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UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN AGUSTÍN DE AREQUIPA

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

ESCUELA PROFESIONAL Y ACADEMICA DE BIOLOGÍA

GUÍA PRÁCTICA DE ANALISIS BIOLOGICOS

MG. ADOLFO RAMOS PAREDES


MG. DANIEL LUQUE ZURITA
MG. EDGAR QUISPE CHIPANA

AREQUIPA – PERÚ

2020

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2
PRESENTACIÓN

La presente Guía de procedimientos de Laboratorio en Análisis Clínicos y


Control de Calidad, es una herramienta básica y fundamental para mejorar la calidad
de los Análisis Bioquímicos que se realizan tanto a nivel hospitalario así como en las
diferentes Unidades de Salud, lo cual constituirá un valioso apoyo para el diagnóstico

Es importante y necesario que el Profesional de Laboratorio en Análisis


Clínicos conozca las Técnicas así como el control de calidad que permitirá valorar y
aprobar los resultados que salen del Laboratorio los que servirán para el diagnóstico
del paciente. El no conocimiento de las Técnicas así como también del mal control de
calidad conlleva a resultados malos que no ayudarán al médico tratante en el
diagnóstico de una Patología

Sirva entonces este documento no solo como guía sino como un manual de
apoyo a todos los Profesionales de Laboratorios, en el área de Análisis Clínicos, el
cual ayudará a mejorar la calidad de los resultados en todos los laboratorios del
Sistema de Salud

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INTRODUCCIÓN

El conjunto de Prácticas de Laboratorio del curso de ANALISIS


BIOLÓGICOS agrupadas en el presente Guía de Prácticas, han sido especialmente
diseñadas para los estudiantes de Biologia que están orientados al área de la Salud y
a todos los que deseen reproducir algunos experimentos y técnicas fundamentales de
esta disciplina.

Se procura, con la presente Guía, que el alumno realice personalmente los


experimentos para desarrollar su manualidad. Pero es indispensable que aprenda a
observar y razonar, y a través de ello, las bases del Método Científico.

El Análisis Clínico no se concibe sin experimentos, pero el estudio teórico


siempre debe acompañar y completar al práctico. Por eso, se aconseja a los alumnos
estudiar previamente los temas que habrá de ensayar en el Laboratorio.

Con esta Guía que entregamos al alumno, esperamos contribuir con el


mejoramiento en la determinación de los análisis y la calidad de los Resultados

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NORMAS DE BIOSEGURIDAD

- Lavado de manos y uso de guantes en todos los casos de manipulación de


Líquidos Corporales.
- Uso de gafas o tapabocas con visera durante la recolección de muestras con
riesgo de salpicaduras.
- No re-enfundar agujas y desecharlas en el recipiente adecuado (Guardián
BD) o desechar la aguja y la jeringa en un galón destinado para tal fin,
evitando la manipulación.
- Preservar la técnica aséptica en la obtención de muestras medi ante
procedimientos invasivos (Venopunción Periférica, Catéter Central, Punción
Lumbar, etc.).
- Informar al paciente sobre el procedimiento. Los procedimientos de
recolección de muestras pueden ser molestos y ocasionar dolor.
- El paciente debe estar en una posición cómoda.
- Verificar rigurosamente con la orden médica el nombre del paciente y los
exámenes a tomar.
- Verificar el tipo de tubos a utilizar antes de tomar la muestra. Las técnicas de
análisis varían en cada institución, por lo tanto, es importante confirmar con
el laboratorio el tipo de tubo, cantidad de muestra y condiciones específicas
de manejo de las muestras.
- Rotular los frascos y tubos con los datos del paciente antes de tomar la
muestra.
- Enviar la muestra al laboratorio en el menor tiempo posible.
- Llenar los tubos al vacío hasta el nivel marcado; es imprescindible que estén
llenos justo hasta la señal.
- Evitar la yodopovidona, material que puede alterar los resultados de los
exámenes, como elevación de potasio, fósforo, ácido úrico y niveles de
bilirrubina.
- En caso de que se tome la muestra de una vía ya instalada en el paciente, es
fundamental realizar una buena purga de la misma con el fin de evitar
contaminación química

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CRITERIOS PARA EVITAR ERRORES ANTES DEL PROCESAMIENTO DE UNA
MUESTRA:

1. PREPARACIÓN DEL PACIENTE

1.1. Instrucciones generales para los análisis de sangre.


- Evitar el estrés antes y durante la toma de la muestra.
- No hacer ejercicios vigorosos durante 3 días antes de tomar la muestra.
- No ingerir bebidas alcohólicas antes ni durante la toma de la muestra.
- Permanecer en ayunas durante 12 horas antes de tomar la muestra.
- No fumar antes ni durante la toma de la muestra.
- Los pacientes en reposo no deberán cambiar de postura al tomarles la
muestra.
- Suspender anticonceptivos orales durante 7 días.

1.2. Instrucciones específicas para algunos análisis de sangre.


A) Prueba de tolerancia para la glucosa
- Seguir instrucciones generales.
- Ingerir una dieta normal
- Suspender medicamentos 3 días antes.
- Realizar la prueba solo en pacientes ambulatorios, pues el reposo en cama y
la inmovilidad pueden disminuir la tolerancia a la glucosa.

B) Creatinina sérica y su depuración en orina de 24 horas.


- Seguir instrucciones generales.
- Suspender los medicamentos que interfieran, 3 días antes.
- No ingerir carne roja durante 3 días antes de la extracción de sangre.

C) Lípidos (colesteroL HDL, LDL, triglicéridos).


- Seguir las instrucciones generales.
- Ingerir dieta normal durante 7 días antes.
- Vigilar los cambios bruscos de peso, pues pueden interferir.
- No utilizar los contrastes yodados antes de la prueba.

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- Suspender medicamentos 3 días antes.

Interferencias que pueden producirse por algunos factores de la fase pre -


analítica en análisis del laboratorio clínico.

-Estrés: glucosa, colesterol, proteínas transportadoras, factores de la


coagulación y células sanguíneas (aumentan valores).
-Ejercicios: glucosa, creatinina, CPK, HDL, potasio, factores de la coagulación,
eritrosedimetación., prolactina, cortisol (aumentan valores).
-Ingestión de alcohol: Gamma glutamil transpeptidasa (GGT), alamino amino
transferasa (ALAT),aspartato amino transferasa (ASAT), lípidos, factores de
la coagulación, glucosa, uratos y triglicéridos (disminuyen valores).
- Hábito de fumar, glucosa, PTG, colesterol, HDL, amilasa y lipasa (aumentan
valores).
-Cambios posturales y estasis venoso: Prochicen de 10 a 20 % de
hemoconcentración de proteínas, enzimas y sustancias ligadas a proteínas
como: cortisol, tiroxina, calcio, hierro, fósforo y lípidos (aumentan valores). -
Cirugía e inyección intramuscular: Creatín fosfoquinasa (CPK), glicemia,
ALAT, ASAT y amilasa (aumentan valores).
-Masaje prostático: amilasa y fosfatasa acida (aumentan valores). -Embarazo:
glicemia, fosfato, cobre, ceruloplasmina, fosfatasas séricas, colesterol,
triglicéridos, amilasa, lipasa, Lactato deshidrogenasa (HDL), fosfatasa
alcalina leucocitaria y eritrosedimentación (aumentan valores). ALAT, ASAT,
proteínas totales, calcio, CPK, recuento de eosinófilos, hemoglobina y
hematocritos (disminuyen valores).
-Inmovilización: Calcio y PTG (aumentan valores).
-Ritmo circadiano: De noche aumentan los leucocitos y eosinófilos, pero
disminuyen algunas hormonas como ACTH.
-Dieta rica en fosfatos y calcio: Aumenta los valores de calcio; y la rica en
grasas, los de lípidos y bilirrubina.

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2. TOMA DE MUESTRA
Las muestras venosas son comúnmente obtenidas por punción directa en el
área antecubital.

También se pueden obtener de un acceso venoso central instaurado en el


paciente.

Se recomienda recolectar la muestra de una vena independiente de la vena


periférica que se esté utilizando para terapia intravenosa mediante técnica
cerrada usando el set Vacutainer®, lo cual mejora la calidad de la muestra
(cantidad apropiada, disminución de hemolisis) y disminuye el riesgo de
contaminación.

- Seleccionar la vena y aplicar el torniquete a 4 cm por encima del sitio que se


va a puncionar.
- Limpiar la piel con algodón impregnado en solución antiséptica, sobre el
sitio de la punción, en forma circular del centro a la periferia.
- Puncionar la vena teniendo cuidado en colocar el bisel hacia arriba; una vez
se encuentre seguro de estar en la vena, introducir el tubo de recolección de
muestra y soltar el torniquete.
- Retirar la aguja y hacer presión sobre el sitio de punción hasta que deje de
salir sangre (aproximadamente cinco minutos).
- Envía las muestras al laboratorio.

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3. VALIDACIÓN DE RESULTADOS
Todos los resultados son validados (confrontados con los valores de otros
parámetros analíticos para verificar una eventual correlación clínica
diagnóstica) y aprobados por el responsable del laboratorio o una persona
designada. La valoración comprende también el Control de Calidad Interno y
todas las fases de preparación, interpretación y transmisión del informe de los
resultados

El laboratorio establece procedimientos para notificar inmediatamente al médico sobre


los resultados críticos. Estos límites de alarma podrían definirse previamente con los
médicos clínicos que utilizan el servicio de laboratorio.

4. ENTREGA DE RESULTADOS
Los resultados deben ser retirados según el horario con la modalidad prevista en cada
laboratorio, y deben ser entregados sólo al paciente.
Los resultados pueden ser entregados a otra persona, con autorización escrita por el
paciente.

. Los resultados no se pueden entregar por teléfono.


. Sólo en caso de necesidad, se pueden comunicar al médico tratante.
. La entrega de resultados tiene que preservar la privacidad del paciente.

EQUIPO:
Con frecuencia el control de calidad se limita al estudio del error total del análisis y la
contribución de los equipos a este error se subestima, sin embargo cada día el
laboratorio depende en mayor grado de los resultados de diversos equipos. El
espectrofotómetro tiene que ser calibrado y controlado regularmente (seis meses) con
patrones, siendo muy importante sobre todo para métodos cuyo resultado se calculan
en base de un coeficiente de absorbancia y que por algún motivo no pueden ser
controlados permanentemente por un patrón de la misma sustancia por ser esta
inestable, cara, etc.

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Espectrofotómetro

En los fotómetros el sistema de selección de la longitud de onda se desajusta y el


error que ello ocasiona puede llegar a un 16%.

Un error fotométrico sistemático resulta cuando se utiliza un fotómetro de filtro con


rango espectral ancho. Se obtienen absorbancias menores que con luz de alta pureza
espectral y aún se puede perder la linealidad de una curva de calibración.

El ancho de la banda espectral de un fotómetro no es controlable, es un factor


intrínseco a la construcción del aparato.

Sin embargo el ancho de la banda de luz en los fotómetros de espectro continuo, es


un factor variable que igualmente influye en la pureza espectral, el ancho de la banda
de la luz está determinado por las aberturas de entrada y salida del monocromador.

Una abertura ancha deja entrar la luz dispersada disminuyendo la pureza espectral.
Algunos equipos de abertura normal hay que controlarla y mantenerla estrecha y
uniforme para cada método.

Un tipo de control muy frecuente para estos equipos es el patrón de absorbancia de


sulfato de cobre y amonio a 540 nm, con el que se hace estudio de la reproducibilidad,
estos equipos se fundamentan en la ley de Beer.

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El analista debe conocer los límites de su equipo respecto a la pureza espectral para
no utilizar su fotómetro inadecuadamente para ciertos métodos.

También debe tomar en cuenta la temperatura del laboratorio debe estar entre 22 y 24
°C y la humedad de 60 ± 10% para la protección de los filtros.

REACTIVOS:
• Verificar que los reactivos sean suficientes e idóneos en cantidad, fecha de
preparación y vencimiento.
. Antes de usar nuevos reactivos verificar:

i. Fecha de vencimiento: Si está vencido, no se puede usar por motivo alguno.


Usar siempre los reactivos con el vencimiento más cercano.
ii. Número de lote: Usar preferiblemente el mismo lote corriente para evitar la
recalibracion del equipo.
• Preparar los reactivos para el uso diario con los siguientes
procedimientos:
i. Llevar a temperatura ambiente (si es necesario).
ii. Abrir delicadamente el frasco de reactivo sin crear aerosol (si es liofilizado).
iii. "Pipetear" la cantidad necesaria de líquido para reconstituir el
liofilizado, haciendo bajar suavemente por la pared del frasco y nunca
crear vórtices.
iv. Esperar, al menos, 30 segundos antes de volver a tapar el frasco de
reactivo.
v. Después de los primeros 15 minutos, agitar suavemente invirtiendo el
frasco de tanto en tanto. Si es posible, utilizar agitadores específicos
otros 15 minutos.

CALIBRADORES, ESTANDARES Y CONTROLES:

Antes de usar calibradores, estándares y controles, verificar:

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1. La fecha de vencimiento: Si está vencido, no se puede usar por
motivo alguno. Usar siempre los calibradores con el vencimiento más
cercano.
2. El número de lote: Usar preferiblemente siempre el mismo lote,
(indispensable para los controles).
3. Si se usan productos congelados, descongelar rápidamente a 37oC y
luego agitar con suavidad unas cuantas veces por inversión del
recipiente. Evitar absolutamente el descongelamiento y congelamiento.

Preparar los calibradores, estándares y controles conforme los siguientes


procedimientos:

1. Llevar a temperatura ambiente.


2. Destapar suavemente el frasco de reactivo, sin crear aerosol.
3. Añadir pipeteando suavemente la cantidad necesaria de líquido para
reconstituir el liofilizado, haciéndolo por las paredes del frasco sin crear
vórtices.
4. Esperar al menos 30 segundos antes de volver a tapar el frasco de
reactivo.
5. Dejar en reposo el tiempo necesario, normalmente entre 10 -15 minutos.
6. Después de 10 minutos, mezclar suavemente de tanto en tanto por
inversión, o usar los específicos agitadores durante otros 15 minutos.

CALIBRACIÓN Y CONTROL

Calibración:
Si no es necesario efectuar una nueva calibración, verificar:
- Fecha de la última calibración.
- Vencimiento de la calibración.
- Número de lote del reactivo.
- Es obligatorio proceder con una nueva calibración cada vez que se cambia el
lote de los reactivos.

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Terminada la calibración, es necesario:
- Verificar que las reacciones son lineales.
- Verificar que los valores de la calibración son aquellos esperados.
- Verificar que no hay variaciones significativas entre los valores de las
calibraciones de los últimos 15 días.
- Archivar al menos por un mes los valores de las calibraciones para un
eventual control.

En caso que las calibraciones no sean aceptables, se precisa repetirlas,


buscando de forma individual el problema:
- Errada la reconstitución o el uso de los calibradores.
- Errada la reconstitución o el uso de los reactivos.
- Errado el funcionamiento del equipo (temperatura, limpieza, etc.).

Control:
Para evaluar el correcto funcionamiento de los sistemas analíticos, se precisa
evaluar pronto el C.C J. con suero de control con valores conocidos.

En cada caso, el examen de los controles tiene que efectuarse en un tiempo lo


suficientemente breve para lograr las medidas correctivas antes de la
validación de la entrega de los resultados.

Para su valoración, el resultado del control se confronta con los valores


esperados, verificando si una o más reglas establecidas son violadas.

La negatividad indica una situación “sub control”. La violación de una o más


reglas significa una situación “fuera de control” que precisa oportunas medidas
correctivas.

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PRACTICA N° 1

METABOLISMO DE GLUCOSA

INTRODUCCION.
La Glucosa es una Aldosa de seis carbonos, presente en la forma D
como Mononosacáridos libre en frutas, como la Uva y otras frutas, así como
combinada en los Disacáridos, Trisacáridos, Oligo y Polisacaridos. Es el
producto final del metabolismo de los Carbohidratos y la principal fuente de
Energía de los Organismos vivos. Su utilización está controlada por la Insulina.

La Glucosa en exceso se convierte en Glucógeno y se almacena en el


Hígado y los Músculos para su uso según se requiera y, más allá de este nivel,
se convierte en Grasa y se almacena en forma de T ejido adiposo.

OBJETIVOS
• Determinar las concentraciones de Glucosa.

FUNDANDAMENTOS DEL METODO


La Glucosa reacciona con el Reactivo enzimático que convierte una
mezcla de las enzimas Glucosa oxidada (GOD) y Peroxidasa (POD). En la
primera etapa la Glucosa es oxidada a Acido gluconico por la acción de la
enzima GOD, liberándose como producto H 2 0 2 , el cual en una reacción
mediada por la enzima POD), reacciona con el ácido P-1-P-Hidroxibenzoico
(P-HBA) y 4-Aminoantipirina (4-AAP) produciéndose un compuesto coloreado
con un máximo de absorción a 505 nm; en cantidad proporcional a la cantidad
de Glucosa presente en la muestra.

D-GLUCOSA -------------------------- ACIDO D- GLUCONICO + H 2 0 2


H 2 0 2 + P-HBA + 4-AAP ------------------ H 2 0 + COMPLEJO COLOREADO

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REACTIVOS

PREPARACIÓN.
El reactivo se provee listo para su uso.

COMPONENTES DEL REACTIVO ENSINIATICO.


BUFFER FOSFATO PH 7.0 75 mM
GLUCOSA OXIDASA 15,000 U/L
PEROXIDASA 2000 U/L
4-AMINOANTIPIRINA 0.5 U/L

ACIDO P-HIDROXIBENZOICO 10 mM
AZIDA SODICA 0.1 g/dl
ESTABILIZANTE Y PRESERVANTES
NO REACTIVOS c.s.

SOLUCION ESTANDAR
D- GLUCOSA EN ACIDO BENZOICO
SATURADO 100 mg/dl

MUESTRA

Suero, Plasma, Liquido Cefalorraquideo, Orina y otros fluidos biológicos

EQUIPO REQUERIDO

- Espectro fotómetro, 505 mm (rango 500 – 546 mm)


- Baño termorregulador
- Pipetas

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PROCEDIMIENTO

TECNICA
Llevar el reactivo a la Temperatura que se realizará el ensayo. Las
pipetas a utilizar deben estar limpias y libres de residuos para no contaminar el
reactivo.
En tres tubos de ensayo marcados B (Blanco), S (Estandar) y
D (Desconocido), colocar:

BLANCO ESTANDAR MUESTRA


MUESTRA (ml) --- --- 0.01
ESTANDAR (ml) --- 0.01 ---
REACTIVO (ml) 1.00 1.00 1.00

Mezclar e incubar 5 minutos a 37°C. ó 10 minutos a Temperatura ambiente


(20° a 25°C). Leer las Absorbancias llevando a cero el Espectrofotómetro con el
blanco de reactivo. El Color resultante es estable por a lo menos treinta minutos.

CALCULOS
100
FACTOR = -----------------------------------------------
ABSORBANCIA STANDARD

GLUCOSA (mg/dl) = FACTOR X ABSORBANCIA DE LA MUESTRA

RANGO DE REFERENCIA
60 a 110 g/dL

INTERPRETACION

La Patología más común relacionada con el Metabolismo de la Glucosa es la


Diabetes Mellitus. El diagnostico precoz y el centro de los pacientes diabéticos, tiene
por objeto evitar la Cetoacidosis y las complicaciones de los síntomas resultante de la

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Hiperglicemia. Debe considerarse en cada caso la condición fisiológica y/o la
patología presente en el paciente en cuestión.

RESULTADOS.

Presentar los resultados de valores de Glucosa de los Alumnos, indicando el


Sexo, Peso, Talla, Indice de Masa Corporal (IMC = (PESO/TALLA 2), Edad.

Realizar una prueba de inferencia estadística para establecer diferencias y


asociaciones (anexo).

NOMBRE SEXO EDAD PESO TALLA IMC GLUCOSA


mg/dl

CUESTIONARIO. (Responder en anexo)

1. Definir Metabolismo. Establecer diferencia entre Anabolismo y


Catabolismo y de ejemplos de casos.
2. Explique el movimiento de la Glucosa en las Células del Cuerpo.
3. Defina Glucolisis
4. Explicar la Glucogenolisis
5. Defina la Glucogénesis.
6. Explicar la Gluconeogenesis.
7. Defina la Lipolisis
8. Qué causa el incremento de los valores de Glucosa

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9. Mencionar casos en que se produce Hipoglucemia
10. Que función cumple la Insulina y el Glucagon

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PRACTICA N° 2

TOLERANCIA A LA GLUCOSA

INTRODUCCION

Muchos trastornos del Sistema Endocrino se debe a la secreción


excesiva o insuficiente de una Hormona dada. Sin embargo, las Hormonas no
ejercen sus acciones en tanto no se unan con sus Receptores o por defectos
en los Sistemas de Segundos Mensajeros.

Dentro de las numerosas alternativas relacionadas con el Sistema


tenemos la Diabetes; enfermedad caracterizada por la excreción excesiva de
Agua en la Orina. Signo Clínico común para los diferentes tipos de Diabetes,
como la Diabetes Insípida con sus modalidades Neurogena y Nefrogena; así
como la Diabetes Mellitus con sus variantes Tipo I y II.

Una Prueba que se realiza cuando existen dudas referentes al


diagnostico de Diabetes es la Prueba de Tolerancia a la Glucosa; Prueba
Presuntiva que permite diferenciar la Diabetes Insípida de la Diabetes Mellitus
en los Hijos de Padres Diabéticos o bien en personas que deseen asegurarse
de no padecer la enfermedad en forma latente o potencial.

OBJETIVO.

• Interpretar las diferentes alteraciones que puedan presentarse en el


dosaje del Perfil Glicemico.

MATERIAL.
Reactivo.
. Kit de Glicemia; laboratorios VALTEK
Equipos:

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. Espectrofotómetro
. Baño Termorregulador
. Pipetas

Material Biológico.

. Alumnos (Muestra: Plasma o Suero)

PROCEDIMIENTO.

Esta Prueba consiste en la administración de una dosis oral de Glucosa


y la práctica de extracciones secuenciales de Sangre para determinar la
Glucemia (Método Enzimático para la determinación de Glucosa en Suero o
Plasma-VALTEK). Según:
1. Obtener muestra de Suero o Plasma en Ayunas (BASAL).
2. Administrar al Paciente 75 gr. de Glucosa disuelta en 300 ml. de
Agua. La Solución debe ser Ingerida entre 5 y 10 minutos
3. Obtener muestras de suero o plasma cada 30 minutos,
hasta completar un tiempo total de 3 horas.

La Determinación de la Glucosa se debe realizar inmediatamente


después de obtener la muestra.

RECOMENDACIONES

La Prueba de Tolerancia a la Glucosa representa exclusivamente una


Prueba Diagnóstica, y por tanto nunca debe realizarse en un paciente si ya se
sabe que es diabético; puesto que no solo aportara el menor dato de interés, si
no que, además, entraña un riesgo innecesario. Pues, su realización está
indicada en Pacientes que tienen una Glucosa normal o próxima a la
normalidad en la que existe sospecha de diabetes o bien en individuos que
presentan una Hiperglucemia Basal Moderada, alrededor de 140 mg/dl.

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Además, se recomienda para efectuar la prueba:

- El Paciente debe estar en Ayunas desde 12 horas antes de la


Prueba, permanecer en Reposo y abstenerse de Fumar.
- Durante los tres Días previos a la Prueba el Paciente debe consumir
una Dieta Libre, cuidando especialmente no limitar los Glúcidos.
- El Paciente no debe padecer una Enfermedad Incurable, ni estar
convaleciente de algún Proceso. Así mismo no debe estar recibiendo
Medicación que pueda alterar la Tolerancia Hidrocarbonatada

INTERPRETACION

CURVA NORMAL

Se caracteriza por una fase Hiperglucemia que alcanza la cifra de


160 mg/dl. en la Primera Hora.
Una segunda fase, Normoglucemica se alcanza a los dos horas.
A los 150 minutos una ligera fase Hipoglucemica, con cifra
ligeramente subnormales

Por ejemplo:
80 (BASAL), 90 (30'), 157 (60'), 120 (90'), 85 (120'), 70 (150')

CURVA TIPO DIABETICO

La Cifra Inicial en Ayunas está por encima del normal (140 o más).
Con una altura en la fase Hiperglucemica superior a 180 -260 mg/dl en
la primera hora, y
Un alargamiento superior de esta fase a las 2 o 3 Horas, con tendencia
Hiperglucemica.

Por ejemplo:

21
145(BASAL), 250(30'), 310(60'), 340(90´), 350(120'), 353(150').

RESULTADOS
Presentar los Resultados, en Tabla adjunta, de los alumnos.
Anotando: Nombre, Sexo, Edad, Peso, Talla, IMC, Glucosa (mg/dl); basal, 30,
60, 90, 120, 150 y 180 minutos.

Construir en papel milimetrado las curvas de tolerancia a glucosa de


los alumnos, considerando los valores en mg/dl (eje vertical) obtenidos , frente
a las horas de evaluación (eje horizontal) (anexo).

NOMBRE SEXO EDAD PESO TALLA IMC

GLUCOSA(mg/dl)
NOMBRE BASAL 30´ 60´ 90´ 120´ 150´ 180´

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CUESTIONARIO.

1. Enumere cinco Enfermedades relacionadas con la Disfunción Glandular.


2. Enumere cinco Enfermedades producto de la Aberración de los Receptores.
3. Que es la Diabetes.
4. Definir la Diabetes Mellitus I y II
5. Que es la Ciclosporina.
6. Como se define la Diabetes Insípida. Clases.
7. Que es la ADH y qué función cumple.
8. Qué función cumple la Insulina.
9. Mencionar la Etiología de la Diabetes I y II.
10. Definir la Hipoglucemia y mencione la Etiología.

23
PRACTICA 3

PROTEINAS TOTALES Y ALBUMINA

METODO COLORIMETRICO PARA LA DETERMINACION DE PROTEINAS


TOTALES Y ALBUMINA EN SUERO O PLASMA (VALTEK).

INTRODUCCION.

Las Proteínas son Compuestos Nitrogenados, estructurados según un


patrón común en los que entran a formar parte, además del Nitrógeno, el
Carbono, el Oxigeno, el Hidrogeno y en ocasiones también el Azufre, el Fosforo y
el Yodo.

Son constituyentes principales del Protoplasma de todas las Células, son de


elevado Peso Molecular y consisten en combinaciones de Aminoácidos unidos por
Enlaces Peptidicos. Se encuentran comúnmente 20 Aminoácidos diferentes de la que
dependen su Forma y Función Especificas. Entre sus funciones figuran: Catálisis
Enzimática, Transporte y Almacenamiento, Movimiento coordinado, generación de
Impulsos Nerviosos, Control de Crecimiento, Inmunidad y Soporte mecánico.

Las Proteínas Plasmáticas por su fácil accesibilidad de Análisis son


importantes: las Inmunoglobulinas, la Albúmina, el Complemento, los Factores de
Coagulación y las Enzimas. Donde la Albúmina es la principal Proteína Plasmática,
responsable de gran parte de la Presión Osmótica Coloidal del Plasma, y que sirve
como Proteína de Transporte para Aniones Orgánicos Grandes (por ejemplo, Acidos
Grasos, Bilirrubina, ciertos Fármacos), y para algunas Hormonas cuando sus
Globulinas Especificas de unión están Saturadas.

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DETERMINACIÓN DE PROTEÍNA TOTAL.

OBJETIVOS.
. Determinar las concentraciones de Proteínas Totales y Albúminas en Suero
o Plasma.
. Interpretar las diferentes alteraciones que pueden presentarse en el Dosaje
de Proteínas Totales y Albúminas en Suero o Plasma.

FUNDAMENTO DEL MÉTODO

Para la determinación de niveles de Proteína Total se utilizan variados


métodos, entre ellos la Densidad, el Indice de Refracción, Absorbancia de la
Muestra en el Rango Ultra-violeta, y por la Técnica de Folin-Ciocalteau.
Originalmente se medía por el método de Kjeldahl, que actualmente se utiliza
como método de referencia.

El Método utilizado se basa en la reacción de Biuret, en la cual los


Enlaces Peptídicos reaccionan en Medio Alcalino con Sulfato de Cobre para
formar un Complejo Coloreado Azul-violeta. El Color formado se Mide
Colorimétricamente, siendo proporcional a la cantidad de Proteína presente en
la Muestra

Proteina + medio alcalino con -------- complejo coloreado (azul violeta)


Sulfato de cobre

REACTIVOS

Preparación: El reactivo se provee listo para su uso.


Componentes del reactivo:
Sulfato de cobre II 15 m M
Tartrato de sodio y potasio 70 mM
Ioduro de potasio 10 mM

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Hidróxido de sodio 200 mM
Preservantes y surfactantes c.s.

Solución Standard
Albúmina Bovina, Ver concentración en la Etiqueta del Frasco.

MUESTRAS
Utilizar de preferencia Suero Libre de Hemolisis. Si se utiliza Plasma, se
obtienen Valores Elevados por la presencia del Fibrinógeno.

EQUIPO REQUERIDO
- Espectrofotómetro o Fotocolorímetro de Ffiltros capaz de
medir Absorbancias a 540 nm (rango 520 - 560 nm)
- Baño Termorregulador
- Pipetas.

PROCESAMIENTO
En Tres Tubos de Ensayo marcados B (blanco) S (estándar) y D (desconocido),
colocar:

TECNICA

BLANCO ESTÁNDAR DESCONOCIDO


MUESTRA(ml) — — 0.01
ESTÁNDAR (ml) — 0.01 —
REACTIVO (ml) 1.00 1.00 1.00

Mezclar e incubar 10 Minutos a 37°C, o 20 Minutos a Temperatura Ambiente


(20° a 25° C). Leer las Absorbancias a 540 nm., llevando a cero el Espectrofotómetro
con el Blanco de Reactivo. El Color resultante es estable por a lo menos treinta
Minutos.

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CALCULOS

CONCENTRACION STANDAR
FACTOR = ---------------------------------------------
ABSORBANCIA STANDAR

PROTEÍNA TOTAL (g/dl) = FACTOR X ABSORBANCIA DESCONOCIDO

RANGO DE REFERENCIA
6.0 a 8.0 g/dl

INTERPRETACION.

La concentración de Proteína Total es muy útil en el Monitoreo de cambios


que se producen como consecuencia de varias Patologías. Hiperproteinemias, se
encuentran en casos de Mieloma Múltiple, Endocarditis Bacteriana y
Hemoconcentraciones de diversos Origenes (Deshidratación, Neuropatías crónicas).
Hipoproteinemias, en casos patológicos como Pérdidas Renales, Desnutrición,
Infecciones prolongadas.

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DETERMINACION DE ALBUMINA

La albúmina reacciona con el reactivo verde de bromocresol y se


obtiene como producto un compuesto coloreado que es proporcional a la
cantidad de proteína presente en la muestra.

Albúmina + verde bromocresol -------------- Compuesto Coloreado

REACTIVOS

Conservar entre 4 y 25°C. y protegido de la luz; estable hasta la


fecha de caducidad indicada en la etiqueta. La absorbancia del reactivo
contra Blanco de Agua a 620 nm., debe ser del orden de 0.150 D.O.

Preparación: El reactivo se provee listo para su uso.

Componentes del reactivo:


- Verde de bromocresosi 0.20 mM
- Buffer succinate pH 3.80 mM
- Preservantes y surfactantes c.s.
- Solución Standard

Albúmina Bovina, ver concentración en la etiqueta del frasco.


(Conservar entre 2 o y 8°C.)

MUESTRA.
La Muestra a utilizar puede ser tanto Suero como Plasma. La
Albúmina es estable en Suero o Plasma una Semana a Temperatura
Ambiente y 1 Mes a 4 o C.

28
EQUIPO REQUERIDO.
- Espectrofotómetro o Fotocolorímetro de Filtros capaz de medir
Absorbancias a 620 nm. (rango 570 - 640 nm.).
- Baño Termoregulador
- Cronómetro y Pipetas.

PROCESAMIENTO

En tres tubos de ensayo marcados B (blanco) S (estándar) y D


(desconocido), colocar:

BLANCO ESTÁNDAR DESCONOCIDO

MUESTRA(ml)—-- — ------------
--- 0.01
ESTÁNDAR (ml) --- 0.01 ---
REACTIVO DE 1.00 1.00 1.00
TRABAJO (ml)

Mezclar e Incubar 10 minutos a 37°C, o 20 Minutos a Temperatura


Ambiente (20° a 25° C). Leer las Absorbancias a 540 nm., llevando a cero
el Espectrofotometro con el Blanco de Reactivo. El Color resultante es
estable por a lo menos treinta Minutos.

CÁLCULOS.

CONCENTRACION ESTANDAR
FACTOR = -----------------------------------------------
ABSORBANCIA ESTANDAR

PROTEÍNA TOTAL (g/dl) = FACTOR X ABSORBANCIA DESCONOCIDO

RANGO DE REFERENCIA:
3.5 a 5.0 g/dl

INTERPRETACIÓN

29
La Concentración de Albúmina en Plasma influye notablemente en el
mantenimiento de la Presión Coloidosmotica, lo que estaría relacionado con su
relativamente elevado peso molecular y su gran carga neta. Una
Hiperalbuminemia es ocasional y se relaciona casi siempre con Deshidratación
que produce el consecuente Aumento en el contenido Proteico del Plasma.
Una Hipoalbuminemia está asociada a procesos de Sobrehidratación, Perdida
de Proteínas, Disminución en la Síntesis, o Aumento en el Catabolism o o
Degradación.

RESULTADOS

Presentar los resultados de valores de Proteínas Totales y Albúmina de


los alumnos; Indicando Sexo, Peso, Talla, IMC, Edad.

Realizar una Prueba de Inferencia Estaditica para establecer diferencias


o asociaciones (anexo).

NOMBRE SEXO EDAD PESO TALLA IMC PROTEINAS ALBUMINA


TOTALES ( mg/dl)
( mg/dl)

30
CUESTIONARIO

1. Describir la Síntesis de las Proteínas.


2. Enumerar las Clases de Proteínas
3. Enumerar la Funciones de las Proteínas
4. Enumerar los 20 Aminoácidos que Constituyen las Proteínas según la
Polaridad de sus Grupos R.
5. Describir la Digestión de las Proteínas.
6. Describir la Absorción de las Proteínas.
7. Porque es Importante la Albúmina en el Plasma.
8. Que Enfermedades o Trastornos son Causales de Hiperproteinemia e
Hipoproteinemia
9. Que Enfermedades o Trastornos Provocan Hiperalbuminemia e
Hipoalbuminemia.
10. Definir el Mieloma Múltiple.

31
PRACTICA: 4

COLESTEROL TOTAL, TRIGLICERIDOS Y LIPOPROTEINAS.

METODO ENZIMATICO PARA LA DETERMINACION DE COLESTEROL


TOTAL, TRIGLICERIDOS, LIPOPROTEINAS DE ALTA DENSIDAD (HDL), Y
LIPOPEOTEINAS DE BAJA DENSIDAD (LDL) EN SUERO (VALTEK,
BIALEX)

INTRODUCCION.

Los Lípidos, constituyen un grupo complejo y diverso de Moléculas


que tienen en común ser Insolubles en mMs Polares y solubles en
aquellos cuya Polaridad es Baja, y que están formados principalmente
por: las Grasas Propiamente Dichas (Trigliceridos y Acidos Grasos),
Colesterol, los Fosfogliceridos y los Esfingolipidos.

Entre los Lípidos, existen Moléculas "esenciales" (no pueden ser


sintetizados por el organismo), otras que requieren ciertas modific aciones
para ser funcionales, y otras muchas "no esenciales" cuya síntesis es
potencialmente posible por la mayoría de las células que se localizan
fundamentalmente en un órgano: el hígado.

Entre las varias funciones de los Lípidos destacan: Son fuente


Energética (tienen mayor Valor Calórico que el resto de los principios
inmediatos), Forma de Almacenamiento de Energía (al poder ser
Almacenados sin Agua, ocupan menos Espacio que los Hidratos de Carbono
y Proteínas), Componentes Estructurales de las Membranas Celulares y de
las Proteínas Plasmáticas, Agente Emulcificante (del Colesterol, procedente

31
de los Acido Biliares), Compuestos Funcionales (Hormonas, Prostaglandinas,
Vitaminas).

La Relativa Especialización de los diversos Tejidos en el manejo de


los Lipidos (Sintesis Endógena en el Hígado, el Almacenamiento en el Tejido
Adiposo, el consumo generalizado) hace necesaria la existencia de un
Transporte Plasmático de los mismos de un lugar a otro. Para este Transporte
es necesarias su incorporación en los Complejos que permitan Solubilización
y que poseean además la incorporación necesaria para su correcta
Metabolización. Los Complejos deTtransporte de la mayoría de los Lípidos
son las Lipoproteínas, como: los Quilomicrones (Transporte de Triglicéridos
exógenos), Lipoproteínas de Muy Baja Densidad -VLDL- (Transporte de
Triglicéridos Endógenos), Lipoproteínas de baja densidad – LDL - (Transporte
de Colesterol y Fosfolípidos a los Tejidos Periféricos), Lipoproteínas de Alta
Densidad - HDL- (Transporte de Colesterol desde las Células al Hígado).

OBJETIVOS.

. Determinar las Concentraciones de Colesterol Total, HDL -Colesterol, LDL


Colesterol y Triglicéridos Séricos.

. Interpretar las Diferentes Alteraciones que puedan presentarse en el


Dosaje del Perfil Lipídico.

33
DETERMINACIÓN DE COLESTEROL TOTAL
FUNDAMENTO DEL METODO.

El Colesterol se Determina por Acción de las Enzimas Colesterol


Ester Hidrolasa y Colesterol Oxidasa. La Primera libera el Colesterol de los
Esteres de Colesterol, y la Segunda Oxida el ColesterolLlibre produciéndose
Peróxido de Hidrógeno, el cual en presencia de la Enzima Peroxidasa
reacciona con el Sistema Cromogénico dando Origen a un Compuesto
Coloreado que Absorbe a 505 nm.

CEH
COLESTEROL ESTER ------------- COLESTEROL + ÁCIDOS GRASOS

CHOD
COLESTEROL + O2 -------------------- COLEST-4-EN-3-ONA + H2O2

PAP
2H 2 O 2 + 4-AAP +P-HBA ----------- COM P. COLOREADO + 4H 2 0

REACTIVOS

Preparación: El Reactivo se Provee listo para su Uso.

Composición del reactivo enzimàtico:

Buffer fosfato pH 7.2 100 mM


Colesterol ester hidrolasa > 150 U/l
Colesterol oxidasa (recombinante) > 100 U/l

34
Peroxidasa > 1000 U/l
4-Aminoantipirina 0.4 mM
Acido p-hidroxibenzoico 10 mM
Azida sódica 0.1 g/dl
Estabilizantes y preservantes no reactivos c.s.
Solución estándard:
Colesterol en solución acuosa estabilizada 200 mg/dl

MUESTRAS

Utilizar de preferencia Suero o Plasma (Heparina o EDTA) Libre de Hemolisis.


La Muestra debe tomarse con el Paciente en Ayunas

EQUIPO REQUERIDO

- Espectrofotómetro o Fotocolorímetro de filtros Capaz de Medir Absorbancia a


505 nm. (rango 500 - 550 nm.).
- Baño Termoregulado.
- Cronómetro y Pipetas
-
PROCESAMIENTO

En tres tubos de ensayo marcados B (blanco) S (estándar) y D


(desconocido), colocar:

Blanco Estándar Desconocido


Muestra(ml) — — 0.01
Estándar (ml) — 0.01 —
Reactivo de trabajo (ml) 1.00 1.00 1.00

Mezclar e Incubar 10 minutos a 37°C, o 10 minutos a Temperatura


Ambiente(>20°C). Leer las absorbancias a 505 nM llevando a cero el

35
Espectrofotómetro con el Blanco de Reactivo. El Color resultante es estable
por a lo menos treinta minutos.

CÁLCULOS.
200
FACTOR = ---------------------------------------
ABSORBANCIA ESTANDAR

COLESTEROL(mg/dl) = FACTOR x ABS.MUESTRA

RANGO DE REFERENCIA:

140 a 200 mg/dl

INTERPRETACIÓN

El colesterol se encuentra presente en la Sangre, Bilis y Tejido


Cerebral. Es el Precursor de los Acidos Biliares, Estereoides y Vitamina D. Su
determinación constituye el Diagnostico y Clasificación de las Disli pidemias.

DETERMINACIÓN DE TRIGLECERDOS

FUNDAMENTO DEL METODO

Los Triglicéridos son Hidrolizados por una Lipasa especifica liberando Acidos
Grasos y Glicerol. El Glicerol es fosforilado por la Enzima Gliceroquinasa y

36
posteriormente, el Glicerolfosfato es Oxidado a Dihidroxiacetona Fosfato por la
Enzima Glicerol-Fosfato Oxidasa, generándose Peróxido de Hidrogeno.

Posteriormente, en una Reacción del tipo Trinder, el Peróxido de Hidrógeno


reacciona con 4 Aminoantipirina y el Acido 3,5-Diclorobencensulfonico para producir
por medio de la enzima Peroxidasa un compuesto coloreado en cantidad
proporcional a la concentración de Triglicéridos presentes en la muestra.

LIPASA
TRIGLICÉRIDOS ---------------- GLICEROL + ACIDO GRASOS

El Glicerol y los Acidos Arasos se forman en una primera etapa por la


acción de la Lipasa sobre los Triglicéridos.

El Glicerol se Fosforila por la Adenosin-5-Trifosfato (ATP) para producir


Glicerol–3-Fosfato (G-3–P) y Adenosin-5-Difosfato (ADP) en una reacción
catalizada por la Glicerol–kinasa (GK).

GK
GLICEROL + ATP ------------------ G-3-P + ADP

La G-3-P es oxidada por la Gliceril Fosfato Oxidase (GPO) produciendo


Deshidroxiacetona Fosfato (DAP) y Peroxido de Hidrogeno.

GPO
G-3- P + O2 ----------------- DAP + H 2 O 2

Los Peróxidos reaccionan con 4–Aminoantipirina y 4-Clorofenol bajo la


influencia catalítica de la Peroxidasa (POD) para formar Quinoneimina.

POD
2H 2 O 2 + 4-AMINOANTIPIRINA + DCBS ------- QUINONEIMINA + HCL + 4 H 2 0

37
REACTIVOS

Preparación: el Reactivo se provee listo para su uso.

Composición del reactivo:

- Buffer Tris PH 7.5 50 Mm


- Lipasa (microbial) >500 U/L
- Glicerokinasa >500 U/L
- Glicerol – 3 Fosfato Oxidasa >500 U/L
- Peroxidasa >1000 U/L
- Acido 3.5 Dicloro – 2 Hidroxibencensulfonico 1.5 mM
- Adenosin Trifosfato (ATP) 0.50 mM
- Mg2+ 5 mM
- Estabilizantes y Preservantes no Reactivos Cs

Solución standard

Glicerol en solución estabilizada equivalente a 200 mg/dl de Triglicéridos.

MUESTRA

Suero o Plasma

EQUIPO REQUERIDO

- Espectrofotometro o Fotocolorímetro de filtros capaz de medir


Absorbancias a 520 nm (rango 500 – 546 mm)
- Baño Termorregulador
- Pipetas

PROCEDIMIENTO

38
En tres tubos de ensayo marcados B (blanco) S (estándar) y D
(desconocido), colocar.

BLANCO ESTÁNDAR MUESTRA


MUESTRA (ml) --- --- 0.01
ESTANDAR (ml) --- 0.01 ---
REACTIVO (ml) 1.0 1.0 1.00

- Mezclar e Incubar 10 minutos a 37°C o 20 minutos a temperatura


ambiente (20° a 25°C
- Leer las Absorbancias a 520 mm, llevando a cero el Espetrofotómetro
con el Blanco Reactivo.

CALCULOS

200
FACTOR = ----------------------------------------
ABSORBANCIA ESTÁNDAR

TRIGLICERIDOS (mg/dl) = FACTOR X ABSORBANCIA DESCONOCIDO

RANGOS DE REFERENCIA

25 a 160 mg/dl

INTERPRETACIÓN
Los Trigliceridos son Lipidos que en parte se absorben de la dieta y
que también son producidos por el Organismo a partir de Carbohidratos. Su
evaluación es importante para el diagnóstico y seguimiento de las
Hiperlipidermias ya sean de origen Genético o secundarias a otras
Enfermedades. Valores elevados aumentar el riesgo de Arteroesclerosis y de
Enfermedad Coronaria.

39
DETERMINACIÓN DE LIPOPROTEINAS DE ALTA DENSIDAD (HDL)

FUNDAMENTOS DE METODO

La Lipoproteína de Alta Densidad (HDL) se obtiene precipitando


selectivamente las Lipoproteínas LDL y VLDL, quedando la primera en solución.

La HDL en solución se determina por acción de las enzimas Colesterol Ester


Hidrolasa y Colesterol Oxidasa.

La primera libera el Colesterol de los Esteres de Colesterol, y la segunda oxida


el Colesterol Libre produciéndo Peróxido de Hidrogeno, el cual en presencia de la
enzima Peroxidasa reacciona con el Sistema Cromogenico dando origen a un
compuesto coloreado.

CEH
COLESTEROL ESTER ------------ COLESTEROL+ACIDOS GRASOS

CHOD
COLESTEROL + 02 ----------------- COLEST - 4 EN - 3 ONA +H202

POD
2H202 +4-AAP+P-HBA --------------- COMP. COLOREADO + 4H20

REACTIVOS

COMPOSICION

ACIDO FOSFOTUNGSTINO 0.55 mM


CLORURO DE MAGNESIO 25 mM

40
Nota: Debe complementarse el uso de Reactivo Precipitante con el Reactivo para la
determinación enzimática de Colesterol VALTEK

MUESTRA

- Suero libre de hemolisis

EQUIPO REQUERIDO

- Espectrofotómetro ó Fotocolorímetro de filtros capaz de medir


absorbancias a 505 nm (Rango 500-550 nm)
- Centrifuga
- Baño Termoregulador
- Pipetas

PROCEDIMIENTO.

Precipitación: Agregar en un Tubo de Centrifuga 0.5 ml de Reactivo Precipitante


y 0.2 ml de muestra mezclar y esperar 15 minutos, a Temperatura Ambiente.
Centrifugar 15 minutos a 3000 rpm ó 3 minutos a 10.000 rpm.

Colorimetria: Utilizando el Reactivo Enzimàtico de Colesterol Total, en 3 tubos


de ensayo marcados B (Blanco), S (Standard) y D (desconocido), colocar:

BLANCO ESTANDAR MUESTRA

MUESTRA (ml) ------ ------ 0.10

ESTANDAR (ml) ------ 0.01 ------

REACTIVO COLESTEROL TOTAL (ml) 1.00 1.00 1.00

Mezclar 10 minutos a 37°C a 20, minutos a temperatura ambiente (20 a 25 °C) y Leer
las absorbancias a 505 nm llevando el espectrofotómetro a cero con el blanco de
reactivo.

41
CÁLCULOS

76.5
FACTOR = ------------------------------------------------
ABSORBANCIA STANDARD

HDL (mg/%) = FACTOR X ABSORBANCIA DESCONOCIDO

CALCULO DEL LDL

LDL(mg/dL) = COLES. TOTAL(mg/dL) – HDL(mg/dL) - TRIGLICÉRIDOS


(mg/dL)
5

RANGOS DE REFERENCIA HDL


BAJO RIESGO RIESGO ESTANDAR RIESGO ALTO
HOMBRES >55mg/dL 35- 65mg/dL <35mg/dL
MUJERES >65mg/dL 45-65mg/dL <45mg/dL

INTERPRETACION

El Colesterol se encuentra presente en la Sangre, Bilis y Tejido


Cerebral. Es Precursor de los Acidos Biliares, Esteroides y Vitamina D. El
Colesterol es Transportado por tres Lipoproteínas, la Lipoproteína de Alta
Densidad(HDL), la de Baja Densidad(LDL), y la de Muy Baja Densidad
(VLDL).

Castelli y Colaboradores han reportado que hay una estrecha relación,


entre los niveles de HDL y el riesgo de Enfermedad Coronaria. La E valuación

42
de los niveles de (HDL) y Trigleceridos provee una valiosa herramienta para
la predicción de Enfermedad Coronaria y la clasificación de las Dislipidemias.

DETERMINACION DE LIPOPROTEINAS DE BAJA


DENSIDAD (LDL)

FUNDAMENTOS DEL METODO

El LDL es obtenido precipitándolo selectivamente mediante el uso de


Heparina en una solución con el Punto Isoeléctrico adecuado, quedando en solución
los Colesteroles HDL y VLDL. El LDL precipitado se determina obteniendo el
diferencial entre el Colesterol Total y el HDL y VLDL que permanecen en solución
por acción de las Enzimas Colesterol Ester Hidrolasa y Colesterol Oxidasa que
actúan sobre estos últimos.

La primera enzima libera el Colesterol de los Esteres de Colesterol y la


segunda oxida el Colesterol Libre produciéndose Peróxido de Hidrogeno, el cual en
presencia de la enzima reacciona con el Sistema Cromogenico dando origen a un
compuesto coloreado.

CEH
COLESTEROL ESTER -------------- COLESTEROL + ACIDOS GRASOS

CHOD
COLESTEROL + 02 --------------- COLESTERO -4-EN-3-ONA + H202

POD
2H202 + 4-AAP + P- HBA --------------- CON. COLOREADO + 4H20

43
REACTIVOS

COMPOSICION

. Citrato de Sodio 60 Mm
. Heparina 100.000 U/L

Nota: Debe complementarse el uso del Reactivo Precipitante con el reactivo para la
determinación Enzimática de Colesterol VALTEK

MUESTRA

Suero libre de Hemolisis

EQUIPO REQUERIDO

- Espectrofotómetro o Fotocolorímetro de filtros capaz de medir


absorbancias de 505 nm (Rango 500-550 nm)
- Centrifuga
- Baño Termorregulador
- Pipetas

PROCEDIMIENTO

Precipitación: Agregar en un Tubo de Centrifuga 1 ml de Reactivo Precipitarte


y 0.1 ml d e M u e s t r a . M e z c l a r y e s p e r a r 1 0 m i n u t o s a T e m p e r a t u r a
a m b i e n t e ( 1 5 a 25°C), Centrifugar 15 minutos a 4000 rpm. Extraer el sobrenadante
dentro de los 10 minutos posteriores a la Precipitación.

Colorimetria: Utilizando el Reactivo Enzimàtico de Colesterol t o t a l , e n 3


t u b o s de ensayo marcados B (Blanco), S (Standard), y D (Desconocido), colocar:

44
BLANCO ESTANDAR DESCONOCIDO
SOBRENADANTE (ml) - - 0.10
ESTANDARD (ml) - 0.01-
REACTIVO COLESTEROL 1.00 1.00 1.00
TOTAL (ml)

- Mezclar e Incubar 10 minutos a 37° C ó 2 0 minutos a Temperatura


Ambiente (20 a 25°C)
- Leer las absorbancias a 505 nm, llevando el
Espectrofotómetro a Cero con el Blanco de Reactivo.

CÁLCULOS
240

FACTOR = ---------------------------------------------
ABSORBANCIA STANDARD

LDL (mg/%) = FACTOR X ABSORBANCIA DESCONOCIDO

RANGOS REFERENCIA
BAJO RIESGO < = 150 m g %
SOSPECHOSO 150 - 195 m g %
ALTO RIESGO >195 mg%

45
INTERPRETACIÓN

El Colesterol se encuentra presente en la Sangre, Bilis y Tejido Cerebral. Es


precursor de los Acidos Biliares, Esteroides, y Vitamina D. El Colesterol es
transportado por tres Lipoproteínas, la Lipoproteína de Alta Densidad (HDL), la de
Baja Densidad (LDL) y la de Muy Baja Densidad (VLDL). Castelli y Colaboradores han
reportado que hay una estrecha relación entre los niveles de LDL y el riesgo de
Enfermedad Coronaria. La Evaluación de los niveles de LDL provee una valiosa
herramienta para la predicción de Enfermedad Coronaria y la clasificación de las
Dislipidemias.

RESULTADOS

Presentar los resultados de valores de colesterol total, triglicéridos, HDL y LDL


de los alumnos indicando Sexo, Peso, Talla, IMC y Edad.

Realizar una prueba de inferencia estadística para establecer diferencias o


asociaciones (anexos).

NOMBRE
SE SEXO
E EDAD
P PESO
T TALLA
I IMC
CC COLESTEROL TRIGLICERIDOS HDL LDL
(mg/dl) (mg/dl) (mg/dl)
TOTAL (mg/dl)

46
CUESTIONARIO

1. Definir Lípidos
2. Clasificar los Lípidos
3. Enumerar las funciones principales de los Lípidos
4. Describir la Digestión y Absorción de los Lípidos.
5. Qué es un Triglicérido
6. Describir el transporte de los Lípidos Endógenos y Exógenos
7. ClasifIcar las Hiperlipidemias
8. Qué es la Ateroesclerosis
9. Qué es la Enfermedad de Tangier

47
PRACTICA 5

CALCIO - HIERRO
METODO COLORIMETRICO PARA LA DETERMINACION DE CALCIO Y
HIERRO EN SUERO (VALTEK — WIENER)

INTRODUCCION

Los Minerales son sustancias sólidas homogéneas inorgánicas por lo general


constituyentes de la Corteza Terrestre.

El Calcio en forma de sales de Fosfato Calcico forma el material duro y denso


de los Dientes y los Huesos. El ion Ca 2+ interviene en muchos Procesos Fisiológicos.
Un nivel normal de Calcio en la Sangre es esencial para una Función Cardiaca,
Nerviosa, y Muscular normal. Participa en la Coagulación Sanguínea (en donde se
denomina Factor IV de la Coagulación). Diversas Sales de Calcio, entre ellas, las
Sales de Acetato, Carbonato, Cloruro, Lactobionato, Libulinato y Fosfato, se emplean
para la reposición de Calcio y como suplementos.

El Hierro es un constituyente esencial de la Hemoglobina, Mioglobina,


Citocromos y otros componentes de los Sistemas Enzimáticos Respiratorios. Una
notable cantidad de este elemento se encuentra depositado en las Celulas del
Sistema Retículo Endotelial del Hígado, Bazo, Medula Osea y Parénquima Hepático.

48
DETERMINACION DE CALCIO (V ALTEK)

OBJETIVOS.

. Determinar las concentraciones de Calcio y Hierro en Suero.


. Interpretar las diferentes alteraciones que pueden presentarse en el Dosaje
del Calcio y Hierro

FUNDAMENTOS DEL MÉTODO

El método utiliza la Cresolftaleina Complexona según Moorehead y


Briggs. la CFC reacciona con el Calcio y Magnesio en Medio A lcalino Fuerte,
formándose un complejo coloreado. La interferencia del Magnesio se elimina
con la adición de 8-Hidroxiquinocina. La Intensidad del color púrpura formado,
es directamente proporcional a la concentración de Calcio presente en la
muestra, y se mide a 570 nm (rango 560 - 600 nm).

REACTIVOS
Composición de los Reactivos:

- BUFFER ALCALINO-
2-Amino-2-metil-1-Propanol ---------------------- 350 mM
Cianuro de Potasio ---------------------------- 2 mM
Estabilizantes e ingredientes no reactives ---------- C.S.

- REACTIVO CFC.

0-Cresolftaleina complexota -------------------------- 0.05mM


8-Hidroxiquinolina ------------------------------------ 5 nM

49
- SOLUCIÓN STANDARD:
Carbonato de Calcio en HC1 diluido ------------------ 10 mg/dl

Preparación del Reactivo de Trabajo:

Mezclar 1 m l de Buffer Alcalino con 1 gota (50 mi) de reactivo CFC.

MUESTRA
- Suero

EQUIPO REQUERIDO

- Espectrofotómetro ó Fotocolorimetro de filtros capaz de leer


Absorbancias a 570 nm (Rango 540 - 600 nm).
- Pipetas.

Técnica con Blanco Tubo

STANDARD MUESTRA
REACTIVO DE TRABAJO (ml) 1.00 1.00
Mesclar y Leer para cada tubo las absorbancias A1 contra blanco de agua.
ESTÁNDAR (ml) 0.01 --------
MUESTRA(ml) -------- 0.01
Mesclar e Incubar al menos 60 segundos y leer para cada tubo las
Absorbancias A2 contra Blanco de Agua.

Cálculos:
10
Factor = ------------------------------------------
(A2 Standard - A1 Muestra)

CALCIO (mg/dl) = FACTOR X (A2 MUESTRA - MUESTRA)

50
Técnica con blanco tubo;

BLANCO ESTÁNDAR MUESTRA


STANDARD (ml) ----- 0.01 ------
MUESTRA (ml) ------ ------ 0.01
REACTIVO DE TRABAJO (ml) 1.00 1.00 1.00

Mezclar e Incubar a lo menos 60 segundos y Leer las Absorbancias contra Blanco


de Reactivo.

CÁLCULOS:

10
Factor = --------------------------------------
Absorbancia Standard

Calcio (mg/dl) = Factor x Absorbancia Muestra

RANGOS DE REFERENCIA:

Adulto: 8.8 a 10.7 mg/dl


Niño: 10.0 a 12.0 mg/dl

INTERPRETACIÓN

El aumento de Calcio Sérico (Hipercalcemia), puede estar asociado a


diversas patologías tales como Hiperparatiroidismo, Hipervitaminosis,
Mielomas y algunos Canceres Oseos. Asimismo, su disminución

51
(Hipocalcemia), puede estar asociada a Hipoparatiroidismo, Nefrosis, Nefritis,
Esteatorrea y Pancreatitis.

Por otra parte, una invasión en el contenido Proteico del Plasma,


también puede derivar en cambios en las Concentraciones de Calcio,
aumentando en algunos casos de Mieloma. También parece existir una
interrelación recíproca entre los Niveles de Calcio y Fósforo.

52
DETERMINACIÓN DE HIERRO (WIENER)

FUNDAMENTOS DEL METODO

El Hierro sérico se libera de su unión con su proteína transportadora


específica, la Transferrina, en Buffersuccinato de pH 3.7 y en presencia de un
reductor, el Acido Mercaptoacético. Posteriormente reacciona con el reactivo
de color, Piridil Bis-Feniltriazina Sulfonato (PBTS) dando un Complejo Color
Magenta, que se mide a 560 nm.

REACTIVOS PROVISTOS

Reactivo PBTs : Solución estabilizada de Viril Bis-Fenil Triazina Sulfunato


50 m mol/1.
Standard: Solución de Iones Fe(III) equivalente a 100 mg/ di.

Buffer succinato: Solución de succinato o 25 mol/1 para pH 3.7

Reductor: Ampolla autorrompible conteniendo ácido Hercaptoacético al


70%.

REACTIVOS NO PROVISTOS

Agua Destilada

INSTRUCCIONES PARA SU USO

Reactivo PBTs: listo para usar.


Standard: Listo para usar.

53
Buffer reductor: Transferir el contenido de la ampolla del reductor al buffer
succinato, vertiéndolo directamente en el frasco de Buffer y
mezclado por inversión.

MUESTRA

. Suero

MATERIAL REQUERIDO

. Espectrofotómetro o Fotocolorímetro. .
. Micropipetas y Pipetas

PROCEDIMIENTO

En tres tubos de fotocolorímetro marcados B (blanco), S (Standard) y D


(Desconocido), colocar:

Blanco Standard Desconocido


Agua bidestilada (ml) 0.5 -- --
Standard (ml) -- 0.5 --
Suero (ml) -- -- 0.5
Buffer – reductor (ml) 2.0 2.0 2.0

- Mezclar, leer absorbancia del tubo D (Blanco de suero Bs)


en Espectrofotómetro a 560 nm o en Fotocolorímetro con filtro verde (540 -
560nm) llevando a cero el aparato con Agua Destilada.

- Agregar, manteniendo el frasco gotero en posición vertical, 1 gota de reactivo


PBTS a cada tubo. Mezclar inmediatamente y leer todos los tubos a 560 nm
entre 6 y 20 minutos, llevando el aparato a cero con Agua.

54
Cálculos:
Corregir las lecturas S y D, restándoles los Blancos correspondientes:

S — B = S corregida
D — (B + BS) = D corregida

Fe (ug/dl) = D corregida x Factor

Donde:
100 ug/dl
Factor = ------------------------------
S corregida

VALORES DE REFERENCIA:

Varones 114.6 ug/dl


Mujeres 103.3 ug/dl

INTERPRETACION

Los niveles de Hierro circulantes son relativamente bajos y dependen de


numerosas variables (Fluctuaciones Diurnas, Edad, Sexo, Hábitos Alimenticios y
Actividad Eritropoyetica. La Anemia por perdida de Hierro representa uno de los
trastornos orgánicos más frecuentes encontrados en la Clínica Medica. Ocurre con
frecuencia en Mujeres, particularmente durante el Embarazo debido a los
requerimientos del Feto.

La otra causas más común de Anemia Ferrofenica, es la pérdida de sangre a


través del Tracto Intestinal, a veces imperceptible, debida a la Hernia de Hiato,
Ulceras Gástricas ó Duodenales, y Carcinomas de Estomago y Colon.

55
Por el contrario, existen situaciones que conducen a Hiperferremia. A veces
se asocian a Terapia Transfusional, y otras veces a desordenes caracterizados por
una síntesis defectuosa de Hemoglobina o Fenómenos Hemolíticos.

RESULTADOS

Presentar los resultados de valores de Calcio y Hierro de los alumnos indicando


Sexo, Peso, Talla; IMC y Edad.

Realizar una prueba de diferencia estadística para establecer diferencias o


asociaciones (Anexo)

HIERRO
NOMBRE SEXO EDAD PESO TALLA IMC CALCIO
(ug/dl)
(mg/dl)

CUESTIONARIO:

1. Mencionar las principales causas de Deficiencia de Calcio


2. Enumerar las causas que producen un aumento de la cantidad de Calcio en
Sangre.
3. Definir la Hipocalcemia o Hipercalcemia mencionar las alteraciones que
ocasionan dichas anomalías.
4. Describir la Absorción y transporte del Calcio.
5. Enumerar las hormonas reguladoras del Calcio.
6. Cuáles son las causas de deficiencia de Hierro.

56
7. Mencionar las causas que incrementan la cantidad de Hierro en la Sangre.
8. Que es la Hiperferremia e Hipoferremia: enumerar las causas de dichas
anomalías.
9. Describir la absorción y transporte del Hierro.
10. Enumerar las hormonas reguladoras del Hierro.

57
P R AC T I C A 6
UREA

DETERMINACION ENZIMATICA DE UREA EN SUERO, PLASMA Y FLUIDOS


BIOLÓGICOS (VALTEK)

INTRODUCCION

La mayor parte del Amoniaco formado por la Desanimación de los


Aminoácidos en el Hígado es convertida en Urea y esta es excretada en la
Orina. Con excepción del Encéfalo, el Hígado es probablemente el único sitio
de formación de Urea y en las Enfermedades Hepáticas Graves del nivel de
Nitrógeno Ureico en la Sangre se abate. Las Materias Primas son dos moles
de Amoniaco y un mol de Dióxido de Carbono del Bicarbonato Plasmático. La
Síntesis a través del Ciclo de la Urea (Ciclo de Krebs-Henseleit) implica la
conversión del aminoácido Ornitina en Citrulina y luego en A rginina, después
de lo cual se regenera la Ornitina y se separa la Urea. El Dióxido de C arbono y
el Amoniaco son introducidos al ciclo por moléculas "Porta doras" cuya
formación requiere Adenosintrifosfato (ATP).

OBJETIVOS

. Determinar las concentraciones de Urea en suero plasma.


. Interpretar las diferentes alteraciones que pueden presentarse en el
dosaje de Urea.

FUNDAMENTOS DEL METODO

La, Urea presente en la muestra es desdoblada a Amoniaco por acción


de la enzima Ureasa, según la propuesta de Faucet y Scott.

58
UREASA
(NH 2 ) 2 CO + 2H 2 0 --------------------------- 2NH 3 + C0 2 + H 2 0

El Amoniaco producido reacciona con Salicilato e Hipoclorito en


ambiente alcalino, formándose un complejo de color Verde. La Intensidad del
color producido es directamente proporcional a la cantidad de Urea presente
en la muestra y su absorbancia se lee a 600 nm (580 - 620).

R E AC T I V O S

COMPOSICIÓN DE LOS REACTIVOS

- SUSPENSIÓN DE UREASA
Ureasa ------------------------------------ 50 u/ml

Estabilizantes y preservantes
No reactivo ------------------------------ 0.5
- REACTIVO SALCILATO
Ácido salicilato ----------------------- 5 Mm.
Nitro prusiato ---------------------------- 5 mM
- REACTIVO HIPOCLORITO
Hipoclorito --------------------------------- l0 mM
Na ----------------------------------------- 200 mM
- SOLUCION STANDARD
UreA ----------------------------------------- 66 mg/dl.
Equivalente Nitrógeno Ureico --------- 30 mg/dI.
Estabilizantes y preservantes
No reactivos ------------------------------ C.S.

MUESTRA

SUERO, PLASMA U ORINA DILUIDA 1:100

59
EQUIPO REQUERIDO

- Espectrofotómetro foto Colorímetro de filtros capaz de leer


absorbencias a 600 Mm. (Rango 580 a 620 Mm.).
- Pipetas
- Baño termorregulador

TECNICA.

PREPARACION DE REACTIVO DE TRABAJO

Mezclar 1 ml de Reactivo Salicilato + 1 gota (50ul) de suspensión de Ureasa.


Preparar el volumen de reactivo necesario manteniendo la proporción ( p o r ejemplo
30 ml Reactivo Salicilato + 30 gotas “1.5ml” de suspensión Ureasa).

BLANCO STANDAR DESCONOCIDO


MUESTRA(ml) ----------- ----------- 0.01
ESTÁNDAR(ml) ----------- 0.01 ------------
REACTIVO DE 1.00 1.00 1.00
TRABAJO(ml)

Incubar 10 minutos a temperatura ambiente ( sobre los 20°C) o 3


minutos a 37°.
Agregar a cada tubo.
1.

REACTIVO
HIPOCLORITO(ml) 1.00 1.00 1.00

Mezclar e incubar 10 minutos a temperatura ambiente (sobre 20°C) o 5 minutos


a 37°C. Leer las Absorbancias dentro del plazo de una Hora.

CALCULOS

60
66
FACTOR = ---------------------------------------------
ABSORBANCIA STANDAR
UREA = FACTOR X ABSORBANCIA DEL DESCONOCIDO

OBSERV ACIONES

Para expresar los valores obtenidos como Nitrógeno Ureico (mg/dl), multiplicar
el valor obtenido por 0.455

RANGOS DIE REFERENCIA

Suero o Plasma
Urea 10 a 50 mg/dl
Nitrógeno ureico 4.5 a 22.7 mg/dl
Orina
Urea 15 a 30 g/24 horas
Nitrógeno ureico 7 a 14 g/ 24 horas

INTERPRETACION

La elevación de Urea es producto de trastornos en la función Renal


o Hepática, Problemas Dietéticos, Diabetes y otros.

RESULTADOS

Presentar los resultados de valores de Urea de los alumnos indicando


Sexo, Peso, Talla, IMC y Edad.

Realizar una Prueba de Inferencia Estadistica para establecer


diferencias o asociaciones (ANEXO)

61
UREA Nitrógeno Urea
mg/dl. Ureico Nitrògeno
NOMBRE SEXO EDAD PESO TALLA IMC plasma g/24h
mg/dl orina Ureico g/24h
o suero

CUESTIONARIO
1. Definir Transaminación, Aminación y Desaminación.
2. Describir el Ciclo de la Urea.
3. Determinar las causas del incremento de la Urea en el Suero o Plasma yen
la Orina.
4. Cuándo la Función Renal es normal, el origen del aumento de Urea en la
Sangre a que causa puede deberse.
5. Definir la Uremia,
6. Cuáles son las causas de la lnsuficiencia Renal Aguda.
7. Mencionar las causas de la Insuficiencia Renal Crónica.
8. Describir el Filtrado Glomerular y la Reabsorción de la Urea en el
Glomérulo.
9. Por qué la Diabetes es causa de la elevación de Urea en la Sangre.
10. Que función cumple la Ureasa.

62
PRACTICA N° 7

ACIDO URICO

DETERMINACION ENZIMATICA DE ACIDO URICO EN SUERO, PLASMA Y


OTROS FLUIDOS BIOLOGICOS (VALTEK)

INTRODUCCION

El Acido Urico es el producto final de la degradación de las Purinas


– Adenina, Guanina e hipoxantina - procedentes del catabolismo de los Acidos
Nucleicos (DNA y RNA), por acción de las enzimas Xantinaoxidasa.

En el Organismo exsisten alrededor de 1200 mg de Acido Urico, de


los cuales son eliminados diariamente unos 700 mg. El 60% lo hace a través
de la Orina, mediante Filtrado Glomerular. Posteriormente es reabsorbido en
los Túbulos Renales del 90 % del total. El resto es eliminado con la Bilis -Vía
Hepática - y los Jugos Pancreáticos y Gástricos.

OBJETIVOS.

. Determinar las concentraciones de Ácido Úrico en Suero o Plasma.


. Interpretar las diferentes alteraciones que pueden presentarse en el Dosaje
del Ácido Urico.

FUNDAMENTOS DEL MÉTODO

El Acido Urico es Oxidado por la enzima específica Uricasa


generándose alantoina y H2O2, el cual en una reacción mediada por la enzima
PAD, reacciona con el Ac. 3-5 Dicloro-2-Hidroxi-Bencensulfonico y 4–AAP
produciéndose un compuesto coloreado con un máximo de absorción a 520
nm, en cantidad proporcional a la cantidad de Acido Urico presente en la
muestra.

63
UOD
Ácido úrico ------------------------------ Alantoina + H 2 O 2

PAD
H 2 0 2 + DHBS + 4- AAP ------------------- H 2 0 + Compuesto Coloreado

REACTIVOS

PREPARACIÓN: El reactivo se provee listo para su uso.

COMPONENTES DEL REACTIVO ENZIMATICO

Buffer Pipes PH 7.5 50 mM


Uricasa > 100 U/L
Peroxidasa > 1000 U/L
Ascorbato Oxidasa > 200 U/L
4 Aminoantipirina 0.5 mM
1.5 DMBS 1 mM
Ferrocianuro 10 mg/L
Acido Sódico 0.1 gldl
Agentes Tensioactivos C.S.

SOLUCIÓN STANDARD

Ácido Úrico en solución estabilizada: 10 mg/di

MUESTRA

Suero, plasma u orina

En el caso de Orina, precalentar la muestra a 60°C para disolver los


posibles uratos precipitados y diluir 1:10 con Agua Destilada.

64
El resultado en este caso, se multiplica por 10.

EQUIPO REQUERIDO

- Espectrofotómetro o Fotocolorímetro de filtros capaz de medir


absorbancias a 520 mm (Rango 505 – 550 mm)
- Baño Termorregulador
- Pipetas

PROCEDIMIENTOS

BLANCO STANDARD MUESTRA


MUESTRA (ml) -- 0.025
STANDARD (ml) -- 0.025 --
REACTIVO DE 1.00 1.00 1.00
TRABAJO (ml)

- Mezclar e incubar 5 minutos a 37° C a temperatura ambiente (> 20° C).


- Leer las absorbancias llevando a cero el Espectrofotómetro con el
Blanco de Reactivo.

CALCULOS

10
FACTOR = ----------------------------------------
ABSORBANCIA STANDARD

ACIDO URICO(mg/dl) = FACTOR X ABSORBANCIA MUESTRA

65
RANGO DE REFERENCIA

SUERO
Hombres: 3.4 a 7.0 mg/dl
Mujeres: 2.4 a 5.7 mg/dl

ORINA
Normal: 250 – 750 mg/24h.
Libre de purinas: < 420 mg/24h.
Pobre de purinas: < 480 mg/24h.
Rica en purinas: < 1500 mg/24h.

INTERPRETACIÓN

Valores elevados se observa en pacientes con Gota, Falla Renal,


Arterosclerosis, Diabetes, Hipotiroidismo, etc. Su disminución se encuentra
asociada a la Enfermedad de Wilson.

RESULTADOS

Presentar los resultados de valores de Acido Urico de los alumnos


indicando Sexo, Peso, Tallai, IMC y Edad.

Realizar una prueba de Inferencia Estadística para establecer


diferencias o asociaciones (ANEXO)

NOMBRE SEXO EDAD PESO TALLA IMC ACIDO ACIDO


URICO URICO
SANGRE ORINA
(mg/dl) (mg/dl)

66
CUESTIONARIO

1. Definir Acido Urico


2. Mencionar la concentración de Acido Urico en el Plasma, la Cantidad Filtrada
en el Glomérulo, lo Reabsorbido y excretado (expresado en valores Absolutos
y Porcentuales)
3. Describir el Filtrado Glomerular y la Reabsorción del Acido Urico.
4. Definir Uricosuria, Uricemia.
5. Mencionar las causas de la Hiperuricemia Metabolica.
6. Cuales son las causas de la Hiperuricemia Renal.
7. Mencione las consecuencias de padecer Hiperuricemia Renal.
8. Causas de Hiepouricemia.
9. Definir la Enfermedad de Wilson.
10. Definir la Gota.

67
HEMOGLOBINA

PRACTICA N° 8

DETERMINACION DE HEMOGLOBINA EN SANGRE TOTAL


(WIENER)

INTRODUCCION

La Hemoglobina es un Cromoproteico constituido por un grupo


Prostético (No Proteico), que recibe generalmente el nombre de Hem o Hemo
que le proporciona a la Sangre su color Rojo característico, y un grupo
Proteico llamado Globina.

La Síntesis de la Hemoglobina empieza a producirse, de una forma


apreciable, en el Eritoblasto Policromatofilo y alcanza un nivel máximo en el
Reticulocito. Alcanzando la Hemoglobina el 95% del peso seco del hematíe.

La Principal Función de la Hemoglobina consiste en transportar el


Oxígeno desde los Alvéolos Pulmonares hasta los Tejidos. Si la Hemoglobina
está cargada de Oxigeno se llama Oxihemoglobina y si está libre de él se
denomina Desoxihemoglobina o Hemoglobina Reducida; predominando la
primera en la Sangre Arterial y la segunda en la Sangre Venosa. También la
Hemoglobina contribuye al transporte del Anhídrido Carbónico o Dióxido de
Carbono desde los tejidos hasta los Alvéolos Pulmonares. Cuando la
Hemoglobina está cargada de Dióxido de Carbono se llama
Carbaminohemoglobina, y confiere a la Sangre un color algo Más Oscuro que
el Normal.

OBJETIVOS.

- Determinar las concentraciones de Hemoglobina en Sangre.

68
- Interpretar las diferentes alteraciones que pueden presentarse en el
Dosaje de Hemoglobina.

FUNDAMENTOS DEL METODO

El Hierro del Heme de la Hemoglobina, Oxihemoglobina y


Carboxihemoglobina, es Oxidado al estado Ferrico por el Ferrocíanuro, formando
Metahemoglobina. Esta se combina con el Cianuro Ionizado para formar Cianuro de
Fierro, que es medido a 540 nm.

REACTIVOS

PREPARACION

Agregar el contenido de un frasco (l0ml) a 990 ml de Agua Destilada o


Desionizada y Mezclar.

COMPONENTES DEL REACTIVO

- Ferrocianato de Potasio 61 mmol/lt


- Cianuro de Potasio 77 mmol/lt
Surfactantes C.S.

MUESTRA
Sangre Total (Citrato, EDTA u Oxalato)

EQUIPO REQUERIDO
- Espectrofotómetro
- Pipetas.

69
PROCEDIMIENTO

BLANCO STANDAR MUESTRA


SANGRE TOTAL(ml) ------- -------- 0.01
ESTÁNDAR DE ------- 0.01 ----------
HEMNOGLOBINA (ml)
REACTIVO DE 2.5 2.5 2.5
TRABAJO (ml)

- Mezclar e Incubar 5 minutos a Temperatura Ambiente (>20°C).


- Leer las absorbancias a 540 nm, llevando a cero el Espectrofotómetro con el
Blanco de Reactivo.

CÁLCULOS

HEMOGLOBINA (gr/dl) = FACTOR X ABSORBANCIA DESCONOCIDO.

CONCENTRACIÓN STANDARD (gr/dl)


FACTOR = ----------------------------------------------------------
ABSORBANCIA DEL STANDARD

VALORES DE REFERENCIA

Hombres: 12.6 a 17.5 gr/dl


Mujeres: 11.5 a 15.5 gr/dl

INTERPRETACION

Valores elevados de Hemoglobina están asociados a Hipocromia, aumento


anormal en el contenido de Hemoglobina en los Hematíes. Valores por debajo del

70
normal a anemia Hipocromica, disminución anormal del contenido de Hemoglobina en
los Eritrocitos.

RESULTADOS

Presentar los resultados de valores de Hemoglobina de los alumnos


indicando Sexo, Peso, Talla, IMC y Edad.

Realizar una Prueba de Inferencia Estadística para establecer


Diferencias o Asociaciones (ANEXO).

NOMBRE SEXO EDAD PESO TALLA IMC HEMOGLOBINA


(gr/dl)

CUESTIONARIO

1. Definir la Hemoglobina y describir su Composición Q uímica


2. Describir la Síntesis de la Hemoglobina.
3. Determinar las funciones de la Hemoglobina.
4. Que trastornos alteran los valores normales de la Hemoglobina.
5. Enumerar los tipos de hemoglobina.
6. Definir la Hemoglobina Fetal.
7. Definir la Beta Thalasemia.
71
PRACTICA N° 9

BILIRRUBINA

DETERNINACION COLORIMETRICA DE BILIRRUBINA


TOTAL Y DIRECTA EN SUERO (VALTEK)

INTRODUCCION

Luego de la destrucción de los Hematíes por los Macrófagos, la


Hemoglobina que contienen es Catabolizada según la secuencia: la Globina
es desdoblada en Aminoácidos que, en primer lugar, van a formar parte de la
reserva de Aminoácidos del Organismo, y posteriormente, son reutilizados. El
Hierro se almacena, de forma temporal, a nivel de Macrófagos, como
Ferritina, y seguidamente es captado por la Transferrina Plasmática y
transportando a la Medula Osea para su reutilización.

La Protoporfirina IX se transporta tras varios pasos sucesivos en


Bilirrubina que pasa al Plasma unido a la Albúmina y es c aptada por el
Hígado, que la conjuga con Acido Glucoronico y la elimina a través de la Bilis
hacia la Luz Intestinal, donde es Metabolizada por la Flora Bacteriana. La
Bilirrubina Indirecta o Libre y la Bilirrubina Conjugada o D irecta.

OBJETIVOS.
. Determinar las concentraciones de Bilirrubina Total y Directa en
Suero.
. Interpretar las diferentes alteraciones que pueden presentarse en el
dosaje del Bilirrubina.

72
FUNDAMENTOS DEL METODO

En Medio Acuoso solo reacciona la Bilirrubina Conjugada o Directa. Los


Glucoronidos de Bilirrubina y la Bilirrubina Directa reaccionan, formándose
Azobilirrubina que en PH Acido presenta un máximo de absorción a 530 nm.
Para medir la Bilirrubina Total es necesaria la incorporación de un Acelerador, el
Benzoato de Cafeína. La Azobilirrubina formada es medida Fotometricamente
entre 520 y 550 nm, siendo la intensidad del Color formado directamente a la
Bilirrubina Total presente en la Muestra.

REACTIVOS
COMPONENTES DE REACTIVO,

Acelerador: Solución de Benzoato de Cafeína, Tamponada y Estabilizada.


Reactivo Sulfanilico: Solución estabilizada de Acido Sulfanilico en HCl, 0.165 M.
Reactivo Nitrito de Sodio: Solución Estabilizada de Nitrito de Sodio.

MUESTRA.

Suero ó Plasma libre de Hemolisis.

EQUIPO REQUERIDO

. E s p e c t r o f o t ó m e t r o o F o t o c o l o r í m e t r o de f i l t r o s c a p a z de medir
absorbancias a 530 nm. (Rango 520 - 550 nm)
. Pipetas.

PROCEDIMIENTO
PREPARACION DIAZORREACTIVO

Agregar al momento de utilizar, por cada 1 ml de Reactivo Sulfanilico 0.05 ml ó


1 gota de reactivo Nitrito de Sodio.

73
BLANCO STANDARD BLANCO DIRECT TOTAL
STANDARD A
STANDARD (ml) 0.1 0.1 - - -
SUERO (ml) - - 0.1 0.1 0. 1
AGUA DESTILADA (ml) 1.2 - 1.2 -
1.2
ACELERADOR (ml) - 1.2 - - -1 1.2
REACTIVO
SULFANILÍCO (ml) 0.1 - 0.1 - -
D1AZORRACTIVO (ml) - 0.1 - 0.1 0.1

. Mezclar e incubar por 5 minutos a Temperatura ambiente.


- Leer las absorbancias a 530 nm llevando el
espectrofotómetro a cero con agua destilada.

NOTA: La Bilirrubina Directa debe Leerse exactamente a los 2 minutos.

CALCULOS

CONCENTRACIÓN STANDARD
FACTOR = ------------------------------------------------------------------------------------
ABSORBANCIA STANDARD - ABSORBANCIA BLANCO STANDARD

BILIRRUBINA DIRECTA (mg/dl) = FACTOR x (DIRECTA - BLANCO)


BILIRRUBINA TOTAL (mg/dl) = FACTOR x (TOTAL - BLANCO)

RANGOS BE REFERENCIA,

BILIRRUBINA TOTAL 0.1 a 1.2 mg/dl


BILIRRUBINA DIRECTA 0.0 a 0.3 mg/dl

74
INTERPRETACION.

Un Incremento de la Bilirrubina Total es producto de una Obstrucción en la Vía


Biliar, Hepatitis, Cirrosis, Enfermedad Hemolítica y algunas deficiencias enzimáticas
Hereditarias. La Bilirrubina Indirecta o Libre, se encuentra elevada por causas Pre-
hepáticas, tales como Enfermedades Hemolíticos, o bien problemas Metabólicos
Intra-hepáticos que involucran el proceso de cCnjugación. En Neonatos, es
importante el Control de la Bilirrubina, ya que la Bilirrubina Indirecta o Libre es
Neurotoxica.

RESULTADOS

Presentar los resultados de valores de Bilirrubina de los alumnos indicando


Sexo, Peso, Talla, ÍMC y Edad.
Realizar una Prueba de Inferencia Estadística para establecer diferencias o
asociaciones (ANEXO).

NOMBRE SEXO EDAD PESO TALLA IMC BILIRRUBINA BILIRRUBINA


TOTAL DIRECTA
(mg/dl) (mg/dl)

CUESTIONARIO

1. Describir el Catabolismo de la Hemoglobina.


2. Definir Bilirrubina Total, Bilirrubina Indirecta y Bilirrubina Directa.

75
3. Numerar las causas que incrementan la Bilirrubina Total,
D i r e c t a , Indirecta.
4. Definir la Urobilinemia.
5. Defina la Urobilina, Urobilinogeno, Estercobilina.
6. Definir el Kernicterus.
7. Cual es la función del Acido Glucoronido.

76
PRACTICA 10

CREATININA

DETERMINACION DE CREATININA EN SUERO, PLASMA Y ORINA (VALTEK)

INTRODUCCIÓN

La Creatinina es un producto final del Metabolismo Muscular. Es un Anhídrido


de la Creatina que se forma mediante una reacción espontánea e irreversible y su
formación tiene una reacción directa con la Masa Muscular.

Cuando esta libre, no se utiliza en el Metabolismo del Cuerpo y, por tanto


funciona únicamente como producto de excreción de la Creatina como de la
Fosfocreatina.

Tras pasar a la Sangre, se elimina en su mayoría vía a Renal mediante


Filtración Glomerular y solo una pequeña cantidad

Su Nivel Plasmático es bastante constante, de manera que no se modifica ni


con el ejercicios ni con las variaciones del Catabolisismo. Además, es mucho
menos dependiente del aporte dietético que la Urea (la cantidad de Creatinina
ingerida con la Dieta Exógena es insignificante).

La Producción Endógena, de Creatinina se mantendrá constante, tanto


Tiempo como la Masa Muscular se mantenga constante.

OBJETIVOS.
. Determinar las concentraciones de Creatinina en Suero o Plasma.

. Interpretar las diferentes alteraciones que pueden presentarse en el Dosaje de


Creatinina en Suero y Plasma.

77
FUNDAMENTO DEL MÉTODO

La Creatinina, en presencia de Picrato Alcalino produce un Color Anaranjado


(Reacción de Joffe) que se mide a 505 nm en cantidad proporcional a su
concentración en la muestra.

REACTIVOS

. Buffer Alcalino: 50 ml de Buffer Alcalino


. Ac. Picrico: 250 ml de Acido Pícrico saturado
. Solución Standard: Solución de Creatinina estandarizada y estabilizada.

MUESTRA

De preferencia utilizar Suero Libre de Hemolisis o Plasma Heparinizado,

EQUIPO REQUERIDO

. Espectrofotometro o Fotocolorímetro de filtros capaza de leer a 505 nm (Rango


490 - 520 nm)
. Pipetas

TÉCNICA PARA SUERO

Desproteinización: A 0.30 ml de Suero agregar 1.50 ml de Reactivo Picrico,

mezclar vigorosamente, dejar reposar 10 minutos y

centrifugar a 3000 R.P.M. por a lo menos 5 minutos.

78
Colorimetría

BLANCO STANDARD DESCONOCIDO

DESPROTEINIZADO (ml) --- --- 1.20

STANDARD (ml) --- 0.20 ---

AGUA (ml) 0.40 0.20 ---

R. PÍCRICO (ml) 0.80 0.80 ---

BUFFER ALCALINO (ml) 0.20 0.20 0.20

- Mezclar e Incubar 20 minutos a Temperatura Ambiente (20° a 25° C).


- Leer las absorbancias a 505 nm (rango 490 - 520 nm) llevando a Cero el
Instrumento con el Blanco Reactivo.

TECNICA PARA ORINA


Diluir la Orina 1:10 con Agua Destilada

BLANCO STANDARD DESCONOCIDO

ORINA DILUIDA (ml) --- --- 0. 20

STANDARD (ml) --- 0.20 ---

AGUA (ml) 0.40 0.20 0.40

R. PÍCRICO (ml) 0.80 0.80 0.30

BUFFER ALCALINO (ml) 0.20 0.20 0.20

. Mezclar e incubar 20 minutos a temperatura ambiente (20° a 25°C)


. Leer las absorbancias a 505 nm (rango 490 – 520 nm) llevando a cero el
Instrumento con el Blanco Reactivo.

79
CALCULOS
ABORBANCIA MUESTRA
CREATININA EN SUERO (mg/l) = ----------------------------------------- X 1.50
ABSORBANCIA STANDARD

ABSORBANCIA MUESTRA
CREATININA EN ORINA (mg/dl) = -------------------------------------------- X 1.50
ABSORBANCIA STANDARD

CREATININA ORINA (mg/24h) = CRIATININA ORINA (mg/dl) X VOL.24 h/l) X 10

CÁLCULO DEL CLEARENCE DE CREATININA

CREATININA ORINA(mg/dl) X V. ORINA 24h(ml)


CLEARENCE (ml/min) = ------------------------------------------------------------------------
CREATININA EN SUERO (mg/dl) X 1440

RANGOS DE REFERENCIA

SUERO ORINA
HOMBRES 0.7 - 1.4 mg/dl 1.3 - 2.6 g/24h
MUJERES 0.6 - 1.2 mg/dl 0.9 - 1.8 g/24h
CLEARENCE: 80 - 160 ml/min

INTERPRETACION
La medición de la Creatinina es útil en el diagnóstico de diversas
Nefropatías y su control permanente es de gran utilidad en aq uellos pacientes
que requieren Diálisis.

80
RESULTADOS

Presentar los resultados de valores de Creatinina de los alumnos


indicando Sexo, Peso, Talla, IMC y Edad.
Realizar una Prueba de Inferencia Estadística para establecer
diferencias o asociaciones (ANEXOS).

NOMBRE SEX EDAD PESO TALL IMC CREATI. CREATI. CREATI. CLEARENCE
SUERO ORINA ORINA (ml/min.
mg/dl) (mg/dl) (mg/24h)

CUESTIONARIO

1. Definir creatinina y describir su composición química.


2. Describir la secuencia de formación de la creatinina.
3. Qué enfermedades alteran los valores normales de la Hemoglobina.
4. Definir la creatinuria.
5. Porque la diabetes mellitus mal controlada incrementa los valores de Creatinina.
6. Es normal valores elevados de Creatinina en Fisiculturistas?.

81
PRACTICA N° 11

TRANSAMINASAS

DETERMINACION DE TRANSAMINASA GLUTAMICO OXALACETICA(TGO) Y


TRANSAMINASA GLUTAMICO PIRUVICA(TGP)

INTRODUCCION

Las Transaminasas son enzimas que participan tanto en el


Anabolismo c o m o e l Catabolismo del Nitrógeno. Se conoce de dos Enzimas,
l a Transaminasa Glutámico Oxalacetica (GOT) y la Transaminasa Glutamico
Piruvica (GPT), presentes en el interior de diversas células; en especial en las
Células Hepáticas, aunque también se encuentran en las Células Musculares.
La cuales escapan en grandes cantidades desde tejidos Muertos o Moribundos
y entran al Torrente Sanguíneo, siendo importante su presencia en muestras
de Sangre para propósitos Médicos Diagnósticos.

OBJETIVOS.
. Determinar las concentraciones de Transaminasasa.
. Interpretar las diferentes alteraciones que pueden presentarse en el
Dosaje del Perfil Hepático.

FUNDAMENTOS DEL METODO

La determinación de la Transaminasa Glutámico Oxalacetica (TGO) se


basa en la siguiente reacción:

TGO
L-Aspartato + Glutamato ------------- Oxalacetato + Glutamato

82
La determinación de la Transaminasa Glumatico Piruvica (TGP ) se
basa en la siguiente reacción:

L-Alanina + A. cetoglutarato --------------- Piruvato + Glutamato

El Piruvato u Oxalacetato formado reacciona con el 2,4-


Dinitrofenilhidrazina, generando en medio Alcalino una Hidrazona c oloreada
que absorbe a 505 nm.

REACTIVOS

COMPONENTES DEL REACTIVO

. SUSTRATO GPT
. BUFER FOSFATO PH 7,4 100 mM
. L-ALANINA 1000 Mm
. Z-OXOGLUTARATO 2 Mm

. SUSTRATO GOT
. BUFER FOSFATO PH 7.4 100 mM
. L-ASPARTATO 1000 mM
. Z-OXOGLUTARATO 2 mM

. REACTIVO COLOR
. 2.4–DINITROFENILHIDRAZINA 1 mM
. HCL 1 mM

. STÁNDAR
. PIRUVATO 2 Mm

83
MUESTRA

. Suero libre de Hemolisis

EQUIPO REQUERIDO
. Espectrofotómetro capaz de leer a 505 nm
(rango 500-550 nm)
. Baño termorregulador
. Pipetas

CURVA DE CALIBRACION

TUBO 1 2 3 4 5
AGUA DESTILADA (ml) 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2
STANDARD (ml) - 0.1 0.2 0.3 0.4
SUSTRATO GOT/GTP (ml) 1.0 0.9 0.8 0.7 0.6
REACTIVO COLOR (ml) 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0

Mezclar e Incubar 20 minutos a Temperatura Ambiente (sobre 20°C)

NaOH 0.4 N (ml) 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0

Mezclar, esperar 5 minutos y leer absorbancias a 505 nm (rango 500-550 nm)


contra Blanco Reactivo (tubo 1).

Graficar en papel milimetrado las unidades de Transaminasa en las Absisas


(eje X ), y las absorbancias en las ordenadas (eje Y).

TGO U/L 0 22 55 95 150 215


TGP U/L 0 25 50 83 126 ------

84
ENSAYO

BLANCO TGO TGP


SUSTRATO TGO (ml) 0.5 0.5 -
SUSTRATO TGP (ml) - - 0.5

Incubar por 3 minutos a 37°C


AGUA DESTILADA (ml) 0.1 - -
MUESTRA (ml) - 0.2 0.1

Incubar por 30 minutos a 37°C

REACTIVO COLOR (ml) 0.5 0.5 0.5

Incubar por 20 minutos a temperatura ambiente (sobre 20°C)


NaOH O.4 N (ml) 5.0 5.0 5.0

Mezclar por inversión y leer las absorbancias a 505 nm (500-550 nm) contra el
Blanco Reactivo. El Color resultante es estable 30 minutos.

CALCULOS

Determinar la actividad de las Transaminasas por interpolación de las


absorbancias obtenidas en la Curva de Calibración

VALORES DE REFERENCIA

TGO (37°C) 5 - 40 U/L


TGP(37°C) 5 - 45 U/L

85
INTERPRETACION

El aumento de las Transaminasas se asocia a Enfermedades que afectan


Tejidos, tales como Hepatitis, Cirrosis, Infarto de Miocardio.

RESULTADOS.

Presentar los resultados de valores de TGO y TGP de los alumnos, indicando


Sexo, Peso, Talla, ÍMC y Edad.
Realizar una prueba de Inferencia Estadística para establecer diferencias o
asociaciones (ANEXO).

NOMBRE SEXO EDAD PESO TALLA IMC TGO TGP


(U/L) (U/L)

CUESTIONARIO

1. Definir Transaminasas.
2. Enumerar las transamínasa conocidas y determinar su localización.
3. Numerar los trastornos que alteran los valores normales de las Transaminasas
TGO y TGP.
4. Describir el anabolismo y catabolismo del nitrógeno por las transaminasas.
5. Definir embolia pulmonar e infarto pulmonar.
6. Indicar la proporción entre TGO y TGP.

86
87
PRACTICA N° 12

FOSFATASA ALCALINA

D E T E R M I N AC I O N C O L O R I M É T R I C A D E L A E N Z I M A
FOSFATASA ALCALINA EN SUERO O PLASMA (VALTEK)

La Fosfatasa Alcalina es una enzima que utiliza la escisión del


Ortrofosfato a partir de los Monoesteres Fosfórico en condiciones
Alcalinas. Se encuentra concentrada en el Hígado, Huesos, Placenta,
Intestino y algunos Tumores. En los Niños y durante el E mbarazo se
encuentran en concentraciones más altas debido al crecimiento rápido del
Hueso, ya que es producida por las Células Formadoras de Hueso
llamadas Osteoblastos.

OBJETIVOS.
. Determinar las concentraciones de Fosfatasa Alcalina.
. Interpretar las diferentes alteraciones que pueden presentarse en el
Dosaje de Fosfatasa Alcalina.

FUNDAMENTOS DEL METODO

La Fosfata Alcalina actúa sobre el HMP-Benzofuranona Fosfato en


Medio Taponado Alcalino. Posteriormente al agregar el Reactivo
Revelador, se obtienen un Cromógeno Azul en forma proporcional a la
concentración de enzima en la muestra

PAL
MHPBF-FOSFATO ------------- HNP-BENZOFURANONA FOSFATO

MHPBF + REVELADOR ------------ COMPUESTO COLOREADO

88
REACTIVOS

El Reactivo Revelador se proporciona concentrando. Debe diluirse con


Agua Desionizada, completando el volumen indicando en la etiqueta del
frasco.

COMPOSICIÓN DE LOS REACTIVOS

BUFFER – SUTRATO

. BUFFER AMP PH 10.2 (37°C) 300 m M


. HNPBF - FOSFATO 36 MM
. IONES MAGNESIO 10 mM
. TENSIOACTIVOS Y PRESERVANTES C.S.
ESTABILIZADORES Y ACTIVADORES
NO REACTIVOS C.S.

REACTIVO REVELADOR

. HIDRÓXIDO DE SODIO 10 mM
. CARBONATO DE SODIO 20mM
. SULFATO DE SODIO 100 mM

SOLUCIÓN STANDARD

. HMPBF EQUIVALENTE A 100 Ul/L DE FOSFATO ALCALINO


. .ESTABILIZANTES Y PRESERVANTES C.S.

89
MUESTRA

Suero libre de Hemolisis ó Plasma Heparinizado

No utiliza Plasma obtenido con Oxalato, Fluoruro ó Citrato ya que


interfieren con el Ensayo

EQUIPO REQUERIDO

. Espectrofotómetro capas de lee a 590 nm (Rango 570 - 600 nm)


. Baño termorregulador
. Pipetas

PROCEDIMIENTO

BLANCO STANDARD MUESTRA


BUFFER – SUSTRATO (ml) 0.50 0.50 0.50

PREINCUBAR 3 MINUTOS A 37°C

AGUA DESTILADA (ml) 0.05 -- --


SOLUCION STANDARD (ml) -- 0-05 --
MUESTRAS (ml) -- -- 0.05

MEZCLAR E INCUBAR EXACTAMENTE 10 MINUTOS A 37 °C

REACTIVO REVELADOR (ml) 2.50 2.50 2.50

Mezclar y Leer las absorbancias a 590 nm (rango 570 - 600 nm), llevando el
Espectrofotómetro a Cero con el Blanco Reactivo

90
CÁLCULOS

FOSFATASA ALCALINA (UI/L) = FACTOR X ABSORBANCIA MUESTRA

100
FACTOR = ----------------------------------------
ABSORBANCIA STANDARD

RANGOS DE REFERENCIA
30 a 125 U/L a 37°C
NOTA: Los valores normales en los Adolescentes pueden triplicar los
observados para los Adultos

INTERPRETACIÓN

La Fosfatasa Alcalina se encuentra aumentada en Sangre en


Enfermedades tales como Alteraciones Oseas, Alteraciones Hepáticas
(Cirrosis Hepática, Metástasis Hepáticas) Carcinoma de Vesícula B iliar.

RESULTADOS

Presentar los resultados de valores de Fosfatasa Alcalina de los


Alumnos indicando Sexo, Peso, Talla, IMC y Edad.

Realizar una prueba de Inferencia Estadística para establecer


diferencias ó asociaciones (ANEXO).

NOMBRE SEXO EDAD PESO TALLA IMC FOSFATASA


ALCALINA (UI/L)

91
CUESTIONARIO
1. Definir la Fosfatasa Alcalina
2. Enumerar las Fosfatasas Alcalinas conocidas
3. Qué factores alteran los valores de Fosfatasas Alcalina
4. Definir Colestasis, Metástasis Hepática y Carcinoma de Vesícula Biliar.
5. Porque las personas que sufren de Hipotiroidismo presentan
niveles bajos de Fosfatasa Alcalina en Sangre

92
PRACTICA N° 13

SANGRE I

INTRODUCCIÓN

La Sangre está compuesta por un líquido acuoso transparente que


contiene Proteínas e Iones, el Plasma, y varios tipos de Células (Glóbulos
Rojos y Glóbulos Blancos) y Fragmentos Celulares denominados P laquetas
suspendidas en él. Las Células mas abundantes son los Glóbulo s Rojos o
Eritrocitos, que le confieren a la Sangre su color característico.

La Sangre impulsada por el Corazón circula por todo el O rganismo y


realiza diferentes funciones: trasportar Dióxido de Carbono, Sustancias
Nutritivas, Sustancias de Desecho y Hormonas; intervienen en los
Mecanismos de Termorregulación al transportar Calor del Interior del Cuerpo
a la Piel; realizan Funciones Defensivas, entre ellas la destrucción de Agentes
Patógenos, la Resistencia a la Infección por determinados M icroorganismos y
por su capacidad de Coagularse evita la pérdida en exceso de Sangre cuando
se lesionan los Vasos Sanguíneos. La tendencia de la Sangre a la
Coagulación, hace indispensable el uso de Anticoagulantes cuando se quiere
conservar durante cierto Tiempo.

OBJETIVOS.

. Determinar el Volumen de Masa Eritrocitaria en la Muestra Total de


Sangre.
. Interpretar las diferentes alteraciones que pueden presentarse en la
Sangre

MATERIAL.

. Muestra de Sangre: Capilar o Venosa.

93
. Tubos Capilares, los Heparinizados para Sangre Capilar o S in
Anticoagulante, y los No Henarinizados para Muestras con
Anticoagulante
. Plastilina.
. Microcentrifuga.
. Abaco deLlectura para Microhematocrito

DETERMINACION DEL HEMATOCRITO

Viene a ser la determinación del Volumen de Masa Eritrocitaria expresada en


Porcentaje, de acuerdo al Volumen de Sangre Total que existe en una Muestra.

TECNICA DEL MICROHEMATOCRITO

FUNDAMENTO

La determinación del Microhematocrito se fundamenta en el uso de Tubos


Capilares de 7 cm. de largo por 1 mm de diámetro interior, los cuales pueden ser
Heparinizados o no Heparinizados de acuerdo a la muetras que se vaya a utilizar
(Sangre con Anticoagulante o Sangre sin Anticoagulane). Esta Técnica es Rápida y
consiste en separar los Eritrocitos del Plasma por Centrifugación, obteniendo
Hematíes Aglomerados, los cuales son medidos en Microescalas o con una Regla
Milimetrada.

PROCEDIMIENTO

. Llenar el Tubo Capilar (Heparinizado o no) con la muestra de Sangre (Capilar


o Venosa) hasta las 3/4 partes de la extensión total del capilar, y el llenado se
hará por capilaridad.

. Una vez lleno el Capilar, sellar uno de los extremos con plastilina, esto con la
finalidad de que al momento de la entrifugación no salga la sangre por
cualquiera de los extremos.

94
. Colocar el Capilar en una Microcentrífuga a una Velocidad de 10,000 r.p.m.
por 5 minutos o a 5,000 r.p.m. por 10 minutos.

LECTURA

Se coloca el Capilar Centrifugado sobre la Escala para Microhernatocrito que


acompaña a la Microcentrífuga, haciendo que la base de la Columna de Eritrocitos
(sobre el límite superior de la Plastilina) coincida con la línea inferior de la Cartilla, y
de manera similar que el tope de la Columna de Plasma coincida con la Línea
Superio; es decir que el Fondo de la Columna de Eritrocitos y el Tope Superior de la
Columna de Plasma coincida al mismo tiempo con lasLlíneas Inferior y Superior de la
Cartilla. La Lectura entonces se realiza tomando como Valor de el Tope Superior de la
Columna de Eritrocitos.

VALORES NORMALES:

Varones: 40 - 50 % (en Altura 45 - 53% )


Mujeres: 38 - 42 % (en Altura 42 - 50% )

INTERPRETACION

La prueba del Hematocrito constituye una Prueba Simple para el diagnóstico de


Anemi; es mucho más util y de confianza que el Recuento de Eritrocitos.

En General, el Valor del Hematocrito baja en caso de


Hemodilución (Hidremia Fisiológica del Embarazo), en todos los casos
o tipos de Anemias Hemorragicas, etc. Al contrario, la Hemoconcentración a
consecuencia de shock con cifras normales o elevadas aparentemente patológicas.

95
VELOCIDAD DE SEDIMENTACION GLOBULAR

Se define como el Descenso de los Elementos Formes de la Sangre en el


Tiempo de 1 a 2 horas. En la sangre a la que se le ha agregado un
Anticuaguante, los Eritrocitos sedimentan hasta formar una columna
compacta en la parte inferior del Tubo o Recipiente al ser colocado en Posición
Vertical.

La velocidad de Sedimentación Globular depende de la concentración de


Fibrinógeno en el Plasma, de la formación de "Rouleaux" (Aglomeración de
Eritrocitos, debido a la diferencia que existe entre la Densidad del Plasma y la masa
de Eritrocitos) y de la concentración de Globulinas Alfa y Beta en el plasma

METODO DE WESTERGREEN

FUNDAMENTO

Se basa en el uso del Tubo Pipeta de Westergreen, que es una P i p e t a d e


Vidrio de 2 mm. de diámetro por 30 cm. de longitud, que viene
calibrada de 0 a 2 0 0 m m de arriba hacia a b a j o . P a r a ello se utiliza Sangre c o n
Anticoagulante.

MATERIALES

. Pipeta de Westergreen
. Gradilla para tubos de Westerween.
. Plastilina.
. Sangre Venosa con Anticoagulante.
. Cronómetro.

96
PROCEDIMIENTO

. Aspirar con la Pipeta de Westergreen la muestra de Sangre hasta la


marca de Cero (0).
. Cerrar el extremo inferior con Plastilina y colocar en posición Vertical
durante 1 y 2 Horas respectivamente; tiempos en los que se
realizarán las lecturas respectivas.

ANÁLISIS

Pasada la primera Hora, Leer de inmediato la cantidad de mm.


(mililitros) que ha descendido en el Tubo de Eritrocitos. Es decir se mide la
columna de plasma por encima del nivel de los eritrocitos sedimentados. Se
realiza el mismo procedimiento a las dos horas.

VALORES NORMALES

Varones: De 1 a 10 mm. en 1 hora.


Hasta 15 mm. en 2 horas.
Mujeres: de 5 a 12mm. en 1 hora.
De 12 a 20 mm. en 2 horas.

INTERPRETACION

Las Variaciones de los valores de Velocidad de Sedimentación G lobular


indican, mas que un transtorno funcional, una lesión orgánica. La
Sedimentación Globular se encuentra aumentada en el Embarazo,
Menstruación, Reumatismo Articular, Neumonía, Gripe, Angina, Infarto al
Miocardio, Neoplasia y en la Artritis Reumatoide. En el Periodo Agudo de la
Fiebre Reumática; en la Tuberculosis Pulmonar en donde adquiere Valor
Pronóstico, por estar relacionada con la Velocidad de Sedimentación, que
seFfrena oAacelera según los periodos de Actividad E volutiva.

97
La V.S.G. esta Disminuida en la Poliglobulia del Recién Nacido, en la
Poliglobulia del Adulto, en nfermedades del Corazón con Estasis Circulatoria y
en la Tos Ferina.

RECUENTO DE ERITROCITOS. METODO DE THOMA.

Viene a ser la determinación del Número de Eritrocitos por Milímetro Cúbico

FUNDAMENTO

Se fundamenta en el uso de la Pipeta de Thoma para Glóbulos Rojos, la


cual viene Calibrada para diluir la muestra de Sangre en dilución de 1 en 200 o 1
en 20, para ello se utiliza con mayor frecuencia como solución diluyente la
solución Hayen que tiene la propiedad de Lisar a los Leucocitos. Permitiendo una
mayor visibilidad de los Eritrocitos.

MATERIALES E INSTRUMENTOS

. Solución Hayen
. Pipetas de Thoma para glóbulos rojos, con su respectiva sonda de absorción.
. Cámara de Neubawer, con su respectivo cubre cámara.
. Microscopio. Rotor para pipetas. Contador manual.

PROCEDIMIENTO

. Obtener Sangre por Punción Digital hasta la marca de 0.5 en la Pipeta para
dilución de Eritrocitos (Cuenta Roja, Bulbo Mayor, 101 en el Extremo
Superior).
. Aspirar el líquido para dilución de Eritrocitos (Solución Hayem) hasta la marca
de 101. Se gira la punta sobre su eje longitudinal para asegurar una Mezcla
Total entre la Sangre y el Diluyente.
. Luego, descartar tres o cuatro primeras gotas de Sangre Diluida y con

98
cuidado llenar la cámara de Neubawer por capilaridad colocando la punta de
la pipeta en uno de los extremos del Cubreobjetos.
. Contar las células que se encuentren en 5 cuadrados pequeños de la
parte central de la cuadricula en la cámara de Newbawer
. Para calcular el número total de eritrocitos se aplica:

NRO TOTAL DE CÉLULAS CONTADAS EN 5 CUADRADOS


N° ERITROCITOS = -----------------------------------------------------------------------------------
ÁREA CONTADA X ALTURA DE CÁMARA X DILUCIÓN

CÉLULAS CONTADAS
= ------------------------------------------
1/5 X 1/10 X 1/200

= CELULAS CONTADAS X 10000

VALORES NORMALES
Neonatos de término, sangre del 4,0-5,6 x 10 6 /ul
Niños de 1 año 4,5 x 10 6 /ul
Niños de 10 años 4,7 x 10 6 /ul
Hombres 4,5-6,5 x 10 6 /ul
Mujeres 4,0 -5,6 x 10 6 /ul

INTERPRETACION

El aumento del recuento Eritrocitario se denomina Policitemia. La


Policitemia puede ser secundarla (Eritrocitosis) o primaria (Eritremia,
Policitennia Vera). La Policitemia Secundaria se debe a varios factores que no
cambian la Masa Hemática, por ejemplo Deshidratación o Anoxia. Una forma
Fisiológica de Eritrocitos se presenta en el Recién Nacido. La Policitemia Vera

99
es poco frecuente, la Pancitosis Idiopática da lugar a un progresivo aumento
de la Masa de Hematíes.

La disminución provoca Anemia. La anemia también puede ser


Primaria o Secundaria. La Secundaria se presenta después de una dilución de
la Sangre por un aumento del Volumen del Plasma, como es el caso en las
Embarazadas, mientras que la Anemia Primaria se debe a una disminución de
la Masa de Hematíes.

VOLÚMENES CORPUSCULARES

VOLUMEN CORPUSCULAR MEDIO (VCM)

Permite calcular el Volumen Promedio de los Hematíes. Se aplica la


siguiente Fórmula:

HEMATOCRITO(%) X 10
VCM (FL) = --------------------------------------------------------- ---------------
RECUENTO ERITROCITARIO (en millones por ul)

Es el más utilizado, es el criterio sobre el que se basa la moderna


clasificación morfológica de las Anemias. Así, de acuerdo con el valor del VCM
una Anemia puede clasificarse en tres grandes grupos: Normocítica (VCM:82 -
98 fl), Macrocitica (VCM mayor que 95 fl) y Microcítica (VCM menor que 80 fl).

VALORES NORMALES: entre 80 - 95 fl

HEMOGLOBINA CORPUSCULAR MEDIO (HCM)


Permite determinar la Cantidad de Hemoglobina contenida en cada
Hematíe. Se calcula mediante la siguiente Fórmula:

100
HEMOGLOBINA (g/dl) X 10
HCM(pg) = ---------------------------------------------------------------------
RECUENTO ERITROCITARIO( en millones por ul)

Guarda estrecha relación con el Volumen Corpuscular Medio. En


consecuencia, las Anemias se acompañan siempre de una disminución de la
HCM lo que corresponde al criterio morfológico de Hipocromia, y las Anemias
Macrociticas de un aumento de la HCM.

VALORES NORMALES: entre 30 - 34 pg.

CONCENTRACION CORPUSCULAR MEDIA DE HEMOGLOBINA (CCMH)

Expresa la Concentración Porcentual de Hemoglobina en cada H ematíe.

HEMOGLOBINA(g/dl) X 100
CCMH (%) = ---------------------------------------------
HEMATOCRITO(%)

Es siempre el resultado de un cálculo matemático realizado a partir del


VCM y de la HCM, por lo que sus variaciones suelen ser muy pequeñas,
incluso en presencia de una acusada hipocromia. Por ello a excepción de
ciertas Enfermedades que presentan aumentos característicos de la CCHM
(Esferocitosis Hereditaria), la utilidad práctica de este parámetro resulta muy
escasa.

VALORES NORMALES: entre 32 - 34 %.

101
RESULTADOS

NOMBRE EDAD PESO TALLA HT VSG RE VCM HCM CCMH

CUESTIONARIO

1. Establezca diferencias entre Hematocrito entre Hombres y M ujeres.


2. Mencione causas.de aumento de Hematocrito.
3. Mencione causas de disminución de Hematocrito.
4. Patologías asociadas a aumento de Velocidad de Sedimentación Globular.
5. Mencione factores que provocan Aumento o Disminución del Recuento de
Eritrocitos.
6. Diferencias entre Recuento de Eritrocitos respecto al S exo.
7. Componentes de la solución diluyente de eritrocitos.
8. Mencione 3 Hormonas que umentan,el Recuento de Eritrocitos.

102
PRACTICA N° 14

SANGRE II

OBJETIVOS.

. Determinar el volumen Leucocitario de la muestra total de Sangre.


. Interpretar las diferentes alteraciones que pueden presentarse en
el volunten leucocitario.

RECUENTO DE LEUCOCITOS. METODO DE THOMA.

Viene a ser la determinación del número de Leucocitos por mililitro o


litro de Sangre.

FUNDAMENTO
Se fundamenta en el uso de la pipeta de Thoma para Glóbulos Blancos,
la cual viene calibrada para diluir la muestra de Sangre en dilución de 1 en 20
o 1 en 10, para ello se utiliza con mayor frecuencia como solución diluyente la
solución Turk que tiene la propiedad de lisar a los eritrocitos. Permitiendo una
mayor visibilidad de los Leucocitos (al teñir sus Núcleos).

MATERIALES E INSTRUMENTOS

. Solución Turk (Acido Acético al 3%, luego 3 gotas de A zul de


Metileno o Violeta de Genciana)
. Pipetas de Thoma para Glóbulos Blancos, con su respectiva S onda
de Absorción.
. Cámara de Neubawer, con su respectivo Cubrecámara.
. Microscopio.
. Rotor para Pipetas.
. Contador Manual.

103
PROCEDIMIENTO

. Aspirar la Sangre hasta la marca de 0.5 o 1 según la dilución (1:20 o


1:10). Limpiar la punta de la pipeta y las paredes externas de la
misma para eliminar el exceso de Sangre.
. Completar con el diluyente (solución Turk) hasta la marca de 11.
Colocar la pipeta en posición horizontal en el Rotor por 2 o 3
minutos (hasta que el contenido este homogeneizado y se hayan
lisado los Eritrocitos).
. Cargar la cámara de Neubawer previamente preparada,
desechando antes 3 o 4 gotas del tallo de la pipeta.
. Dejar en reposo de 3 a 5 minutos, para que los Leucocitos se
depositen en el retículo de la cámara.
. Efectuar el recuento de Leucocitos con objetivo de 10X.

RESULTADOS.

Los resultados se dan contando el número de Leucocitos en las 4


cuadriculas grandes y extremas de la Cámara y multiplicando la suma total
por 50 (dilución 120).

NOTA: Si el recuento está bien hecho, las variaciones entre el número


de Leucocitos en dos cuadrados no son mayores de 8.

La multiplicación del número de Leucocitos contados por 50 se explica


con el cálculo siguiente:

G.B. CONTADOS EN LOS 4 CUADRADOS GRANDES


N° G.B./ml = ------------------------------------------------------------------------------
AREA CONTADA X H X DILUCIÓN DE SANGRE

104
G.B CONTADOS
= -------------------------------------
4 X 1/10 X 1120

= G.B. CONTADOS X 50

DONDE H = ALTURA DE LA CÁMARA

VALORES NORMALES

ADULTOS: 5,000 - 10,000 / ul


NIÑOS: 6,000 - 15,000 / ul
RECIÉN NACIDOS: 10,000 - 20,000 /ul

INTERPRETACION

La disminución de las cifras normales de Leucocitos se denomina


Leucopenia y se presenta en algunas enfermedades infecciosas, como ocurre
en la Angina Granulocitopenia Idiopática, también algunos casos de Anemia
Perniciosa, Clorosis, Fiebres Tifoideas y en la Brucelosis, Mala Nutrición, etc.

El aumento se denomina Leucocitosis, que se debe a la Quimiotaxis y


al estímulo de los Organos Hematopoyéticos. Generalmente se da el aumento
en procesos Infecciosos Agudos.

También se sabe que la Vasodilatación provoca Leucocitosis y la


Vasoconstricción Leucopenia

105
FORMULA DIFERENCIAL DE LEUCOCITOS: HEMOGRAMA DE SHILLING.

El recuento o formula de Leucocitos consiste en diferenciar y valorar


las proporciones relativas (por 100) de los diferentes tipos de Leucocitos que
se observan en un Frotis de Sangre periférica coloreada.

Esta diferenciación se da en base a.

- GRANULOCITOS POLIMORFONUCLEARES:
. NEUTROFILOS
. ABASTONADOS.
. SEGMTENTADOS.
. EOSINÓFILOS.
. BASÓFILOS.

- AGRANULOCITOS MONONUCLEARES
. MONOCÍTOS.
. LINFOCITOS.

FORMULA DIFERENCIAL EN LAMINA (Frontis sanguíneo)

FUNDAMENTO

Se fundamenta en la coloración de un frotis sanguíneo con colorante de


Wright, en el cual se realizar la diferenciación o recuento microscópico de
los diferentes tipos de Leucocitos, expresando los valores obtenidos en
porcentajes.

MATERIAL EQUIPO E INSTRUMENTOS

. Frotis sanguíneo coloreado


. Aceite de inmersión.

106
. Microscopio.
. Contador de células.

PROCEDIMIENTO

Para el recuento diferencial utilizamos el objetivo de inmersión (100X).

. Colocar 1 gota de Aceite de Inmersión en el límite de las 2/3


partes del Frotís de la lámina (cercana a la cola del Frotís).
. Enfocar la Imagen al Microscopio y buscar una zona en la que los
elementos formes de la Sangre se puedan diferenciar, es decir, en
donde no estén aglomerados unos sobre otros.
. Ya ubicada la zona llevar el extremo de la Lámina al Objetivo del
Microscopio y hacer un recorrido vertical de este extremo de la
lámina al otro, contando los diferentes tipos de Leucocitos que se
observan, hasta llegar contar los 100 Elementos.
. Luego proceder a informar el número de estos en porcentajes.
. Contados los 100 Elementos proceder a expresar el
número de elementos contados en porcentajes

VALORES NORMALES
G.B. ADULTOS RELATIVO ABSOLUTO POR
7000 LEUCOCITOS
NEUTROFILOS 40 – 70% 2800 – 5250
LINFOCITOS 20 – 30% 1400- 3150
MONOCITOS 4 - 8% 140- 700
EOSINOFILOS 1 – 4% 70 – 420
BASOFILOS 0 – 1% 0 - 70

107
INTERPRETACION:

NEUTROF I L I A
El aumento de Neutrófilos indica Proceso Infeccioso con L eucocitosis. La
cual puede ser provocada por Cocos, o en todo caso Infecciones provocadas
por Estafilococos, etc. o diversos Bacilos (tales como Bacilo Diphteriae, etc.)
Se encuentra en Apendicitis, Endocarditis, Reumatismo Poliarticular Agudo,
etc. y en general en las Infecciones Agudas.

EOSENOFILIA
El aumento de Eosinofilos es causa de su intervención en procesos
alérgicos experimentales y clínicos, tales como Asma Bronquial, Rinitis,
etc. También se producen por alergias en la piel como Urticaria, Eczemas,
Dermatitis, Coreasis, Dermatitis Exfoliativa, Herpes Zoster. En enfermedades
producidas por parásitos como Tenias, Cisticercosis, Ascaris, Ancilostoma, Oxiuros,
etc. Puede también presentarse Eosinofilia Fisiológica en la Menstruación, en el
Embarazo, o después de los ejercicios musculares violentos.

BASOFILIA
El aumento de Células Basófilas es moderado y relativo en la Cirrosis Hepática.
En las Anemias Hemolíticas, en la Clorosis, en la Enfermedad de Hodgkin y es
importante en las Leucemias Mieloides y en la Polícitemia.

NEUTROPENIA
Se presenta Neutropenia (disminución de Neutrófilos), la que a veces está
acompañada de Leucopenia (disminución de Leucocitos], en Fiebre Ondulante,
Sarampión, Anemia Aplásica, Anemia Hémolítica Congenita., Hemoglobinuria
Paroxistica Nocturna, Trastornos Esplecnicos, Paludismo, Septicemias muy
Tóxicas,Lleucemias, Agranulocytosis, etc.

108
MONOCITOSIS
Se presenta en la Tuberculosis Crónica, la Brucelosis, Endocarditis Bacteriana
sub Aguda, Infecciones por Ricketsias, Paludismo y en la convalecencia de las
infecciones que producen Leucocitosis.

También se presenta en la Mononucleosis Infecciosa, Carcinomas, Tuberculosis


de forma Septicemica, Leucemia Monocitica e intoxicaciones por Tetracloruro de
Carbono, y en las Reticulocitis.

LINFOCITOSIS
Es el aumento relativo o absoluto de la cifra total de Linfocitos. Se presenta
en las infecciones agudas o crónicas: Tos Ferina, Mononucleosis Infecciosa,
FiebreTtifoidea., Gripe y formas crónicas del Paludismo, Procesos Tuberculosos
Sifilíticos, etc.: Hemopatías, Leucemia Linfática Aguda o Crónica, Anemia
Perniciosa y Aplásica, Púrpura Hernorrágica, Intoxicaciones en Enfermedades
Metabólicas; Diabetes. También se suele observar algunas Infecciones Víricas. El
aumento de Linfocitos guarda relación definida con la resistencia a las
infecciones.

La concentración de elementos formes en la Sangre circulante puede variar en


los distintos periodos de la enfermedad: Fase Neutrofilica o de lucha, Fase Monocitica
o de defensa y Fase Linfocitaria o de curación

109
TIEMPO DE COAGULACIÓN

METODO DE DUKE PARA LA DETERMINACION DE TIEMPO DE COAGULACION

FUNDAMENTO
Tiempo que requiere una muestra de Sangre Total para formar un
Coágulo

MATERIALES
. Lámina Porta Objetos.
. Lanceta Estéril.
. Torunda de Algodón con Alcohol.
. Cropnometro

PROCEDIMIENTO
. Limpiar la yema del dedo (desinfectar).
. Realizar la punción con una Lanceta Estéril, desechando luego las dos
primeras gotas de Sangre.
. Recogerla la tercera gota de Sangre del dedo en una lámina
Portaobjetos limpio y seco, además desengrasada, poniendo en marcha
El Cronómetro.
. Luego dejar en reposo 3 minutos, para luego hacer el control de la
formación de Fibrina cada 30 segundos.
. Pasado 3 minutos con 30 segundos tocar la gota de Sangre con la
Lanceta, hasta observar el momento de levantar esta arrastre en la
punta un filamento llamado Fibrina. Este control se realiza cada 30
segundos.
. Observar el Tiempo en que se ha observado la Formación del
Coagulo de Fibrina.

110
VALORES NORIMALES

De 2 a 5 minutos.

INTERPRETACION

Esta es una prueba muy frecuente antes de toda Intervención


Quirúrgica.

La disminución del Tiempo de Coagulación tiene relativa


importancia, salvo posible Trombosis. Se observa reducción de este tiempo
después de Hemorragias, Esplenectomia, Cardiopatía Descompensada y
Anestesia General.

En cuanto al aumento del Tiempo de Coagulación es muy


importante y este puede prolongarse cuando hay carencia de alguno de los
Factores de la Coagulación (Tromboplasitina, Protrombina o Fibrinógeno).
Un Tiempo prolongado tiene significación clínica en la Hemofilia Ictericia
por Obstrucción, Anemias, Leucemias, Neumonía etc. y en menor grado en
las Diátesis Hemorrágicas o Hemofilia del Recién Nacido, por otro lado
también se prolonga por la Ingestión de Anticoagulantes y Tetraciclinas.

111
TIEMPO DE SANGRIA

METODO DE IVY PARA DETERMINAR TIEMPO DE SANGRIA

FUNDAMENTO
Es el tiempo que demora el sangrado de una herida estandarizada.
Mide la habilidad de los pequeños vasos para responder a una lesión, lo
que depende de la integridad de la Pared Vascular, de su capacidad
constrictora, del número y calidad de las Plaquetas que formarán el Tapón
Hemostático Temporal.

MATERIALES E INSTRUMENTOS

. Muestra de Sangre Capilar.


. Lanceta Descartable.
. Papel Filtro.
. Torunda de Algodón con Alcohol

PROCEDIMIENTO

. Desinfectar el lóbulo de la oreja.


. Realizar la punción con la lanceta de no más de 3 a 4 mm. Y
poner en marcha el cronómetro.
. Cada 30 segundos absorber la sangre con el papel filtro, sin
que este llegue al lóbulo de la oreja.
. Si no sangra detener la marcha del cronómetro.

V ALORES NOMALES

De 1 a 2 minutos.

112
INTERPRETACION

El Tiempo de Sangría puede estar prolongado por Ingestión de


Medicamentos (Aspirina), Anomalías Plaquetarias, Trombopenia
(Idiopática, Aplasia y Leucemias), Trombopatias (Tromboastenias,
Distrofia) Trombocitemias (esencial y secundaria), Anomalías
Plasmáticas del Factor VIII, Factor 1, Factores V, X y XI y Angiopatia
Aislada

RESULTADOS

NOMBRE EDAD SEXO IMC RL NEU. A NEU. S EOS BAS MON LIN TC TS

CUESTIONARIO:

1. Definir Hemograma.
2. Cuáles son los valores normales para el recuento total de Leucocitos
3. Que es la Leucocitosis y cuáles son las causas más frecuentes de su
ocurrencia
4. Que es Leucopenia y cuáles son las causas más frecuentes de su ocurrencia
5. Que es Eosinofilia y cuáles son las causas más frecuentes de su ocurrencia

113
6. Cuál es la composición de la solución de Turk y que efecto tiene sobre los
Eritrocitos y Leucocitos.
7. Qué es el tiempo de Sangría y que determina.
8. Que es la Hemorragia y cuáles son las causas predeterminantes.
9. Qué es la Trombosis y cuáles son las causas predeterminantes.
10. Qué entiende por Púrpura Trombocitopénica.
11. Defina Equimosis, Petequia, Hematoma.
12. Cuáles son los valores normales para el Recuento de Plaquetas.
13. Que es la Trombocitopenia y cuáles son las causas más frecuentes de
ocurrencia
14. Qué es Trombocitosis y cuáles son las causas más frecuentes de ocurrencia.
15. Qué es tiempo de Protrombina.

114
PRACTICA N° 15

TIPIFICACION DE SANGRE

INTRODUCCION

Viene a ser una Prueba de Tipificación de la Sangre de un individuo, que


consiste en determinar el Grupo Sanguíneo al que pertenece según la clasificación
del sistema ABO y la determinación del Factor Sanguíneo según el Sistema Rhesus.

OBJETIVO.

. Determinar el grupo sanguíneo según la clasificación del sistema ABO


y el Factor Rh.
. Interpretar las diferentes alteraciones que pueden presentarse en la
Incompatibilidad Sanguínea.

DETERMINACIÓN DE GRUPO SANGUINEO ABO Y RH

SISTEMA ABO

Los determinantes Antigénicos o Epitopes de este Sistema se expresan en la


superficie de los Eritrocitos cono Oligosacáridos Complejos, que se diferencian por
su residuo terminal.

Tal como se observa en el siguiente esquema, una Enzima Fucosiltranferasa


producida por un gen H, cataliza la unión de un residuo de Fucosa (FUC) a una
Galactosa (GAL) del Oligosacárido precursor (el Ag O produciendo el Antígeno H:

115
Los individuos que poseen el Gen A unen N- Acetilglucasamina
(NAG) al Antígeno H produciendo el Antígeno A. En cambio los individuos
que poseen el Gen B unen otro residuo de Galactosa (GAL) al Antígeno H,
produciendo el Antígeno B. Los individuos que poseen ambos Genes
sintetizan ambos Antígenos A y B.

SISTEMA RH

El sistema Rh es también de gran importancia, puesto que es la


causa mayor de la Enfermedad Hemolitica del Recién Nacido. Los
Antígenos Rhesus son Proteína Lípido Dependientes que están escasamente
distribuidas sobre la superficie celular de los Eritrocitos, y son generadas
por 3 Genes relacionados, de los cuales el Locus Rh D es el más notable
debido a su Inmunogenicidad. Los Fenotipos resultantes son dos, el Rh D+
y el Rh-.

FUNDAMENTO
La Identificación del Grupo Sanguíneo (Sistema ABO) se realiza
haciendo reaccionar los Eritrocitos desconocidos frente a Sueros conocidos
conteniendo Anticuerpos contra Eritrocitos A, B y AB por separado, produciendo
Aglutinación en caso de ser Positiva la reacción.

116
La Identificación del Factor Sanguíneo (Sistema Rhesus), se determina
según la presencia del antígeno D en la superficie Eritrocitaria. La prueba se
realiza poniendo en contado los Eritrocitos desconocidos con un suero conocido
que contiene Anticuerpos Anti-D, que producen un Fenómeno de Aglutinación en
caso de haber presencia de Antígeno D, denominándose a estos Rh Positivos.

A anti B B anti A O anti A y B AB


A - + + -
B + - + -
O - - - -
AB + + + -

. O DONANTE UNIVERSAL
. AB RECEPTOR UNIVERSAL

MATERIALES E INSTRUMENTOS

. Lámina excavada.
. Baguetas.
. Sueros con Anticuerpos conocidos: Anti A, Anti B. Anti AB, y Anti D (Anti
Rh).
. Muestra de Sangre Total con Anticoagulante o Sangre Capilar si la realiza
de inmediato.

PROCEDIMIENTO

. Rotular la lámina excavada con el número respectivo de dicha muestra.


. Colocar una gola de Sangre con Anticoagulante o Sangre Capilar recién
extraída en 4 excavaciones de la lámina.
. A g r e g a r a c a d a c i r c u l o l o s r e s p e c t i v o s r e a c t i v o s : Suero
Anti A, Anti B, Anti Rh respectivamente.

117
. Inmediatamente proceder a mezclar con un Palillo de Dientes.
. L u e g o se Homogeniza con Movimientos de R o t a c i ó n y se hace la
l e c t u r a correspondiente.

RESULTADOS

Para ello se hace la Observación Microscópica de Aglutinación Positiva o


Negativa

PARA GRUPO SANGUINEO


Si no se produce Aglutinación con ninguno de los Sueros Reactivos,
pertenece al Grupo O.
Si Aglutina con Suero Anti A, pertenece al Grupo "A".
Si Aglutina con suero anti B, pertenece al Grupo "B".
Si Aglutina con sueros anti A y anti B, pertenece al grupo "AB"

PARA FACTOR SANGUINEO


Si Aglutina con Anti Rh, indica Factor Rh Positivo
Si No Aglutina con Anti Rh, indica Factor Rh Negativo

INTERPRETACION
Debido a que los Individuos poseen en su Superficie Eritrocitaria c i e r t o s
Antígenos o Factores Aglutinógenos q u e constituyen u n Carácter Hereditario y
Particular, se llegó a determinar 4 Grupos Sanguíneos dentro del Sistema ABO,
teniendo en cuenta la presencia o ausencia del Antígeno A y el Antígeno B en el
Eritrocito, donde:

. Grupo “A” : contiene en el Plasma Anticuerpos Anti B y en sus Eritrocitos


Antígeno A.
. Grupo "B": poseen Anticuerpos Anti "A" (plasma) y Antígenos B
(Eritrocitos).
. Grupo “AB”: poseen Antigenos A y B y carecen de Anticuerpos.

118
. Grupo "C": posee Anticuerpos Anti A y Anti B y carecen de Antígenos en
su Superficie Eritrocitaria. Por lo tanto estos Antígenos reaccionan al entrar
en contacto con ciertos Anticuerpos Específicos a ellos, revelándose la
reacción mediante procesos de Aglutinación o Lisis, es decir que al hacer
reaccionar los Glóbulos Rojos del desconocido frente a Sueros conocidos
(Anti A, Anti B y Anti AB, por separado), se produce Aglutinación, en caso
de ser Positiva la Reacción, o No Aglutinación en caso de pertenecer al
Grupo "O".

Cosa similar sucede con el Factor Rh, que permite la agrupación en 2


Grupos: Rh Positivo y Rh Negativo por la presencia o ausencia del Antígeno D,
donde los que lo posean se denominan Rh Positivos y los que carezcan de él son los
Rh Negativos. Por lo tanto, al poner en contacto los Eritrocitos de un Individuo con
el Suero Anti D, la reacción puede ser positiva o negativa; siendo Positiva, sí el
Antígeno D se encuentra presente y negativo si el Antígeno D no esta presente.

RESULTADOS

NOMBRE ANTIGENO ANTICUERPOS GRUPO FACTOR


SANGUINEO SANGUINEO

CUESTIONARIO (ANEXO)

1. Cuáles son los Sistemas de Grupos Sanguíneos más importantes.


2. Qué son las Imunoglobulinas y Aglutinogenos.

119
3. Describa el Factor Rh.
4. Cuál es la frecuencia de los diferentes Grupos Sanguíneos en nuestro medio.
5. Describa la reacción por Transfusión de Sangre Incompatible.
6. Describa la Enfermedad Hemolítica del Recién Nacido. ¿Cual es su causa?
7. Qué entiende la Profilaxis Rhesus?
8. Qué entiende por Reacción Cruzada Primaria y Secundaria?
9. Qué es la Hemolisis y cuáles son las causas?
10. Qué es el Test de Coombs, importancia?
11. Qué es la Anemia Autoinmune, cuáles son sus causas?

120
PRACTICA N° 16

REPRODUCTOR MASCULINO

INTRODUCCION

Los cambios Puberales obedecen a la Maduración o Reactivación


de Dos Ejes Endocrinos: el Eje Hipotálamo - Hipófisis - (cortico) adrenal
(HHA) o Adrenarquia y el Eje Hipotálamo - Hipófisis - gonadal (HHG) o
Gonadarquía.

La Adrenarquia ocurre alrededor de los 6 a 8 años de edad y


precede a la Gonadarquía en aproximadamente 2 años. Se forman los
Sexoesteroides o Andrógenos Adrenales en la Zona Reticular;
Androstenediona (ATD), Dehidroepiandrosterona (DHEA) y su Sulfato de
Dehidroepiandroterona (DHFA-S). Estos dos últimos son Marcadores
Bioquímicos de la secreción Androgénica Corticoadrenal y del inicio de la
Adrenarca. A esa edad, la Adrenarca se puede manifestar por un cambio en
el olor del sudor, que adquiere las características propias del Adulto.
Posteriormente, en el Púber, contribuye a la aparición del vello corporal,
especialmente púbico y axilar.

El periodo Prepuberal se caracteriza por baja producción de FSH,


LH y Esferoides Sexuales. Luego, por estímulos externos e internos, se
producen descar'as Aferentes hacia el Sistema Nervioso qué hacen que el
Hipotálamo secrete Liberinas o Factores Liberadores (Hormona Liberadora
de Gonadotropinas: GRH) que a su vez hacen que la Hipófisis libere
Trofinas como las Gonadotrofinas (FSH - Hormona Estimulante del
Folículo- y LH - Hormona Luteinizante) las que luego actúan sobre las
Gónadas, que permanecieron Quiescentes desde el Nacimiento hasta la
Adolescencia. Las hormonas secretadas por las Gónadas, o Finalinas, a su
vez, causan la aparición de los caracteres típicos del Macho y de la Hembra.

121
En el Hombre, las Gónadas quedan más o menos activas desde la
Pubertad. En la Mujer, la Función Ovárica sufre regresión después de un
periodo de tiempo y los Ciclos Sexuales cesan (la Menopausia). En ambos
sexos las Gónadas tienen una doble función: Efectora Final de la Vía
Eferente Neuroendocrina: Células de Sertoli o Folículos producen
Células Germinativas (Gametogénesis); y como relevo endocrino para que
las Células de Leyding y Teca produzcan otras Hormonas
(Endocrinotransmisores), Andrógenos y Estrógenos. Como Masculinizantes
y Feminizantes respectivamente. En el Macho la secreción de
Gonadotropinas no es cíclica, pero en la Hembra Postpuberal se necesita
una secreción de Gonadotropinas en sucesión ordenada, para que ocurra la
Menstruación, el Embarazo y la Lactancia. La FSH es el Transmisor final
para los Efectores (mantiene el Epitelio Espermatogeno en el Macho y es
responsable del Crecimiento Precoz de los Folículos Ováricos de la
Hembra).
La LH es transmisor intermedio que hace secretar Andrógenos y
Estrógenos; aunque también es transmisor final en la Hembra al hacer
madurar los Folículos Ováricos y de la Ovulación, de la formación del
Cuerpo Lúteo y de la secreción de Progesterona.

Las Gónadas de ambos sexos producen Andrógenos y Estrógenos,


aunque predominantemente aquellas de su propio sexo. En los Machos los
más importantes de los Andrógenos u Hormonas Masculinas son la
Testosterona y la Dihidrotestosterona (DHT). La T estimula el desarrollo
del Tracto Genital y el desarrollo y mantención de los Organos Accesorios
y Caracteres Sexuales Secundarios; acelera el Crecimiento en Altura (retarda
el cierre de la Epífisis de los Huesos Largos), agranda la Laringe y Cuerdas
Vocales con lo que baja el Tono de la Voz. En los Adultos, la Castración
produce Cambios Mentales y Emocionales, por ejemplo, la Pérdida de
Agresividad. En el Hombre Adulto los resultados de la Castración son
menos conspicuas que en Animales. Podemos mencionar la permanente
Esterilidad, limitada Atrofia de los Organos Sexuales Secundarios, y
disminución, pero no siempre pérdida total del Impulso Sexual. En las

122
Hembras, los Estrógenos, de los que el Estradiol es el más potente, son
igualmente responsables del desarrollo de los Caracteres Sexuales a salida y
contribuyente a la Turgencia.

Las Células Epiteliales que revisten los Túbulos Seminíferos


(conocidos como Epitelio Germinal) dan lugar, por un complejo proceso de
División Celular, a las Células Germinales Masculinas, los E spermatozoos.
Esto constituye el Componente Efector de los Testículos. El Número de
Espermatozoides es enorme, durante una simple Eyaculación se pueden
descargar 300 Millones. El Esperma vive sólo uno a dos días en el Tracto Genital
Femenino. Las Células Germinales Primordiales se dividen Mitóticamente dando
lugar a las Espermatogonias (con 2n Cromosomas), las que por Crecimiento,
Sinapsis o Entrecruzamiento y Replicación de cada par de Cromosomas (Tetrada
con 4 Cromátidas) se convierten en Espermatocitos Primarios. Luego cada
Espermatocito Primario se divide dando lugar entonces a Espermátidas (con n
Cromosomas) que por Metamorfosis se convierten en Espermatozoides Móviles y
Activos. Las Espermátidas maduran transformándose en Espermatozoides en los
pliegues profundos del Citoplasma de las Células de Sértoli, células que contienen
Glucógeno perteneciente a los Túbulos de las cuales los Espermatozoides pueden
nutrirse. La Espermatogénesis es influenciada por algo de la Vitamina B. La Vit.
E es designada como de Fertilidad (o Antiesterilidad), aunque esta función no ha
sido establecida para el Hombre. La falta de Vit. A produce Queratinización del
Epitelio de los Tubulos Seminíferos y los Ovarios. Una Dieta baja en Proteínas o
exenta del Aminoácido Arginina decrece la Espermatogénesis. Los
Espermatozoides que acaban de abandonar el Testículo no están capacitados para
desplazarse con movilidad suficiente para producir la Fertilización. Adquieren
dicha capacidad durante su paso por el Epididimo.

Debido a la presión causada por su continua formación, los


Espermatozoos son constantemente empujados a través de los Conductos
Seminíferos, y pasan luego a la Rete-Testis, Conductos Aferentes, Epididimo,
Conducto Deferente hasta las Vesículas Seminales, ese movimiento es ayudado por
los Cilios de los Tubulos. Los Conductos, Vesículas Seminales y Próstata y otras

123
Glándulas producen una Secreción Fluida donde se encuentran los
Espermatozoides. Este Fluido formado por esos varios componentes se conoce
como Fluido Seminal o Semen. Contiene gran cantidad de Fructosa, como
Nutriente para el Esperma.

Varias secreciones son añadidas desde lasGglándulas Accesorias


Masculinas a medida que el Esperma es transportado desde los Testículos. Las
secreciones del Epididimo son altas en Potasio y Glicerilfósforilcolina, una
potencial fuente de Energía para los Espermatozoos. Los Conductos Deferentes se
unen a los Conductos Secretorios de las Vesículas Seminales y juntos forman el
Conducto eyaculador. Las secreciones de las Vesículas Seminales tienen un alto
contenido de Acido Cítrico y Fructosa. La Fructosa es metabolizada por las
Mitocondrias en el espacio medio del Espermatozoide para proporcionar
Energía. El Esperma y las secreciones acumuladas son almacenados en la Porción
Distal del Conducto Deferente de la Ampolla Terminal. A medida que el Conducto
Eyaculador pasa a través de la Próstata las secreciones de este Organo son
añadidas. La secreción Prostática es ligeramente acida y contiene varias fuertes
Enzimas Proteolícas, contiene una alta concentración de Zinc y la depleción de este
metal daña el Epitelio Glandular, sirve para diluir el Esperma, proporcionar
Materiales Nutrientes e incrementar la Motilidad del Esperma. La presencia de
pequeñas cantidades de Prostaglandinas parece ser necesaria para acrecentar la
Motilidad Espermática.

Cuando las cosas funcionan bien, las señales sexuales desde el


Cerebro estimulan la liberación de una sustancia química en el Pene, GMPc, que
relaja los Músculos del Tejido Eréctil Esponjoso y hace expandir espacios
recientemente abiertos y el Pene comienza a enderezarse. Ocurre una plena
erección solo cuando la Venas que normalmente drenan la Sangre han sido
cerradas.

En Hombres impotentes, el tejido eréctil no se expande lo bastante


para tapar las Venas, debido a un déficit de GMPc. La Sangre sale del Pene tan
rápido como entra y la erección se detiene. Viagra trabaja prolongado los efectos

124
del GMPc (bloqueando la enzima que la rompe o hidroliza) de tal forma que aún
una pequeña cantidad de la sustancia puede actuar por más tiempo).

La Erección se produce por Impulsos Aferentes desde los Organos


Genitales hasta los Centros Integradores de los Segmentos Lumbares e la Médula
Espinal y de aquí hasta los Efectores. En el Hombre, también se produce por
impulsos que llegan por los Haces Descendentes que median la erección en
respuesta a Estímulos Eróticos Psíquicos. Las Fibras Eferentes van por los Nervios
Esplácnicos (Nervios Errores) hacia músculos localizados en el Cuerpo Cavernoso
cerca al Area Púbica, cuya contracción impide la salida de Sangre. Impulsos
Simpáticos Vasoconstrictores terminan la erección. La erección es iniciada por la
dilatación de las Arteriolas del Pene. Cuando el Tejido Eréctil del Pene se llena de
Sangre, las Venas son comprimidas bloqueando la salida y contribuyendo a la
turgencia.

La Excitación Sexual aumenta la actividad de los Nervios


Parasimpáticos Sacros (Nervios Eferentes) que inervan las Arterias del Tejido
Eréctil, liberando Acetilcolina que produce Relajación Muscular Lisa y subsecuente
Flujo de Sangre a los Espacios Vasculares, el Pene se Agranda y entra en erección.
La Sangre queda en el Tejido Eréctil (Cuerpos Cavernosos y Esponjosos). La
Erección es un Mecanismo Parasimpático. La Eyaculación es un Mecanismo
Simpático. Se libera Noradrenalina que constriñe las Arterias del Tejido Eréctil, la
Sangre drena lentamente y vuelve al estado flácido el Pene. Durante la
Estimulación o Excitación Sexual Normal, además del componente Parasimpatico
Colinérgico, el Endotelio de los Vasos Sanguíneos de los Cuerpos Cavernosos
Humanos, la función de ON (Oxido Nitrico) es activar la enzima GC (Guanilato
Ciclasa). Por su parte la enzima GC actúa incrementando la concentración de
GMPc.

Durante el Coito interviene prácticamente todo el Sistema Nervioso,


Somático y Visceral. Intervienen ciertos Músculos Esqueléticos y la Eyaculación es
un Reflejo Espinal. Las Vías Aferentes son en su mayoría Fibras de los Receptores
Táctiles del Glande del Pene, que llegan a la Médula Espinal por los Nervios

125
Pudendos Internos. Ante los Estímulos Genitales se desencadenan Contracciones
Peristálticas de los Conductos Deferentes y las Vesículas, y el Semen pasa hacia la
Uretra, la cual Cursa el Pene. La Emisión es una Respuesta Simpática integrada en
los Segmentos Lumbares altos de la Médula Espinal y efectuada por la contracción
de la Musculatura Lisa de los Conductos Deferentes y de las Vesículas Seminales,
en respuesta a órdenes que viajan por los Nervios Hipogástricos. El Semen es
impulsado fuera de la Uretra por la contracción del Bulbo Cavernoso, un Músculo
Esquelético. Los Centros Reflejos Espinales para esta parte del Reflejo se
encuentran en los Segmentos Sacros Superiores y Lumbares Inferiores de la
Médula Espinal. Las Vías Motoras salen por la Primera a la Tercera Raíces Sacras
y por los Nervios Pudendos Internos. Durante la Copula hay un incremento de la
Frecuencia Respiratoria (más de 40/min), del Pulso (100 a 170 pulsaciones/min), y
de la Presión Sanguínea (30 a 80 mm de Hg Sistólica y 20 a 40 mm Hg Diastólica).

Existe una dramática declinación en las concentraciones de los


Andrógenos Adrenales (Adrenopausia), Dehidroepiandrosterona (DEHEA), y
Sulfato de DHEA (DHEAS) (DHEA(S) colectivamente), Androstenediona (A)
(Gonzales et al, 2000) sin cambios acompañantes en los niveles básales de Cortisol
(Paolisso et al. 1997, Baulie, 1999)

Existe un declive de la Función Testicular, o de la secreción de


andrógenos gónadales que algunos autores llaman Andor-Decline o Disminución
Androgénica en el Envejecimiento Masculino, mal llamada Andropausia (Kaneku
el al, 1992, Gonzales, 2001). Pero por otra parte, el hallazgo, en algunos estudios,
que los Niveles de Testosterona (T) no disminuyeron significativamente con la
edad en Hombres excepcionalmente sanos, plantea la cuestión de los roles relativos
de males crónicos relacionados con la Edad vs. Envejecimiento per se en producir
los decrecimientos observados. Estudios sobre este aspecto han sugerido que la
Edad, Infertilidad y el Fumar ejercen efectos independientes sobre los niveles de T
y T libre durante el Envejecimiento (Harman et al, 2001).

La Secreción de Hormona del Crecimiento (GH) declina con la


Edad en la Población Geronte Sana en aproximadamente 14% por Década desde la

126
Vida Adulta (Somatopausia). Empero en Pacientes Gerontes con Enfermedades
Orgánicas del Eje Hipotalámicopituitario, la Secreción de GH está
significativamente reducida comparada con controles similares. Esto implica que
hay que diferenciar entre los cambios Bioquímicos y Fisiológicos que son
consecuencia del Envejecimiento y aquellos Factores que indican la existencia de
una Enfermedad.

Además se observa una declinación de la Tolerancia a la Glucosa


durante el Envejecimineto, y la Resistencia a la Insulina es la principal responsable
del deterioro de la Homeostasis de la Glucosa. Esos estudios han reportado casi
Normal Sensibilidad Hepática a la Insulina, pero reducida utilización periférica de
la Glucosa. La Pérdida Muscular y Aumento de Grasa Abdominal observada en el
Envejecimiento puede ser la consecuencia de una reducida acción de la Insulina
sobre el Metabolismo Proteico así como resistencia a la Leptina, lo que no ocurrirá
en Gerontes Excepcionalmente Sanos.

PERFIL REPRODUCTOR

EVALUACIÓN DE SEMEN

MATERIALES

. Microscopio
. Contómetro
. Baño María a 37°C

. Eosina: Pesar 0.5 g y diluirlo en 100 ml de Sol. Salina al 0.9%.


. Ortotoluidina (OPT) al 0.15%: se prepara colocando en un frasco
oscuro 0.15 ml de Orto-Toluidina y se completa a 100 ml con
Suero Fisiológico.

. Sol. de Trabajo: 10 ml de sol. de O-toluidina (OPT) al cual se


agrega 0.02 ml de Peróxido de Hidrógeno al 1.5%. Estas se

127
mezclan inmediatamente antes de su uso.
. Buffer Hipoosmótico: se prepara con:
- Fructosa (1351 mg)
- Citrato de Sodio 2 H 2 0 (735 mg)
- 100 ml de agua.

EXTRACCIÓN DEL SEMEN

Se pedirá a los Sujetos que lo obtengan por Masturbación después


de un periodo de Abstinencia de 3 a 5 días y lo depositen en un Frasco de
Vidrio o de Plástico, el cual ha de ser precalentado a la Temperatura
Ambiente antes de su uso. Marcar el Frasco con el Nombre, Número, Fecha,
Hora y Número de Días de Abstinencia. La Muestra debe protegerse de
Temperaturas Extremas (<20°C ó > 40°C).

ESPERMATOGRAMA MACROSCÓPICO

. COLOR. Blanco, Límpido y Homogéneo. Algunas veces se observan


unos Granos Gelatinosos que No se Licúan y que
Sedimentan rápidamente. No se ha demostrado que la presencia de
estos Granos tengan alguna implicancia en la Infertilidad. Cuando la
Concentración es Bastante Baja la Muestra Aparece Transparente.
. COAGULACIÓN: (Función de Vesículas Seminales).
. TIEMPO DE LICUEFACCIÓN: (Función de la Próstata): ocurre
dentro de 30 de obtenida la Muestra.
La Lisozima y Amilasa de la Próstata licuan el Coágulo producido
desde las Vesícula Seminales. La presencia de Hebras Mucosas que es
un Signo de Incompleta Licuefacción, puede Distorsionar los
Resultados del Procedimiento de Conteo.
. CONSISTENCIA O VISCOSIDAD: La Muestra es Normal cuando el

128
Semen sale del Tip en Pequeñas
Gotas o en forma de un Filamento igual o menor a 2 cm. Más de 2
cm. pueden indicar Vesiculitis.

MICROSCOPIO

. CONCENTRACIÓN: Se Diluye la Muestra de Semen en Suero con


Pipeta de Thoma para Globulos Blancos. Se
coloca una Gota de Muestra en la Camara de Newbauer, se cuenta el
Numero de Espermatozoides encontrados en 2 Cuadrados Grandes (de
16 Cuadrados Regulares) y se Multiplica por 100,000.
Valores Normales: 60 a 250 Millones por Mililitro (ml).
. MORFOLOGÍA: Puede Evaluarse tanto en una Muestra Fresca como
en un Extendido. Normales, Inmaduros (presenta
Gota Citoplasmática en el Segmento Intermedio), Anomalías de
Cabeza (Alargadas, Acintadas, Grandes, Pequeñas, Piriformes),
Anomalías de Segmento Intermedio y Anomalías de la Cola.
. VELOCIDAD DE LOS ESPERMATOZOIDES: Para Efectuar la
determinación de la
Velocidad de los Espermatozoides, se Calienta la Cámara de
Newbauer a 37°C, y se carga la Cámara con una Gota de Semen. Con
un Cronómetro digital se mide el Tiempo que Tarda el Espermatozoide
en Cruzar un Cuadrado Pequeño (50 Micras). El Cálculo de la
Velocidad se realiza Dividiendo 50 entre el Tiempo en Seg. Para un
Cálculo Más Efectivo se Repite el Procedimiento 10 veces y se
obtiene un Promedio. Se considera que la Velocidad es Normal
cuando es Mayor de 30 Micras/ Seg.

. VITALIDAD: Para la Evaluación de la Vitalidad se Mezcla una Gota


De Semen con una Gota de Solucion de Eosina en una
Lamina Portaobjetos y se Cubre con una Laminilla Cubreobjetos.
Después de dos minutos se Observa la preparación a 400X. Se cuentan
los Espermatozoides No Coloreados (Vivos) y Coloreados (Muertos)

129
hasta llegar a 100. El % de Espermatozoides Vivos (Vitalidad) está
dado por el % de Espermatozoides Móviles, más el Porcentaje de
Espermatozoides Inmóviles pero Vivos Inmóviles No Coloreados, se
considera la Muestra como Normal cuando la Vitalidad es Mayor de 70%. La
Presencia de una Gran Proporción de Células Viables pero móviles pueden
ser Indicativas de Defectos Estructurales en el Flagelo.
. MOTILIDAD: 1 y 2 h después de la Eyaculación X400.
- Grado 3: movimiento Lineal Rápido y Vigoroso
- Grado 2: movimiento Lineal Lento u Ondulante.
- Grado 1: movimiento In Situ
- Grado 0: Inmóviles

Se debe Contabilizar por lo menos 100 Espermatozoos en Diferentes


Campos. Una Muestra Es Normal cuando el Porcentaje con Movilidad
Grado 2 y 3 es mayor del 50% y cuando la Movilidad Grado 3 es Mayor del
25%. Valores Por Debajo del 1% referidos se consideran Astenoespérmicos.

COLORACION DE LEUCOCITOS

Principio: La Orto-Toluídina es utilizada para la identificación de PMN


(Polimorfonucleares), debido a que cambian de un Estado
Incoloro a uno Marrón por la acción que tiene la Peroxidasa de los
Neutrofilos sobre el peróxido de hidrógeno.

PROCEDIMIENTO:

Se coloca 0,1 ml de Semen en un Tubo de Ensayo y se agrega 0,9 ml de


Solucion de Trabajo, se agitan por 1 Minuto y se coloca en Baño María a 37°C por
20-30 Minutos.
Al término de la Incubación se coloca 10 Microlitros de muestra en la
Cámara de Neubauer y se cuentan los Neutrofilos que aparecen coloreados de
marrón. Para obtener el número de Leucocitos por ml se Divide por 10 el Número

130
de Leucocitos contados en 25 cuadrados y se Multiplica a este Valor por Un
Millón.

Se considera que la Muestra es Patológica cuando se encuentra Más de


Un Millón de Leucocitos/ml y se denomina Leucospermia. En la Leucospermia se
observa espermaglutinación y/o presencia de gérmenes móviles. Las Células que
No Son Coloreadas deben ser también Contadas y corresponden a Células de la
Progenie o a otros tipos de Leucocitos.

EVALUACION DE LA FUNCION DE LA MEMRANA

Colocar 0.1 ml de Buffer Hipoosmótico y agregar 0.1 ml de


Semen y se Mezclan.

Incubar durante 30-60' a 37°C.

Después de la Incubación se coloca una Gota en una Lámina


Portaobjetos y se cubre con una Laminilla, y se Observan al M icroscopio,
donde se Cuentan en Varios Campos los Espermatozoides con Colas
Hinchadas así como aquellas Sin Hinchar, hasta completar 100
Espermatozoides.

Expresar el Resultado como el Porcentaje de Espermatozoides


con Cola Hinchada en relación al Total de Espermatozoides.

Se considera una Muestra como Normal enfrentada a una


Solución Hipoosmótica, cuando el Porcentaje de Colas Hinchadas es Mayor
de 60 %.

131
RESULTADOS

NOMBRE COLOR TIEMPO TIEMPO CONSIST. CONCENTR. MORFO. VELOC. VITAL. MOTIL. LEUCOC./ml % COLAS
MUESTRA COAG. LICUEF. O VISCOS. HINCHADAS

CUESTIONARIO

1. Cuáles son los dos Esteroides Testiculares y cuál es su Origen?


2. Qué Cantidad de la Dihidrotestorerona Sérica deriva de la Conversión
Periférica de Testosterona?
3. Cómo se Regula la Secreción de Testosterona?
4. Qué Fármacos Interfieren con Frecuencia con la Espermatogénesis?
5. Cuáles son las Categorías con Frecuencia con la Espermatogénesis?
6. Cuál es el Principal Andrógeno que controla el Tamaño de la Próstata?
7. Cuáles son los Efectos del Tratamiento Antíestrogénicos en los Varones con
Hiperplasia Prostática Benigna?
8. Cuál es la Función de los Receptores Adrenérgicos Alfa 1 en la Hiperplasia
Prostática Benigna?
9. Cómo se Establece el Diagnóstico de Hiperplasia Prostática Benigna?
10. Cuáles son los Cambios Vesicales Producidos en los Pacientes
con Hiperplasia Prostática Benigna?

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BIBLIOGRAFIA

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