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LE BIOTECNOLOGIE

Alla fine del ‘900 si è sviluppata l’ingegneria genetica, insieme di tecniche per la manipolazione
dell’informazione genetica degli esseri viventi. Attraverso questa nuova disciplina si sono potuti ottenere gli
OGM. Le moderne biotecnologie agiscono sul genotipo degli organismi per ottenere nuovi fenotipi utili. Le
biotecnologie sono quindi applicazioni tecnologiche che usano organismi viventi per realizzare prodotti e processi
per usi specifici. Alcuni esempi sono:
- Uso di cellule come bioreattori per produrre molecole in campo industriale e farmaceutico;
- Generare piante transgeniche resistenti a determinati parassiti;
- La terapia genica per correggere i difetti genetici alla base di molte patologie;
- Individuare l’identikit genetico di una persona con le biotecnologie forensi;
- Produrre nuove forme di energia come i biocombustibili.
Ci sono tre tipi di biotecnologie, verde (es. monitoraggio ambientale e riduzione inquinamento), bianca (es.
produzione antibiotici e assunzione amminoacidi e proteine) e rossa (es. diagnosi, terapie, produzione vaccini).
Le origini però sono molto antiche perché, inconsapevolmente, anche la fermentazione per la produzione pane,
birra e vino sono alla base delle biotecnologie. Nella fermentazione alcolica l’acido piruvico generato dalla
demolizione dello zucchero è convertito in acetaldeide; si libera CO 2 gassoso, che causa il ribollire tipico del
processo. Il frumento odierno ha 42 cromosomi ed è esaploide, cioè ha 6 alleli per ogni gene. In questa specie le
probabilità di ottenere una combinazione particolare di alleli da un incrocio casuale sono remote (ordine di 1 su
centinaia di migliaia), ma questo limite è superato dalle biotecnologie moderne, che permettono di trasferire solo i
geni desiderati (con conseguente alterazione genica minima) e i geni trasferiti possono provenire anche da specie
distanti dal punto di vista evolutivo, creando esemplari impossibili da ottenere con gli incroci tradizionali.

CLONAGGIO GENICO
Per clonare un gene sono necessari diversi passaggi:
1. Il gene di interesse viene separato dagli altri geni dell’organismo di partenza . Per isolare uno specifico
frammento di DNA si sfrutta l’azione di alcuni enzimi, le endonucleasi di restrizione, prodotti dai batteri
come difesa dai virus, perché essi attaccano il DNA del virus da demolire. Per tale proprietà, gli enzimi di
restrizione vengono utilizzati per tagliare i due filamenti di una molecola di DNA a doppia elica, in
corrispondenza di una specifica sequenza bersaglio. In particolare, questi enzimi idrolizzano il legame
fosfodiesterico (l’atomo di fosforo lega due ossigeni, legati ai carboni 5’ e 3’ degli zuccheri di due nucleotidi
adiacenti) tra due nucleotidi adiacenti all’interno della doppia elica di DNA. Uno degli enzimi usati è EcoRI
(escherichia coli), che agisce su sequenza GAATTC. Tali enzimi producono anche estremità coesive (sticky
ends) utili per il clonaggio.
2. Una volta ottenuto il frammento di DNA da clonare bisogna inserirlo nel vettore di clonaggio (molecola di
DNA plasmidico modificata) per ottenere il DNA ricombinante. Il vettore e il frammento genico da
incorporare nel vettore vengono tagliati con lo stesso enzima di restrizione, in modo tale che le estremità si
appaino spontaneamente con dei legami a idrogeno, che però costituisce un’unione debole. Per questo la
DNA ligasi è in grado di ricostruire il legame fosfodiesterico tra due nucleotidi adiacenti utilizzando l’ATP
come cofattore.
3. Il vettore plasmidico deve essere inserito in una cellula ospite . La tecnica più diffusa è la trasformazione
batterica, cioè la capacità dei batteri di inglobare frammenti di DNA se stimolati ad esempio con calore o
campi elettrici. Un altro metodo è quello della microiniezione nel caso delle cellule animali, o ancora la
biolistica (nel caso delle cellule vegetali) che consiste nello sparo del DNA dopo averlo caricato su
microproiettili di materiali inerti (es. oro o tungsteno).
4. Le cellule trasformate vengono deposte su piastre di terreno agar. Bisogna isolare le cellule batteriche che
hanno incorporato il plasmide, da quelle che non lo hanno ricevuto. Per questo ci sono i marcatori di
selezione, cioè geni che conferiscono resistenza a un antibiotico: solo i batteri contenenti il plasmide
ricombinante riusciranno a sopravvivere.
5. All’interno della cellula trasformata il vettore può replicarsi grazie alla presenza del sito ORI : si formano
così molte copie del vettore e quindi anche del gene che abbiamo inserito.

COSA CONTENGONO I VETTORI PLASMIDICI


Oltre ai geni per la resistenza ad antibiotici, essi contengono anche un’origine di replicazione (per consentire la
replicazione del plasmide a ogni divisione cellulare), e un sito multiplo di clonaggio (polilinker) in cui ci sono
sequenze di riconoscimento per diversi enzimi di restrizione.
Uno dei primi plasmidi usati come vettori è il plasmide pBR322, che ha resistenza all’ampicillina (amp) e alla
tetraciclina (tet).

LIBRERIE GENOMICHE
Chiamate anche genoteche, sono collezioni di cloni batterici ciascuno contenente un diverso frammento di DNA .
Nelle genoteche i frammenti genici contengono sia sequenze codificanti (esoni) sia non codificanti (introni). Un
modo per escludere gli introni è partire dall’mRNA che, dopo lo splicing, ha già rimosso gli introni. Il problema
però è che il vettore è a DNA: per ovviare al problema si converte il filamento singolo di mRNA nella sua copia a
DNA (cDNA), attraverso l’enzima trascrittasi inversa. Per creare una libreria a cDNA vi sono alcuni processi:
1. Isolamento degli mRNA cellulari. Le cellule vengono lisate (demolite per rottura membrana) e l’estratto
viene applicato a una resina cromatografica che contiene oligonucleotidi poli(T), che si appaiano alla
coda di poli(A) delle estremità 3’ di tutti gli mRNA. Così l’mRNA è puro.
2. Gli mRNA purificati sono convertiti in cDNA dalla trascrittasi inversa .
3. Con la DNA ligasi sono saldati, alle estremità di ciascun cDNA, degli oligonucleotidi con la sequenza di
riconoscimento per un enzima di restrizione. In questo modo, tagliando vettore e cDNA con lo stesso
enzima, le estremità si appaiano.
4. Si trasforma una cellula ospite con la miscela di vettori ottenuti . Ciascuno di essi ha un diverso cDNA.
Nell’insieme, essi costituiscono la libreria di cDNA.

REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI (PCR)


Se si vuole isolare in forma pura un cDNA contenuto nella libreria a cDNA bisogna ricorrere al processo di PCR,
che sfrutta due fenomeni naturali: la tendenza di due filamenti di DNA complementari ad appaiarsi
spontaneamente, e la capacità della DNA polimerasi di copiare un filamento di DNA stampo . Questo DNA
stampo può essere da un corto frammento fino a un intero genoma. In questo caso il DNA stampo sarà lo stesso
vettore di clonaggio, che deve essere estratto e purificato lisando le cellule. Una volta estratto, il DNA stampo
viene inserito nella miscela di reazione della PCR, dove vi è una coppia di oligonucleotidi a DNA, detti primer,
che si posizionano all’inizio e alla fine della sequenza da amplificare, e che innescano la polimerizzazione. Vi
sono in particolare 3 passaggi:
1. Denaturazione: il DNA di partenza viene riscaldato a 90 °C per separare la doppia elica ed esporre il
singolo filamento che servirà da stampo per la DNA polimerasi;
2. Ibridazione: la temperatura viene abbassata a 50 °C per far appaiare i primer alle estremità del DNA
stampo;
3. Allungamento: la DNA polimerasi sintetizza la prima copia della porzione di DNA stampo tra i due
primer. Ciò avviene a 60 °C perché così solo i primer appaiati alle sequenze perfettamente complementari
rimangono legati al DNA stampo. Per questo è necessario utilizzare DNA polimerasi termoresistenti
come la Taq polimerasi (batterio thermus aquaticus), perché di norma le DNA polimerasi si inattivano a
una temperatura superiore ai 45 °C.
Dopo l’allungamento, il campione viene riportato a 90 °C e si può ripetere il ciclo. Partendo da una copia di
sequenza di DNA stampo, dopo un ciclo si ottengono due copie, le quali possono essere sottoposte ad altri cicli
per ottenere 2n copie. Questo processo è detto amplificazione del DNA ed è un vantaggio della PCR, perché
partendo da una quantità minuscola di DNA è possibile ottenere una massa molto maggiore, per poi essere
sottoposta ad analisi cliniche o manipolazioni genetiche.

L’IMPRONTA GENETICA
Le biotecnologie sono importanti per le scienze forensi per la lotta al crimine. Per esempio, è possibile isolare le
tracce di DNA presenti sulla scena di un delitto e, grazie alla PCR, amplificarle per analizzarle. La tecnica più
utilizzata è l’analisi dei polimorfismi dei frammenti di restrizione (RFLP) che si basa sulla varietà di enzimi di
restrizione, che attaccano ognuno una sequenza specifica. Se tra due individui esiste (in una stessa sequenza) una
differenza anche di un solo nucleotide, l’endonucleasi non sarà più in grado di tagliare il DNA in quel punto: così
si basa la RFLP. Se i due campioni di DNA provengono dallo stesso individuo, i siti di taglio per le endonucleasi
sono identici e la dimensione dei due frammenti coincide.
Una tecnica più recente è quella del DNA fingerprinting: si analizzano particolari frammenti di restrizione,
presenti in numero diverso da individuo a individuo. In generale, oltre alle scienze forensi, queste tecniche
vengono applicate anche, ad esempio, per gli accertamenti di paternità.

SEQUENZIAMENTO DEL DNA


Un gene è un’unità di informazione e, per essere compresa, è necessario estrarre e decodificare l’informazione
genetica in esso contenuta. Il sequenziamento genico permette di ricostruire l’ordine in cui le basi si susseguono
lungo il filamento di DNA. Questa tecnica è stata messa a punto da Sanger e si basa sull’utilizzo di
didesossinucleotidi che, mancando del gruppo 3’-ossidrile dello zucchero (importante per il legame
fosfodiesterico con il nucleotide successivo), bloccano l’allungamento della catena di DNA. Per questo sono
terminatori di catena. Si sfrutta anche la DNA polimerasi, che genera una copia di un filamento stampo. Dopo
aver separato i due filamenti, il frammento da sequenziare viene appaiato a un primer che innesca la reazione di
sintesi. Il campione viene distribuito in 4 provette diverse, contenenti:
- La miscela per la reazione di polimerizzazione;
- I quattro desossinucleotidi (dATP desossiadenosina, dCTP desossicitidina, dTTP desossitimidina,
dGTP desossiguanosina) utilizzati dalla DNA polimerasi per la formazione del filamento stampo;
- Uno dei quattro didesossinucleotidi (dd…) che serve per interrompere la catena.
In ogni provetta si formano filamenti di lunghezza diversa, a seconda del punto in cui il didesossinucleotide è
stato incorporato e ha fatto terminare l’allungamento. Al termine, si avrà una provetta con tutte le posizioni
evidenziate in cui è stata incorporata una Adenina, un’altra per la Timina e così per Guanina e Citosina.
Vi sono sequenziatori automatici che, oltre ad amplificare con la PCR il DNA da sequenziare, vi è anche un
marcatore fluorescente il cui colore è diverso per ogni base azotata, così il colore viene registrato dal computer
che, automaticamente, ricostruisce la sequenza passo a passo.

I VETTORI DI ESPRESSIONE
È possibile far esprimere un gene in un organismo differente da quello di origine; in questo caso si parla di
organismo geneticamente modificato (OGM). Per costruirlo bisogna conoscere la regolazione dell’espressione
genica nei diversi organismi. L’espressione genica dipende dalla presenza di elementi in cis (sequenze di DNA
come il promotore o l’operatore) e in trans (es. fattori trascrizionali). Questi elementi sono specifici per un certo
organismo: per esempio, un promotore batterico non è riconosciuto dalle RNA polimerasi eucariotiche e
viceversa. Per fare in modo che invece questo avvenga, esistono i vettori di espressione (che consentono di far
esprimere un gene clonato all’interno di qualsiasi cellula ricevente). Nei vettori di espressione, il sito multiplo di
clonaggio è posizionato tra promotore e terminatore, in modo che qualsiasi gene clonato possa esprimersi. Questa
possibilità apre le strade a molti ambiti come agricoltura, industria e medicina.

PRODUZIONE BIOTECNOLOGICA DI FARMACI


È possibile inserire il gene per la proteina di interesse in cellule più semplici da coltivare, es. batteri; l’apparato
metabolico cellulare permette di sintetizzarla a costi minori e con minor impatto ambientale. In questo caso si
parla di organismi bioreattori. Il primo farmaco ottenuto così è stato l’insulina nel 1978, che è un regolatore del
metabolismo del glucosio e la sua mancanza causa il diabete. Prima dell’insulina ricombinante, i diabetici
assumevano insulina bovina purificata che, però, poteva causare effetti collaterali. Invece con le biotecnologie è
stato possibile clonare il gene dell’insulina umana e farlo esprimere in batteri, per ottenere grandi quantità in
forma pura. Oltre a questa vengono prodotti alla stessa maniera ormoni, anticorpi o vaccini. È possibile anche
modificare geneticamente gli embrioni di animali da allevamento come mucche o pecore: sono state generate
mucche transgeniche il cui latte ha proprietà nutritive simili al latte materno; oppure pecore il cui latte contiene
alte quantità di ormone della crescita umano, usato per curare i bambini con patologie legate a ritardi della
crescita. In generale queste tecnologie sono chiamate pharming.

MODELLI ANIMALI TRANSGENICI


Le biotecnologie permettono di generare modelli animali transgenici. Il topo è un animale modello perché
condivide con l’umano il 97,5% dei geni e gli apparati per il metabolismo sono simili. Con le biotecnologie si può
modificare il genoma degli animali modello, ottenendo così dei topi transgenici utili per lo studio delle malattie.
Un altro metodo prevede la generazione di topi senza un gene, chiamati topi knock-out, per comprendere le
funzioni dei singoli geni.

TERAPIA GENICA
Oggi è possibile anche sostituire un gene non funzionale con la sua copia corretta. Queste tecniche sono alla base
della terapia genica e rivoluzionano la cura di gravi malattie genetiche umane. Alcune patologie sono causate da
proteine che non funzionano bene perché il gene che le codifica ha subito una o più mutazioni; in altri casi
l’inattivazione di un gene causa la mancanza totale della proteina.
Per esempio, il deficit dell’enzima ADA (adenosina deaminasi) causa una deficienza immunitaria. Nel 1990 una
bambina affetta dalla patologia è stata curata utilizzando un vettore virale modificato per inserire il gene ADA
umano nelle cellule del midollo osseo prelevate dalla bambina. Le cellule sono state iniettate nuovamente nel
paziente che, dopo 6 mesi, aveva già un sistema immunitario efficiente.
Un altro esempio è un caso di epidermolisi bollosa giunzionale: nel 2017 un bambino con mutazione nel gene
LAMB3 ha ricevuto un trapianto di pelle il cui gene mutato era stato sostituito dalla copia funzionante. Così è stato
rigenerato l’80% della pelle superficiale del bambino.

TERAPIE CON CELLULE STAMINALI


Le biotecnologie riguardano anche l’uso di cellule staminali, che si differenziano in: totipotenti (danno origine a
tutti i tipi cellulari e quindi ipoteticamente a un intero organismo); pluripotenti (si differenziano nei tre foglietti
embrionali – mesoderma, ectoderma ed endoderma – ma non generano un intero individuo); multipotenti
(generano tipi cellulari limitati, es. le cellule del sangue). Oggi si possono isolare sia quelle embrionali
pluripotenti (che possono essere prodotte generando in vitro embrioni umani, una procedura non accettata per
motivi meramente etici), sia quelle multipotenti, le uniche che rimangono negli adulti e che vengono dette
somatiche (e che non rappresentano un problema etico). In quest’ultimo caso però le staminali somatiche sono
difficili da separare e il loro potenziali di differenziamento è molto inferiore. Nel 2012 un ricercatore giapponese
ha ideato in laboratorio nuove cellule staminali, le staminali pluripotenti indotte (iPSC), ottenute dalla
riprogrammazione delle somatiche già differenziate. In questo modo non vi sono problemi di natura etica legati
all’embrione. Il concetto si basa su dei geni che codificano per fattori trascrizionali che riportano la multipotente
allo stato di pluripotenza.

BIOTECNOLOGIE NELL’AGRICOLTURA
Sono utili per la produzione di piante transgeniche resistenti ai parassiti, come le piante Bt che, per essere
coltivate, non hanno quindi bisogno di pesticidi chimici (fonti di inquinamento ambientale) e, nel caso specifico
del mais Bt, questo non viene attaccato da un parassita che produce un fungo, fonte di una tossina dannosa per
uomo e animali. Le piante Bt sono ottenute dal gene cry, presente in un batterio che vive nella terra, e che produce
una proteina tossica per i parassiti ma non per animali e insetti benefici (es. api). Un altro esempio di applicazione
all’agricoltura è il Golden Rice, arricchito di vitamina A, importante per la crescita cellulare. Infatti, il riso è
molto utilizzato nella cultura orientale ma, per la carenza di vitamina A, causa alcuni problemi come la cecità. Il
Golden Rice è in sperimentazione in Asia.

PRODUZIONE DI BIOCOMBUSTIBILI
È possibile anche inserire più di un gene alla volta, generando nuove vie metaboliche non esistenti in natura. Un
esempio di questa applicazione è la produzione di biocombustibili, come il bioetanolo o il biodiesel, sintetizzati
per fermentazione a partire da masse vegetali. Una fonte è rappresentata dalle biomasse vegetali di scarto (es.
lavorazione del legno, alberi morti, sterpaglie, buccia dei frutti ecc.), ricche di carboidrati sotto forma di molecole
complesse a struttura fibrosa (es. cellulosa). Per rendere sfruttabili questi scarti bisogna digerire queste molecole,
liberando gli zuccheri di cui sono composte. Le vie enzimatiche per la degradazione dei carboidrati complessi
sono presenti in numerosi microrganismi, e per questo sono stati generati microrganismi OGM, contenenti
operoni di diverse specie batteriche per la degradazione della cellulosa e la sintesi di acidi grassi (produzione di
biodiesel).

BIOTECNOLOGIE PER L’AMBIENTE


Tra gli inquinanti più pericolosi e difficili da eliminare ci sono i metalli pesanti (es. mercurio o piombo), rilasciati
da scarichi industriali e che spesso contaminano le falde acquifere. In batteri del genere Escherichia coli è stato
aggiunto un gene che codifica la metallotionina, proteina che intrappola il mercurio all’interno della cellula.
Questi batteri possono essere immobilizzati su una matrice solida, da utilizzare come biofiltro che assorbe il
mercurio presente nelle acque.
È possibile creare anche biosensori batterici che rilevano la presenza di sostanze inquinanti nell’acqua o nel
suolo: è presente il gene per la proteina fluorescente verde GFP (delle meduse) che rende il batterio luminescente
e facilmente individuabile da un sistema. L’espressione del gene GFP però è regolata da un promotore che si
attiva solo se ci sono sostanze inquinanti come gli idrocarburi.