Obtención de animales transgénicos

BOREAS  NATURAL
Dra. Rosario Osta
Laboratorio de Genética Bioquímica y Grupos Sanguíneos
Facultad de Veterinaria Universidad de Zaragoza

1- Introducción
2- Transgénesis al azar
3- Recombinación homóloga o transgénesis dirigida
4- Bibliografía

Resumen
En el siguiente artículo se pretende mostrar de una forma
simplificada alguno de los métodos utilizados en la obtención
de animales transgénicos. En la primera parte nos
referiremos a la creación mediante transgénesis al azar en el
que no se controla el lugar de inserción del transgén en el
genoma. La segunda parte hablaremos de la recombinación
homóloga o también llamada mutagénesis dirigida, en la que
se controla el lugar de inserción. Por último, veremos de
forma esquemática las aplicaciones que se barajan como
interesantes.

Palabras-clave: transgénesis, animal transgénico,

recombinación homóloga, transgénesis dirigida

1- INTRODUCCIÓN: ¿QUÉ ES UN ANIMAL

TRANSGÉNICO?
Desde que en 1982 el Dr. Palmiter en la revista Nature,
ofreció la imagen del primer ratón transgénico que
conmocionó al mundo científico los estudios sobre este tema
han sido muy numerosos. Las aplicaciones de los animales
transgénicos poseen una dificil clasificación y abarcan
numerosos campos. Se podría hablar de dos grandes áreas
de aplicación, las que servirían para investigación básica y
médica (donde el animal de elección debido al coste
económico y tiempo es el ratón) y las que tendrían un efecto
directo sobre la producción y sanidad animal (especies
domésticas). Pero ante todo tendremos que definir ¿qué es
un animal transgénico?

Un animal transgénico es aquel al que se ha introducido un

gen exógeno a fin de mejorar o cambiar caracteres existentes
o introducir nuevos y que es capaz de transmitir a su
descendencia.

A pesar de que los métodos de obtención son numerosos,

todos ellos tienen unas fases comunes que pasamos a
enumerar .En primer lugar, elegir y aislar el gen deseado de
células normales y clonarlo. Posteriormente, purificar el
fragmento deseado o insertarlo en un vector para introducirlo
en el interior de las células receptivas. Una vez en el interior,
hay que conseguir que el gen actúe correctamente, es decir,
en puntos no dañinos de inserción y que se exprese y de
lugar al producto génico deseado. Por último, estos genes
introducidos deben transmitirse en cada generación celular y
por supuesto a la descendencia. Nos encontramos pues, con
una tecnología muy compleja que se ha desarrollado, basada
sobretodo en dos grandes campos científicos, la genética y la
reproducción (Pintado y Gutiérrez, 1991).

2- TRANSGÉNESIS AL AZAR
Como ya hemos explicado antes este tipo de transgénesis
consiste en la incorporación del transgén al DNA de una
forma aleatoria. En primer lugar, deberemos realizar la
elección del transgén, lo que supone un conocimiento
completo del mismo, tanto de su parte estructural (el producto
que expresará) como de su parte reguladora (marcará el
cómo, dónde y cuando se expresará), ambas partes pueden
ser de la propia especie o diferente. Un ejemplo de esta
construcción puede observarse en la Figura l. Así pues, es
tan o más importante la elección del producto génico como la
regulación del mismo. A pesar de los grandes avances
científicos, todavía hoy son necesarios más estudios a nivel
básico para poder llegar a entender como funcionan los
diferentes genes y sus reguladores.

Figura 1.- Construcción genética (transgén) utilizada en

transgénesis al azar

Respecto a los métodos para introducir ese transgén en el

organismo han sido muy numerosos. Sin embargo, nos
vamos a centrar en el que ha sido el más utilizado que es la
microinyección en pronúcleos.

Tras la preparación de la construcción genética (transgén) se

introduce una gran cantidad de ese material genético en el
huevo, es decir, ya ha tenido lugar la unión de los gametos
masculino y femenino, pero todavía no ha comenzado la
division del embrión. La inyección del DNA se realiza
normalemente en el pronucleo masculino. Como puede
observarse en la Figura 2, para la realización de la
experiencia se coloca el embrión en un microscopio invertido
para con la ayuda de dos micropipetas, una con extremos
redondeados que nos permitira sujetar el embrión y la otra
con el estremo afilado que nos permitirá inyectar el DNA
exógeno. 

Figura 2.- Inyección de DNA en un embrión de ratón

Los animales que nacen, tras la implantación de embriónes

microinyectados en una madre adoptiva, serán analizados
para conocer si han introducido el transgén en su genoma
mediante técnicas de biología molecular. Si el transgén ha
sido introducido y ademas los descendientes de este animal
producen animales transgénicos acabamos de crear un
transgénico.

Como ya se ha comentado antes esta es la técnica más

utilizada para la creación de este tipo de animales. Sin
embargo, también se han desarrollado otros métodos de los
que pasamos a enumerar algunos:

1. Métodos víricos, que son utilizados para animales en los

que el huevo fecundado esta protegido, como por
ejemplo, en aves. En este caso son los retrovirus en los
que se ha eliminado el poder patógeno los utilizados
como vectores. Utilizamos estos virus como una especie
de autobús que será capaz de llevar el transgén al
genoma.
2. Método de bombardeo de partículas, en el que el
transgén en el individuo adulto se introduce con ayuda
de unos proyectiles impregnados en DNA. Es la llamada
 pistola de DNA, estos microproyectiles son partículas de
tungsteno u oro que son disparadas mediante una
bomba de helio. Este método ha tenido una mayor
importancia en plantas debido a que el escaso poder de
penetración del DNA ha sido un gran inconveniente para
su utilización en animales.
3. Otro de los métodos que resulta interesante es la
introducción del transgén mediante espermatozoides.
Este método se realizó con éxito por un grupo italiano
hace algunos años, pero nunca volvio a repetirse por
otros grupos de investigación, lo que lo descalifico como
método de elección. Sin embargo, actualmente mediante
la modificación de algunos parámetros parece barajarse
como un método que en un futuro pueda dar resultados
favorables.

Sin embargo y a pesar de que hasta el momento todos los

animales transgénicos (excepto en el ratón, luego veremos
por que) han sido desarrollados mediante esta tecnología,
que el gen exógeno sea introducido en el genoma al azar
posee muchos inconvenientes derivados del escaso control
sobre la inserción del mismo. Así, pueden insertarse más de
una copia y/o en zonas del genoma que no permitan la
expresión del mismo y/o en genes que sean cruciales para la
vida del embrión (existen determinados autores que hablan
del 7-10%). Ante estos problemas resulta de gran interés el
conseguir una metodología que permita controlar con mayor
exactitud el lugar de integración del transgén. Esto fué
logrado mediante el aislamiento de las células E.S. en ratón,
en otras especies se intenta lograr mediante las experiencias
de clonación.

3- RECOMBINACIÓN HOMÓLOGA O
TRANSGÉNESIS DIRIGIDA
 Como hemos comentado antes, esta metodología surgió
para intentar dirigir el transgén a un lugar específico del
genoma,eso es posible si el material genético es introducido
en células en cultivo. La utilización de cultivos celulares para
la manipulación genética presenta varias ventajas que
intentaremos explicar: Es más fácil la introducción del DNA en
el genoma (mayor accesibilidad), es posible seleccionar las
células que nos interesen ya pueden estudiarse
minuciosamente mediante técnicas de biología molecular.
Dichas técnicas nos permitiran conocer donde, como y
cuantas veces se ha introducido el gen exógeno.

Pero, ¿cómo de unas células en cultivo puede realizarse un

individuo adulto?. Esta pregunta tuvo su respuesta tras el
aislamiento de las células E.S. o totipotentes. Fueron aisladas
por primera vez por Evans y Kaufman en 1981 y provienen de
embriónes de ratón (en estadios tempranos, morulas o
blastocistos, son embriónes de 2 y 3 días) . Lo interesante de
este tipo de células es que introducidas en un embrión son
capaces de llegar a formar parte de cualquier tejido del
mismo entre ellos las células germinales primordiales y por
tanto los gametos. Es decir modificando geneticamente estas
células podemos modificar los gametos y por tanto la
descendencia.

La construcción genética utilizada además de los genes de

selección posee regiones homólogas (es decir idénticas
secuencias de DNA) del lugar del genoma en el que
queremos insertar el transgén. Al introducir la misma en las
células, mediante estas zonas homólogas se realiza un
intercambio con las de gen , introduciéndose en ese lugar la
parte de la construcción no homóloga al resto. De este modo,
la realización de esa experiencia se hace de una forma
mucho más fina y localizada y es posible hacer llegar, como
hemos comentado antes, el transgén a un lugar específico del
genoma bajo el efecto de las regiones reguladoras que nos
interesen. Esta experiencia se realiza en células en cultivo, no
es posible realizarlas directamente en el embrión,por que es
necesario una gran cantidad de DNA para realizar los
estudios de selección de células correctamente modificadas.

Figura 3.- Esquema de la recombinacion

En este caso, la pipeta de inyección presenta una mayor
apertura de forma que permita la recogida de dichas células.
Por norma general suelen introducirse de 10 a 15 células en
blastocistos siendo muy importante la aproximación de dichas
células al botón embriónario del mismo, como puede
observarse en la Figura 4.

Figura 4.- Microinyección de células ES en blastocisto de

ratón

Hace algún tiempo y debido a la mejora de la calidad de las

células totipotentes, se comenzó a realizar el método de
agregación. La técnica consiste en co-cultivar dichas células
con embriónes en estado de mórula (previa eliminación de la
membrana pelúcida, que protege al embrión) para logra que
exista la unión entre ellas y que el individuo que nace sea una
mezcla de ambos tipos celulares.

Con cualquiera de los dos métodos se logra conseguir lo que

se llama un animal quimera, facilmente detectable por que las
células E.S. provienen de una línea de ratones de color
marrón y el blatocisto utilizado es de color negro. Es decir la
piel de los animales que hayan sido "colonizados" por las
células E.S. poseerá dos colores tal como se observa en la
Figura 5.
 Figura 5.- Ratón quimérico donde se observan  los dos
colores del animal en la piel

Lo necesario es que algunas de las células que formen la

línea germinal (es decir, los espermatozoides) provengan de
las ES y sean capaces de formar un individuo transgénico.Por
tanto una vez obtenida la quimera es necesario cruzarla para
obtener su descendencia y localizar el animal transgénico.

Como puede observarse, esta sería la forma de elección para

la realización de animales transgénicos. Sin embargo, el
problema existente para aplicar este tipo de metodología es la
no existencia de estas células excepto para el ratón. A pesar
de los numerosos esfuerzos realizados por conseguir llegar a
aislar células totipotentes en otras especies no se llegó a
conseguir.

Es aquí de nuevo donde debemos de hablar de la Oveja

Dolly, conocida por todos. Pero, ¿Qué era lo que los
investigadores del Roslin pretendían?. Como hemos tratado
de explicar anteriormente, la posibilidad de tener células en
cultivo para ser manipuladas era uno de sus grandes
intereses cuando desarrollaban esta metodología.

En 1996 el equipo de Ian Wilmut, demostró como a partir de

células de embrión eran capaces de crear un animal que
provenía de estos clones (Campbell y cols, 1996). Este hecho
significaba la posibilidad de tener células en cultivo para
poder realizar una transgénesis mucho más fina mediante
recombinación homologa. 
Pero, ¿para qué sirven los animales transgénicos?

Si tenemos en cuenta que el genoma humano esta casi

acabado y es esperable que nos proporcione una gran
información sobre las enfermedades genéticas, mutaciones
que las producen, etc, la utilización de los animales
transgénicos nos permitirá un mayor conocimiento de la
función y regulación de los distintos genes. De este modo,
una de las grandes utilidades es la creación de modelos
experimentales de enfermedades humanas, de modo que los
posibles tratamientos sean anteriormente testados en este
tipo de animales. Ya existen modelos de ratón que
desarrollan las patologías de Alzheimer, esclerosis lateral
amiotrófica, parkinson, diabetes,etc. que nos permitiran un
conocimiento mas exhaustivo de las mismas y la búsqueda
de posibles tratamientos.

Si hablamos de los animales transgénicos utilizados en

producción animal podemos pensar en varios modos de
actuación. Por un lado, la utilización de esta tecnología para
intentar mejorar en calidad o cantidad los caracteres
existentes o la introducción de nuevos caracteres en los
organismos. Este tipo de metodología ha tenido un mayor
desarrollo en los vegetales pero por el momento en los
animales no ha sido desarrollada. En contra de lo que ocurre
en vegetales, no existen productos alimenticios transgénicos
de origen animal en el mercado.

Otra de las aplicaciones en la "producción animal" ha sido la

utilización de los animales como bioreactores, es decir, la
producción de proteínas de interés en estos animales que
hasta ahora se viene realizando en bacterias o cultivos
celulares. Es lo que se denomina "Granjas biotecnológicas" o
Biotecnología de Corral y que esta teniendo un gran
desarrollo en los últimos años. El equipo pionero en este tipo
de metodología fué el Dr. Wilmut en el Instituto Roslin que
inicio sus estudios en 1989. Este es el caso de la oveja
"Tracy", el animal producía en la leche 30 gr./litro de alpha-l-
antitripsina, fármaco utilizado en el tratamiento de fibrosis
quística humana. Esta proteína producida por el animal se
encuentra en fase de estudio y es esperable que pueda
utilizarse como fármaco en un breve espacio de tiempo. El
problema se planteó cuando las hijas de esta oveja a pesar
de continuar la producción de dicha proteína en la leche esta
estaba muy disminuida. Aquí, de nuevo debemos de hablar
de la oveja Dolly, ya que contrariamente a lo que la opinion
pública piensa, cuando el Dr. Wilmut intentó llevar a cabo
esta técnica no era solamente para producir clones de
animales altamente seleccionados si no clonar animales
transgénicos que produzcan sustancias terapéuticas en su
leche. Sin embargo, y contrariamente a lo que se opina, esta
metodología no está ni mucho menos desarrollada
totalmente, seran necesarios futuros estudios que permitan
tener un conocimiento más completo de todos estos
procesos.

4- BIBLIOGRAFÍA
Campbell, K.H.S.; McWhir, J., Ritchie, W.A. and Wilmut, I.
(1996). Nature, 380, 64-66.

Pintado, B. y Gutierrez, A(1991). XIV Curso internacional de

Reproducción Animal. Madrid.

Evans, M.J. y Kaufman, M. H. (1981). Nature, 292,154-156.