A-LA REGOLAZIONE DELL'ESPRESSIONE

"GENICA"NEI PROCARIOTI
1)Premessa
Va innanzitutto premesso che con "espressione genica
"s'intende quella serie di eventi che dall'attivazione della
trascrizione di un gene ,conducono alla produzione della
proteina corrispondente---->si noti ,inoltre che la regolazione
di questi processi è molto sottile e che la complessità aumenta
salendo la scala evolutiva;in pratica,studiare la regolazione
dell'espressione di un gene significa accertare in quali tessuti
viene espresso ,in quali condizioni ed infine qual è l'effetto di
tale espressione
I primi studi che hanno fornito fondamentali informazioni
sulla "regolazione dell'espressione di un gene furono condotti
su "cellule procariotiche"(sono genomi costituiti da una sola
molecola di DNA);al riguardo si è capito che :
1--->Il principale livello al quale si svolge a
"regolazione dell'espressione" è quello della trascrizione ,in
altri termini-----> della decisione da parte del sistema
cellulare di "spegnere " o "accendere" in seguito a stimoli
ambientali la "trascrizione di un gene "
2---->che le cellule procariotiche possono anche
modulare ,"l'espressione genica"a stadi successivi a quello
trascrizionale.
2)Espressione genica costitutiva e regolata
Si è già detto che l'espressione genica è sottoposta a varie
variazioni,tuttavia altresì si rileva che vi sono i geni
cd."costitutivi" che sono espressi in modo continuo ,nel senso
che sono sempre "accessi":
--> i geni costitutivi sono geni che "codificano" per
molecole fondamentali (per l'appunto costitutivi) coinvolte in
meccanismi come ad es. la sintesi proteica e il metabolismo di
base o possono anche essere componenti di citoscheletro e
delle membrane cellulari
Bisogna notare che il concetto di "espressione costitutiva " si
sovrappone il concetto di "espressione regolata"che
diversamente coinvolge un certo numero di geni (maggiore
rispetto a quelli coinvolti nella funzione costitutiva) tutti
deputati a rendere la cellula sensibile e responsi rispetto alle
variazioni interne o esterne.
Riguardo a ciò ,nei procarioti si osservano due fenomeni
apparentemente opposti :
---->da una parte vi sono gruppi di geni che sono espressi
solo se nell'ambiente sono disponibili determinate sostanze
oppure che si verificano delle determinate condizioni ---->si
tratta della cd. "espressione indicibile",la cui sostanza
responsabile è chiamata -induttore-(es nelle proteine coinvolte
nelle vie cataboliche di nutrienti )
---->dall'altra parte vi sono altri gruppi di geni che invece
"sono espressi"in assenza di determinati composti ,la quale
"espressione"cessa al momento in cui nella cellula sono
presenti tali sostanze :in questo caso si parla della
cd."espressione reprimibile" e la sostanza responsabile si
chiama -repressore/corepressore.
Il fenomeno della repressione si osserva in molte vie
biosintetiche di composti necessari alle cellule (es.
amminoacidi,vitamine ecc).
Infine si viene a notare che la "repressione "cessa (e quindi
l'espressione di geni riprende )quando il livello intracellulare
del co-repressore scende la di sotto di un certo valore.
Si può ,quindi notare che nei procarioti,benché siano
organismi molto semplici, la regolazione dell'espressione
genica procariotica è molto efficiente ed il loro genoma è
altamente organizzato.
2)L'unità funzionale responsabile del controllo della sintesi
delle proteine a livello della trascrizione nei procarioti è
l'OPERONE--->(modello di regolazione dell'espressione
genica elaborato da Francois Jacob e Jacques Monod
dell'Istituto PasteurI)
Un operose (ovvero l'"unità funzionale responsabile del
controllo della sintesi delle proteine a livello della
trascrizione nei procarioti) è costituito da un gruppo di "geni
strutturali" codificati per proteine aventi funzioni correlate
(es.coinvolte nella stessa via metabolica)e sottoposte ad una
regolazione "unica e coordinata"ad es. vengono tutti "indotti"
o "repressi"contemporaneamente nella stesa proporzione da
parte del prodotto del gene regolatore(che è distinto dai geni
strutturali).
In questo modo le cellule procariotiche possono sintetizzare le
proteine coinvolte in una data funzione solo quando questa è
necessaria.
Uno dei principali meriti di F.Jacob e J.Monod fu quello di
aver intuito che "induzione e repressione" sono in realtà
manifestazioni diverse di un unico meccanismo .
Si noti che gli elementi costitutivi di un operone sono :
1-i geni strutturali ,cioè uno o più geni codificati per proteine
coinvolte in uno stesso processo cellulare, e situati in
posizione adiacenti sul cromosoma .Tali geni sono inoltre
preceduti da un unico promotore (posto a monte del primo
gene) e seguiti da
da un unico terminatore (posto a valle dell'ultimo gene )
2-un gene regolatore (distinto dai precedenti) che codifica per
una proteine cd.repressore
3-repressore,cioè una proteina allosterica ,che :
a)sintetizza in modo "costitutivo"
b)è dotata di una doppia specificità:
-->nella forma attiva è in grado di riconoscere e di
legarsi reversibilmente ad una breve sequenza di DNA
indicata come "operatore"(interposta tra il promotore e il
primo dei geni strutturali): promotore
-->inoltre è in grado di riconoscere e di legarsi
reversibilmente ad un "corepressore"( composto a basso peso
molecolre) andando così incontro ad una modificazione della
sua conformazione(che a seconda dei casi attiva o inibisce la
sua capacitò di riconoscere e legarsi all'operatore
4-almeno una sequenza di DNA cd.operatore,riconosciuta dal
repressore in forma attiva ed interposta tra il promotore ed il
primo dei geni strutturali (qualche volta sovrapposta al
promotore stesso).
--->A proposito del legame dell'operatore con il
repressore (cioè la proteine allosterica)si rileva che tale
legame rendendo innanzitutto impossibile il legame della
RNA polimerasi al promotore blocca la trascrizione dei geni
controllati dal promotore (quindi esercita sulla trascrizione un
controllo negativo)---->in pratica la presenza della proteina
sul DNA impedisce la trascrizione.
Quest'ultimo meccanismo è coinvolto sia nell'induzione ,sia
nella repressione ,solo che :
--->Nell'induzione il repressore,da solo, è in forma attiva
e legandosi al promotore blocca la trascrizione
--->Nella repressione ,il repressore,da solo è in forma
"inattiva" ,quindi non è in grado di legarsi
all'operatore,quest'ultimo quindi è accessibile alla RNA
polimerasi che sintetizza il messaggero (Leggi pag 639).
5)Un esempio di operone inducibile (L'operone "lac)
Il primo operone ad essere studiato fu l'operone lac(l'operone
del lattosio),il quale rappresenta un buon modello per
illustrare la struttura e il funzionamento generale di una
grande maggioranza di operoni( vedere libro pag 641)
Dall'esempio riportato nel libro (pag.641) si noti che ,affinché
la sintesi degli enzimi avvenga solo quando è necessario
,occorre che l'interazione repressore-operatore sia
estremamente specifica ,in modo tale da evitare :
-sia che proteine sbagliate si leghino all'operatore
-sia che il repressore si leghi a sequenze di DNA diverse
dall'operatore.
Il repressore "lac" è un tetrametro formato da 4 subunità
identiche disposte simmetricamente ,ognuna delle quali
presenta:
-Il dominio di legame al DNA costituito da un motivo helix-
turn-helix posto all'estremità terminale -N
-Un dominio regolatore che lega l'allolattosio
-Un Linker che collega il secondo dominio al primo ( il
dominio regolatore al dominio di legame al DNA )
trasmettendogli la modificazione indotta dal legame con
l'allolattosio
-Un dominio di tetramerizzazione posto all'estremità
terminale-C per mezzo del quale le 4 subunità interagiscono .
6)Il controllo positivo degli operino catabolici :la repressione
da cataboliti il ruolo del cAMP
Bisogna tuttavia notare che nei procarioti la "regolazione
della sintesi delle proteine degli operatori indicibili
(catabolici) non avviene solamente con il controllo negativo
dei repressori sulla trascrizione,infatti si è notato che:
--->le cellule E.coli (ed altri batteri),se poste in un terreno
contenente "glucosio"accanto ad un substrato catalizzante (in
grado da solo di indurre la sintesi degli enzimi del proprio
catabolismo ),l'INDUZIONE non si verifica fino a a quando
tutto il glucosio non è stato utilizzato (tale fenomeno è
chiamato "effetto glucosio"o" repressione catabolismi")-----
>in altre parole le cellule preferiscono utilizzare il glucosio
rispetto a tutti gli altri atomi di carbonio e di
energia,realizzando in tal modo un notevole risparmio di
energia e di materia .
*Alla base di questo fenomeno sta il fatto che in realtà la
RNA polimerasi ha:
-una bassa affinità per i promotori degli operatori catabolici
-ed una scarsissima tendenza a legarsi ai promotori------>a
ragione di ciò non avviene la "trascrizione dei messaggeri"
Affinchè possa avvenire che la polimerasi si leghi ai
promotori catabolici è necessario che "alla zona" del
promotore posta immediatamente a monte del posto di legame
della polimerasi si trovi LEGATA una particolare proteina
,la "proteina legante l'AMP o proteina recettore dell'AMP
ciclico--->cAMP receptor protein ,CRP(VED. PAG. 644).
7)L'Attenuazione interviene nel regolar l'espressione di molti
operino biosintetici dopo che la trascrizione è iniziata
Si tenga conto che , una volta che la trascrizione è iniziata
sotto il controllo dell'operatore , il trascritto nascente può
assumere strutture secondarie che possono indurre ad una
pausa(anche ad uno stop) e causare la cd."attenuazione
trascrizionale"(questo avviene perché il potenziale regolativo
degli operoni biosintetici non è esaurito):
-->in pratica l'attenuazione trascrizionale è una sorta di
meccanismo che ,in risposta a cambiamenti ambientali , usa
l'induzione di pause (o anche di terminazioni precoci del
processo) per modulare l'espressione di geni.
Il primo caso di attenuazione trascrizione fu descritto in
E.coli per l'operone (reprimibile)del triptofano( VEDI PAG.
645-646).
8)I Riboswitch: l'interazione tra RNA e piccole molecole
regolatrici senza l'intervento di proteine modifica la
conformazione dell'RNA modulando la trascrizione o la
traduzione
I Riboswitch sono molecole di RNA(sensori ad "RNA")che a
seconda delle condizioni ambientali(es.dalla temperatura)
possono assumere diverse strutture secondarie:
--->lo schema di funzionamento dei Riboswitch non è
diverso da quello osservato nell'attenuazione trascrizionale
,con la peculiarità che questi i Riboswitch regolano
l'espressione genica senza il coinvolgimento di ribosomi o
proteine .
Tra i riboswitch ,quelli più semplici sono quelli sensibili alla
temperatura ,i quali regolano l'adattamento delle cellule ad un
parametro fisico in grado di influenzare notevolmente i
processi cellulari ;
^In realtà ,il potenziale regolativo di queste molecole si basa
sul fatto che la struttura secondaria di questi riboswitch
dipende proprio dalla temperatura:
-->il modello base del "termosensore"consta di un elemento
strutturato a forcina che contiene un sito di legame per il
ribosoma e un codone d'inizio:
I-a basse temperature il termosensore si struttura in modo tale
da mascherare il "sito di legame" e quindi impedire il legame
dei ribosomi
II-invece ad alte temperature la struttura a forcina
parzialmente si "svolge" permettendo il legame dei ribosomi
e la conseguente traduzione dell'mRNA.
Esempi di questo genere si trovano ad es. nelle infezioni
batteriche e nella risposta al calore (es.il caso del batterio
"listeria monocytogenes ")
Un'altra categoria di riboswitch è quella coinvolta nella
risposta alle "variazioni di concentrazione di metaboliti, ioni,
precursori degli amminoacidi , colatori enzimatici e
amminoacidi ).
In questi casi le sequenze "sensore" chiamate "aptameri" sono
prevalentemente localizzate nel 5'UTR di mRNA batterici ;
-In un modello comune di funzionamento ,gli
"aptameri"legano un metabolica quando la sua
concentrazione supera una certa soglia ed assumono strutture
secondarie e terziarie diverse a seconda del metabolica legato
(vedi pag.646).
In conclusione ,il fenomeno della regolazione mediata dai
riboswitch non è affatto raro ,anzi, è calcolato che il numero
dei geni regolati da riboswitch sensibili ai metaboliti sia in
alcuni batteri di circa il 2% ;inoltre i riboswitch controllano
geni essenziali per la sopravvivenza e per la capacità
infettante delle cellule batteriche .
B-LA REGOLAZIONE DELL'ESPRESSIONE GENICA
NEGLI EUCARIOTI
Anche le cellule eucariotiche devono rispondere ai
cambiamenti dell'ambiente; dal punto di vista dei meccanismi
della regolazione genica,sebbene molti meccanismi di base
siano comuni a procarioti ed eucarioti ,in realtà le cellule
eucaristie hanno evoluto dei sistemi di regolazione
dell'espressione genica molto più complessi e sofisticati,in
grado di regolare sia nel tempo che nello spazio l'espressione
di geni specifici .
Si tenga comunque conto che negli eucarioti sono presenti
queste caratteristiche peculiari :
-Gli eucarioti ,anche quelli più semplici ,hanno
"genomi"(organizzati in cromosomi lineari ) con dimensioni
molto più grandi rispetto a quelli di qualsiasi procariote
-In tutti gli eucarioti pluricellulare è presente il processo di
"differenziamento",attraverso cui le diverse cellule dello
stesso organismo ,si specializzano ,funzionalmente e
morfologicamente,attivando o reprimendo in maniera
differenziale l'espressione di geni specifici
-Negli eucarioti pluricellulari esiste un livello di regolazione
che ha origine dall'interazione "cellula-cellula",che è una
caratteristica della multicellularità, che stimola molte risposte
di espressione genica che sono alla base di processi come lo
sviluppo e il differenziamento
-L'espressione di un gene eucaristico ,prevede dal DNA al
prodotto funzionante molti più stadi ,separati nel tempo e
nello spazio (invece nei procarioti tutto avviene in un unico
compartimento cellulare).
9)John B.Gurdon e la clonazione di un anfibio mediante
trasferimento cellulare
Il ricercatore Gurdon affrontò nel 1962 studiò il problema "se
la progressiva specializzazione delle cellule eucariotiche
durante il differenziamento fosse accompagnata dalla perdita
di geni diventati inutili nel tipo cellulare in corso di
specializzazione , o se invece l'intero patrimonio genetico
delle cellule si fosse mantenuto intatto ,sebbene i geni non
rilevanti al fine dello specifico differenziamento venissero in
qualche modo <<spenti>>".Nello specifico ,lo studioso :
-usò il modello sperimentale del rospo "Xenopus laevis"
considerato che già si sapeva che le uova e gli embrioni di
anfibio (relativamente grandi) mantengono,nelle prime fasi
dello sviluppo, rispetto all'ambiente un buon grado di
indipendenza
-fece uso della tecnica del "trasferimento cellulare",grazie al
quale il nucleo di una cellula somatica derivata da embrioni (a
diversi stati di sviluppo,es.---->da blastula a girino)veniva
trasferito all'interno del citoplasma di un uovo
precedentemente "enucleato".
In realtà con il suo esperimento Gurdon fu in grado di clonare
un rospo adulto inserendo il nucleo di una cellula epiteliale
intestinale di girino all'interno di un uovo enucleato(la
scoperta ebbe conseguenze scientifiche così rilevanti che nel
2012 Gurdon ebbe il premio nobel)---->Questo tipo di
esperimento fece da apripista ai successivi esperimenti di
"clonazione animale",in cui l'individuo che si viene a generare
dallo sviluppo dell'uovo ,sarà un <<clone>>(una copia
genetica)dell'individuo dalla cui cellula è stato ottenuto il
nucleo trasferito nel citoplasma dell'uomo
10)Wilmut e Campbell e la clonazione di un mammifero :la
pecora Dolly
Un ulteriore passo avanti nella comprensione della "plasticità
e potenzialità "dei genomi fu fatto da I;Wilmut e
K.H.S.Campbell (1996/97) ,i quali dimostrarono che
potevano clonare una pecora a partire da cellule di un uovo
enucleato in cui era stato trasferito il nucleo di altre cellule
somatiche ed embrionali ,coltivati "in vitro"anche con
numerosi passaggi :
 --->successo fu sicuramente rivoluzionario ,non solo
perché si era riusciti a clonare un mammifero ,ma soprattutto
perché gli organismi clonati si potevano generare dal
trasferimento di nuclei derivanti anche da cellule somatiche
adutle e differenziate (es. quelle della ghiandola mammaria di
una pecora di 6 anni)
11)Frederick C.Steward e la clonazione nel regno vegetale
Si tenga comunque conto che la clorazione nel regno
vegetale è una realtà molto comune ,infatti, non solo si
verifica in natura, ma viene sfruttata dai tempi antichi in
agricoltura sia per "talea" sia per "margotta";al riguardo si
ricorda , l'esperimento chiave condotto nel 1958 da
F.C.Steward e collaboratoti che affrontarono il problema dal
punto di vista scientifico;
-isolarono frammenti di "floema"(tessuto differenziato
conduttore di linfa) dalle radici di carota e li incubarono nel
latte di noce (che contiene fattori di crescita e gli ormoni
necessari all'accrescimento e al differenziamento )
-dalla massa di tessuto che venne a generarsi (cd. callo) ,gli
studiosi disgregarono le singole cellule e le misero a crescere
in un terreno di coltura solido ,nel quale ogni singola cellula
generò una nuova pianta di carota .
12)I diversi livelli a cui avviene la regolazione
dell'espressione genica negli eucarioti
Negli eucarioti si riconoscono almeno 6 livelli di regolazione
dell'espressione genica :
1-il controllo a livello genomico in cui il numero di copie di
alcuni geni viene aumentato in condizioni specifiche,dando
così origine ad un grande aumento del prodotto genico
2-la modulazione dello stato della cromatina (cd.controllo
epigenico) per cui la cromatina presente in uno "stato
aperto"(eucromatina)tende ad essere più trascritta rispetto a
quella presente in una condizione "chiusa"(eterocromatina)
3-la modulazione trascrizionale ,simile a quella osservata nei
procarioti ,ma arricchita di potenzialità e componenti
4-la regolazione post-trascrizionale ,che comprende molti
modi di regolare le fasi successive alla trascrizione ,ma
precedenti la traduzione di mRNA eucariotici
5-la regolazione tradizionale che comprende i meccanismi di
controllo della sintesi proteica
6-la regolazione post-traduzionale che comprende la
modulazione di attività ,stabilità e smistamento delle
proteine .
In particolare :
Il controllo a livello genomico
Negli eucarioti la regolazione dell'espressione genica è
operata nella maggioranza dei casi accendendo o spegnendo
l'espressione di specifici geni senza variazione della quantità
totale di informazione geentica( infatti,non è operata perdendo
e acquisendo geni);tuttavia ci sono delle eccezioni
rappresentati dall'amplificazione e dal riarrangiamento genico
Modificazione genomica associata alla regolazione
dell'espressione genica:L'amplificazione dei geni per gli
rRNA di Xenopus e riarrangiamento dei geni per le
immunoglobuline
Il ruolo dell'amplificazione genica per rDNA (vedi Libro pag
650) è quello di fornire materiale per la sintesi (massiccia) di
ribosomi che avviene durante lo sviluppo dell'ovocita----->i
suddetti ribosomi vengono quindi immagazzinati e tenuti
pronti per poter essere impiegati nella sintesi proteica .
--->è importante notare che l'amplificazione
dell'rDNA non comporta nè un aumento dei
cromosomi(rispetto alle cellule somatiche),nè l'aumento della
loro dimensione ; invece ,quasi tutto l'rDNA in eccesso si
trova nei nucleoli extracromosomici
Per quanto riguarda il riarrangiamento dei geni per le
immunoglobine (vedi pag. 650) il ricercatore S.Tonegawa ha
compreso che la varietà degli anticorpi si origina a livello
somatico solo a carico di cellule del sistema immunitario
(linfociti T e B)durante la loro maturazione ed è preesistente
all'esposizione all'antigene ;questa variabilità anticorporale si
genera attraverso due processi:
1)Un primo processo che consta di riarrangiamenti tra
segmenti di DNA (vedi libro 650)
2)Un secondo processo che consiste in una successione di
"mutazioni somatiche "(a carico del gene formatosi) che
contribuisce ad aumentare la diversità delle immunoglobuline
disponibili .
Il controllo a livello della formazione della cromatina
Tra gli anni '70 e gli anni '80 si è cominciato a capire che la
struttura della cromatina svolge un ruolo fondamentale nella
regolazione dell'espressione genica ; si è scoperto :
A) Che l'acetilazione degli istori è presente nelle regioni del
DNA che contengono geni attivi dal punto di vista
trascrizione
B)Che i geni attivi adottano una conformazione della
cromatica più aperta (accessibile a tutti i componenti del
macchinario trascrizione)
C)Che le regioni regolative dei geni sono caratterizzate da
una bassa densità nucleosomica che le rende ipersensibili
all'attacco degli enzimi nucleolitici (come al DNasi I)infatti
queste regioni sono note come "siti ipersensibili alla DNasi).
L'insieme delle modificazioni chimiche delle due sostanze
della cromatina ,il DNA e gli ISTONI che hanno effetti
funzionali sulla trascrivibilità della cromatina stessa senza
modificare la sequenza di DNA prende il nome di
<<epigenetica>>.
Ad oggi si è arrivati ad avere un quadro dettagliato delle
modificazioni della cromatina associate con le unità
trascrizionale ;si sà che :
-i promotori ,le regioni codificanti e le regioni di
terminazione dei geni ,i confini introne/esone sono dotati di
modificazioni istoniche e di caratteristiche e specifiche
disposizioni dei nucleosomi ,grazie alle quali nei nuclei in
interfase si possono riconoscere "regioni di eterocromatina
condensata" e di "eucromatina più lassa"generalmente
associate rispettivamente a cromatina inattiva e attiva
trascrizionalmente .
La Decondensazione della cromatina è collegata alla
trascrizione (dimostrazione)
In diversi tipi cellulari di Drosophila si nota un particolare
ciclo cellulare in cui la fase S di duplicazione ,non è seguita
dalla fase M della mitosi--->si tratta del processo cd."di
endoreduplicazione" in cui i cromosomi presenti nei nuclei
interfasici sono detti "politenici"("cromosomi politecnici"cioè
fatti da tanti fili):Ciò avviene perché alla duplicazione del
DNA non segue la separazione dei cromatici fratelli.
Questa particolarità biologica ha assunto una certa
importanza quando è stata correlata una specifica funzione
cioè alla"trascrizione specifica di regioni dei cromosomi
politecnici alla quale si accompagnano cambiamenti
morfologici evidenziabili anche al microscopio"(vedi 652)
Nel 1976 è stato dimostrato che rispetto alla cromatina
passiva, la cromatina "attiva"è più sensibile(fino a 10 vv)
all'azione della DNasi ;fu successivamente confermato non
solo che loci attivi (anche quelli solo potenzialmente attivi)
sono più sensibili alla degradazione da parte delle
nucleari,ma anche che i siti sensibili alla DNasi si estendono
ben oltre le singole unità trascrizioni;inoltre in
corrispondenza delle regioni sensibili alla DNasi I si
riconoscono regioni più brevi di elevata sensibilità cd."siti
ipersensibili alla DNasi".
I siti ipersensibili alla DNasi hanno diverse peculiarità :
- i nucleosomi sono molto rari se non assenti