Estudio de quimiostato de producción de

ácido cítrico a partir de glicerol

por Yarrowia lipolytica
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superposiciónAnita Rywińska Piotr Juszczyk Maria Wojtatowicz Waldemar Rymowicz
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https://doi.org/10.1016/j.jbiotec.2011.01.007Obtenga derechos y contenido

Resumen
El objetivo del estudio era examinar cómo la tasa de dilución y la composición
química de los impactos medio de producción en la síntesis de ácido cítrico por
la Yarrowia lipolytica cepa Wratislavia AWG7 a partir de glicerol en una cultura
quimiostato. La levadura Y. lipolytica Wratislavia AWG7, un acetato (acet - ) y
un mutante morfológico (fil - ), se cultivó en un medio limitado por nitrógeno y
fósforo a una tasa de dilución de 0.009–0.031  h −1 en el quimiostato. En
condiciones de estado estacionario, el aumento en la tasa de dilución fue paralelo
a la disminución en la concentración de ácido cítrico (de 86.5 a 51.2  g  L −1), así
como por el aumento en la tasa volumétrica (de 0.78 a 1.59  g  L −1  h −1 ) y la tasa
específica (de 0.05 a 0.18  g  g −1  h −1 ) de producción de ácido cítrico. El
rendimiento del proceso de producción varió de 0.59 a 0.67  g  g −1 .
En un cultivo continuo de 550 h de la prueba de levadura, a una tasa de dilución
de 0.01  h −1 , en un medio con concentraciones mejoradas de fuentes de carbono,
nitrógeno y fósforo, la concentración de ácido cítrico, la concentración de
biomasa y la tasa volumétrica de la producción de ácido cítrico fueron
97.8  g  L −1 , 22.2  g  L −1 y 0.98  g  L −1  h −1 , respectivamente. El rendimiento del
proceso disminuyó a 0.49  g  g −1. El número de células muertas no superó el 1%,
mientras que el de las células en gemación representaron aproximadamente el
20%. Debido al bajo contenido de ácido isocítrico y polioles, el proceso de
fermentación se caracterizó por una alta pureza.
Este estudio ha producido el siguiente hallazgo: el doble mutante Y. lipolytica
AWG7 es un productor eficaz de ácido cítrico, con la capacidad de preservar sus
 propiedades sin cambios durante el largo plazo del proceso continuo de
quimiostato. Esta es una característica tecnológica valiosa de tales mutantes.
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Palabras clave

Quimiostato
Ácido cítrico
Glicerol
Yarrowia lipolytica

1 . Introducción
Con una producción anual global superior a 1,7 millones de toneladas
( Anastassiadis et al., 2008 ), el ácido cítrico (CA) ocupa el primer lugar entre los
ácidos orgánicos sintetizados por microorganismos ( Berovic y Legisa, 2007 ). El
ácido cítrico es producido predominantemente por el hongo
micelial Aspergillus niger, pero en los últimos años se ha prestado mucha
atención al uso potencial de la levadura Yarrowia lipolytica ( Anastassiadis et al.,
2008 , Finogenova et al., 2005 ). La levadura puede utilizar una amplia variedad
de sustratos no convencionales como fuente de carbono ( Barth y Gaillardin,
1997), y el rápido desarrollo de las industrias de biocombustibles proporciona un
fácil acceso a grandes cantidades de glicerol, que es el principal subproducto de
la producción de biodiesel y, al mismo tiempo, una materia prima industrial
atractiva y de bajo costo ( Fan et al., 2010 ) . En la última década, Y. lipolytica ha
utilizado con éxito el glicerol como fuente de carbono para la producción de
ácido cítrico ( Imandi et al., 2007 , Levinson et al., 2007 , Papanikolaou et al.,
2002 , Rymowicz et al., 2006 , Rymowicz et al., 2010 , Rywińska et al.,
2009 , Rywińska et al., 2010 , Rywińska y Rymowicz, 2010 ).
Una desventaja de usar Y. lipolytica especialmente cepas de tipo salvaje para la
producción comercial de CA es la secreción simultánea de ácido isocítrico (ICA),
que tiene una capacidad tampón inferior y una capacidad de quelación en
comparación con CA. Además, la cristalización de CA durante el proceso de
purificación se ve afectada por contaminaciones de ICA> 5% ( Förster et al.,
2007 ). Es interesante observar que los polioles, como el eritritol y el manitol, se
produjeron en el caldo de cultivo durante la biosíntesis de ácido cítrico
por Y. lipolytica a partir de glicerol ( Rywińska y Rymowicz, 2010) Los polioles
desempeñan un papel ya que las reservas de carbohidratos se producen como
compuestos de almacenamiento de carbono. En la etapa posterior de la
fermentación, todos los polioles se consumen tan pronto como se agota la fuente
principal de carbono y la levadura puede convertir los polioles en ácido
cítrico. Esto, a su vez, prolongó la fase efectiva de producción de ácido
cítrico. Rywińska y Rymowicz (2009) mostraron que el proceso más corto fue
donde se utilizó glicerol puro (después de 92  h), mientras que se utilizaron
polioles (después de 109  h). Además del alcohol de azúcar, en la etapa inicial de
la fase de producción, la levadura produjo intermedios de un ciclo tricarboxílico,
como el ácido málico y fumárico. Estos metabolitos, como los polioles, se
utilizaron al final de los cultivos ( Rywińska y Rymowicz, 2009 ).
La biosíntesis de ácido cítrico se ha llevado a cabo en regímenes discontinuos,
alimentados y repetidos, así como en cultivos repetidos con reciclaje celular y
reemplazo de medio. La capacidad de la levadura para producir poblaciones
unicelulares bien dispersas ofrece una gran promesa de mejorar la biosíntesis de
ácido cítrico en el clásico cultivo de quimiostato continuo de un solo paso.

2 . materiales y métodos
2.1 . Microorganismo

Se utilizó Y. lipolytica Wratislavia AWG7, un mutante de acetato negativo

(acet - ) con un fenotipo de colonia liso (fil - ) ( Rywińska et al., 2008 ), de la
colección del Departamento de Biotecnología y Microbiología de Alimentos,
Wrocław Universidad de Ciencias Ambientales y de la Vida, Polonia. La cepa de
levadura se almacenó a +4  ° C.

2.2 . Medios de comunicación
El medio para la preparación del inóculo contenía (g  L −1 ): glicerol, 50 (POCh,
Polonia); extracto de levadura, 3; extracto de malta, 3, y bactopeptona, 5 en agua
corriente. Los cultivos se cultivaron en  matraces de 0,3 L que contenían 0,1  L
de medio de inóculo en un agitador rotativo Elpan (Polonia) a 30  ° C durante 3
días. Se añadió 10% (v / v) de inóculo al biorreactor.
El efecto de la velocidad de dilución (0.009, 0.015, 0.021, 0.024, 0.031  h −1 )
sobre el crecimiento de Y. lipolytica y la producción de ácido cítrico en el cultivo
de quimiostato se realizó en medio PM1 contenido (g  L −1 ): glicerol, 150 (POCh,
Polonia ); NH 4 Cl, 3; KH 2 PO 4 , 0,2; MgSO 4 · 7H 2 O, 1; y extracto de levadura
1 en agua del grifo. La producción de ácido cítrico por levadura en cultivo de
quimiostato bajo deficiencia de nitrógeno y fósforo se realizó en medio PM2
contenido (g  L -1 ): glicerol, 200 (POCh, Polonia); NH 4 Cl, 4; KH 2 PO 4 ,
0,25; MgSO 4· 7H 2 O, 1; y extracto de levadura 1 en agua del grifo. La tasa de
dilución fue de 0.01  h −1 .
Los cultivos crecieron en un reactor de tanque agitado de 5 L (BIOSTAT B-
PLUS, Sartorius, Alemania) con un volumen de trabajo de 2.0  L a 30  ° C. La
velocidad de aireación y la agitación se establecieron en 0,36 v / v / min y
600  rev  min -1 , respectivamente. El pH se mantuvo automáticamente a 5,5
mediante la adición de una solución de NaOH al 40% (p / v).

2.3 . métodos analíticos

La biomasa se determinó gravimétricamente después de secar a 105  ° C. El

contenido de proteínas se estableció por el método de Stewart (1975) . La
concentración de ácido isocítrico se midió por un método enzimático ( Goldberg
y Ellis, 1983 ). Las concentraciones de ácido cítrico, glicerol, eritritol y manitol
se determinaron por HPLC (Beckman Gold System, EE. UU.) Con una columna
de ácido orgánico HPX87H de Aminex acoplada a un detector UV a 210  nm y
un detector IR. La columna se eluyó con 20  mM de H 2 SO 4 a temperatura
ambiente, a una velocidad de flujo de 0,6  ml  min -1 .
El carbono, el hidrógeno, el nitrógeno y el azufre se determinaron por
cromatografía de gases con un analizador CHNS EA-1110 (CE Instruments). El
fósforo se analizó usando un espectrofotómetro ICP-AES Liberty 220
(Varian). Las muestras de biomasa se mineralizaron a presión aumentada en un
aparato de microondas CEM-MDS 2000. La biomasa producida en el medio
completo (C: N: P: S  ≈  10: 1: 0.2: 0.1) se utilizó como control ( Rywińska et al.,
2006 ).
Usando la cámara de Thom, se determinó el número total de células, el número
de células muertas y el número de células en gemación a partir de las muestras
recolectadas durante el cultivo ( Rywińska et al., 2008 ). La longitud y el ancho
de las células se midieron usando un micrómetro ocular y el volumen de las
células se calculó usando la fórmula para el volumen de la elipse. Las células
muertas se contaron en las preparaciones teñidas con azul de metilo (1:
10,000). Estabilidad de ACET - y fil - mutación de la levadura se determinaron
usando un método de placa en agar YNB  +  Na-acetato y en agar
YM  +  glucosa, respectivamente ( Rywińska et al., 2008 ).

2.4 . análisis estadístico

Los valores medios y las desviaciones estándar se calcularon a partir de los datos
obtenidos de tres experimentos diferentes. El análisis de varianza se realizó
mediante procedimientos ANOVA unidireccionales seguidos de pruebas Duncan
utilizando Statistica versión 9 (StatSoft, Inc.). Las diferencias estadísticas
en p  <  0.05 se consideraron significativas.

3 . Resultados y discusión
En la literatura, solo se han encontrado algunos informes sobre el uso de cultivos
de quimiostato para la biosíntesis de ácido cítrico por Y. lipolytica. Esos cultivos
se cultivaron con n-parafinas ( Aiba y Matsuoka, 1978 ), glucosa ( Klasson et al.,
1989 , Anastassiadis et al., 2005 , Anastassiadis y Rhem, 2006 ) y etanol
( Kamzolova et al., 2003 ). Hasta el momento, Y. lipolytica no ha rastreado
ninguna publicación sobre la biosíntesis continua de CA en el quimiostato con
glicerol como único sustrato para la producción de ácido cítrico.

3.1 . Efecto de la velocidad de dilución en la producción de ácido cítrico.

El proceso se inició como un cultivo discontinuo en medio PM1 ( Tabla
1 ). Después del agotamiento del glicerol, la biosíntesis continua con cultivos de
quimiostato comenzó a una tasa de dilución de 0.009  →  0.031  h −1 ( Tabla
1 ). Se alcanzó un estado estable (concentraciones constantes de ácido cítrico,
biomasa y glicerol residual) dentro de 1-3 días después de cambiar la tasa de
dilución (1-3 días solo porque las diferencias entre las tasas de dilución no fueron
significativas). El proceso continuó para 2 o 3 reemplazos medios. Cuando la tasa
de dilución aumentó, las concentraciones de ácido cítrico y biomasa
disminuyeron (de 86.5 a 51.2  g  L −1 y 15.3 a 8.8  g  L −1, respectivamente),
mientras que la concentración residual de glicerol en el medio aumentó (de 2.2 a
65.3  g  L -1 ) ( Tabla 1 ). Las concentraciones de subproductos no deseados
(ácido isocítrico, eritritol y manitol) disminuyeron solo ligeramente.
Tabla 1 . Efecto de la tasa de dilución sobre el crecimiento de Y. lipolytica
Wratislavia AWG7 y la producción de ácido cítrico en el cultivo de quimiostato en
medio PM1.

Glicer
Tasa Ácido
Bioma ol Ácido Eritrit Manit
de isocítri
sa residu cítrico ol ol a
 Q  CA (g L −1 h  b  q  CA (g g −1  h  c Y  CA (g g 
diluci co
(g  L −1  al (g  L − (g  L − (g  L − −1
 ) −1
 ) −1
 )
ón (g  L    1
−1
) (g  L − 1 )  ) 1
 )
(h −1 ) )
1
 )
0.009 15,3 a 2,2 d 86.5 a 2.78 a 4.67 a 1.90 a 0,78 0,05 0,59
0,015 13,1 b 15,7 c 81,6 b 2.70 a 6.20 d 2,67 c 1,22 0,09 0,61
2,47
0,021 11,5 c 54,9 b 63,3 c 2,33 c 4.70 a 1,33 0,12 0,67
a. C.
0,024 9.6 d 56,1 b 60,3 d 1.57 b 3.47 b 2.13 ab 1,45 0,15 0,64
0,031 8.8 d 65.3 a 51,2 e 1,53 b 3.86 c 0,30 d 1,59 0,18 0,61

Los valores con el mismo alfabeto a lo largo de la misma columna no son significativamente diferentes
en el nivel 0.05.
una
Q  CA  =  productividad volumétrica de ácido cítrico.
si
q  CA  =  tasa específica de producción de ácido cítrico.
C
Y  CA  =  rendimiento de ácido cítrico (g  ácido  g −1 glicerol).
Las aplicaciones industriales de procesos continuos plantean serios problemas. A
la velocidad de dilución, a la cual el quimiostato de Y. lipolytica alcanza la
máxima productividad específica, es imposible obtener altas concentraciones de
ácido cítrico en un cultivo líquido. En este trabajo, el aumento en la tasa de
dilución fue paralelo al aumento en las tasas específicas y volumétricas de
producción de ácido cítrico. A pesar de esto, el rendimiento del proceso fue de
entre 0,59 y 0,67  g  g -1 ( Tabla 1 ). En estudios anteriores, en el cultivo
discontinuo con Y. lipolytica Wratislavia AWG7 cultivado en glicerol crudo, el
rendimiento de ácido cítrico fue de 0,46  g  g −1 ( Rymowicz et al., 2006),
mientras que en el cultivo discontinuo alimentado en las mismas condiciones, el
rendimiento de ácido cítrico fue de 0,66 y 0,69  g  g -1 para glicerol crudo y puro,
respectivamente ( Rywińska et al., 2009 ).

3.2 . Biosíntesis de ácido cítrico en cultivo de quimiostato a una tasa de

dilución de 0.01  h −1

Se realizaron estudios adicionales de producción de ácido cítrico en medio PM2

(con más nutrientes), a una tasa de dilución de 0.01  h −1 ( Fig. 1 ). En
comparación con el cultivo en medio PM1 a la tasa de dilución de 0.009  h −1 , el
cambio en la composición del medio y la tasa de dilución ligeramente aumentada
aumentaron las concentraciones de ácido cítrico (97.8  g  L −1 ) y biomasa
(22.2  g  L −1 ) , mejoró la productividad volumétrica de ácido cítrico
(0,98  g  L −1  h −1 ) y redujo el rendimiento del proceso (a 0,49  g  g −1) Esto podría
atribuirse al aumento de las concentraciones de biomasa y subproductos no
deseados. Las concentraciones finales de ácido isocítrico y manitol fueron 5.1 y
1.6  g  L -1 , respectivamente, y también hubo un ligero (pero constante) aumento
en la concentración de eritritol. La tasa específica de producción de ácido cítrico
(0.044  g  g -1  h -1 ) fue comparable a la obtenida con medio PM1 a una tasa de
dilución de 0.009  h -1 , a pesar de la alta concentración de biomasa. Anastassiadis
y col. (2005)informaron que los cambios proporcionales en las concentraciones
de carbono y nitrógeno (cuando se mantienen en la misma relación C / N)
afectaron tanto la cantidad de ácido cítrico producido como la tasa
específica. Este hallazgo ha sido confirmado en el presente estudio.
1. Descargar: Descargar imagen a tamaño completo
La Fig. 1 . Producción de ácido cítrico por Y. lipolytica Wratislavia AWG7 en
cultivo de quimiostato bajo deficiencia de nitrógeno y fósforo en medio PM2. Las
barras de error representan la desviación estándar para tres réplicas independientes.

3.3 . Características de la población de levadura.

El crecimiento de la levadura está frecuentemente limitado por la fuente de

nitrógeno en el medio. Uno de los factores que afectan la extensión de la
biosíntesis de ácido cítrico es la disminución de la concentración de nitrógeno
intracelular, del 8% en la trofofase a aproximadamente el 4% al final de la fase
exponencial ( Anastassiadis et al., 2002 ). Los medios utilizados en el presente
estudio fueron deficientes tanto en nitrógeno como en fósforo, lo que resultó en
la deficiencia de nitrógeno y fósforo intracelular, en comparación con la biomasa
cultivada en el medio de control ( Tabla 2 ). El aumento en la tasa de dilución en
medio PM1 fue paralelo a la disminución en la concentración de biomasa y la
acumulación de carbono intracelular. La concentración de proteínas en la
biomasa varió de 26.3 a 41.3% (p / p),con tasas de dilución crecientes . En el
medio PM2, a una relación C / N sin cambios, hubo un ligero aumento en el
contenido de proteínas, así como en las concentraciones de nitrógeno intracelular
(hasta 4,92%) y carbono (hasta 48,3%). La concentración de fósforo disminuyó a
0.28% ( Tabla 2 ).
Tabla 2 . Composición elemental de la biomasa Y. lipolytica Wratislavia AWG7
durante la biosíntesis continua de ácido cítrico en cultivo de quimiostato con
glicerol como sustrato.
Tasa de Proteína Carbono Hidrógeno Nitrógeno Fósforo Azufre
Medio
dilución (h −1 ) (%) (%) (%) (%) (%) (%)
0.009 PM1 26,3 a 47,8 a 8.52 a 4.18 a 0,34 b 0.16 b
0,015 PM1 33,4 c
0,021 PM1 34,7 d 47,2 a 8.31 a 5.35 b 0.46 a 0.26 a
0,024 PM1 40,1 e
0,031 PM1 41,3 f 46,1 c 7.50 c 5.41 a 0.48 a 0.26 a
0,010 PM2 29,6 b 48,3 b 9.2 a 4.92 a 0.28 c 0.22 a
Medio de
- - 47,14 6,90 7.38 2,08 0.25
control a

Los valores con el mismo alfabeto a lo largo de la misma columna no son significativamente diferentes
en el nivel 0.05.
una
C: N: P: S  ≈  10: 1: 0.2: 0.1 ( Rywińska et al., 2006 ).

Debido a que el proceso de biosíntesis se realizó con células de levadura en

crecimiento, parecía haber un mayor riesgo de que, al ser un acetato y un mutante
morfológico, Wratislavia AWG7 pudiera degenerarse. Las cepas genéticamente
modificadas son más propensas a la degeneración que las cepas salvajes y
requieren un control más estricto de la estabilidad de los rasgos adquiridos. Por lo
tanto, la población de levadura se analizó adicionalmente para determinar el
estado fisiológico, la morfología celular, el volumen celular en ciernes y la
estabilidad de la mutación ( Tabla 3 ).
Tabla 3 . Estado fisiológico de la población de levadura. La estabilidad de la fil - y
ACET - de mutación en Y. lipolytica Wratislavia culturas AWG7 en quimiostato.

Tasa de Celda Celda

dilución Medio incipiente muerta Fil + (%) Acet + (%) Volumen de células
(h −1 ) (%) (%)
Min – max Promedio
(μm 3 ) (μm 3 )
0 /
0.009 PM1 14,7 0.9 0.9 - -
2.6  ×  10 8
0 /
0,015 PM1 15,6 0.6 0.4 0.4 - -
2.6  ×  10 8
0 /
0,021 PM1 14,2 0.5 0.5 0.2 0.2 - -
2.2  ×  10 8
Tasa de Celda Celda
dilución Medio incipiente muerta Fil + (%) Acet + (%) Volumen de células
(h −1 ) (%) (%)
Min – max Promedio
(μm 3 ) (μm 3 )
0 /
0,024 PM1 10,5 0.7 00 - -
1.6  ×  10 8
0 /
0,031 PM1 11,4 0.6 00 - -
1.7  ×  10 8
0 /
0,010 PM2 19,1 0.7 2.2 2.2 5.23–31.16 16,5
3.2  ×  10 8

Cuando se hizo uso del medio PM1, los brotes fueron producidos por el 10.5-
15.6% de las células, independientemente de la tasa de dilución aplicada. En el
medio PM2, la proporción de células en gemación alcanzó el 19,1%, mientras
que el número de células muertas no superó el 1%. En el medio PM1, entre la
población del orden de entre 1.6 y 2.6  ×  10 8 , el número de participantes en
bruto (fil + ) no superó el 1%; en medio PM2 alcanzó el 2.2%. No se observó
incremento en el número de acet + revertantes . La estabilidad de
las mutaciones acet - fue confirmada por la producción baja y estable de ácido
isocítrico.
Las mediciones relevantes han revelado que el volumen celular en Wratislavia
AWG7 es bajo (no supera los 16  μm 3 en el 90% de la población). Resultados
similares fueron obtenidos por Rywińska et al. (2004) durante la producción
continua de ácido cítrico por cepa de levadura AWG-7 a partir de jarabe de
glucosa en un reactor de membrana. En sus estudios, el volumen de células
Wratislavia AWG7 fue el más pequeño entre tres levaduras examinadas (no más
de 20  μm 3 ) y la biosíntesis de CA fue muy estable. Makri y
col. (2010) informaron que la morfología de la levadura Y. lipolytica cultivada
con glicerol depende de la fase de crecimiento. La célula de levadura más
pequeña apareció en la fase de producción de CA. Rywińska y col. (2008)mostró
que el aumento más significativo en el volumen de células de levadura se
observó cuando la eficiencia de la síntesis de CA fue notablemente menor. Los
resultados reunidos en este estudio sugieren que la estabilidad y la eficiencia de
la biosíntesis de ácido cítrico podrían estar asociadas con la proporción de las
células más pequeñas.
4 . Resumen
La cepa Y. lipolytica AWG7, un acetato y un mutante morfológico, es un
productor eficaz de ácido cítrico. Conserva su alta viabilidad, así como su
estabilidad genética y fenotípica durante todo el proceso de quimiostato continuo
de larga duración. El proceso de fermentación es de alta pureza, debido a las
bajas concentraciones de metabolitos no deseados: ácido isocítrico y polioles.