Laboratorio Bioquímica I

Práctica #11: Efecto de la concentración de sustrato sobre la

actividad enzimática
UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE CIUDAD JUÁREZ – INSTITUTO DE CIENCIAS BIOMÉDICAS
Licenciatura en Química – Laboratorio de Bioquímica I.
De la Rosa Carrillo Laura Alejandra − Kevin González Montoya 177273.

Resumen: El análisis cinético puede revelar el número y orden de los pasos individuales mediante los
cuales las enzimas transforman sustratos en productos. Junto a otras técnicas que sondean la estructura
de proteínas, los análisis cinéticos revelan detalles del mecanismo catalítico de una enzima dada. En esta
práctica, estudiamos como afectan distintas concentraciones a la velocidad de reacción de la hidrolisis
de sacarosa por medio de la enzima invertasa, utilizando una técnica espectrofotométrica para medir la
concentración y haciendo un análisis matemático utilizando el modelo de Michaelis-Menten y su
linearización de Lineweaver-Burk. A altas concentraciones, la velocidad de la reacción dejó de aumentar
y pasó a ser casi constante, hecho que concuerda con la teoría de la cinética enzimática.
Abstract: Kinetic analysis can reveal the number and order of the individual steps by which enzymes
transform substrates into products. Along with other techniques that probe protein structure, kinetic
analyzes reveal details of the catalytic mechanism of a given enzyme. In this practice, we study how
different concentrations affect the reaction rate of sucrose hydrolysis by means of the invertase enzyme,
using a spectrophotometric technique to measure the concentration and doing a mathematical analysis
using the Michaelis-Menten model and its linearization of Lineweaver-Burk. At high concentrations, the
rate of the reaction stopped increasing and became almost constant, a fact that is consistent with the
theory of enzymatic kinetics.

Palabras clave: sacarosa, enzimas, invertasa, cinética, dinitrosalicilato, Michaelis-Menten.

Introducción
En presencia de una cantidad dada de enzima, la velocidad de una reacción enzimática aumenta a
medida que aumenta la concentración del sustrato hasta que se alcanza una velocidad límite (señalada
por la abreviación Vmax), después de lo cual un aumento adicional en la concentración del sustrato no
produce un cambio significativo en la velocidad de reacción (punto C en la figura 1). En este punto, hay
tanto sustrato presente que esencialmente todos los sitios activos de enzimas tienen sustrato unido a
ellas. En otras palabras, las moléculas de enzima están saturadas con sustrato. El exceso de moléculas
de sustrato no puede reaccionar hasta que el sustrato ya unido a las enzimas haya reaccionado y se haya
liberado (Rodwell, Bender, Botham, Kennelly, & Weil, 2013).

Figura 1. Efecto de la concentración de sustrato sobre la velocidad inicial de una reacción catalizada por enzima.

Para describir matemáticamente la cinética enzimática, Michaelis y Menten crearon un modelo donde el
sustrato S se une a la enzima E, para formar el intermediario enzima-sustrato ES, que luego reacciona
para dar E + el producto P. El modelo explica que el segundo paso (la reacción de ES y su
descomposición en E+P) es el limitante de velocidad. Para esto, Michaelis y Menten crearon una
constante llamada kcat o número de recambio, la cual representa la rapidez con la que una enzima cataliza
una reacción y se define como el número de moléculas de sustrato que pueden convertirse en producto
por molécula de enzima y por unidad de tiempo (Baynes, & Dominiczak, 2011). La proporción de ES, en
relación con el número total de moléculas de enzima [E]t, es decir, la relación [ES]/[E]t, limita la velocidad
(v) de una enzima, de manera que:

1
 𝑣 = 𝑘𝑐𝑎𝑡 [𝐸𝑆]

Puesto que E, S y ES se encuentran todos en equilibrio químico, la enzima alcanza una velocidad máxima
(Vmax) a concentraciones de sustrato [S] muy elevadas (donde la enzima se encuentra saturada), cuando
[ES] ≈ [E]t. Por tanto:

𝑉𝑚𝑎𝑥 = 𝑘𝑐𝑎𝑡 [𝐸]𝑡

Para la disociación del complejo ES, la ley de acción de masas implica:

[𝐸][𝑆]
𝐾𝑑 =
[𝐸𝑆]

Haciendo un análisis de las ecuaciones anteriores podemos obtener el modelo de Michaelis-Menten que
tiene la siguiente forma:

𝑉𝑚𝑎𝑥 [𝑆]
𝑣=
𝐾𝑚 + [𝑆]

Donde Km se expresa en unidades de concentración y que se define como la concentración de sustrato

que corresponde a ½ Vmax en la gráfica de Michaelis-Menten (Mathews, Van Holde y Ahern, 2002).

Objetivos

 Determinar los parámetros Vmax y KM de la enzima invertasa.

Material

 Tubos de ensaye
 Una gradilla
 Pipetas de 1 mL
 Pipetas de 5 mL
 Un baño de agua a 37 grados centígrados
 Un baño de agua a ebullición

Metodología
Se prepararon dos series de tubos idénticas, etiquetadas del 1 al 12 y con base en las proporciones de
la siguiente tabla:

No. de Enzima Amortiguador [Sacarosa] (M)

tubo 0.02 0.03 0.05 0.1 0.3 Agua
1y7 1 mL 0.5 mL 1 mL 0 mL 0 mL 0 mL 0 mL 0 mL
2y8 1 mL 0.5 mL 0 mL 1 mL 0 mL 0 mL 0 mL 0 mL
3y9 1 mL 0.5 mL 0 mL 0 mL 1 mL 0 mL 0 mL 0 mL
4 y 10 1 mL 0.5 mL 0 mL 0 mL 0 mL 1 mL 0 mL 0 mL
5 y 11 1 mL 0.5 mL 0 mL 0 mL 0 mL 0 mL 1 mL 0 mL
6 y 12 1 mL 0.5 mL 0 mL 0 mL 0 mL 0 mL 0 mL 1 mL

Una vez preparados y mezclados los tubos se incubaron a 35°C. A los 10 minutos, los tubos seriados del
número 1 al 6 se retiraron de la incubadora y se les añadió 0.5 mL de dinitrosalicilato, después fueron
llevados a ebullición por 3 minutos. Una vez enfriados, se llevó al espectrofotómetro y se leyó su
absorbancia a una longitud de onda de 540 nm, usando como blanco el tubo 6. El mismo procedimiento
se llevó a cabo con la serie de tubos del 7 al 12 solo que estos se dejaron durante otros 10 min en la
incubadora, es decir, estuvieron incubados a 35°C por 20 minutos en total.

2
Resultados

Tabla 1. Absorbancias obtenidas en el experimento, cada una corresponde a una concentración de

sacarosa.
[Sacarosa] (M) Abs a los 10 minutos Abs a los 20 minutos

0.00 0 0

0.02 0.0187 0.0201

0.03 0.0312 0.0422

0.05 0.052 0.109

0.10 0.111 0.225

0.30 0.373 0.714

Tabla 2. Absorbancias de cada concentración de sacarosa ordenados respecto al tiempo, para poder
calcular las velocidades iniciales.
[Sacarosa] (Abs)
Tiempo
0.02 0.03 0.05 0.1 0.3
0 0 0 0 0 0
10 0.44 0.523 0.678 0.82 0.923
20 0.893 1.096 1.584 1.584 1.859

Tabla 3. Concentracion de
sacarosa contra velocidad inicial Michaelis-Menten
para el modelo de Michaelis- Vmax 0.1
Menten. 0.09
[Sacarosa] (M) Vo 0.08
0.07
0 0 0.06
½ Vmax 0.05
0.02 0.0453
0.04
0.03 0.0573 0.03
0.02
0.05 0.0664 0.01
0.1 0.0764 0
0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35
0.3 0.0936 Km
Gráfica 1. Modelo de Michaelis-Menten sobre la cinética de la hidrolisis de
sacarosa por la enzima invertasa. Las líneas punteadas señalan las
constantes cinéticas.

Constantes cinéticas determinadas gráficamente

Km ≈ 0.020 Abs
Vmax ≈ 0.1

3
 Tabla 4. Recíprocos de las
variables para el modelo lineal de Lineweaver-Burk
Lineweaver-Burk. 25
1/[Sacarosa] 1/Vo
20
50 22.075
15
33.33 17.452 y = 0.232x + 10.259

20 15.060 10

10 13.089 5

3.33 10.683 0
0 10 20 30 40 50 60

Gráfica 2. Modelo de Lineweaver-Burk, resultante de calcular el recíproco

del modelo de Michaelis-Menten. La ecuación de la recta nos permite
calcular las constantes cinéticas.

Constantes cinéticas determinadas analíticamente

𝒎 = 𝟎. 𝟐𝟑𝟐

𝒃 = 𝟏𝟎. 𝟐𝟓𝟗

𝟏 𝟏
𝑽𝒎𝒂𝒙 = = = 𝟎. 𝟎𝟗𝟓𝟒
𝒃 𝟏𝟎. 𝟐𝟓𝟗

𝑲𝒎 = 𝒎 ∙ 𝑽𝒎𝒂𝒙 = (𝟎. 𝟐𝟑𝟐)(𝟎. 𝟎𝟗𝟓𝟒) = 𝟎. 𝟎𝟐𝟐𝟏

Discusión y conclusión

La enzima invertasa cataliza la hidrólisis de sacarosa para invertir el azúcar. El azúcar invertido es una
mezcla 50/50 de glucosa y fructosa, ambos monosacáridos. Se le llama azúcar invertida porque su
actividad óptica cambia o se invierte después de la hidrolisis. La hidrolisis de la sacarosa catalizada por
la invertasa es relativamente simple; una vez que la sacarosa se une a la enzima, la conformación de la
enzima cambia. El agua rompe el enlace acetal que une ambos
componentes de la sacarosa (como se indica en rojo en la imagen X)
y un OH del agua se une al carbón de la fructosa mientras que un H
se une al oxígeno de la glucosa, fragmentando la unión del disacárido
y liberando las dos azucares como productos.

El dinitrosalicilato, además de permitirnos detectar la presencia de

azucares reductoras como lo son la fructosa y la glucosa al formar
ácido 3-amino-5-nitrosalicílico, nos permitió medir su absorbancia a
540 nm y así cuantificar los azucares o dicho de otra forma, nos da
una medición de la concentración de los productos la cual la
asumimos como concentración de sustrato en unidades de
absorbancia.

Las constantes cinéticas se calcularon usando el modelo de

Michaelis-Menten, el cual sirve para explicar cómo una enzima puede causar una mejora de la velocidad
cinética de una reacción y explica cómo las velocidades de reacción dependen de la concentración de
enzima y sustrato. El modelo de Michaelis-Menten toma la siguiente forma:

𝑉𝑚𝑎𝑥 [𝑆]
𝑣=
𝐾𝑚 + [𝑆]
De dicho modelo, podemos resaltar dos partes esenciales, las constantes cinéticas V max (siendo esta en
realidad una pseudo-constante) y Km. Dichas constantes se pueden aproximar de dos formas, empleando
la linearización de Lineweaver-Burk donde se calcula el reciproco del modelo de Michaelis-Menten y se
grafica para obtener la recta y su respectiva ecuación donde cada miembro corresponde a un valor de la
ecuación de la recta graficada, de modo qué:

4
 1 𝐾𝑚 1 1
= ∙ +
𝑉𝑜 𝑉𝑜 [𝑆] 𝑉𝑚𝑎𝑥

y m x b

De esta forma, pudimos inferir que:

1 1
𝑏= = 𝑉𝑚𝑎𝑥
𝑉𝑚𝑎𝑥 𝑏
𝐾𝑚
𝑚=
𝑉𝑚𝑎𝑥
Dichas ecuaciones nos permitieron calcular Km el cual tuvo un valor de 0.0221, valor al que se aproxima
el valor estimado por medio de la gráfica de Michaelis-Menten, y Vmax fue calculado con un valor de
0.0954, el cual también resulta similar al estimado por el método gráfico.

El método gráfico resulta de estimar los valores de las constante a través del modelo de Michaelis-
Menten, observando el punto en el que la velocidad comienza a tener un comportamiento lineal, dejando
de aumentar conforme la concentración de sustrato aumenta, adoptando un comportamiento asintotal y
por tanto, nos permite determinar Vmax la cual se define como la velocidad máxima que alcanza la reacción
al estar la enzima totalmente saturada por sustrato. El valor de Km se define como el valor de
concentración de sustrato al cual corresponde ½ Vmax, por lo que se puede aproximar calculando la mitad
de Vmax y tomando su valor de [S] correspondiente.

Cuestionario

1.- ¿La velocidad inicial de una reacción enzimática es dependiente exclusivamente de la cantidad
de sustrato presente? ¿Si, no, por qué?

No, también depende de la concentración de enzima presente, supongo que la temperatura también
afecta pues ha de aumentar el número de colisiones por lo que también podría afectar la velocidad inicial.

2.- ¿Cuál es la diferencia entre los cambios de energía libre que existen entre un proceso
catalizado por una enzima y el mismo proceso no catalizado?

El cambio de energía libre no cambia en una reacción catalizada, solamente reduce su energía de
activación.

3.- ¿Por qué a concentraciones de sustrato mucho mayores que el valor de la Km la velocidad de
la reacción es independiente de la concentración de sustrato?

Porque a una dada concentración de enzima, llega a un punto donde si se aumenta la concentración de
sustrato lo suficiente, se llega al punto donde las enzimas están saturadas, por tanto, la concentración de
sustrato deja de afectar qué tan rápido suceden las reacciones. La velocidad de la reacción pasa entones
a ser relativamente constante.

4.- ¿La Km de una enzima varía con la concentración de enzima? ¿Si, no, por qué?

Según Rodwell, Bender, Botham, Kennelly, y Weil (2013), [S]total >> [E]total para que [S]libre sea
aproximadamente igual a [S]total. Por lo tanto, un pequeño aumento en [E]total no tiene un efecto
significativo en [S]libre. (En otras palabras, el aumento de la concentración de enzima no reduce
significativamente la concentración total de sustrato). Dado que [S]libre no se ve afectado
significativamente por un aumento de [E]total, tampoco hay un efecto significativo en Km. Sin embargo,
desconozco si es el mismo caso para todos los tipos de enzimas o solamente para las enzimas
monomericas o con un solo sitio de unión.

Bibliografía

Rodwell, V., Bender, D., Botham, K., Kennelly, P. & Weil, A. (2013). Bioquímica ilustrada. México:
McGRAW-HILL INTERAMERICANA EDITORES.

Baynes, J. & Dominiczak, M. (2011). Bioquímica médica. España: Elsevier.

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Mathews, C., Van-Holde, K. & Ahern, K. (2002). Bioquímica. España: Pearson Educación.