TRANSCRIPCIÓN REVERSA Y PCR

Técnicas de Biología Molecular II (20-I)

Transcriptasas Reversas La transcripción reversa contribuye a:

1) Propagación de retrovirus, por ejemplo, virus
La transcripción inversa implica una amplia familia de inmunodeficiencia humana (VIH), virus de
de enzimas llamadas transcriptasas reversas que la leucemia murina de Moloney (M-MuLV) y
juegan un papel único en el flujo de información virus de la mieloblastosis aviar (AMV).
genética. Desde su descubrimiento, los
investigadores han utilizado estas enzimas como
herramientas fundamentales en una amplia gama
de aplicaciones de biología molecular.

El dogma central original de la biología molecular

sostenía que el ADN se transcribía en ARN, que a
su vez se traducía en proteína. Sin embargo, este
concepto fue desafiado en la década de 1970
cuando dos equipos científicos, uno dirigido por
Howard Temin en la Universidad de Wisconsin y
el otro dirigido por David Baltimore en el MIT,
identificaron de forma independiente nuevas
enzimas asociadas con la replicación de virus de
ARN llamados retrovirus. Estas enzimas
convierten el genoma viral de ARN en una
molécula de ADN complementario (ADNc), que
luego es capaz de integrarse en el genoma del
huésped. Estas son ADN polimerasas
dependientes de ARN y se llaman transcriptasa
reversa porque, en contraste con el flujo de ADN
a ARN del dogma central, transcriben plantillas de
ARN en moléculas de ADNc.

En 1975, Temin y Baltimore recibieron el Premio

Nobel de Fisiología o Medicina (compartido con
Renato Dulbecco por su trabajo relacionado en la
inducción de tumores virus) por su trabajo
pionero en la identificación de transcriptasas
reversas.
Las transcriptasas reversas se han identificado en
muchos organismos, incluidos virus, bacterias,
animales y plantas. En estos organismos, su papel
general es convertir secuencias de ARN en se-
cuencias de ADNc que son capaces de insertarse
en diferentes áreas del genoma.

Ana Luisa Bravo Licenciatura en Biología Molecular | UAM Cuajimalpa

1
TRANSCRIPCIÓN REVERSA Y PCR
Técnicas de Biología Molecular II (20-I)

2) Diversidad genética en eucariotas a través de 4) Síntesis de elementos extracromosómicos de

elementos móviles transponibles llamados ADN / ARN llamados ADN multicapa de
retrotransposones. cadena sencilla (msDNA) en bacterias.

3) Replicación de telómeros.

Ana Luisa Bravo Licenciatura en Biología Molecular | UAM Cuajimalpa

2
TRANSCRIPCIÓN REVERSA Y PCR
Técnicas de Biología Molecular II (20-I)

Aplicaciones Transcripción Reversa

Además de sus funciones en los sistemas
biológicos, las transcriptasas reversas también
Principales Componentes de Reac-
sirven como herramientas importantes en biología ción
molecular. Para investigar las funciones del RNA,
Los componentes de reacción principales para
debe ser convertido en su ADNc, el cual tiene
la transcripción reversa incluyen a la
mayor estabilidad. El ADNc permite
transcriptasa reversa, los primers, el ARN
manipulaciones adicionales para estudiar el ARN
muestra (pretratado para eliminar el ADN
utilizando técnicas basadas en el ADN, como la
genómico), el buffer (con DTT + inhibidor de
clonación, la PCR y la secuenciación, por lo que la
RNasa), los dNTPs y agua libre de RNasa.
transcripción reversa es un paso crucial en
muchos trabajos experimentales basados en ARN.

Uno de los primeros protocolos que utilizaron

transcriptasas reversas fue para la producción de
ADNc en la construcción de bibliotecas que
contenían copias de ADN de ARNm de las células
y tejidos. Estas bibliotecas de ADNc ayudan a
comprender la expresión de los genes y sus
funciones en un momento específico.

Aunque la creación de bibliotecas de ADNc fue

un importante paso en la caracterización de la
expresión genética, aún quedaban desafíos en el
Aunque todas las transcriptasas reversas
estudio ARN con bajas concentraciones. Estos
convierten el ARN en ADNc, pueden diferir en
desafíos fueron abordaron posteriormente con el
sus actividades funcionales y en sus
desarrollo de la PCR. La transcripción inversa
propiedades, las cuales afectan su capacidad
combinada con PCR o RT-PCR, permite la
para transcribir (i) fragmentos de ARN largos, (ii)
detección de ARN incluso a niveles muy bajos de
cadenas ricas en GC, (iii) ARN con estructuras
expresión y resuelve el problema para la
secundarias significativas o (iv) ARN de baja
detección de ARN circulante, virus ARN y las
calidad.
fusiones de genes cancerosos en el diagnóstico
molecular. Dado que la transcripción reversa proporciona
plantillas de ADNc para la amplificación por PCR
Además, los ADNc sirven como plantillas en
y los experimentos posteriores, es uno de los
aplicaciones como los microarreglos y la
pasos más críticos. La transcriptasa reversa
secuenciación de ARN desconocidos.
seleccionada debe ofrecer la mayor eficiencia
incluso con muestras de ARN desafiantes, como
los que están degradados, con inhibidores o los
poseen un alto grado de estructuras
secundarias.

Ana Luisa Bravo Licenciatura en Biología Molecular | UAM Cuajimalpa

3
TRANSCRIPCIÓN REVERSA Y PCR
Técnicas de Biología Molecular II (20-I)
Características de la Transcriptasa Reversa
La mayoría de las transcriptasas reversas
utilizadas en biología molecular se derivan del
gen pol del virus de la mieloblastosis aviar (AMV)
o del virus de la leucemia murina de Moloney
(MMLV).
La transcriptasa inversa de AMV fue una de las
primeras enzimas aisladas para la síntesis de
ADNc en el laboratorio. La enzima es un
heterodímero de 170 kDa con un rango de
temperatura de reacción óptimo de 42-48° C. La
transcriptasa reversa de AMV posee una fuerte
actividad de RNasa H, dando como resultado
fragmentos de ADNc más cortos (<5 kb).
La transcriptasa reversa MMLV se convirtió en
una alternativa popular debido a su estructura
monomérica, que permitió su clonación y
modificación de una forma más simple. La
transcriptasa reversa MMLV es una enzima de 75
kDa con una temperatura de reacción óptima de
alrededor de 37° C. Aunque es menos
termoestable que la de AMV, es capaz de
sintetizar cDNA más largos (<7 kb) y con una
mayor eficiencia, debido a su menor actividad de
RNasa H.
Para mejorar aún más la síntesis de ADNc, la
transcriptasa reversa MMLV ha sido modificada
para tener actividad de RNasa H aún más baja (es
decir, dominio de RNasa H mutado, o RNasaH–),
tener mayor termoestabilidad (hasta 55° C) y una
procesividad mejorada (65 veces mayor). Estos
atributos dan como resultado un rendimiento
mayor y fragmentos de ADNc más largos,
aumento en la sensibilidad, mejor resistencia a los
inhibidores y tiempos de reacción más rápidos.
La capacidad de una transcriptasa reversa para
soportar altas temperaturas es un aspecto
importante de la síntesis de ADNc. Las elevadas
Ana Luisa Bravo
temperaturas de reacción ayudan a
desnaturalizar el ARN con estructuras
secundarias fuertes y/o con alto contenido de
GC, permitiendo que las transcriptasas reversas
lean a través de la secuencia. Como resultado,
en la transcripción reversa a temperaturas más
altas se sintetizan las cadenas completas de
ADNc y con mayores rendimientos, lo que
conduce a una mejor representación de una
población de ARN por los ADNc.
La actividad RNasa H, degrada el ARN que se
encuentra hibridado al ADNc simultáneamente con
la polimerización. No es deseable para la síntesis
de ADNc largos porque la plantilla de ARN puede
degradarse antes de completar la transcripción
reversa de los fragmentos completos. Esta activi-
dad también puede disminuir la eficiencia de la
transcripción reversa, presumiblemente debido a
su competencia con la actividad polimerasa de la
enzima.
La procesividad de una transcriptasa reversa se
refiere al número de nucleótidos incorporados
en un solo evento de unión de la enzima. Por lo
tanto, una transcriptasa reversa altamente
procesiva puede sintetizar cadenas de ADNc
más largas en un tiempo de reacción más corto.
La procesividad de la enzima también está
asociada con su afinidad por el ARN plantilla.
Las transcriptasas reversas con alta procesivi-
dad son resistentes a los inhibidores comunes
Licenciatura en Biología Molecular | UAM Cuajimalpa
4
TRANSCRIPCIÓN REVERSA Y PCR
Técnicas de Biología Molecular II (20-I)
que pueden obtenerse al extraer el ARN, como
heparina y sales biliares de sangre y heces y for-
malina y parafina de muestras histológicas fija-
das. Estos inhibidores a menudo se unen al ARN
y/o reducen la actividad de polimerización.
En el siguiente gel de electroforesis se puede
apreciar la síntesis de ADNc en presencia de inhi-
bidores utilizando transcriptasas reversas procesi-
va (H) y con baja procesividad (L3 y L4).
Las transcriptasas reversas altamente procesivas
también funcionan mejor con muestras de ARN
de baja calidad y cantidad. Este atributo hace que
este tipo de enzimas sean ideales para el ARN
aislado de tejidos de animales, así como muestras
de investigación clínica, que tienden a degradarse
debido al procesamiento y a los entornos ricos
en ARNasa. Del mismo modo, estas enzimas son
una buena opción para experimentos cuando hay
cantidades limitadas de ARN disponibles.
La fidelidad de la transcriptasa reversa representa
la precisión con la que la secuencia del ARN
plantilla es mantenida por la enzima durante la
síntesis de ADNc. La fidelidad está inversamente
Ana Luisa Bravo
correlacionada con una tasa de error de
transcripción inversa.
Las transcriptasas reversas tienen una elevada
tasa de error, ya que, a diferencia de ADN
polimerasas, no tiene la capacidad de
corrección de errores. Las basadas en MMLV
tienen una tasa de error en el rango de 1 en
15,000 a 27,000 nucleótidos sintetizados,
mientras que y la AMV muestra una tasa de
error mayor.
La fidelidad de las transcriptasas reversas
puede desempeñar un papel importante en
aplicaciones como la secuenciación de ARN
donde la precisión de la secuencia es crítica.
Para la mayoría de las otras aplicaciones de
ADNc, el número de errores incorporados
durante la transcripción inversa probablemente
sea insignificante por dos razones: la mayoría de
los genes son más cortos que 10 kb y el
proceso de transcripción inversa no amplifica
los errores introducidos en el ADNc.
Las transcriptasas reversas pueden tener
actividad terminal de nucleotidil transferasa
(TdT), lo que da como resultado la adición no
dirigida de nucleótidos (1 a 3) en el extremo 3'
del ADNc sintetizado y ocurre solo cuando la
transcriptasa reversa alcanza el extremo 5' del
ARN plantilla. En general, esta actividad no es
deseable porque los nucleótidos añadidos no
corresponden a la plantilla. La adición de
nucleótidos no dirigida por plantilla ocurre
comúnmente con la preferencia en el orden de
A > G ⋝ C > T.
Las diferentes transcriptasas reversas poseen
diversos grados de actividad intrínseca de TdT.
En las reacciones con las transcriptasas
reversas MMLV y AMV sin modificación, entre el
25 y 90% de las cadenas de ADNc sintetizadas
Licenciatura en Biología Molecular | UAM Cuajimalpa
5
TRANSCRIPCIÓN REVERSA Y PCR
Técnicas de Biología Molecular II (20-I)
pueden contener nucleótidos adicionales en el
extremo 3'. Las transcriptasas reversas MMLV
modificadas, por otro lado, tienden a mostrar una
actividad TdT intrínseca reducida. Además de la
elección de la transcriptasa inversa, la velocidad
de adición de nucleótidos depende de las
condiciones de reacción, como la relación
ARN-enzima, cantidad de enzima, tiempo de
incubación y temperatura de reacción.
Para ciertas aplicaciones como la clonación de
ADNc, la amplificación rápida de los extremos de
ADNc (RACE) y la secuenciación de ARN (RNA-
Seq), es deseable la adición de una cadena de C
al extremo 3' del ADNc. Este tipo de actividad de
TdT puede inducirse durante la síntesis de ADNc
al agregar altas concentraciones de iones de
magnesio y o manganeso a la reacción. Al
combinar la actividad TdT con primers específicos
diseñados, se puede modificar específicamente el
Ana Luisa Bravo
extremo de ADNc de 3' y el extremo de ARN de
5'. Algunos ejemplos de la utilización de estas
modificaciones de las secuencias incluyen la
introducción de un sitio de restricción para la
clonación del ADNc y la adición de adaptadores
para los procesos de secuenciación de ARN.
Plantilla de ARN
El ARN total se usa rutinariamente en la síntesis
de ADNc para aplicaciones como RT-qPCR,
mientras que los tipos específicos de ARN
(ARNm y miARN) pueden utilizarse para ciertas
aplicaciones como la construcción de
bibliotecas de ADNc y perfiles de miRNA.
Mantener la integridad del ARN es crítico y
requiere precauciones especiales durante la
extracción, el procesamiento, el
almacenamiento y el uso experimental. Las
mejores prácticas para prevenir la degradación
del ARN incluyen el uso de guantes, el pipeteo
con puntas de barrera para aerosoles, el uso de
reactivos y material de laboratorio libre de
nucleasas y la descontaminación de las áreas
de trabajo.
Para aislar y purificar ARN, hay una variedad de
estrategias disponibles dependiendo del tipo de
materiales de origen (sangre, tejidos, células) y
los objetivos de los experimentos. Los objetivos
principales del aislamiento son estabilizar las
moléculas de ARN, inhibir las ARNasas y
maximizar el rendimiento con métodos adecua-
dos de almacenamiento y extracción. Los méto-
dos de purificación deben eliminar los
compuestos que interfieren con la actividad
enzimática y los inhibidores comunes de las
transcriptasas reversas, como sales, iones
metálicos, etanol y fenol. Una vez purificado, el
ARN debe almacenarse a –80 ° C con ciclos
mínimos de congelación-descongelación.
Licenciatura en Biología Molecular | UAM Cuajimalpa
6
TRANSCRIPCIÓN REVERSA Y PCR
Técnicas de Biología Molecular II (20-I)
En ocasiones, pequeñas cantidades de ADN
genómico (ADNg) se pueden purificar junto con el
ARN. El ADNg contaminante puede interferir con
la transcripción reversa y puede dar lugar a falsos
positivos o menor detección en aplicaciones
sensibles como RT-qPCR.
Para eliminar el ADNg se agrega DNasa I al ARN
aislado, la ADNasa I debe eliminarse
completamente antes de la RT-PCR, ya que
cualquier enzima residual degradaría el ADN
monocatenario, los primers y el ADNc sintetizado.
A menudo, la inactivación de la DNasa I (con
EDTA y calor) o los procedimientos de
eliminación de enzimas producen degradación del
ARN o pérdida de muestra.
Como alternativa a la DNasa I, se utilizan las
ADNasas específicas de doble cadena para
eliminar el ADNg contaminante sin afectar el ARN
o los ADN monocatenarios. Su propiedad
termolábil permite una inactivación simple a una
temperatura relativamente suave (55° C) no tiene
impactos negativos. Dichas ADNasas termolábiles
de doble cadena específicas se pueden incubar
con el ARN durante 2 minutos a 37° C antes de
las reacciones de transcripción reversa.
Selección de los Primers
Para iniciar la transcripción reversa, las
transcriptasas reversas requieren de un primer
corto que se une a sus secuencias
complementarias en la plantilla de ARN y sirve
como punto de partida para la síntesis de una
nueva cadena. Dependiendo de la plantilla de
ARN y las aplicaciones posteriores, se pueden
usar primers de tres tipos básicos: primers oligo
(dT), primers aleatorios y primers específicos.
Los primers oligo(dT) consisten en una cadena de
entre 12 y 18 desoxitimidinas que se unen a colas
de poli (A) de ARNm eucariotas, que constituyen
Ana Luisa Bravo
solo el 1–5% del ARN total. Estos primers son la
opción óptima para construir bibliotecas de
ADNc a partir de ARNm eucariotas, para
la clonación de ADNc de cadenas completas y
para la amplificación rápida de los extremos de
ADNc en 3’ (RACE 3’). Debido a su
especificidad para las colas de poli(A), los
primers de oligo(dT) no son adecuados para el
ARN degradado, como el de muestras fijadas en
formalina, embebidas en parafina, ni para los
ARN que carecen de colas de poli(A), como
como ARN procariotas y microARN.
Dado que la síntesis de ADNc comienza en la
cola poli(A) 3’, los primers oligo(dT) pueden
causar un sesgo del extremo 3’. El ARN con una
estructura secundaria significativa también
puede interrumpir la síntesis de las cadenas de
ADNc completas, lo que da como resultado una
representación insuficiente de los extremos 5'.
Los primers oligo(dT) pueden modificarse para
mejorar la eficiencia de la transcripción reversa.
Por ejemplo, la longitud de los primers puede
extenderse a 20 nucleótidos o más para permitir
reacciones de transcripción reversa a
temperaturas más altas. En algunos casos, los
primers oligo(dT) pueden incluir bases
degeneradas como dN (dA, dT, dG o dC) en el
extremo 3’.
Licenciatura en Biología Molecular | UAM Cuajimalpa
7
TRANSCRIPCIÓN REVERSA Y PCR
Técnicas de Biología Molecular II (20-I)
Esta modificación evita el deslplazamiento de
poli(A) y bloquea el sitio de unión inmediatamente
arriba de la cola de poli(A). Estos primers se
denominan oligo(dT) anclado.
Los primers aleatorios, como lo dice su nombre,
son oligonucleótidos con secuencias de bases
aleatorias. A menudo tienen seis nucleótidos de
largo y generalmente se conocen como
hexámeros aleatorios, N6 o dN6. Debido a su
unión aleatoria (es decir, sin especificidad en el
ARN), pueden potencialmente hibridarse con
cualquier especie de ARN en la muestra. Por lo
tanto, estos primers pueden considerarse para la
transcripción inversa de ARN sin colas poli(A)
(ARNt, ARN no codificante, ARN pequeños, ARNm
de procariontes), ARN degradado y ARN con
estructuras secundarias conocidas (genomas
virales).
Si bien los primers aleatorios ayudan a mejorar la
síntesis de ADNc para la detección, no son
adecuados para la transcripción reversa de
fragmentos completos de ARN largos. El aumento
de la concentración de hexámeros aleatorios en
las reacciones de transcripción reversa mejora el
rendimiento de ADNc, pero da como resultado
fragmentos de ADNc más cortos debido a que
hay mayor número de sitios de unión en la misma
plantilla de ARN.
Además, el uso de primers aleatorios puede no
ser ideal para algunas aplicaciones, ya que se
puede sobreestimar del número de copias de
Ana Luisa Bravo
ARNm. A menudo se usa una mezcla de primers
oligo(dT) y aleatorios para lograr los beneficios
de cada tipo de cebador. Para los ensayos de
expresión de miARN, los hexámeros aleatorios
no son adecuados y deben diseñarse primers
especiales para la transcripción reversa de
miARN.
Los primers específicos ofrecen la unión más
específica en la transcripción reversa. Estos
primers están diseñados en base a secuencias
conocidas del ARN objetivo. Como los primers
se unen a secuencias de ARN específicas, se
necesita un nuevo conjunto de primers
específicos para cada ARN objetivo. Como
resultado, se requiere más ARN para el análisis
de múltiples ARN diana.
Otros Componentes
El buffer de reacción mantiene un pH y una
fuerza iónica favorables para la reacción, tam-
bién puede contener aditivos para mejorar la
eficiencia de la transcripción reversa.
Los dNTP generalmente deben estar a 0.5-1
mM cada uno, preferiblemente a concentracio-
nes equimolares. Se recomiendan dNTP de alta
calidad, recién diluidos, para garantizar una
transcripción reversa competente.
El DTT, un reactivo reductor, que a menudo se
incluye para la actividad enzimática óptima.
Licenciatura en Biología Molecular | UAM Cuajimalpa
8
TRANSCRIPCIÓN REVERSA Y PCR
Técnicas de Biología Molecular II (20-I)
La eficacia de la reacción puede verse
comprometida si el DTT u otros aditivos
precipitan; por lo tanto, los componentes de
reacción deben disolverse y mezclarse bien.
Generalmente se incluye un inhibidor de RNasa
en el buffer de reacción o se agrega a la reacción
de transcripción reversa para evitar la
degradación del ARN. Las RNasas pueden haber
sido purificadas conjuntamente durante el
aislamiento o introducidas durante la
configuración de la reacción. Existen varias
RNasas conocidas, y los inhibidores de RNasa
apropiados deben elegirse en función de su
modo de acción y requisitos de reacción.
El agua utilizada en las reacciones de
transcripción reversa debe estar libre de
nucleasas. Se recomienda agua libre de
nucleasas de una fuente comercial, o agua
tratada con DEPC (dietilpirocarbonato) para
eliminar cualquier ARNasa. Las RNasas
contaminantes no se pueden eliminar por
filtración simple y el agua esterilizada por
autoclave no es adecuada porque las RNasas son
estables al calor.
Ana Luisa Bravo
Reacción de Retrotranscripción
Las reacciones de transcripción inversa impli-
can tres pasos principales: la hibridación de los
primers, la polimerización de ADNc y la
desactivación de enzimas. La temperatura y la
duración de estos pasos varían según la elec-
ción del primer, el ARN objetivo y la transcripta-
sa reversa utilizada.
La hidridación del primer se lleva a cabo a 65° C
durante 5 min y luego se incuba en hielo duran-
te al menos 1 min. Esto ayuda a garantizar que
el ARN sea monocatenario y que el primer se
una al objetivo de manera eficiente. Después se
añaden la transcriptasa reversa, el buffer, los
dNTP y el inhibidor de RNasa.
Durante la polimerización del ADN la
temperatura y la duración de la reacción
pueden variar según la elección del primer y la
transcriptasa reversa utilizada. Con un primer
oligo(dT) (con Tm ~ 35-50° C), la reacción
puede incubarse directamente a la temperatura
óptima de la transcriptasa inversa (37-50° C).
Licenciatura en Biología Molecular | UAM Cuajimalpa
9
TRANSCRIPCIÓN REVERSA Y PCR
Técnicas de Biología Molecular II (20-I)

Los hexámeros aleatorios suelen tener una Tm
más baja (~10–15 ° C) debido a su longitud más
corta, por lo tanto, cuando se usan estos (solo o
en combinación con oligo(dT)), se recomienda
incubar la reacción a temperatura ambiente
(~25° C) durante 10 minutos.
segunda cadena. En la síntesis de la segunda
cadena de ADNc se recomiendan transcriptasas
reversas con una actividad mínima de ARNasa
H para maximizar la longitud y el rendimiento de
ADNc.

Entre las transcriptasas inversas hay diferencias

PCR con Transcripción
en su termoestabilidad, que a su vez determina la Reversa
temperatura de polimerización óptima. El tiempo
de polimerización depende de la procesividad de En RT-PCR, una población de ARN se convierte
la transcriptasa inversa. en ADNc por transcripción inversa (RT), y luego
el ADNc se amplifica por la reacción en cadena
La desactivación de la enzima es el paso final en de la polimerasa (PCR).
las reacciones de transcripción reversa. La
temperatura de desactivación puede estar en el
rango de 70–80° C, dependiendo de la
termoestabilidad de la enzima. La desactivación
generalmente se lleva a cabo durante un período
de 5 a 15 minutos, con una temperatura más alta
se requiere un tiempo más corto.

Síntesis de la Primera y Segunda Hebra

La síntesis de ADNc a partir de una plantilla de

ARN genera un híbrido de ADNc:ARN. Este
proceso se conoce como síntesis de ADNc de la
primer cadena. Si la actividad RNasa H está
presente (como en las transcriptasas inversas de
AMV y MMLV de tipo salvaje), el ARN del híbrido
ADNc:ARN se separa durante la síntesis de la
primera cadena. El ADNc de la primera cadena
puede usarse directamente en algunas
aplicaciones como RT-PCR, donde una ADN
polimerasa termoestable (ADN polimerasa Taq) El paso de amplificación de ADNc brinda
oportunidades para estudiar más a fondo las
replica la cadena complementaria del ADNc.
especies de ARN originales, incluso cuando
En la construcción y secuenciación de la tienen una cantidad limitada o expresado en
biblioteca de ADNc, la primer cadena de ADNc baja abundancia. Las aplicaciones comunes de
se usa como plantilla para generar ADNc de RT-PCR incluyen la detección de la expresión
doble cadena que representa al ARN objetivo. de genes, el examen de variantes de
Este proceso se conoce como síntesis de la transcripción y la generación de plantillas de

Ana Luisa Bravo Licenciatura en Biología Molecular | UAM Cuajimalpa

10
TRANSCRIPCIÓN REVERSA Y PCR
Técnicas de Biología Molecular II (20-I)
La RT-PCR se puede realizar en uno o en dos
pasos. Como su nombre lo indica, la RT-PCR de
un solo paso combina en un solo tubo de
reacción, la síntesis de ADNc de la primera
cadena y la PCR.
Esta configuración de reacción simplifica el flujo
de trabajo, reduce la variación y minimiza la
posible contaminación. La RT-PCR de un solo
paso permite un procesamiento más fácil de
grandes cantidades de muestras, haciéndola apta
para aplicaciones de alto rendimiento. Sin
embargo, la RT-PCR de un solo paso utiliza
primers específicos para la amplificación, lo que
limita el análisis a unos pocos genes por muestra
de ARN. Dado que la reacción depende de la
transcripción reversa y de las condiciones de
amplificación, la RT-PCR de un solo paso podría
ser menos sensible y eficiente en algunos casos.
Sin embargo, el uso de un primer específico
puede ayudar a maximizar el rendimiento del
ADNc objetivo y minimizar la amplificación de
fondo.
Ana Luisa Bravo
En la RT-PCR de dos pasos se realizan dos
reacciones separadas, comenzando con la
síntesis de ADNc (tubo 1) seguida de la
amplificación por PCR de una parte del ADNc
resultante (tubo 2).
La RT-PCR de dos pasos es útil para detectar
múltiples genes en una sola muestra de ARN. La
separación de las reacciones de RT y PCR
permite la optimización de las condiciones de
reacción para cada paso, así como la flexibilidad
para utilizar diversos tipos de primers en la
transcripción reversa (oligos (dT), hexámeros
aleatorios o primers específicos de genes) y en
la configuración de la PCR (por ejemplo,
elección de ADN polimerasa y componentes de
PCR). En comparación con RT-PCR de un solo
paso, las desventajas de la RT-PCR de dos
pasos son el aumento del tiempo de
experimentación, el aumento en el manejo y el
procesamiento de las muestras lo que
incrementa la probabilidad de contaminación y
variación de los resultados.
Licenciatura en Biología Molecular | UAM Cuajimalpa
11
TRANSCRIPCIÓN REVERSA Y PCR
Técnicas de Biología Molecular II (20-I)

Referencias

Baltimore D (1970) RNA-dependent DNA polymerase in virions of RNA tumour viruses. Nature 226(5252):1209–
1211.
Bridge JA (2016) Reverse transcription-polymerase chain reaction molecular testing of cytology specimens: Pre-
analytic and analytic factors. Cancer Cytopathol. doi:10.1002/cncy.21762.
Champoux JJ, y Schultz SJ (2009) Ribonuclease H: properties, substrate specificity and roles in retroviral rever-
se transcription. FEBS J 276(6):1506–1516.
Dombroski BA, Feng Q, Mathias SL et al. (1994) An in vivo assay for the reverse transcriptase of human re-
trotransposon L1 in Sacchromyces cerevisiae. Mol Cell Biol 14(7):4485–4492.
Gubler, U y Hoffman BJ (1983) A simple and very efficient method for generating cDNA libraries. Gene 25(2-
3):263–269.
Invitrogen Corp. (2002) High performance RT for reliability in every experiment.
Invitrogen Corp. (2003) Thermal stability and cDNA synthesis capability of SuperScript III reverse transcrip-
tase. Focus 25(1): 19–24.
Kawasaki ES, Clark SS, Coyne MY et al. (1988) Diagnosis of chronic myeloid and acute lymphocytic leukemias
by detection of leukemia-specific mRNA sequences amplified in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A 85(15):5698–
5702.
Kramer MF (2011) Stem-loop RT-qPCR for miRNAs. Curr Protoc Mol Biol Unit 15.10.
Mayer G, Müller J y Lünse CE (2011) RNA diagnostics: real-time RT-PCR strategies and promising novel target
RNAs. Wiley Interdiscip Rev RNA 2(1):32–41.
Okayama, H y Berg P (1982) High-efficiency cloning of full-length cDNA. Mol Cell Biol 2(2):161–170.
Poole JC, Andrews LG y Tollefsbol TO (2001) Activity, function, and gene regulation of the catalytic subunit of
telomerase (hTERT). Gene 269(1-2):1–12.
Schena M, Shalon D, Davis RW et al. (1995) Quantitative monitoring of gene expression patterns with a comple-
mentary DNA microarray. Science 270(5235):467–470.
Schrader C, Schielke A, Ellerbroek L et al. (2012) PCR inhibitors - occurrence, properties and removal. J Appl
Microbiol 113(5):1014–1026.
Temin HM y Mizutani S (1970) RNA-dependent DNA polymerase in virions of Rous sarcoma virus. Nature 226
(5252):1211–1213.
Thermo Fisher Scientific (2015) SuperScript IV Reverse Transcriptase.
Thermo Fisher Scientific [s.f.] Reverse Transcription Education en https://www.thermofisher.com/mx/es/home/life
-science/cloning/cloning-learning-center/invitrogen-school-of-molecular-biology/rt-education.html. Consultado
en junio 2020.
Wang Z, Gerstein M y Snyder M (2009) RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet 10
(1):57–63.

Ana Luisa Bravo Licenciatura en Biología Molecular | UAM Cuajimalpa

12