Primera Evaluación Fitopatología 2020-I

PARTE 2 (Componente práctico)

Nombre y código: Valentina Pulido Huertas - 10208383631

Por favor: a) Respetar los espacios dispuestos para las respuestas, no se aceptarán respuestas fuera del
espacio establecido. b) Realizar el parcial en letra Arial 11 e interlineado 1.15. c) Si se encuentran
respuestas iguales en otros exámenes será causal de anulación. d) Guarde su parcial con su nombre y
apellido indicando que es la evaluación práctica así (EP): Nombre Apellido_EP (Eje. Robert Koch_EP)

Pregunta 1. Describa los síntomas presentados en las siguientes imágenes y proponga el

posible agente causal dentro de bacterias fitopatógenas (si puede llegue a especie).

Se observan manchas necróticas pequeñas como

pecas, con bordes definidos y halos cloróticos en la
periferia de cada lesión, en espacios intravenales, con
avance de las lesiones, estas se fusionan dando lugar
a lesiones concéntricas de mayor tamaño.
Agente causal: Pseudomonas syringae

Se presentan lesiones superficiales, protuberantes con

aspecto corchoso, conocido como sarna común, las
lesiones tienden a tener una forma de estrella concava
presentando en el centro de la lesión grietas que
permiten la liberación de las esporas.

Agente causal: Streptomyces scabei

 Hay marchitamiento de la parte aérea, pero se
caracteriza por presentar un marchitamiento en verde,
además se observa una gran cantidad de exudados
bacterianos en el área de los haces vasculares del
tubérculo,

Agente causal: Ralstonia solanacearum

Se presenta un entorchamiendo en las hojas y

antocianescencia leve, atrofia en el desarrollo de las
ramas de la planta, similar al síntoma de roseta que
ocasiona un acortamiento de los entrenudos de la
planta, hojas pequeñas.

Agente causal: Spiroplasma mollicutes (MLO)

Pregunta 2. Realice un cuadro comparativo diferenciando los siguientes procedimientos:

aislamientos, cultivos puros y preparación de suspensiones de propágulos/unidades firmadoras
de colonia (UFC) entre bacterias y hongos, mencionando medios de cultivo, aspectos
relevantes en cada actividad entre otros.

BACTERIAS HONGOS
Aislamientos

Hay aislamientos directos cuando Cultivos hay Depende

puros si hay o no presencia de signos,
presencia de exudados bacterianos en la puede ser directo o indirecto
Se realizan
planta, diluciones
se toma seriadas
una muestra delaexudado Es necesario realizar
partir de respectivamente (procesovarios repiques
similar al de
una colonia en suspensión se va para obtener el hongo
y se realiza la siembra en medio de bacterias), si el patógeno es de suelo se puro si hay micelio.
extrayendo
cultivo. una alícuota
E indirecto si no hayhasta aislar de
presencia A partirelde suelo
la aísla esporas, y se
sesiembra en medio
requiere hacer
colonia. También en medio de cultivo, se de cultivo, obteniéndolo
exudados se desinfecta el material y se diluciones, y si el material esta muy a partir de
realiza el
macera estriado
para obtenerenunaplacas
pastadedePetri, suspensiones. Los
se contaminado,
la cual se montajes
inoculanse realizan
partes
obtiene
se tendrá la muestraa cultivar.
la muestra en micro cultivos.
directamente del susceptibles Se tienen
con el patógeno diferentes
(cebo).
cultivo a estudiar y se procede a realizar medios de cultivo para la siembra.
el rayado. 2
 Conteo de propagulos

Se emplea un espectrofotómetro, en el En la cámara de neubauer, se prepara la

que se tiene una fuente de radiación la
cual tiene una longitud de onda
seleccionada (600 nm) la cual pasa a
través de la suspensión previamente
preparada, se obtiene un registro que
depende de la turbidez de la suspensión
siendo este la cantidad de bacterias.
suspensión del inoculo y se pone en la
cámara, se observa en el microscopio y
dependiendo del tamaño de los
propágulos se puede contar en los 5
cuadros principales o solo en el central,
cada método cuenta con una formula
para conocer el número de propágulos.

Pregunta 3. A partir de la siguiente información realizar la cuantificación de inóculo de hongos

y bacterias y hacer la dilución correspondiente para tener la concentración y el volumen
deseado para realizar pruebas de patogenicidad. (Incluir en los cuadros todos los cálculos
realizados)

A. Se desea realizar una prueba de patogenicidad en tomates con el patógeno de postcosecha

Rhizopus sp., para lo cual se realizó un incremento de inóculo en cebada y posteriormente se
tomaron estructuras del patógeno en tubos estériles para hacer el conteo de conidias/mL, para
esto se sabe que son propágulos grandes. Se realizaron dos conteo (uno en cada cámara),
donde el primer valor fue de 480 conidias y el segundo de 490 conidias. Para la prueba de
patogenicidad por el método de inoculación por aspersión, se desea preparar una suspensión
de 1 x 105 conidias/mL. Se sabe que el volumen de inóculo que se debe tomar de la suspensión
madre para obtener esta concentración es 3.1 mL.

- Dentro de las pruebas se realizarán inoculaciones localizadas por gota con esta densidad de
inóculo (1 x 105 conidias/mL), empleando tres gotas de 10 μL por fruto, ¿Cuantas conidias se
depositan por sitio inoculado? ¿Cuál fue la densidad de inóculo empleada por fruto?

C 1=1 x 105 conidias/mL

0,01 mL∗1 x 10 5 conidias /mL
¿ conidias= =1000 coni dias
1 mL
- Por cada sitio inoculado se depositan 1000 conidias.
3000 conidias
Densidad de inóculo= =100 conidias/ μL
30 μL
- Por cada fruto se inocularán 100 conidias por cada microlitro.

3
- Usted debe determinar la viabilidad de los propágulos (conidias) ¿Cómo lo realizaría y como
se denominan estas pruebas?

Se realizan pruebas de germinación, se evalúa su capacidad de germinación en con una

siembra en PDA. Se parte del monocultivo→se realiza una suspensión de conidias →
siembra a una concentración conocida (1x10^5 conidias/mL) en una caja de Petri
empleando el asa bacteriológica → incubar por 24 h → se cortan pedazos del PDA →y se
identifica el patógeno en microscopio → se cuentan las conidias que tienen el tubo
germinativo del doble de su tamaño. Las que presentan esto, están germinadas. Se cuentan
todas las conidias y se hace la proporción. Esta será la proporción de Viabilidad.

B. En su trabajo semestral se requieren inocular 20 cebollas de bulbo con el patógeno Pantoea

agglomerans. Cada cebolla se debe inocular en dos puntos equidistantes un volumen de la
suspensión de 100 μL por punto y una densidad de 1x107 UFC/mL. Luego del aislamiento del
patógeno se realizó la multiplicación en caldo nutritivo y pasadas 12 horas en la evaluación de
la suspensión realizada en el espectrofotómetro se obtuvo una D.O de 0.143 (600 nm). Se sabe
por literatura que para esta especie a esta longitud de onda un valor de D.O = 0.3 equivale a 1
x 108 UFC/mL.

Ajuste de la suspensión de inóculo del patógeno teniendo en cuenta como volumen final, el
necesario para inocular el total de las cebollas.

V f =1 cebollax 200 μL .∗20 cebollas=4000 μL

D .O600 nm=0,143 ; por el factor de dilusión ( 10 ) se obtiene=1,43
1,43∗1 x 108 UFC /mL
Segúnla teoría D. O 600 nm = =476666666,7 UFC /mL
0,3
C 1=476666666,7 UFC / mL ; C 2=1 x 107 UFC /mL ; V 1=? ; V 2=4 mL
4 mL∗1 x 10 7 UFC /mL
V 1= =0,084 mL=84 μL
476666666,7 UFC /mL
Se requieren 84 µL de la suspensión de inóculo y agregarle 3916 µL de agua destilada para
completar el volumen requerido para inocular las 20 cebollas.

Pregunta 4. Usted está siendo entrevistado por un investigador para entrar a trabajar como
Ingeniero Agrónomo en el ICA, en el área de fitopatología. Para evaluar sus capacidades y
conocimientos le piden evaluar unas plantas de arroz procedentes de Perú, debido a que se
teme que está corresponda a una enfermedad cuarentenaria ausente en el país. Sin embargo,
debido a la actual situación presentada por el COVID-19, dicha prueba está siendo virtual. El

4
investigador le envía la siguiente imagen en la cual ordenó los síntomas del más leve al más
severo.

El investigador logra aislar el patógeno en medio AN. Él le dice que deben asegurarse
(completamente) de que estos aislamientos no correspondan a la bacteria cuarentenaria
(ausente) del género Xanthomonas. Por lo tanto, le pide que diseñe un esquema para
identificar la bacteria aislada. En una primera fase, solo se pueden realizar pruebas
bioquímicas, por lo tanto, usted debe proponer las pruebas a realizar para llegar al confirmar o
descartar el género problema. Complete el siguiente diagrama incluyendo al final otras pruebas
que le permitan identificar la especie de la bacteria/patovar. En los cuadros que tienen un
NUMERO en la parte superior escribir la prueba correspondiente y en los cuadros con LETRAS
en la parte superior, colocar 3 géneros que por el resultado se puedan descartar de ser el
posible agente causal.

Nota: dentro del diagrama disminuir la letra a Arial 8.

5
 R/
Tinción
de
Gramm
R/ Prueba de Hugh y
Leifson

R/ Xylophilus
R/ Pantoea,
Dickeya,Erwinia
R/ Fluorescencia en KB

R/Xanthomonas
R/:Agrobacterium,Bur
kholderia, Ralstonia

R/ Las pruebas moleculares para identificarlo por PCR, ola prueba de la catalasa.
Xanthomonas oryzae pv. oryzae