Primera Unidad Enzimología y Metabolismo Energético

REUNION DE
PRACTICA N° 06
- DISTRIBUCION INTRACELULAR DE LAS ENZIMAS DE OXIDORREDUCCION - -

INTRODUCCION:
Los carbohidratos, ácidos grasos, aminoácidos y algunas otras sustancias sufren oxidaciones en el organismo mediante
sistemas enzimáticos simples o complejos. Estos sistemas están constituidos por proteínas, fosfolípidos, grupos prostéticos y
átomos metálicos.

De acuerdo a su estructura y función, las enzimas que intervienen en estos procesos se encuentran clasificadas en diversos
grupos y tienen denominaciones particulares dentro de la literatura enzimológica. Las enzimas de óxido - reducción tienen una
distribución característica intracelularmente, hallándolas de modo fundamental en una subestructura celular en donde la energía
derivada de las oxidaciones es "capturada" en la forma del intermediario macroérgico ATP.

FINALIDAD:
 Identificar la distribución intracelular de las enzimas de oxidoreducción usando los indicadores redox 2 - 6
diclorofenilindofenol y p - fenilendiamina y los componentes celulares de un homogeneizado de hígado de rata obtenidos
por centrifugación diferencial mediante el método de Schreider y col.

MATERIAL Y EQUIPO:
 Buffer fosfato de sodio 0.1M pH: 7.4
 2,6-diclorofenolindofenol 0.02 %
 Succinato 0.1M
 p–fenilendiamina 1%
 Homogenizado total de hígado de rata en sucrosa 0.25 M
 Fracción nuclear del homogenizado.
 Fracción mitocondrial del homogenizado.
 Fracción microsomal soluble del homogenizado.
 KCl 0.154 M

PROCEDIMIENTO:
1) Proceder a realizar el fraccionamiento celular de la siguiente manera:
a. Cada grupo recibirá una rata albina ( Rattus rattus var. albicans). El animal será sacrificado, inmediatamente se hara un
corte longitudinal en el abdomen procediendo a extraer el hígado.
b. Se coloca el hígado en un petri se elimina la cápsula del hígado y otros tejidos periféricos.
c. Homogenizado al 10%: se pesa 10gr de hígado y se corta en fragmentos pequeños y se coloca en el homogenizador
potter y se le agrega solución de KCl 0.154 M. Se hace presión manualmente con el embolo girando hacia el fondo.
Todo debe trabajarse entre 0 y 4ºC.
d. El homogenizado es centrifugado a 800 revoluciones por 10 minutos colocándolo en tubos de polietileno, previa
calibración en la balanza, se emplea una centrífuga refrigerada. El sobrenadante es separado en un beaker de 500ml. El
sedimento constituye la fracción nuclear y se coloca en un beaker de 100ml.
e. El sobrenadante anterior es centrifugado a 15000 revoluciones por 15 minutos en la centrífuga refrigerada. Se separa el
sobrenadante en un beaker, constituyendo la fracción microsomal con el citosol. El sedimento se separa en otro beaker
y constituye la fracción mitocondrial.

2) Rotular previamente los tubos de ensayo y preparar el siguiente sistema agregando lo que se indica en el siguiente cuadro:
TUBOS DE ENSAYO
COMPONENTES (en ml)
I II III IV V
Buffer fosfato 0.1M pH 7.4 1.0 0.5 0.5 0.5 0.5
2-6 diclorofenolindofenol 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
Succinato de sodio 0.1 M 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2
Fracción nuclear -- 0.5 -- -- --
Fracción mitocondrial -- -- 0.5 -- --
Fracción microsomal-soluble -- -- -- 0.5 --
Homogenizado Total -- -- -- -- 0.5
Mezclar y dejar en reposo por 5 minutos a temperatura ambiente.
Observar los resultados en cada uno de los tubos (considerar cambio de color).
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3) Rotular previamente los tubos de ensayo y armar el segundo sistema agregando lo que se indica:
TUBOS DE ENSAYO
COMPONENTES (en ml)
I II III IV V
Buffer fosfato 0.1M pH 7.4 1.5 1.0 1.0 1.0 1.0
p-fenilendiamina 1%
0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
(sustrato+indicador)
Fracción nuclear -- 0.5 -- -- --
Fracción mitocondrial -- -- 0.5 -- --
Fracción microsomal-soluble -- -- -- 0.5 --
Homogenizado Total -- -- -- -- 0.5
Mezclar y dejar en reposo por 5 minutos a temperatura ambiente.
Observar los resultados en cada uno de los tubos (considerar cambio de color).

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ACTIVIDADES A DESARROLLAR POR EL ALUMNO:

Explique bioquímicamente lo encontrado.
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PREGUNTAS DE APLICACIÓN:
1) ¿Cuál fueron los objetivos de la práctica?
2) Identifique las variables que intervinieron en el experimento realizado en la práctica.
3) Identifique los componentes del sistema enzimático empleado en la práctica y señale sus principales
características.
4) ¿Qué es el 2,6-diclorofenolindofenol y p-fenilendiamina, cómo actúan en la cadena respiratoria?
5) Grafique en una cadena de óxido – reducción la acción de los indicadores rédox 2,6 diclorofenolindofenol y
p–fenilendiamina.
6) ¿Qué es un homogenizado de hígado y cómo se obtienen las fracciones celulares por centrifugación
diferencial?
7) ¿En qué fracciones celulares se encuentran las enzimas de óxido – reducción?
8) Haga un esquema de la centrifugación diferencial

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS.
1) Murray R. Harper Bioquímica Ilustrada. 31° edición, México 2019.