Primera Unidad Enzimología y Metabolismo Energético

REUNION DE
PRACTICA N° 04
- FACTORES QUE MODIFICAN LA VELOCIDAD DE REACCION ENZIMATICA - -

INTRODUCCION:
Las enzimas son catalizadores complejos de origen biológico que tienen un alto grado de especificidad y eficiencia; permitiendo
que las reacciones químicas intracelulares ocurran rápidamente a través de vías bien definidas. Sin estas proteínas
especializadas, la vida tal como es no podría existir.

Debido que se necesitan muy bajas concentraciones de enzima para catalizar una reacción dada, solo muy pocas enzimas
pueden medirse directamente. En general, la actividad de cualquier sistema enzimático puede ser demostrada de dos maneras:
Verificando el sustrato no transformado y verificando los productos liberados después de un tiempo determinado de incubación
en condiciones específicas de pH y temperatura.

Por tanto, tomando una determinada enzima como patrón es posible tener una idea más o menos clara de la influencia de los
factores (Tiempo, temperatura, concentración de enzima, concentración de sustrato, pH, iones, etc ), sobre la serie infinita de
enzimas que se conoce. Para estudiar cada uno de estos factores es necesario que los otros permanezcan constantes, de tal
manera que la investigación del factor variable no se vea afectada por la variación que pudieran sufrir los otros.

FINALIDAD:
 Evidenciar el efecto de iones activadores, pH, concentración de enzima, concentración de sustrato, tiempo y temperatura
sobre la velocidad de una reacción enzimática utilizando la enzima amilasa salival que tiene la capacidad de degradar el
almidón en maltosa y glucosa (disacáridos reductores); verificando tanto el sustrato residual y los productos formados en
dicha reacción.

MATERIAL Y EQUIPO:
 Buffer fosfato 0.1M pH 6.6
 Buffer acetato 0.1M pH 4.6
 Buffer borato 0.1M pH 9.0
 Solución de cloruro de sodio al 2 %
 Amilasa salival dializada al 0.25 %
 Ácido clorhídrico 0.05N
 Solución yodada (yoduro de potasio + yodato de potasio)
 Solución cúprico alcalina.
 Solución fosfomolíbdica.

PROCEDIMIENTO:
1) Preparar el siguiente sistema:
TUBOS DE ENSAYO
COMPONENTES (en ml)
I II III IV V VI VII VIII
Solución de almidón al 1 % 1.0 1.0 2.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
Buffer acetato 0.1M pH 4.6 - - - 5.0 - - - -
Buffer fosfato 0.1M pH 6.6 5.0 5.0 5.0 - 5.0 - 5.0 5.0
Buffer borato 0.1M pH 9.0 - - - - - 5.0 - -
Solución de NaCl al 2 % 1.4 - 1.4 1.4 1.4 1.4 1.4 1.4
Agua destilada 2.6 3.4 1.0 2.0 2.0 2.0 2.4 2.0
Mezclar y colocar los tubos del I al VII a incubación por cinco minutos a 37 °C.
El tubo VIII, mantenerlo en agua helada entre 0° y 4° por cinco minutos.
Agregar: Amilasa Salival al 0.25% - 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.2 0.6
Mezclar por inversión y continuar la incubación por 20 minutos (computar el tiempo desde el momento en que el preparado
enzimático fue agregado a cada tubo)
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2) Cumplidos los 20 minutos de incubación, retire los tubos de ensayo, arme una serie paralela y realizar el control de la
actividad enzimática según:
a. El SUSTRATO RESIDUAL, el cual se realiza por la reacción del yodo; y agregue:
TUBOS DE ENSAYO
COMPONENTES (en ml)
I II III IV V VI VII VIII
Incubado de cada uno de los tubos
0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
del preparado anterior.
HCl 0.05N 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0
Solución iodada 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
Observe los resultados de las reacciones en cada uno de los tubos, valorando los cambios de coloración (azul
oscuro, azul claro, sin color).

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b. Los PRODUCTOS FORMADOS (maltosa, glucosa), el cual se en base a la capacidad reductora de éstos. Esta
determinación sólo se realizará en los tubos III y V del incubado preparado en el paso 1.
TUBOS
COMPONENTES (en ml)
III V
Incubado correspondientemente de los tubos III y V 1.0 1.0
Solución cúprico alcalina 1.0 1.0
Mezclar por inversión y colocarlos en baño de agua hirviendo por 8
minutos.
Sacar los tubos y enfriarlos con agua corriente.
Observe los resultados.

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ACTIVIDADES A DESARROLLAR POR EL ALUMNO:

Explique bioquímicamente lo encontrado.

PREGUNTAS DE APLICACIÓN:
1) ¿Cuál fueron los objetivos de la práctica?
2) Identifique las variables que intervinieron en el experimento realizado en la práctica.
3) Identifique los componentes del sistema enzimático empleado en la práctica y señale sus principales
características.
4) ¿Cómo se puede evidenciar la presencia del sustrato residual en la práctica realizada?
5) ¿Cómo se puede evidenciar los productos formados en la reacción enzimática observada?
6) Confeccione una lista de los factores físico-químicos que intervienen modificando la velocidad enzimática
en cada uno de los tubos empleados en la práctica.
7) ¿Cuál fue el pH óptimo para que la enzima empleada en la práctica pudiera actuar?
8) ¿Qué función cumple el ácido clorhídrico al 0.05N empleado en la práctica?

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS.
1) Murray R. Harper Bioquímica Ilustrada. 31° edición, México 2019.