
Almacenar a temperatura ambiente. En caso de que el etanol absoluto se encuentre
a una pureza menor al 100%, se deberán realizar los cálculos necesarios para
ajustar la concentración requerida. Cambiar la solución cada 10 tinciones.

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 6.3 Etanol al 80%
Reactivo Cantidad
Etanol absoluto 400 mL
Agua destilada Aforar a 500 mL
Almacenar a temperatura ambiente. En caso de que el etanol absoluto se encuentre
a una pureza menor al 100%, se deberán realizar los cálculos necesarios para
ajustar la concentración requerida. Cambiar la solución cada 10 tinciones.
6.4 Solución de permeabilización
Reactivo Cantidad
Tritón X-100 250 µL
Citrato de sodio dihidratado 0.25 g
Agua destilada Aforar a 250 mL
Preparar antes de usar. Agitar antes de aforar.
6.5 Buffer de fosfatos (PBS)
Reactivo Cantidad
Cloruro de sodio 8.06 g
Cloruro de potasio 0.22 g
Fosfato de sodio (Na2HPO4) 1.15 g
Fosfato de potasio (KH2PO4) 0.2 g
Agua destilada Aforar a 1L
Ajustar pH a 7.4. Almacenar en refrigeración.
6.6 Buffer de citratos
Reactivo Cantidad
Citrato de sodio dihidratado 2.94 g
Tween-20 500 µL
Agua destilada Aforar a 1L
Ajustar pH a 6.0. Almacenar en refrigeración. Usar de 2 a 3 veces.
6.7 Diluyente PBS-Tritón-BSA
Reactivo Cantidad
Tritón X-100 50 µL
Albumina de suero bovino (BSA) 1g
Buffer de fosfatos (PBS) Aforar a 100 mL
Almacenar en refrigeración.

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 6.8 Solución de bloqueo
Reactivo Cantidad
Normal goat serum (NGS) 25 µL
PBS-Tritón-BSA 500 mL
Preparar al momento.
6.9 Solución de anticuerpos
Reactivo Cantidad
Anticuerpo primario o secundario De acuerdo a la dilución necesaria
PBS-Tritón-BSA Diluir de acuerdo a la dilución
Preparar al momento.
7. Procedimiento
7.1 Desparafinar los tejidos de 30 min a 4 hr (dependiendo del tejido) a 60° C.
7.2 Hidratar las laminillas de acuerdo al siguiente tren de alcoholes:
Reactivo Tiempo
Xilieno 5 min
Xileno 5 min
Etanol absoluto:Xileno (50:50) 1 min
Etanol absoluto 1 min
Etanol al 96% 1 min
Etanol al 80% 1 min
Agua destilada 5 lavados

7.3 Incubar las laminillas con la solución de permeabilización por 8 min.

7.4 Hacer dos lavados con PBS de 5 min cada uno.
7.5 Para el desenmascaramiento, colocar las laminillas en buffer de citratos y
calentar 1.5 min en el horno de microondas (Abrir cada 20 seg). Al finalizar enfriar
con agua destilada, secar y marcar con plumón hidrofóbico.
7.6 Incubar con la solución de bloqueo por 1 hr a temperatura ambiente.
7.7 Hacer dos lavados con PBS de 5 min cada uno.
7.8 Agregar el anticuerpo primario sobre los tejidos dentro de una cámara húmeda,
dejar incubando toda la noche en refrigeración (4-8°C).
7.10 Hacer 3 lavados de 5 min con PBS cubiertos de la luz.

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7.11 Incubar con el anticuerpo secundario por 2 hr a temperatura ambiente y
cubiertos de la luz.
7.12 Hacer dos lavados con PBS de 5 min cada uno cubiertos de la luz.
7.13 Sellar el corte teñido con medio de montaje (Vectashield con DAPI) y colocar
un cubreobjeto sobre la laminilla y presionar para eliminar las burbujas formadas.
7.14 Limpiar la laminilla y mantenerlas en refrigeración. Observar al microscopio de
fluorescencia para su análisis.
8. Referencias
NA
9. Control de cambios
Revisión Fecha Descripción del cambio
001 20-12-2018 Creación del documento

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