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Cellula B

Plasmacellula

I B attivati si differenziano in
plasmacellule
Morfologia della plasmacellula

La plasmacellula matura ha un nucleo eccentrico ed un


abbondante citoplasma basofilo.
Immunoglobuline o anticorpi
(proteine che legano l’Ag)

•Effettori specifici della RI adattativa umorale


Immunoglobuline o anticorpi
(proteine che legano l’Ag)

• Glicoproteine multimeriche
• Di membrana o secrete
Immunoglobuline o anticorpi
(proteine che legano l’Ag)

Anticorpo: termine coniato da Karl Landsteiner nel 1900 per definire la


sostanza che reagiva in maniera specifica con i batteri

•Esiste componente nel siero in grado di precipitare le


tossine ed agglutinare i batteri: (antitossina, agglutinina,
precipitina)
Emil Von Behring
(premio Nobel 1901)
e Shibasaburo Kitasato
Berlino

• siero di conigli precedentemente immunizzati


per la tossina tetanica potevano trasferire la
loro immunità ad animali non immunizzati
• Paul Ehrilich studio analogo sulla difterite
• Emile Roux (Istituto Pasteur) dimostra
efficacia dell’antitossina nel trattamento dei
bambini esposti al contagio da bacillo difterico
1939 A. Tiselius E.A. Kabat
•Misero a punto un metodo elettroforetico per separare le
diverse proteine del siero.
Elettroforesi su carta
Molecole con carica netta positiva → catodo (-)
Molecole con carica netta negativa → anodo (+)
La mobilità elettroforetica dipende da:
• Intensità del campo elettrico
• Coefficiente frizionale (dimensione e carica della particella)

Volendo effettuare in
siero-elettroforesi si
impiega un tampone a pH
alcalino il quale
conferisce alle molecole
proteiche una carica
negativa rendendole
solubili senza sottoporle a
denaturazione.
Elettroforesi delle proteine del siero

Siero, non plasma, per eliminare l’interferenza del fibrinogeno


Separazione delle proteine in base alla loro carica

• Questa tecnica ha permesso


di separare le albumine e le
altre frazioni del siero, le
alfa, beta e gamma globuline

in ordinata i
valori
dell'assorbanza
ed in ascissa la
posizione delle
bande.
1939 A. Tiselius E.A. Kabat

• La frazione delle gamma


globuline era presente in
quantità più elevata nei
sieri di animali immunizzati.
Le immunoglobuline sono presenti nella
frazione delle gamma globuline del siero
Bande α , β e γ

•Gli anticorpi presenti in questa frazione di


globuline immuni sono stati chiamati
immunoglobuline
Separazione delle proteine
plasmatiche
Harvard University, Cohn e alcuni colleghi
intrapresero una ricerca finalizzata a individuare il
metodo migliore per la separazione delle proteine
plasmatiche in frazioni stabili dotate delle loro
proprietà biologiche naturali,
(la tecnica più efficiente consisteva nel sottoporre il plasma a
centrifugazione e poi a raffreddamento a 0°C. Dopo aggiunta di
etanolo e tampone, la temperatura andava ridotta ulteriormente fin
quasi al punto di congelamento; poi si aumentava il contenuto di
etanolo fino a raggiungere il livello dell’8% in volume, si portava la
temperatura a –3°C, il pH a 7,2 e la forza ionica a 0,14.
In questa maniera si otteneva la precipitazione di tutte le
componenti biologiche del sangue in quattro frazioni, in una sola
delle quali (la seconda) si localizzava la quantità maggiore di gamma-
immunoglobuline, nel 1964 ridenominate IgG.)
Gli anticorpi possono essere separati in base al PM

Ultracentrifugazione delle immunoglobuline su gradiente di


saccarosio
ha permesso di risalire al peso delle immunoglobuline rappresentato come
coefficiente di sedimentazione S
(maggiore è il peso della molecola più è elevato il valore di S)

La porzione gamma globulinica venne separata in due frazioni al elevato


coefficiente di sedimentazione a 20°C in acqua:
19S (PM 950.000 dal)
7S (PM 150.000 dal)
Rodney Porter Gerald Edelman (anni ’50-’60) (Premio Nobel 1972)
Digestione proteolitica della frazione 7s (150.000) con papaina (enzima
derivato dalla papaya oggi usata come tenerizzatore della carne)
Proteina purificata: 150.000 dal

Digestione proteolitica con papaina

Purificazione con resina a scambio anionico di carbossimetilcellulosa che


consente di separare le proteine in base alla loro carica

50kDa 50kDa

Le frazioni I e II erano in grado di legare


l’antigene ma non di ma non di precipitarlo
50kDa
o agglutinarlo mentre la frazione III di
formare cristalli a bassa forza ionica e a
pH neutro
Rodney Porter Gerald Edelman (anni ’50-’60) (Premio Nobel 1972)
Alfred Nisonoff( 1923-2001)
continua il lavoro di Rodney Porter

Proteina purificata: 150.000 dal

Digestione proteolitica con


pepsina

Prodotto di 2/3 delle gamma globuline


totali in grado di precipitare l’antigene
indicando che doveva essere almeno
bivalente

F(ab)’2
F(ab)’2 = frammento dimerico dell’Ig in contenente i due siti di
legame dell’antigene
La digestione delle IgG con papaina o pepsina, ha
permesso di costruire un modello di struttura delle Ig, perché
a determinati frammenti proteolitici corrispondono funzioni
ben definite

Proteolytic fragments of an IgG molecule. IgG


molecules are cleaved by the enzymes papain (A)
and pepsin (B) at the sites indicated by arrows.
Papain digestion allows separation of two
antigen-binding regions (the Fab fragments) from
the portion of the IgG molecule that binds to
complement and Fc receptors (the Fc fragment).
Pepsin generates a single bivalent antigen-
binding fragment, F(ab¢)2.
Proteina purificata: 150.000 dal

Per rompere la
Riduzione e alchilazione per struttura
rompere ponti disolfuro quaternaria
(dissociare le
subunità)

gel filtrazione: 50.000 dal + 25.000 dal


• 2 Catene leggere 25kD
• 2 Catene pesanti 50-70kD
Rodney Porter

Ab riconoscevano
capra solo catene H

coniglio

Ab riconoscevano
capra catene H e catene L

Anticorpi prodotti contro il frammento fab riconoscevano


sia le catene L che le catene H mentre anticorpi prodotti
contro il frammento fc riconoscevano solo le catene H
• 2 Catene leggere 25kD
• 2 Catene pesanti 50-70kD
Mieloma multiplo Proteine di Bence-jones
Neoplasia plasmacellule secernenti
anticorpi (<65000dal)

NH3+ NH3+

Sequenza aa di tutti i
VL VL
mielomi disponibili

CL CL

COO- COO- Tutte le catene leggere


variano tra di loro nella
K λ
(60%) (40%)
parte NH3+ terminale ma
non nella COO- terminale
Plasmacitomi 1) Sequenza aa
coltivati in vitro
2) Produzione di anticorpi monoclonali per
Neoplasia plasmacellule determinare la classe diversa o isotipo
secernenti anticorpi

NH3+

VH

Sequenza aa
CH
δ , γ , µ , ε
α (440aa) ISOTIPO
(330aa)
CH

CH

COO-
Classi (o isotipi) anticorpali

classe Catena sottoclassi Catena


pesante leggera
IgG γ γ 1, γ 2, κ , λ
γ 3, γ 4
IgM µ κ , λ
IgA α α 1, α 2 κ , λ
IgE ε κ , λ
IgD δ κ , λ
Markers isotipici:
• permettono di classificare le
catene pesanti di una specie
animale in classi e sottoclassi e
quelle leggere in tipi e sottotipi.

• Se iniettati in un’altra specie si


creano Ab.
Markers allotipici:
• esistono alleli multipli di
geni isotipici, piccole
differenze aa. Non si
creano Ab in animali.

• Politrasfusi e poligravide
vedono queste piccole
differenze.
• 2 Catene leggere 25kD
• 2 Catene pesanti 50-70kD
Sito di legame con l’antigene
Sito di legame con l’antigene
Regioni variabili o cornice (FR1, FR2, FR3, FR4) ed
ipervariabili (CDR1, CDR2, CDR3)
Markers idiotipici:
determinanti antigenici

presenti sulle regioni variabili
ed ipervariabili.
• Noi stessi fabbrichiamo Ab che
riconoscono questi siti.
• Rete idiotipica.

• Ab anti zona cornice


(inducono una modificazione
conformazione: azione inibitoria o
nulla)
• Ab anti parte ipervariabile
(competono con Ag, possono inibire il
legame)

Network idiotipico
Flessibilità della regione
cerniera
• Conferisce l’adattabilità della molecola alle diverse strutture
antigeniche
Regione cerniera

IgA, IgD, IgG IgE, IgM


CH1/ CH1 CH1/ CH1
Regione cerniera CH2/ CH2
CH2/ CH2 CH3/ CH3
CH3/ CH3 CH4/ CH4
Funzioni effettrici mediate dal frammento Fc:
Fissazione del complemento
Funzioni effettrici mediate dal frammento Fc:
opsonizzazione
Funzioni effettrici mediate dal frammento Fc:
ADCC (antibody dependent cell cytotoxicity)
Recettori Fc dei leucociti
sCD23 induce un aumento
MASTCELLULE della produzione di IgE da
BASOFILI parte di B linfociti
Struttura delle classi (o isotipi)
anticorpali
classe Catena sottoclassi Catena
pesante leggera
IgG γ γ 1, γ 2, κ , λ
γ 3, γ 4
IgM µ κ , λ
IgA α α 1, α 2 κ , λ
IgE ε κ , λ
IgD δ κ , λ
180.000 Da

• Primo isotipo secreto nel corso della RI


primaria e prime ad essere espresse
come Ig di membrana dai linfociti B che
maturano nel fegato fetale e nel midollo
osseo

• Concentrazione sierica 1 mg/ml


• Bassa affinità ed elevata avidità
PM 900.000Da (19s) • Molto efficaci nell’attivare il C
(Catena J = 15kDa) • Mucose e latte materno
Esameri molto più potenti nell’attivare il

C
IgG

• PM 150.000 (7s)
• Concentrazione sierica 10 mg/ml
• 1/3 territori extravascolari
• Attivano il C
• Poco avide ma molto affini
• (rimuovono tossine e virus)
Concentrazione sierica:
3mg/ml
(monomeriche 160.000-170.000
Dal 8% zuccheri)

70.000Dal latte, saliva, lacrime, muco


(dimeri 400.000 Dal o tetrameri
600.000 Dal)

IgA2 circa 20aa in


Endocitosi
R-dip meno nella zona
cerniera di IgA1
Zona
cerniera

1u internazionale = 2,4 ng/ml


30µ g/ml
80-100IU
Nessuna funzione effetrice nota
Difesa contro i parassiti
Allergie
IgG 10 mg/ml

IgA 3 mg/ml

IgM 1 mg/ml

IgE 100IU
1 IU=2,4ng/ml
IgD 30µ g/ml
Glicosilazione

• Importante per
l’EMIVITA
• CITOFILIA
• Mantengono la
conformazione
allosterica
Superfamiglia delle
immunoglobuline
I CINQUE
ISOTIPI (O CH1 CH1
CLASSI) CH2 CH2
DELLE CH3 CH3
IMMUNO- CH4
GLOBULINE
IgM IgD
nella forma di
membrana

CH1 CH1
CH1
CH2 CH2
CH2
CH3 CH3
CH3
CH4

IgG IgE IgA


Jules Bordet 1890

• è necessaria la presenza di più fattori sierici per uccidere i


batteri
• Il siero immune fresco contro il Vibrio Cholerae era in grado di
distruggere i batteri ma se preriscaldato a 58°C non era più in
grado di eliminare il patogeno
• L’aggiunta di siero fresco non immune ricostituiva l’attività litica
• (gli anticorpi prendono parte alla fase di riconoscimento
specifico mentre la funzione effettrice dipende dal
reclutamento di altre proteine sieriche)