1 Cinética de la Fermentación Láctica de Suero Ultrafiltrado con Cultivo Mixtos.

2 (Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus y Lactobacillus helveticus).

3
4 David Julio Palmar Palmar*; Ronald Roman Romero**; Gisela Paéz1.
5
6 Escuela de Ingeniería Química, Laboratorios de Tecnología de Alimentos y
7 Fermentaciones Industriales1, Facultad de Ingeniería, Universidad del Zulia. Apartado
8 526, Maracaibo. 4001-A, Venezuela, Telf. 0261-4128746, Fax. 0261-7598800.
9 palmardj@gmail.com* ; rnldromero2001@hotmail.com** ; gpaezr@gmail.com1
10
11 Resumen
12
13 Se estudió la cinética de la fermentación láctica de suero ultrafiltrado con cultivos puros
14 y mixtos de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus y Lactobacillus helveticus en
15 relación 1:1 a condiciones controladas de pH= 5.9 y T= 42 ºC . El suero de leche crudo
16 y ultrafiltrado fue caracterizado, evaluando sus contenidos de lactosa, nitrógeno,
17 proteína, solidos totales, grasas y pH. El valor de la tasa especifica de crecimiento
18 máxima µmáx=0.4044 ± 0.011 h-1 fue para el cultivo mixto, la constante de crecimiento
19 KS= 7.6289 ± 0.074 Kg/m3, y el rendimiento real YC= 1.3281 (Kg de biomasa
20 producido/Kg de lactosa consumido) para su mantenimiento. Los modelos de
21 Gompertz modificado, ecuación Logístico sencilla, Logístico generalizado por Edwards
22 & Wilke, ecuación de Hanson & Tsao y otros de regresión no lineales se emplearon
23 para describir la cinética de fermentación del crecimiento de biomasa, consumo de
24 sustrato y producción de ácido láctico. Los modelos logístico, Gompertz modificado,
25 modelo logístico generalizado propuesto por Edwards & Wilke describieron
26 adecuadamente la cinética fermentación del suero ultrafiltrado bajo condiciones de pH
27 controlado.
28
29 Palabras claves: Cultivo por carga, cultivo mixto, suero ultrafiltrado, modelo cinético,
30 modelos de regresión no lineales.
31
32 Kinetics of Lactic Fermentation Whey Ultrafiltration with mixed cultures.
33 (Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus y Lactobacillus helveticus).
34
35 David Julio Palmar Palmar*; Ronald Roman Romero**; Gisela Paéz1.
36
37 Escuela de Ingeniería Química, Laboratorios de Tecnología de Alimentos y
38 Fermentaciones Industriales1, Facultad de Ingeniería, Universidad del Zulia. Apartado
39 526, Maracaibo. 4001-A, Venezuela, Telf. 0261-4128746, Fax. 0261-7598800.
40 palmardj@gmail.com; rnldromero2001@hotmail.com; gpaezr@gmail.com
41
42 Abstract
43 It was studied kinetic of the fermentation of whey ultrafiltrate with batch cultures of
44 Lactobacillus delbrueckii subs. bulgaricus and Lactobacillus helveticus pure and mixed
45 in the ratio 1:1 batch culture under conditions of controlled pH= 5.9 and T = 42 ºC. The
46 whey crude and ultrafiltrate was characterized, and its contents of lactose, nitrogen,
47 protein, total solid, fat and pH evaluated. The value of the specifies of growth rate
48 maximum was 0.4044 ± 0.011 h -1 for the mixed culture, the saturation constant KS=
49 7.6289 ± 0,074 Kg/m³ and true yield YC = 1.3221 (kg biomass produced/Kg of lactose
50 consumed for growth) for its maintenance were determined from the culture batch
51 experiments. The models of modified Gompertz, equation simple Logistic, Logistic
52 generalized by Edwards & Wilke, equation of Hanson & Tsao and others of regression
53 nonlinear were used to describe the kinetic of fermentation of the growth of biomass,
54 substrate consumption and lactic acid production. A logistic, Gompertz Modified and
55 logistic generalized model proposed by Edwards & Wilke it suitably described the
56 kinetic fermentation of the whey ultrafiltrate under condition of pH controlled.
57
58 Key words: batch culture, mixed culture, whey ultrafiltrate, kinetics model, models of
59 nonlinear regression.
60
61 Introducción
62
63 En Venezuela existen alrededor de 80 plantas industriales con una producción anual
64 entre 50 y 60.000 toneladas de quesos, principalmente fresco, que proviene casi en su
65 totalidad de leche de ganado vacuno. Se puede calcular que este volumen de materia
66 sólida genera alrededor de 150.000 toneladas de suero de leche que en su mayoría es
67 suero dulce, una pequeña parte se seca para obtener suero en polvo, otro se añade como
68 complemento de dieta en la alimentación de porcinos y bovinos, en otros casos se extrae
69 lactosa, la otra se emplea en la industria de alimento, no obstante, no menos del 80 %
70 del suero es desechado [1].
71
72 El ácido láctico obtenido por fermentación del suero de leche a través de procesos de
73 bioconversión utilizando bacterias lácticas (Lactobacillus helveticus, Lactobacillus
74 delbrueckii. subsp.bulgaricus, Lactobacillus casei etc.) pueden llevarse a cabo por dos
75 vías; Cultivo por Carga y Cultivo Continuo. El suero, actuará como sustrato (lactosa)
76 para producir el ácido láctico se seleccionara el microorganismo capaz de crecer en
77 suero de leche y fermentar la mayor parte, si no es que toda, la lactosa a ácido láctico
78 [2]. Aunque el suero contiene alrededor del 93% de agua, la composición típica del
79 suero de leche producido del queso, que damos a continuación, en la Tabla 1, se indica
80 la presencia de valiosos elementos nutritivos [3,4].
81
82 En Venezuela anualmente se gasta una gran cantidad de divisas en la adquisición de
83 ácido láctico, alrededor de 7.576.321millones de Bolívares Fuertes en el periodo 2000-
84 2008 en pago de importaciones Venezolanas de Ácido Láctico a diversos países
85 productores tales como: Alemania, México Suiza, USA, Holanda, Colombia, Japón,
86 China, con el fin de utilizarlo en diversos sectores del estado como el médico,
87 farmacéutico, industrial, universitario entre otros; estas divisas por concepto de
88 importación del producto podrían ahorrarse obteniendo este ácido por medio de los
89 procesos biotecnológicos [5,6].
90
91 El procesamiento del suero fresco tiene como objetivo extraer de él los componentes
92 valiosos, es decir, las proteínas y la lactosa. Las técnicas de procesamiento pueden ser
93 divididas en dos grupos: Técnicas de Concentración y Técnicas de Separación, esta
94 última consisten en separar directamente de la solución diluida del componente que
95 interesa. Las principales técnicas de este tipo son la ósmosis inversa, ultrafiltración y
96 precipitación de proteínas [7].
97
98 El uso de membranas en los recientes años ha llegado a ser aceptada y entendida en
99 la industria láctea, membranas como por ejemplo la Ultrafiltración (UF), describe los

2
100 procesos en los cuales las partículas de tamaño significativamente más grande que
101 están en el solvente son retenida cuando la solución es hidráulicamente forzadas a través
102 de una membrana de poros muy fina y Ultra ósmosis (Nanofiltración).
103
104 La membrana de ultrafiltración (UF) puede ser mejor descrita como un filtro. Las
105 membranas de UF fraccionan entre la proteína molecular y la lactosa seguida de agua,
106 cenizas, y la lactosa pasa a través de él mientras reinyecta proteína y grasa. Las
107 membranas estándar para sistemas de UF usada en la industria láctea son de
108 polietersulfano. Las membranas de Ultra osmosis (Nanofiltración), son descritas como
109 barreras formadas de una poliamida soportadas sobre una polietersulfona. Este resulta
110 en una barrera de capa rica en grupos carboxilatos, reinyecta sales y es controlada por
111 tamaño y carga iónica. La utilidad de la membrana además de acrecentar
112 simultáneamente la capacidad de concentrar es la de reinyectar las especies [8,9,10]
113
114 Tabla 1. Composición Típica Porcentual Aproximada del Lactosuero [3,4].
Ácido Proteínas. Lactosa. Cenizas. Lípidos. pH. Agua.
Componente láctico.
Composición % 6.6
0.20 0.9 4.9 0.6 0.3 a 93.1
5.8
115
116 En un proceso de fermentación las ecuaciones cinéticas más importantes que deben
117 conocerse son la producción de biomasa, la formación de producto y el consumo de
118 sustrato [7]. Esto se logrará por la obtención de datos experimentales a nivel de
119 laboratorio para de este modo ajustar estos datos con las ecuaciones cinéticas propuesta
120 en la literatura. Los modelos pueden ayudar a disminuir la cantidad requerida de tiempo
121 de evaluación y costos, además permite un diseño más óptimo y/o eficiente de prueba,
122 permiten mejorar la cadena de distribución, por ejemplo en la calidad de elaboración de
123 alimentos [11]. Las ecuaciones más frecuentes que se reportan se muestran en la Tabla
124 2. [7].
125
126 Un modelo empleado para crecimiento bacterial es el logístico generalizado
127 propuesto por Edwards & Wilkes [11]. El modelo tiene la siguiente fórmula:
M
Ci 
128 1  EXP F ti  ec. (1)
129
130 dónde F ti   ao  a1t  a2t 2  .....  ant n .
131
132 Este modelo también puede ser usado para evaluar las velocidades de consumo de
133 substrato y formación de productos respectivamente. Las velocidades de procesos
134 fueron evaluadas tomando la derivada de Ci, con respecto al tiempo de la siguiente
135 manera:
136
dCi  Ci 

 Ci1   a1  2a 2 t i  .....  na n t in1 
137 dt  K ec. (2)
138
139 Un modelo predictivo para curvas de crecimiento empleado satisfactoriamente es la
140 ecuación modificado de Gompertz sugerido por Zwietering et al [12]. En el cual la
141 curva de crecimiento es definida como el logaritmo Neperiano del tamaño relativo de la

3
142 población [Y=LN(N/No) o LN(X/Xo)] como una función del tiempo (t). La ecuación
143 modificada de Gompertz consta de tres parámetros a,b,c que ha sido reparametrizada
144 para incluir parámetros de contenido biológico como A, µmáx , y λ , para representar
145 curvas de formas sigmoidales definidas por los datos experimentales.
146
147 La máxima velocidad de crecimiento especifica µmáx , es definida como la tangente
148 en el punto de inflexión, el tiempo de adaptación λ, es definida como el intercepto del
149 eje t con esta tangente; y la asíntota A es igual LN(X/Xo), la cual es máximo valor
150 alcanzado de crecimiento microbiano, utilizando análisis de regresión no linear se puede
151 hallar estos parámetros a partir de la data experimental. La expresión final resulta:
152
153 Y = A exp{-exp[(µmáx e(1) /A)(λ – t) +1]} ec. (3)
154
155
156 Tabla 2. Ecuaciones y modelos Cinéticos para la Biomasa, Consumo y Producción [7].
157
158
159
160
161
162
163
164
165
166
167
168
169
170
171
172
173
174 Materiales y Métodos
175
176 Microorganismo
177
178 Los microorganismos utilizados fueron Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus
179 ATCC 27558 y Lactobacillus helveticus ATCC 8018 . El Lactobacillus delbrueckii
180 subsp. bulgaricus ATCC 27558 y el Lactobacillus helveticus ATCC 8018 fueron
181 obtenidos liofilizado de la American Type Culture Collection, Rockville, Md.
182
183 Para el cultivo de las bacterias, se reactivaron los microorganismos liofilizados en
184 leche, durante 48 horas a 37°C, de los tubos de reactivación ( 25*150 mm), se tomó 1
185 ml y se transfirió a unos tubos, con 9 ml de un medio de formulación específico para
186 lactobacterias, con la siguiente composición: Leche descremada 100 g/ 1L, jugo de
187 tomate 100 mL/ 1L se filtró a través de papel de filtro y se ajustó el pH a 7 se deja toda
188 la noche a 10 °C, extracto de levadura 5 g/ 1L y agua destilada hasta completar 1L con
189 el pH ajustado a 7. Se incuba a 37 °C durante 24 hr en los tubos; y se refrigera a 4°C
190 para su conservación [13,14].
191

4
192 Muestras: Suero de Leche
193
194 El suero de leche o lactosuero empleado fue suministrado por la empresa
195 VENELACTEOS ubicada en Santa Rosa de Agua en Maracaibo, Edo. Zulia-
196 Venezuela, Proveniente de la etapa inicial de producción de queso blanco prensado de
197 mano (suero de leche dulce pH = 6.5), y se transportó hasta el laboratorio de Ciencia y
198 Tecnología de la Leche de la Facultad de Ciencias Veterinarias de la Universidad del
199 Zulia, en un lapso aproximado de 2 horas.
200
201 Equipo: Ultrafiltración. Desproteinización y Suplementación del Suero de Leche
202
203 Un volumen de 100 litros de suero fue fraccionado en 5 partes iguales para ser
204 procesado en lotes de 20 litros. El módulo fue cebado con 2 litros de suero
205 aproximadamente. El suero se colocó en el tanque para ser recirculado a una
206 temperatura de 30 ± 5 ºC. Se utilizó una planta piloto de filtración tangencial dividida
207 en dos procesos en serie; un proceso de ultrafiltración y un proceso de nanofiltración,.
208 [9].
209
210 Fermentación:
211
212 Las fermentaciones por carga se realizaron en fiolas de 500 ml de capacidad, en un
213 incubador rotatorio New Brunswick modelo INNOVA 4300 y en el fermentador New
214 Brunswick modelo Bioflo 4000 con capacidad máxima de 5 litro. Se utilizó 300 ml de
215 suero suplementado, esterilizado en el auto clave a 115 ° C durante 15 minutos, se
216 inoculó el microorganismo en campana de flujo laminar, y se sellan las fiolas con papel
217 parafinado para garantizar anaerobiosis. La fermentación se llevó a cabo manteniendo la
218 temperatura a 42 °C sin agitación.
219
220 En el fermentador se empleó 2.7 litros de suero suplementado, y se esterilizó en el
221 mismo equipo, calentando con vapor a 115 °C durante 15 minutos. Se inocula el cultivo
222 en el fermentador en condiciones asépticas, y se realizó la fermentación sin aireación,
223 con control de pH a 5.9, además controlando la temperatura a 42 °C y agitación de 50 a
224 100 rpm, se empleó Tween 80 como antiespumante en una concentración de 1 g/ L.
225
226 Cultivo por Carga
227
228 Se realizaron 8 cultivos por cargas y por duplicado a temperatura de 42 °C y pH a
229 5.9 con agitación de 100 rpm, utilizándose Tween 80 como antiespumante en un
230 fermentador New Brunswick, modelo Bioflo 4000 para un volumen de trabajo de 3
231 litro; 0.3 litro corresponde al inóculo. Se midió la concentración de biomasa, lactosa y
232 ácido láctico, cada hora hasta alcanzar el máximo crecimiento logarítmico de biomasa a
233 partir de la hora de inoculación, denominada hora cero (0).
234
235 Determinaciones: Métodos de Análisis
236
237 A las muestras de suero original, concentrado de proteína y permeados de
238 ultrafiltración, se les determinó por triplicado Nitrógeno por el método Kjeldahl [15]. El
239 contenido de Proteína se determinó como el porcentaje de nitrógeno multiplicado por el
240 factor 6.38 [15]. Sólidos totales y cenizas se determinó empleando los método de la
241 A.O.A.C. (calentamiento en estufa y mufla) [15], Grasa por el método volumétrico de

5
242 Gerber (Gerber-Schneider) [25]. La concentración de biomasa se determinó
243 turbidimétricamente, midiendo la absorbancia de la muestra en un espectrofotómetro
244 modelo CARY UV – 50 VARIAN (Mulgrave, Victoria, Australia) a una longitud de
245 onda de 490 nm. Relacionando la densidad óptica (D.O) con el peso seco de la biomasa
246 por unidad de volumen a través de la construcción previa de la curva de calibración
247 [16].
248
249 El contenido de lactosa se determinó utilizando el método espectrocolorimétrico de
250 Dubois & Col [17]. (método fenol ácido sulfúrico), empleando un espectrofotómetro
251 modelo CARY UV – 50 VARIAN (Mulgrave, Victoria, Australia) a intervalos
252 constantes de una hora desde el inicio de la fermentación a una longitud de onda de 490
253 nm. Para la medición se utilizó una curva de calibración [17]. La concentración de ácido
254 láctico se determinó por cromatografía en fase gaseosa, empleando un cromatógrafo
255 Perkin Elmer, XL Autosystem (Norwalk, USA) provisto con un detector de ionización a
256 la llama (PID) equipado con una columna capilar Carbowax, para ácidos grasos, de 15
257 metro de longitud y 0.25 mm de diámetro. [7,2].
258
259 Método para Simulación de Modelos Cinéticos
260
261 Los distintos modelos cinéticos disponibles para la fermentación láctica en
262 producción del ácido, biomasa y consumo del sustrato en el sistema por carga fueron
263 analizados por regresión no lineal empleando un algoritmo modificado de Marquardt
264 [18] y software denominado Curve Expert Versión 1.3 [19].
265
266 Resultados y Discusiones
267
268 Composición del Suero de Leche
269 La caracterización promedio del lactósuero empleado en este estudio fue de queso
270 blanco prensado, suero de leche fresco crudo, se presenta en la Tabla 3. El análisis y la
271 caracterización del suero crudo, indicó que es un suero dulce. Este suero, contiene
272 proteínas remanentes sin desnaturalizar. La caracterización del suero luego de la
273 ultrafiltración y tratamiento térmico ácido arrojó resultados en lactosa, nitrógeno,
274 proteínas, sólidos totales, cenizas, grasas y pH, temperatura de 35°C mostrados en la
275 Tabla 3. Al emplear el proceso de ultrafiltración de esta forma se logró una eficiente
276 remoción de proteína, como en el suero dulce empleado en el estudio de Araujo y col
277 [20].
278
279 Al observar y comparar los valores reportados en dicha tabla, muestran que la
280 desproteinización es más efectiva utilizando el proceso de ultrafiltración tangencial y
281 tratamiento térmico ácido, que los valores reportados por Jakymec y Moran H. [7]
282 ,Urribarri, y Vielma [2], Quintero y Rodríguez [13]. También se observa que los valores
283 de la Tabla 3 del suero crudo son similares a la composición promedio obtenidos por
284 Faría, García y García [3,4] y así como también por los alcanzados por Muñi [9].
285
286 Cultivo por Carga
287
288 Las Figuras 1 y 2 muestran el progreso de las fermentaciones de cultivos puros, L.
289 delbrueckii subsp. bulgaricus, L. helveticus y sus cultivos mixtos en relación 1:1,
290 respectivamente. Estas Figuras representan el comportamiento de los microorganismos
291 en las fermentaciones de cultivos por cargas en términos de crecimiento y consumo de
6
292 sustrato observándose que el tiempo de la fase de adaptación de crecimiento tuvo un
293 periodo corto, y fase de crecimiento exponencial de 8 horas promedio a temperatura de
294 42 °C y pH 5.9 controlado. Esto indica una adecuada adaptación de los
295 microorganismos al medio. La mayor producción de biomasa se presentó en el cultivo
296 de L. helveticus (99,966±0.105 Kg/m3), como se muestra en la Figura 1.
297
298 Tabla 3. Caracterización promedio del suero de leche.
Materia Prima. Suero Crudo. Suero Ultrafiltrado*.
Composición %
Lactosa (Kg/m3). 64.8818 ± 0.2371 58.94 ± 0.5636
Nitrógeno (%P/V). 0.1395 ± 0.0084 0.0406 ± 0.0027
Proteína (%P/V). 0.8903 ± 0.0538 0.2592 ± 0.0177
Sólidos totales (%P/V). 6.6464 ± 0.0056 3.2731 ± 0.1539
Cenizas (%P/V). 0.5108 ± 0.0028 0.3819 ± 0.01380
Grasa (%P/V). 0.52 ± 0.1347 0.0
pH. 6.55 ± 0.2273 4.53 ± 0.2345
299 *Resultado obtenido posterior al proceso de ultrafiltración en suero desproteinizado por tratamiento térmico acido,
300 para mejorar la eficiencia de remoción de proteína.
301
302 En la Tabla 4 se reportan los valores de velocidad específica de crecimiento
303 calculados a partir del ajuste lineal de la pendiente de biomasa Vs tiempo en la región
304 de crecimiento exponencial así como también la biomasa en los bioprocesos por carga.
305
306 La máxima velocidad especifica de crecimiento (µmáx) fue de 0,4189±0.214 h-1 para
307 el cultivo puro de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, en suero ultrafiltrado.
308 Los resultados indican que se obtuvo biomasa de forma satisfactoria utilizando suero
309 ultrafiltrado y suplementado, al igual que estudios en donde solo se varió el
310 microorganismo y las variables de operación de los bioprocesos, como en el estudio de
311 Buitrago y Soto [21], donde se logró altos niveles de proteína celular a partir de suero
312 ultrafiltrado diluido.
313
314 Tabla 4. Velocidad específica de crecimiento (µ) y biomasa en cultivo por carga
315 de Lactobacillus en suero de leche ultrafiltrado a pH =5.9 y T = 42 °C.
Microorganismo. µmáx(h-1). X(Kg/m3) R2.
Lactobacillus helveticus. 0.2431 ± 0.119 99.966±0.105 0.9703
Lactobacillus delbrueckii subsp
bulgaricus. 0.4189± 0.214 25.28± 0.85 0.9755
Mezcla(1:1)
L. helveticus/ L. Delbrueckii subsp 0.4044 ± 0.011 82.2186± 0.72 0.9891
bulgaricus.

316
317 El comportamiento del crecimiento con respecto al consumo de sustrato puede ser
318 comprendido con el valor de rendimiento YX/S observado para cada cultivo como se
319 muestra en la Tabla 5 junto con los rendimientos de productos YP/S, además de los
320 valores de concentraciones de ácido láctico en función del tiempo correspondiente las
321 condiciones utilizadas en el cultivo por carga (a partir de las Figuras 1 y 2).

7
322
323 La producción de ácido láctico de cultivos puros se observan en la Figura 3, así como
324 los cultivos mixtos a partir del suero de leche ultrafiltrado y suplementado
325 observándose una mayor de producción de ácido láctico en el cultivo mixto en relación
326 (1:1), con un máximo de 11.9173 Kg/m3, hubo una variación mínima en la producción
327 en el cultivo puro de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus (8,7436± 0.851
328 Kg/m3), con respecto al del Lactobacillus helveticus (8,7940± 0.111 Kg/m3).
329
330 Tabla 5. Concentración y Productividad de ácido láctico en cultivo por carga de
331 Lactobacillus en suero de leche ultrafiltrado a pH =5.9 y T = 42 °C.
Microorganismo. Concentración Rendimiento Rendimiento
Acido YX/S (Kg/m3.h) YP/S (Kg/m3.h)
P (Kg/m3)
4,9267
Lactobacillus helveticus. 8.7940± 0.111 0,2012

Lactobacillus delbrueckii subsp 8.7436± 0.851 1,3751 0,3767

bulgaricus.

L. helveticus/ L.delbrueckii subsp

11.9173± 0.562 1,3281 0,1429
bulgaricus. Mezcla(1:1)

332
333 Desarrollo de Modelos Cinéticos
334
335 La fermentación de la lactosa empleando lactobacteria (Lactobacillus delbrueckii
336 susbsp. bulgaricus y Lactobacillus helveticus), sirvió para demostrar el crecimiento
337 microbiano o producción de biomasa, consumo de sustrato y producción de ácido
338 láctico. Los resultados experimentales de esta fermentaciones por carga mostradas en
339 las Figuras 1,2,3 fueron utilizadas también para desarrollar los modelos cinético de la
340 fermentación de los cultivos puros y mixtos empleando la lactosa del suero ultrafiltrado.
341 Para la producción de biomasa de los cultivos puros y mixtos fueron simulados según
342 los modelos cinéticos y matemáticos mostrados en la Tabla 2, además de la de
343 Gompertz modificado [12], esto se muestran en las Figuras 4,5 y 6.
344
345 Se pudo observar que las ecuaciones o modelos de la Tabla 2, simularon la fase de
346 adaptación, pero no se ajustaron exactamente al comportamiento de la data experimental
347 en la zona de crecimiento exponencial, la ecuación de Amrane & Prigent [22] presentó
348 una buena simulación para la producción de biomasa desde la fase de adaptación,
349 crecimiento exponencial, hasta la fase de muerte, a pesar de no tener una buena
350 correlación en relación a los datos experimentales, este comportamiento se observó en
351 la Figura 4 para el cultivo de Lactobacillus helveticus.
352
353 Para el cultivo de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus de la Figura 5 se notó
354 que los modelos igualmente simulan el corto periodo de adaptación de la data
355 experimental, así como la de crecimiento exponencial, la que presento un mejor
356 modelamiento fue la ecuación logística modificada por Edwards & Wilkes[11]. De las
357 Figuras 4, 5, 6 se desprende que el modelo con mejor ajuste para la producción de
358 biomasa fue el de Gompertz Modificado[12], logístico modificado por Edwards &
359 Wilkes[11] y Logístico sencillo [7] debido al ajuste de regresión no lineal las cuales
360 obtuvieron una alta correlación.

8
361
362
363
364
365
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374
375 Figura 1. Crecimiento en cultivo por carga,
Figura 2. Consumo de lactosa en cultivo por carga,
Lactobacillus helveticus (L.h) (); Lactobacillus
376 delbrueckii subsp. bulgaricus (L.b) (▲) y cultivos
Lactobacillus helveticus (L.h) () ; Lactobacillus
delbrueckii subsp. bulgaricus (L.b) (▲) y cultivos
377 mixtos (L.h/L.b) (•), en suero de leche ultrafiltrado a mixtos (L.h/L.b) (•), en suero de leche ultrafiltrado a
378 pH= 5.9 y T= 42 ºC. pH= 5.9 y T= 42 ºC.
379
380 La data experimental fue alisada o modelada utilizando también el modelo logístico
381 generalizado para la biomasa sugerido por Edwards & Wilkes [11]. Igualmente el
382 modelo logístico generalizado también fue utilizado para evaluar la utilización de
383 sustrato y velocidades de producción de ácido láctico, en las Figuras 7, 8,9 y 10, 11,12
384 respectivamente.
385
386 Para los modelos de Consumo de Sustratos, de los cultivos puros de la Figuras 7 y 8,
387 se observó que no modelaron el comportamiento de los datos experimentales, además
388 no se obtuvo una buena correlación para el ajuste de dichos modelos con respecto a la
389 data. Este comportamiento es más notorio en la zona que corresponde a la fase
390 exponencial de los microorganismos, de manera similar se presenta un
391 comportamiento de dichas modelaciones en la Figura 9 para el cultivo mixto de
392 Lactobacillus helveticus y Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus.
393
394 La aplicación del modelo logístico generalizado sugerido por Edwards & Wilkes
395 [11], tiene una alta precisión y una representación próxima a los resultados para evaluar
396 las velocidades de consumo de sustrato. Esto se observa en las Figuras 7, 8 en cultivos
397 puros, al igual que en cultivos mixtos Figura 9. En los modelos de producción de ácido
398 láctico el mejor ajuste a los datos experimentales para el Lactobacillus helveticus fue el
399 de Hanson & Tsao [23] lo que indica una buena correlación, como se muestra en la
400 Figura 10.
401
402 A pesar de que en la literatura el modelo mayormente empleado es el de Luedeking
403 & Piret [24] el cual simuló un comportamiento análogo al experimental, no presenta una
404 correlación buena con respecto a la de Hanson & Tsao [23]. El de modelo de
405 Producción Sencilla [7] presentó una curva similar a la de Luedeking & Piret [24]. El
406 modelo Logístico [7] ajusto en un rango razonable que al final de los datos de
407 producción de ácido láctico Vs el tiempo cae bruscamente por lo cual ajusta solo en el
408 periodo de producción exponencial. En la cinética de producción de biomasa los
409 modelos basados en función del modelo de Monod [7], resultaron inadecuados para
410 expresar el crecimiento de las lactobacterias, se pudo observar que la linealidad

9
411 predicha por el modelo de Monod [7] ajusta solamente parte de la fase de crecimiento
412 de biomasa. Esto indica que no represente completamente la fermentación esto se puede
413 observar en las figuras 4,5 y 6.
414
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427 Figura 3. Producción de ácido láctico en cultivo por carga, Figura 4.Simulación de curvas de crecimiento de cultivo por
428 Lactobacillus helveticus (L.h) () ; Lactobacillus carga de Lactobacillus helveticus (L.h) en suero de leche
delbrueckii subsp. bulgaricus (L.b) (▲) y cultivos ultrafiltrado a pH= 5.9 y T= 42 ºC. Líneas continuas
429 ajustadas a partir de los modelos de la Tabla 2. (•) Data
mixtos (L.h/L.b) (•), en suero de leche ultrafiltrado a experimental ;(□) Monod; () Luedeking & Piret; (○)
430 pH= 5.9 y T= 42 ºC. Logistico; ( ) Amrane & Prigent; () Edwards & Wilke;
431 () Gompertz Modificado
432
433 Los modelos en algunos casos produjeron parámetros erróneos o con valores irreales,
434 en los cultivos sencillos de L. helveticus y L. delbrueckii subsp. bulgaricus, para obtener
435 una representación gráfica de la cinética de la producción de biomasa en cultivo por
436 carga en suero ultrafiltrado, los modelos que significativamente produjeron mejor ajuste
437 resultaron el modelo de Gompertz modificado [12], Logístico generalizado propuesto
438 por Edwards & Wilkes [11] y Logístico sencillo [7], para simular la producción de
439 biomasa presentó unas correlaciones de 0.9986, 0.9987 y 0.9678 respectivamente en
440 cultivo mixtos. Se observó prácticamente una fase adaptación corta en el crecimiento de
441 biomasa en todos los bioprocesos en cultivo carga. A continuación se expresan los
442 resultados de los datos encontrados por la simulación:
443 Para producción de biomasa cultivos mixtos:
444 Modelo modificado de Gompertz sugerido por Zwietering et al [12]:
445
446 Y= 4,12699*exp{-exp[(0,52553 *e(1) /4,12699)*(0,97511 – t) +1]}
447
448 λ = 0,97511389; µmáx =0,52553572 h-1 ; A= 4,126964; corr=0.9986
449
450 Modelo de Edwards & Wilkes [11]:
451
452 CB= M/[1 + EXP(∑i=5i=0aiti)]
453
454 M= Biomasa= 92.0848 Kg/m3; ao=4.7448; a1=-0.6977; a2=5.220X10-2; a3= -8.7323X10-
3
455 ; a4=6.6468X10-4; a5=-1.67192X10-5; corr=0.9987
456
X m X O e  t
457 Modelo Logístico [7]: X 
458 X m  X O  X O e  t
459 µmáx =0,4404 h-1 ; Xo= 2.50653 Kg/m3; Xmáx= 82.2186 Kg/m3 ; corr=0.9678

10
460 En los modelos de consumo de sustrato, del análisis gráfico se desprende que los
461 modelos para simular la utilización de sustrato para la conversión de la lactosa a ácido
462 láctico, el modelo Logístico generalizado propuesto por Edwards & Wilkes [11]
463 proporcionó una buena descripción de la cinética de consumo y el modelo de Hanson
464 & Tsao [23] en cultivos por carga produjo una correlación de 0.9987 y 0.7892 en este
465 orden. La concentración inicial de sustrato óptima fue obtenida de los resultados
466 experimentales y posteriormente hallados en la simulación a través de los modelos o
467 ecuaciones por ensayo y error.
468
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481
Figura6.Simulación de curvas de crecimiento de cultivos
482 Figura 5.Simulación de curvas de crecimiento por carga de mixtos(L.b/L.h) por carga de Lactobacillus delbrueckii
483 Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus (L.b) en suero subsp.bulgaricus (L.b) y Lactobacillus helveticus (L.h) en
de leche ultrafiltrado a pH= 5.9 y T= 42 ºC. Líneas suero de leche ultrafiltrado a pH= 5.9 y T= 42 ºC. Líneas
484 continuas ajustadas a partir de los modelos de la Tabla 2. (•) continuas ajustadas a partir de los modelos de la Tabla 2.
485 Data experimental ;(□) Monod; () Luedeking & Piret; (○) (•) Data experimental ;(□) Monod; () Luedeking &
Logistico; ( ) Amrane & Prigent; () Edwards & Wilke; Piret; (○) Logistico; ( ) Amrane & Prigent; ()
486 () Gompertz Modificado Edwards & Wilke; () Gompertz Modificado
487
488
489 Modelo de Edwards & Wilkes[11] :
490
491 CB= M/[1 + EXP(∑i=5i=0aiti)]
492
493 CS= Sustrato; M= 67.8 Kg/m3; ao=88.14; a1=0.72426; a2= -1.3436X10-2; a3=
494 1.5529X10-3; a4=-8.61956X10-4; a5=1.93965X10-5; corr=0.9887
495
496 Ecuación de Hanson & Tsao [23].
497
498 S= 67,869*EXP(-3,6789X10-2 *2,50456*(EXP(0,325*t)-1))
499
500 So=67.869 Kg/m3; µ=0.325h-1; Ks=3.6789X10-2 m3/Kg*h; Xo= 2.504563 Kg/m3 ;
501 corr=0.7892
502
503 Para la simulación de la cinética de producción de ácido láctico los modelos que
504 produjeron mejor resultados en cultivo mixtos resulto los modelos Logístico sencillo [7]
505 y Logístico generalizado propuesto por Edwards & Wilkes [11] los cuales brindaron
506 una correlación de 0. 9865 y 0.9887. A continuación se describen las ecuaciones que
507 mejor representan el proceso de fermentación de suero ultrafiltrado: Para producción de
508 ácido láctico en cultivos mixtos:
509

11
510
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520
521 Figura 7. Simulación del consumo de sustrato en cultivo por
Figura 8. Simulación del consumo de sustrato en
522 carga de Lactobacillus helveticus (L.h) en suero de leche
cultivo por carga de Lactobacillus delbrueckii subsp.
ultrafiltrado a pH= 5.9 y T= 42 ºC. Líneas continuas
523 bulgaricus (L.b) en suero de leche ultrafiltrado a pH=
ajustadas a partir de los modelos de la Tabla 2. (•) Data
5.9 y T= 42 ºC. Líneas continuas ajustadas a partir de
524 experimental ;(□) Monod; (▲) Hanson & Tsao; () Yeh et
los modelos de la Tabla 2. (•) Data experimental ;(□)
al.; ( ) Aborhey & Williamson; (○) Edwards & Wilke.
525 Monod; (▲) Hanson & Tsao; () Yeh et al.; ( )
Aborhey & Williamson; (○) Edwards & Wilke.
526
527 Modelo de Edwards & Wilkes [11]:
528
529 CP= (Po*0.20+Po)/[1 + EXP(∑i=5i=0aiti)]
530 CP= Producción de ácido láctico; Po= 2.452399 Kg/m3; ao= 15,492; a1= 0,70856;
531 a2= - 1.4843X10-2; a3= 1.82694X10-3; a4=- 9.93434X10-4; a5=1.928X10-5;
532 corr=0.9887
533
534 Modelo Logístico [7].
535 P=[Po*Pmáx*EXP(P’o*t)]/[ Pmáx- Po+ Po*(EXP(P’o*t))] ; P´o = rpo / Po (h-1);
536 rpo=(Kg*m-3 *h-1).
537 Po=3,23056 Kg/m3; Pmáx= 11,91735 Kg/m3; P’oavg = 0,2010549 corr=0. 9865
538
539 La data experimental alisada o modelada empleando el modelo logístico
540 generalizado propuesto por Edwards & Wilkes [11], para evaluar las velocidades de
541 producción de ácido láctico, fue adecuada para este propósito tanto para los cultivos
542 puros como para el cultivo mixto. Esto se observa en las figuras 10,11 en cultivos puros,
543 al igual que en cultivos mixtos figura 12.
544
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554 Figura 10. Simulación producción de ácido láctico en
555 Figura 9.Simulación de consumo de sustrato de cultivos cultivos por carga de Lactobacillus helveticus (L.h) en
556 mixtos(L.b/L.h) por carga de Lactobacillus delbrueckii suero de leche ultrafiltrado a pH= 5.9 y T= 42 ºC.
subsp.bulgaricus (L.b) y Lactobacillus helveticus (L.h) en suero Líneas continuas ajustadas a partir de los modelos de la
557 de leche ultrafiltrado a pH= 5.9 y T= 42 ºC. Líneas continuas Tabla 2. (•) Data experimental; () Producción
558 ajustadas a partir de los modelos de la Tabla 2. (•) Data sencilla; () Luedeking & Piret; (▲) Hanson & Tsao;
experimental ;(□) Monod; (▲) Hanson & Tsao; () Yeh et al.; ()Logistico (○) Edwards & Wilke.
559 ( ) Aborhey & Williamson; (○) Edwards & Wilke.

12
560
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562
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572
573 Figura 12. Simulación producción de ácido láctico en
574 Figura 11. Simulación producción de ácido láctico en cultivos por cultivos por carga mixtos (L.b/L.h) de Lactobacillus
carga de Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus (L.b) en delbrueckii subsp.bulgaricus (L.b) y Lactobacillus
575 suero de leche ultrafiltrado a pH= 5.9 y T= 42 ºC. Líneas helveticus (L.h) en suero de leche ultrafiltrado a pH= 5.9 y
576 continuas ajustadas a partir de los modelos de la Tabla 2. (•) Data T= 42 ºC. Líneas continuas ajustadas a partir de los
experimental; () Producción sencilla; () Luedeking & Piret; modelos de la Tabla 2. (•) Data experimental; ()
577 (▲) Hanson & Tsao; ()Logistico (○) Edwards & Wilke. Producción sencilla; () Luedeking & Piret; (▲) Hanson &
578 Tsao; ()Logistico (○) Edwards & Wilke.
579
580 CONCLUSIÓNES
581
582 El suero de leche ultrafiltrado y suplementado es adecuado para la producción de
583 ácido láctico utilizando cultivos mixtos de L. delbrueckii subsp. bulgaricus y L.
584 helveticus obteniéndose valores de rendimiento real YC= 1.3281 (Kg de productos/Kg
585 de lactosa consumido para crecimiento). La producción de ácido láctico en este estudio
586 fue de 11.9173 ± 0.562 Kg/m³ en cultivo mixto de Lactobacillus delbrueckii subsp.
587 bulgaricus y Lactobacillus helveticus a condiciones controladas de pH= 5.9 y T= 42 ºC.
588
589 El consumo de la lactosa fue mayor en el cultivo mixto, esto explica que haya una
590 producción con alto rendimiento en ácido láctico; lo cual no ocurrió en los cultivos
591 puros de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus y Lactobacillus helveticus donde
592 se obtuvo una producción promedio de 8.75 Kg/m³ para ambas especies. La mayor
593 producción de biomasa fue 99.966 ± 0.105 Kg/m³ en cultivo puro de Lactobacillus
594 helveticus, mientras que en Lactobacillus delbrueckii subs. bulgaricus fue de 25.8 ±
595 0.85 Kg/m³; en cultivo mixto la biomasa producida fue de 82.2186 ± 0.72 Kg/m³ , este
596 comportamiento de concentraciones finales de biomasa determina en cierta forma la
597 utilización de sustrato por parte de las lactobacterias anaeróbicas.
598
599 Los modelos que produjeron mejor ajuste para cultivos puros y mixtos en la cinética
600 fermentación del suero ultrafiltrado bajo condiciones de pH y temperatura controlado
601 para la biomasa resultaron el modelo de Gompertz modificado, Logístico generalizado
602 propuesto por Edwards & Wilkes y Logístico sencillo, para consumo de sustrato
603 resultaron el modelo de Edwards & Wilkes, Hanson & Tsao y para la producción de
604 ácido resultaron el modelo de Edward & Wilkes, Logístico, Producción Sencilla
605
606 Es de destacar que el suero de leche ultrafiltrado (lactosuero), empleando un proceso
607 de Ultrafiltración y Nanofiltración en una Planta Piloto de Filtración Tangencial resulta
608 un sustrato idóneo para determinar la cinética de fermentación con cultivos lácticos
609 para la producción de ácido láctico.

13
610
611 AGRADECIMIENTO
612
613 Al Consejo de Desarrollo Científico y Humanístico de la Universidad del Zulia
614 (CONDES) por el financiamiento de la presente investigación.
615
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