PRÁCTICA Nº 5

CINÉTICA ENZIMÁTICA: DETERMINACIÓN DE LOS PARÁMETROS

CARACTERÍSTICOS

FUNDAMENTO
En la hidrólisis enzimática de la urea en disolución acuosa se producen dióxido de carbono y amoníaco, cuyos
iones aumentan la conductividad de la disolución. La velocidad del proceso se determina por medidas conductimétricas a
diferentes concentraciones de sustrato.
El mecanismo general de la catálisis enzimática suele representarse en la forma:

E+S ES P+E (E = Enzima S = Sustrato P = Productos)

cuya velocidad inicial, V, viene dada por la ecuación de Michaelis-Menten:

Vm ⋅ [S ]
V= (Vm = Velocidad máxima, y KM = Constante de Michaelis)
[S ] + K M
(Ec.1)

La Ecuación 1 puede transformarse en la inversa, denominada también representación de Lineweaver-Burk:

1 1 KM
V Vm Vm ⋅ [S ]
= + (Ec. 2)

MATERIAL Y REACTIVOS
- 6 Erlenmeyer 250 mL
- 2 Vasos de precipitados altos de 100 mL
- Pipeta graduada de 25 mL
- Pipeta automática de 200 µL (0.2 mL)
- Probeta de 100ml
- Urea
- Disolución de Ureasa en Glicerol 50%, 1000 U/ml
- Conductímetro

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
1. Preparar disoluciones de urea con arreglo al siguiente esquema:

Erlenmeyer Disolución [S] = Concentración (%) Preparación

1 1 0.4 0.4 g urea + 100 ml H2O
2 2 0.2 50 ml Disolución 1 + 50 ml H2O
3 3 0.1 50 ml Disolución 2 + 50 ml H2O
4 4 0.05 50 ml Disolución 3 + 50 ml H2O
5 5 0.025 50 ml Disolución 4 + 50 ml H2O
6 6 0.0125 50 ml Disolución 5 + 50 ml H2O

2. Colocar 40 ml de la disolución 1 en un vaso de precipitados, añadir una barra magnética, colocar el vaso en el agitador
e introducir el electrodo del conductímetro.
3. Añadir 0.2 ml de disolución de ureasa.
4. Medir la conductividad de la disolución a los tiempos marcados en la tabla.
5. Repetir la operación con todas las disoluciones.

RESULTADOS EXPERIMENTALES Y EJERCICIOS PROPUESTOS

Ejercicio 1.- Rellenar todas las casillas de la tabla:

tiempo (s) C = Conductividad (u. a.)

0
15
30
45
60
90
120
150
180
210
240

Para calcular V (Velocidad inicial de la reacción), representar C frente a t, trazar una tangente en el origen y calcular
su pendiente. Hacer esto para todas las concentraciones y anotar los valores en las casillas correspondientes

[S] 0.4 0.2 0.1 0.05 0.025 0.0125

V
1/[S]
1/V

Ejercicio 2.- Representar las siguientes gráficas:

1-6 C frente a t.
V = Pendiente inicial
Vm ⋅ [S ]
V frente a [S]. Corresponde a la ecuación V=
[S ] + K M
7

Ordenada del tramo horizontal = Vm

Vm
Abscisa correspondiente a = KM
2
1 1 KM
1/V frente a 1/[S]. Corresponde a la ecuación
Vm Vm ⋅ [S ]
8 = +
V
1
Ordenada en el origen =
Vm

KM
Pendiente =
Vm

Ejercicio 3.- Calcular Vm y KM a partir de las gráficas 7 y 8:

Gráfica 7 Gráfica 8

Vm
 KM

OBSERVACIONES
Gráfica 7

Gráfica 8
Gráficas 1 - 3
Gráficas 4 - 6