Primera Unidad Enzimología y Metabolismo Energético

REUNION DE
PRACTICA N° 05
- ACCION DE INHIBIDORES SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA - -

INTRODUCCION:
Los inhibidores enzimáticos son sustancias que actúan sobre una enzima disminuyendo su actividad, excluyéndose aquellos
agentes como los ácidos fuertes, alcoholes y calor que producen alteraciones en la estructura espacial de la molécula proteica
que conduce a la desnaturalización. Se clasifican en reversibles e irreversibles, que se pueden distinguir experimentalmente;
cuando eliminamos por algún método el exceso de inhibidor y la enzima recupera su actividad original, se dice que el inhibidor
es reversible y contrariamente, si la enzima continúa inhibida después de la eliminación del inhibidor, se dice que es irreversible.

Los inhibidores reversibles presentan varios tipos de inhibición diferenciados experimentalmente. Los tipos más comunes son:
la inhibición reversible competitiva y la inhibición reversible no competitiva, además de la inhibición reversible acompetitiva.

La inhibición competitiva es aquella que se revierte al aumentar la concentración de sustrato. El inhibidor se combina
reversiblemente con la enzima en el sitio donde se debería unir el sustrato impidiendo la formación del complejo activo enzima-
sustrato. El inhibidor como el sustrato compiten por el mismo sitio y tratan de desplazarse mutuamente de la enzima. Un
ejemplo clásico, de este tipo de inhibición es el de la succinato deshidrogenasa que tiene como sustrato el succinato y puede
ser inhibido por sustancias estructuralmente parecidas a dicho ácido como son el malato, ácido oxálico y glutarato.

La inhibición no competitiva se caracteriza porque no puede ser revertida por un aumento de la concentración del sustrato ya
que este último no puede desplazar al inhibidor unido a la enzima. El inhibidor se une a la enzima en un sitio diferente al que se
une al sustrato. Por esto la unión de este último con la enzima no es afectada por la presencia del inhibidor, pudiéndose formar
un complejo enzima-sustrato-inhibidor, cataliticamente inactivo que no puede escindirse en productos y complejo-enzima-
inhibidor. Ejemplos de este tipo de inhibición son los causados por el N-etilamida, cloruro de mercurio, EDTA; los cuales
enlazan iones metálicos necesarios para la actividad enzimática, NO y CO; inhiben metaloenzimas por enlazarse al ión
metálico.

La inhibición acompetitiva, es otro tipo de inhibición reversible, común en sistemas complejos, en ésta el inhibidor se une
exclusivamente al complejo enzima-sustrato para dar un complejo enzima-sustrato-inhibidor incapaz de transformarse en otro
producto.

Experimentalmente se puede identificar si un inhibidor es o no competitivo. Por ejemplo, si al sistema deshidrogenasa

succínica+succinato, se agrega malonato como inhibidor. Si el efecto inhibidor se revierte al incrementar la concentración del
sustrato (succinato) entonces se podrá afirmar que el inhibidor es de tipo competitivo. Si la inhibición no se revierte al agregar
sustrato (succinato), entonces la inhibición será de tipo no competitiva. Quedando por demostrar si este tipo de inhibición es
reversible o no.

FINALIDAD:
 Demostrar que en el sistema enzimático deshidrogenasa succínica+succinato el malonato es un inhibidor competitivo y el
cloruro de mercurio produce inhibición no competitiva.

MATERIAL Y EQUIPO:
 Buffer fosfato 0.1 M, pH 7.2
 Succinato de sodio 0.1 M
 Succinato de sodio 0.5 M
 2 – 6 Diclorofenolindofenol
 Malonato de sodio 0.1 M
 Cloruro de mercurio
 Homogenizado hepático 10 %
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PROCEDIMIENTO:
1) Rotular previamente los tubos de ensayo y preparar el siguiente sistema agregando lo que se indica en el siguiente cuadro:
TUBOS DE ENSAYO
COMPONENTES (en ml)
I II III IV V
Buffer fosfato 0.1M pH 7.2 2.0 1.8 1.3 1.3 1.0
Succinato de sodio 0.1M -- 0.2 0.2 0.2 --
Succinato de sodio 0.5 M -- -- -- -- 0.5
Cloruro de mercurio 0.1 M -- -- -- 0.5 --
Malonato de sodio 0.1 M -- -- 0.5 -- 0.5
2-6 diclorofenolindofenol 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
Homogenizado 10% 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
Dejar en reposo por 30 minutos a temperatura ambiente.
Observar los resultados en cada uno de los tubos (considerar cambio de color).

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2) Transcurridos los 30 minutos, a los tubos II, III y IV agregar lo que se indica:
TUBOS DE ENSAYO
COMPONENTES (en ml)
II III IV
Succinato de sodio 0.1M -- 0.5 0.5
Buffer fosfato 0.1M pH 7.2 0.5 -- --
Dejar en reposo por 15 minutos a temperatura ambiente.
Observar los resultados en cada uno de los tubos.

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ACTIVIDADES A DESARROLLAR POR EL ALUMNO:

Explique bioquímicamente lo encontrado.

PREGUNTAS DE APLICACIÓN:
1) ¿Cuál fueron los objetivos de la práctica?
2) Identifique las variables que intervinieron en el experimento realizado en la práctica.
3) Identifique los componentes del sistema enzimático empleado en la práctica y señale sus principales
características.
4) Confeccione una lista de los componentes que se emplearon en la práctica e indique sus características de
participación en la práctica.
5) ¿Por qué el malonato es inhibidor competitivo y el cloruro de mercurio es no competitivo?
6) ¿Cómo podría usted demostrar que la inhibición producida por el cloruro mercúrico es o no reversible?
7) De usted por lo menos dos ejemplos de sustancias que producen inhibición competitiva en el sistema
Deshidrogenasa succínica – succinato, además del malonato utilizado en el presente experimento.
8) Señale por lo menos tres ejemplos de sustancias que pueden producir inhibición no competitiva reversible,
sin considerar el cloruro de mercurio.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS.
1) Murray R. Harper Bioquímica Ilustrada. 31° edición, México 2019.