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PRÁCTICO Nº 4
OBJETIVOS
Aplicar la técnica de volumetría por precipitación para determinar el contenido de cloruros totales en
diferentes alimentos.
Introducción
El análisis volumétrico o volumetría es una técnica que permite medir en forma cuantitativa una gran
variedad de compuestos en solución. Aplicada a alimentos, permite mediante una medición simple del
volumen de una solución de concentración conocida, determinar la concentración desconocida de
diferentes compuestos problema o analitos, tales como: acidez total en alimentos, contenido de calcio, de
vitamina C, de cloruros, etc.
La técnica ocupa instrumental sencillo y puede ser realizada a mano o con tituladotes automáticos. Para
realizarla a mano sólo requiere de un matraz donde colocar la muestra, pipetas para medir la muestra y
una bureta desde la cual agregar cuantitativamente la solución valorada, de concentración conocida o
patrón, (¿qué forma de expresión de concentración se usa en la solución patrón? ¿Por qué?) si se va a
titular la muestra con la solución patrón o, la muestra, si se va a titular el patrón con la muestra.
El procedimiento se conoce como valoración, volumetría, titulación y titración. Se basa en que la reacción
que se produce entre el componente de la solución patrón con el analito presente en la muestra es una
reacción estequiométrica. Es decir, que los componentes reaccionan cuantitativamente entre sí,
equivalente a equivalente. (Escriba un ejemplo y explique lo indicado)
En el proceso la solución patrón, o la muestra, según sea el caso se añade gota a gota hasta que ha
reaccionado con todo el analito, o el patrón. Entonces se mide el volumen agregado y mediante un
cálculo estequiométrico se calcula cantidad del compuesto problema y se expresa en al forma adecuada
para informar el contenido, generalmente en g/100 g o mg/100 g, dependiendo de la cantidad de
componente problema medido.
El final de la valoración, visualizado mediante el cambio del indicador o mediante el cambio instrumental,
se denomina punto de equivalencia o punto final. ¿Por qué?
Existen diferentes tipos de métodos volumétricos:
Material:
Reactivos:
Preparación de Soluciones:
Medición en muestra
Realice un blanco paralelo, reemplazando los 2 g de muestra por 2 ml de agua. Para ello, agregue los
25 ml de ácido nítrico caliente hasta ebullición por 5 minutos y agregue 10 ml de permanganato, siga
calentando por otros 10 minutos, si no decolora agregue cristales de ácido oxálico. Una vez decolorado
agregue los 10 ml de agua fría, los 2 ml de indicador y titule el blanco con tiocianato de potasio
Cálculos:
La reacción se produce entre le ión cloruro y el ión plata produciéndose un precipitado insoluble.
INVESTIGUE LA ECUACIÓN CORRESPONDIENTE A LA REACCIÓN.
Como usted agrega un exceso de reactivo de precipitación, es decir, más del necesario para
medir todo el cloruro de la muestra. Al titular con el tiocianato, Ud. realiza una retro-titulación, es
decir, titula lo que sobró de reactivo y no reaccionó con su analito problema, es decir el cloruro
en solución.
1 - Reste al gasto de tiocianato 0,1N del blanco el gasto correspondiente a la titulación que hizo en la
muestra. Así se obtiene el gasto de la muestra.
2 – Transforme el gasto de muestra en mili-equivalentes o en equivalentes de cloruro en la muestra.
3a- Exprese dichos mEq de cloruro en mg o g de cloruro en muestra
3b- Exprese dichos mEq de cloruro en mg o g de cloruro de sodio en muestra
4 – Exprese los mg de cloruro y de cloruro de sodio en muestra en gramos de cloruro y gramos de
cloruro de sodio por 100 g de muestra.
PRÁCTICO Nº 5
OBJETIVO
Aplicar una técnica colorimétrica para medición de azúcares reductores en diferentes alimentos.
Aplicar una técnica de óxido-reducción utilizable para medición de azúcares reductoras en alimentos
INTRODUCCIÓN.
· Estándares de identidad: los alimentos deben tener una composición química de acuerdo a ciertas
regulaciones.
· Rotulación nutricional: para informar a los consumidores del contenido nutricional de los alimentos,
a fin de que elijan sus alimentos de acuerdo a su dieta.
· Detección de adulteración: cada tipo de alimento posee un carbohidrato característico.
· Calidad del alimento: las propiedades fisicoquímicas de los alimentos como dulzor, apariencia,
textura y estabilidad depende del tipo y concentración de carbohidratos presentes.
· Económicas: a nivel industrial se desea utilizar ingredientes que no resulten muy caros (los
azúcares son baratos comparados con otros ingredientes como proteínas y aceites).
· Procesamiento de alimentos: la eficiencia de varias operaciones de procesado de alimentos
depende del tipo y concentración de carbohidratos presentes.
FUNDAMENTO
100 - (% humedad + % cenizas + % grasa total ácida o básica + % proteína + % fibra dietética total)
2. Refractometría. Es una técnica que mide cuanta luz es refractada cuando pasa a través de una sustancia
transparente determinada. La luz desviada define un ángulo con el cual se determina el llamado índice de
refracción que es característico para cada sustancia. Este índice de refracción permite identificar una
sustancia desconocida o puede ser usado para medir la pureza de una sustancia. De modo semejante se
puede utilizar para determinar la cantidad de sustancia disuelta en un medio definido, debido a la
proporcionalidad que presenta en relación con la concentración de sustancia presente.
Este método se basa en la medición del índice de refracción de una solución preparada a partir del alimento
y, como tal, es útil para estimar los azúcares presentes en solución verdadera, ya que el índice de refracción
depende de su concentración.
El método es útil para la determinación rápida del contenido de azúcares en alimentos, tales como
jugos de uva, duraznos, mermeladas, miel, melazas y productos de tomate. En la práctica, se utilizan los
instrumentos conocidos como sacarímetros, los que están calibrados directamente en el porcentaje de
azúcar.
3. Polarimetría. Esta técnica se basa en la medición de la magnitud en que una sustancia interactúa con el
plano de la luz polarizada. El método de medición aprovecha entonces el hecho que la rotación óptica que
producen algunas sustancias sobre el plano de la luz polarizada es dependiente de la concentración de
éstas en solución. La concentración de soluciones clarificadas de azúcares se puede medir aprovechando
que la rotación óptica de los azúcares ópticamente activos es dependiente de la concentración de azúcar en
solución.
Cuando se usa este método para la determinación de lactosa en leche, requiere clarificación
de la solución antes de la medición.
4. Densidad. La densidad de las soluciones acuosas aumenta a medida que aumenta la concentración de
azúcares. De este modo, la concentración de carbohidrato se puede determinar midiendo la densidad
mediante densímetros o hidrómetros. Esta técnica se emplea rutinariamente en la industria para determinar
concentración de azúcares en jugos y bebidas.
5. Infrarrojo. Los carbohidratos contienen grupos químicos que absorben radiación infrarroja en longitudes
de onda donde ninguno de los otros constituyentes principales del alimento lo hacen, por lo que su
concentración se puede determinar midiendo la absorbancia en el infrarrojo a esas longitudes de onda. Los
instrumentos para el análisis en el infrarrojo no son destructivos y efectúan mediciones rápidas y son muy
apropiados para el análisis en línea o para el laboratorio de control de calidad donde se analizan muchas
muestras rutinariamente.
6. Métodos colorimétricos. Varios métodos se basan en que ocurre una reacción entre los azúcares y
varios reactivos que generan color, cuya intensidad está relacionada con la concentración del azúcar
presente y su absorbancia puede ser medida y comparada contra una serie de estándares. Este fundamento
es la base de una variedad de métodos colorimétricos para determinar azúcares en alimentos.
a) Antrona. Esta produce un color verde azulino con cualquier carbohidrato en condiciones ácidas de
reflujo, incluyendo almidón, y se puede usar para la estimación de carbohidratos totales en alimentos. La
medición se efectúa a 620 nm. Existe una relación lineal entre la absorbancia y la cantidad de
carbohidrato presente en la muestra. El método determina azúcares reductores y no reductores debido a
la presencia de ácido sulfúrico que es fuerte oxidante. El método no es estequiométrico y es necesario
preparar una curva de calibración usando una serie de estándares de concentración conocida de
carbohidratos.
d) Acido pícrico. Este reactivo reacciona con los azúcares reductores y es reducido por tales azúcares a
ácido picrámico de color rojo, cuyo color puede ser medido por colorimetría. Este reactivo es explosivo,
lo cual limita su uso.
e) Acido 3,5 dinitrosalicílico (DNS). El DNS es similar al ácido pícrico en cuanto a que sólo reacciona con
los azúcares reductores. Es reducido por tales azúcares al correspondiente compuesto amino,
generándose un producto café-rojizo cuyo color es proporcional al azúcar presente y se puede medir
contra una serie de estándares. Este reactivo es ampliamente utilizado en la determinación de azúcares
y otras fracciones de carbohidratos luego de la hidrólisis de cualquier fracción no reductora a azúcares
reductores. Por ejemplo, se puede usar en la determinación de sacarosa luego de una hidrólisis ácida a
monosacáridos reductores, glucosa y fructosa, y en las etapas finales de la estimación de fibra dietaria
como polisacáridos no amiláceos, luego de la hidrólisis de la fracción final de polisacáridos a azúcares
reductores.
7. Métodos de titulación. Los azúcares reductores se pueden determinar por métodos que incluyen la
titulación de una solución del azúcar que se va a estimar contra una solución estándar de reactivo, tal como
en los métodos de reducción de cobre. También los azúcares pueden hacerse reaccionar con un exceso de
agente oxidante, como cloramina-T, y el agente oxidante restante se titula con un reactivo apropiado. En el
método de Lane-Eynon, se usa una bureta para agregar la solución de carbohidrato a un matraz que
contiene una cantidad conocida de solución de sulfato de cobre hirviente e indicador azul de metileno. Los
azúcares reductores reaccionan con el sulfato de cobre. Una vez que todo el sulfato de cobre ha
reaccionado, un agregado adicional de azúcar reductor produce un cambio de color en el indicador, de azul
a incoloro. El volumen de solución de azúcar requerido para alcanzar el punto final se anota y la
concentración de azúcar se interpola en una curva de calibración confeccionada con una serie de soluciones
estándares de concentración conocida de carbohidratos.
8. Métodos gravimétricos. El método de Munson y Walker se utiliza para determinar azúcares reductores
en una muestra. Los carbohidratos se oxidan en presencia de calor y un exceso de sulfato de cobre y
tartrato alcalino en condiciones tales que se forma un precipitado de óxido de cobre. La cantidad de
precipitado es proporcional directamente a la concentración de azúcar reductor de la muestra. La
concentración de precipitado se determina gravimétricamente y se lee en una tabla el equivalente a azúcar
reductor.
9. Métodos enzimáticos. Estos métodos son rápidos, muy específicos y sensibles y son ideales para
determinar carbohidratos en muestras de alimento. Se requiere poca muestra. Los alimentos líquidos se
pueden analizar directamente (ej. vinos, cerveza, jugos clarificados de fruta, etc.) o si son sólidos se deben
dispersar en agua (pulpas de fruta, manjar, mermeladas, etc.).
Existe una gama de métodos disponibles en base a kits rápidos. En el caso de glucosa, una muestra
de solución del azúcar es tratada con una enzima, hexoquinasa, en presencia de ATP. Eso transforma la
glucosa en glucosa 6 fosfato. La glucosa 6 fosfato enseguida reacciona con NADP en presencia de glucosa
6 fosfato deshidrogenasa para formar NADPH cuya cantidad es proporcional a la concentración de glucosa 6
fosfato. El NADPH es medido por espectrofotometría a 340 nm y, a partir de la diferencia entre este valor y el
del reactivo blanco, se calcula el contenido de glucosa de la muestra original. Para determinar fructosa, éste
azúcar es convertido a glucosa por una isomerasa y se repite el procedimiento anterior.
10. Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). Es un método instrumental que se basa en la
separación de azúcares en solución sobre la base de sus características diferenciales de adsorción en una
columna apropiada a alta presión, los que luego son detectados por un detector adecuado, el cuál, en el
caso de azúcares, a menudo se basa en medidas de índice de refracción. Los azúcares presentes son
identificados por el tiempo de retención y cuantificados por las áreas bajo los pics.
El método tiene la ventaja de ser muy rápido, sensible y relativamente simple de operar, y permite la
identificación y cuantificación de azúcares individuales cuando están presentes en una mezcla en un
alimento, por ejemplo en yoghurts de fruta.
Este método es aplicable a compuestos con grupo carbonilo libre, los llamados azúcares reductores.
Implica la oxidación del grupo funcional aldehído cuando está presente en la glucosa y del grupo funcional
cetona en la fructosa. El ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS) en ambiente alcalino forma un producto de
reducción café rojizo, el ácido 3-amino-5-nitrosalicílico, cuando se calienta en presencia del azúcar reductor.
La intensidad del color desarrollado a 540 nm, que es proporcional a la cantidad de azúcar reductor, se
puede utilizar para determinar el contenido de carbohidrato disponible del alimento, luego de la hidrólisis de
los polisacáridos y oligosacáridos a azúcares reductores.
Material y equipos.
IV. PROCEDIMIENTO
1.1. Alimentos sólidos, ej. cereales para desayuno - hidrólisis de carbohidratos disponibles a
azúcares reductores:
a) Moler el alimento finamente en un mortero y pesar con precisión 0,1 a 0,2 g en un tubo de ebullición.
b) Agregar 10 mL de ácido sulfúrico 1,5 M y calentar en un baño de agua en ebullición por 20 minutos,
agitando ocasionalmente, para hidrolizar polisacáridos y otros azúcares no reductores.
c) Enfriar y agregar cuidadosamente 12 mL de NaOH al 10%. Mezclar y filtrar en un matraz de aforo de
100 mL, lavando el tubo hacia el matraz con agua destilada. Completar a volumen con agua destilada y
homogeneizar por inversión.
a) Pesar con precisión 3 g de pasta en un matraz Erlenmeyer de 250 mL, agregar 50 mL de agua, entibiar
y agitar por 10 minutos.
b) Filtrar en un matraz de aforo de 100 mL, lavar el residuo en el matraz con una pequeña porción de agua
destilada. Homogeneizar invirtiendo el matraz varias veces.
c) Diluir 10 mL de esta solución a 250 mL con agua destilada en un matraz de aforo y mezclar bien.
Preparar soluciones de glucosa de 0,25 – 0,5 – 0,75 – 1,0 – 1,25 y 1,5 mg de glucosa por ml, en
matraces aforados de 100 ml, a partir de una solución stock que contiene 25 mg/ml de glucosa, usando agua
destilada para diluir
3. Mediciones de absorbancia.
Hidrolizado. Pipetear 1 mL del hidrolizado preparado en 1.1. o 1.2., o 1 mL de la solución preparada en 1.3.
en un tubo de ensayo y agregar 1 mL de reactivo DNS. AGREGAR EL REACTIVO CON CUIDADO
UTILIZANDO PROPIPETA O TORNILLO, SI LE CAE EN LAS MANOS LAVE INMEDIATEMENTE CON
ABUNDANTE AGUA HASTA ELIMINAR SENSACIÓN DE JABÓN EN LAS MANOS, SEGUIR LAVANDO
CON AGUA POR LO MENOS OTROS CINCO MINUTOS.
Estándares e hidrolizado. Calentar todos los tubos en un baño de agua en ebullición durante 5 minutos
para permitir que ocurra la reacción entre el azúcar reductor y el DNS. Enfriar, agregar a cada tubo 10 mL de
agua destilada y agitar bien. ANTES DE AGITAR TAPAR EL TUBO DE ENSAYO CON PARAFILM PARA
EVITAR QUEMARSE CON EL REACTIVO. Leer la absorbancia de cada solución a 540 nm. AL VACIAR
EL TUBO EN LA CUBETA, DEBE TENER CUIDADO PORQUE EL REACTIVO DE DNS ES CORROSIVO
Cálculos.