Tolerancia bacteriana a las nanopartículas de plata (Snps): Aeromonas punctata aislada del ambiente de

aguas residuales.

El uso de nanopartículas de plata (Snps) está aumentando en un gran número de productos de

consumo. Por lo tanto, la posible acumulación de nanopartículas en el medio ambiente se está
convirtiendo en una gran preocupación. Aeromonas punctata aislada de aguas residuales mostró
tolerancia a 200 μg/ml Snps. Los datos de cinética de crecimiento de A. punctata tratada con
nanopartículas fueron similares a los de la ausencia de nanopartículas. Hubo una reducción en la
cantidad de exopolisacáridos (EPS) en el sobrenadante de cultivo bacteriano después de la interacción
nanopartícula-sobrenadante. El recubrimiento EPS de las nanopartículas se confirmó mediante análisis
UV-visible, XRD y FTIR comparativo. Los Snps con capucha de EPS mostraron menos toxicidad para
Escherichia coli, Staphylococcus aureus y Micrococcus luteus en comparación con los no cortados. El
estudio sugiere el recubrimiento de nanopartículas por EPS producida por bacterias como un probable
mecanismo fisiológico de defensa.

Introducción

Las nanopartículas de plata (SNP) son potenciales candidatas a una fuerte actividad antimicrobiana y se
utilizan en cantidades significativas en productos de consumo, en la industria alimentaria para el
almacenamiento, envasado y procesamiento [1], en textiles [2], en aplicaciones médicas para productos
para el cuidado de heridas y dispositivos terapéuticos [3], y en diagnósticos y entrega de medicamentos
[4, 5]

Pero el aumento de las concentraciones de SNP con propiedades físicas y superficiales variadas podría
suponer una amenaza para la salud humana y medioambiental [6]. Impellitteri et al. 2009 [7] revelaron
que los SNP impregnados en ropa y sistemas de lavado pueden filtrarse fácilmente a las aguas residuales
durante el lavado, lo que podría interrumpir bacterias útiles utilizadas en instalaciones de tratamiento
de aguas residuales o poner en peligro organismos acuáticos en lagos y arroyos.

Los estudios de toxicidad in vitro e in vivo en especies de mamíferos demostraron que los SNP tienen la
capacidad de entrar en las células y causar daño celular [8]. Pueden provocar aberraciones
cromosómicas y daños en el ADN y son capaces de inducir la detención por proliferación en las líneas
celulares [9].
El uso indiscriminado de nanomateriales de plata en productos comerciales conduce a su liberación en
el medio ambiente y, en última instancia, daña las comunidades microbianas del ecosistema [10]. La
liberación de SNP que entraron en las plantas de tratamiento de aguas residuales se estimó en 270 t/
año [11]. Debido a esto, las bacterias sensibles se perturban, además de dañar algunas formas
beneficiosas también. En última instancia, los SNP liberados desestabilizan el funcionamiento de los
ecosistemas [11]. Por otra parte, algunas bacterias resistentes existen debido a su naturaleza adaptativa
[12]. La hipótesis del trabajo fue estudiar el principio subyacente a la tolerancia bacteriana a los Snps y
su posible mecanismo.

Materiales y métodos

Materiales

Todos los productos químicos y medios fueron obtenidos de Himedia Laboratories Ltd., Mumbai, India.
La bacteria se aisló de las aguas residuales (Vellore, India). Los Snps manufacturados se obtuvieron de
Sigma Aldrich, EE.UU. Las nanopartículas se dispersaron mediante un procesador ultrasónico a una
frecuencia de 132 kHz (Crest, EE.UU.).

Caracterización de Snps Los Snps se caracterizaron con espectroscopia visible UV y microscopio

electrónico de transmisión de alta resolución (TEM; Tecnai G-20) después de la dispersión en medio LB.
Las muestras se prepararon colocando una gota de suspensión homogénenea sobre una rejilla de cobre
con una película de carbono lacey y secado al aire. El tamaño medio de partícula se analizó a partir de
las imágenes digitalizadas con el software Image Tool. Las características morfológicas de los SNP
fabricados se caracterizaron por microscopia electrónica de barrido (SEM; FEI Sirion, Eindhoven, Países
Bajos).

La superficie se midió utilizando un analizador de superficie Smart Sorb 93 de un solo punto BET (Smart
Instruments Co. Pvt. Ltd., Mumbai, India). Las partículas recibidas también fueron sometidas a un
análisis de difracción de rayos X (XRD) utilizando un difractómetro JEOL-JDX 8030. El objetivo era Cu Kα (
λ = 1.54 Å). El generador funcionaba a 45 kV y con una corriente de 30 mA. El rango de exploración (2 θ )
fue seleccionado de 10 a 100 a.

Aislamiento e identificación de microorganismos.

La muestra recogida en el medio cloacal (1 ml) se cultivó en caldo LB suplementado con 100 µg/ml de
Snps e incubado a 30 « C durante 24 h con agitación (200 rpm). El cultivo bacteriano aislado del medio
mencionado fue identificado mediante el sistema de identificación microbiana Sherlock (MIS) siguiendo
el método de análisis de Wintzingerode et al. [13] y análisis 16S rRNA.

El análisis de secuenciación de genes rRNA de 16S se realizó utilizando los cebadores 27F (5
-AGAGTTGATCCTGGCTCCAG3 ) y 1492R (5 -GGTTACCTTGTTACGACTT-3 ) [14]. Los nucleótidos rRNA 16S
casi completos fueron alineados y las identidades bacterianas fueron deducidas por la búsqueda BLAST
para determinar sus parientes más cercanos. Un árbol filogenético fue construido mediante el uso de
Clustalw.pls cheque.
Difusión del disco y método de difusión del agar

La sensibilidad bacteriana a los Snps se probó mediante el método de difusión del disco (25, 50 y 100 µg
por disco) [15] y el método de difusión del pozo (10, 25, 50, 100 y 200 μg/pocillo) [16]. Se midió el
diámetro medio de la zona de inhibición que rodea el disco/pozo. Se emplearon seis réplicas para todas
las concentraciones. Las bacterias Escherichia coli (ATCC 13534 y ATCC 25922), Staphylococcus aureus
(ATCC 25923) y Micrococcus luteus (aislado clínico) se utilizaron como control positivo. El método de
difusión del agar se realizó con solución de nitrato de plata a concentraciones de 10, 25, 50, 100, 250 y
500 µg/ml.

Método de recuento de la placa de dilución

Las diferentes concentraciones de Snps (10, 25, 50, 100 y 200 µg) se aplicaron uniformemente en la
superficie Se determinó el agar LB y las unidades formadoras de colonias (UFC) para cada concentración.
Se utilizaron como control placas libres de nanopartículas incubadas en las mismas condiciones. Se
promediaron los recuentos de seis placas correspondientes a una concentración particular.

La concentración de iones de plata

Snps dispersados en caldo LB a 100 y 200 µg/ml fueron centrifugados a 15.000 g durante 30 min. El
sobrenadante transparente fue cuidadosamente recogido y filtrado a través de un filtro estéril de 0,1
µm. Las concentraciones de iones se midieron mediante un AAS después de la acidificación en ácido
nítrico al 1% [17].

Estudio de cinética de crecimiento.

Para examinar el perfil de crecimiento bacteriano en presencia de SNP a concentraciones crecientes

(10-200 µg/ml), el caldo LB se sonicated durante 30 minutos después de añadir los SNP para evitar la
agregación de nanopartículas. Posteriormente, se inocularon los frascos con 1 bucle lleno de cultivo
bacteriano recién preparado e incubaron en un agitador orbital a 200 rpm y a temperatura ambiente (30
[ C).

Se utilizaron medios libres de nanopartículas como control. El crecimiento bacteriano se midió cada 2 h
utilizando un colorímetro (Elico CL 157) a 600 nm. En este experimento se incluyeron un control positivo
(frasco que contiene nanopartículas y medios nutritivos, desprovisto de inóculo) y un control negativo
(frasco que contiene inóculo y medio nutritivo, desprovisto de nanopartículas).

El valor de absorción para el control positivo se sustrajo de los valores experimentales (frascos que
contenían medios nutritivos, inóculo y nanopartículas). Los perfiles de crecimiento de las cepas de
control positivo se registraron a una concentración de 100 µg/ml de Snps. Los estudios de crecimiento
de todas las bacterias se realizaron con las cantidades correspondientes de iones de plata que fueron
liberados durante el tiempo de dispersión de Snps en el medio.

Análisis FTIR

Un bucle lleno de cultivo de A. punctata fue inoculado en 50 ml de caldo LB y cultivado durante 48 h a

temperatura ambiente, bajo agitación a 180 rpm. Se extrajeron los exopolisacáridos (EPS) [18] y se
cuantificaron [19]. El EPS purificado [18] fue sometido a análisis FTIR (espectrómetro Perkin-Elmer - un
instrumento en modo de reflectancia difusa a una resolución de 4 cm-1 en pellets Kbr).

Al mismo tiempo, se recogió otra parte del sobrenadante del cultivo de A. punctata (10 ml) e interactuó
con 100 µg/ml de Snps durante 4 h, en un agitador rotatorio a 200 rpm para mantener una interacción
adecuada con nanopartículas. Después de la interacción, la mezcla fue centrifugada y Los pellets de
nanopartículas fueron separados, liofilizados y sometidos a análisis FTIR. Se recogió el sobrenadante y se
cuantificó el EPS que quedó en el sobrenadante del cultivo después de la interacción con los SNP. La
extracción EPS y el análisis FTIR también se realizaron con cepas de control positivo.

Análisis espectral UV-visible y análisis XRD

El EPS purificado se redessolucionó en agua desionizada (DI) e interactuó con diferentes

concentraciones de SNP (10-100 µg/ml), en un agitador rotativo a 200 rpm para mantener una
interacción adecuada con las nanopartículas. La absorbancia de Snps se midió después de 4 h de
interacción, usando un espectrofotómetro visible UV (Shimadzu UV - 1700, Japón) a 200-700 nm.
Después de la interacción, los SNP fueron separados, liofilizados y analizados por XRD (Panalytical Xpert
Pro, Eindhoven, Países Bajos).

Para examinar el efecto de las nanopartículas recubiertas de EPS, los SNP recubiertos y no recubiertos
interactuaron con cepas de control positivo a una concentración de 100 µg/ml según el método descrito
anteriormente.
Resultados y discusión

La caracterización de la espectroscopia UV-visible de Snps es una de las técnicas utilizadas para la

caracterización estructural de Snps. Los espectros de absorción visible UV para los SNP fabricados
mostraron una banda de absorción a 425 nm (fig. 1). Se determinó que la superficie de los SNP
fabricados era . 26 m2/g. Las imágenes TEM mostraron que los SNP eran esféricos en forma y
polidispersos con diámetros en el rango de 5 a 40 nm. Las imágenes del SEM mostraron Snps cuyo
tamaño era inferior a 40 nm.

El patrón XRD de los SNP dispersos se caracteriza por un pico mayor a 38.115 y picos menores a 44.299,
64.443, 77.397, 81.541 y 98.241. Esto confirma la estabilidad de las nanopartículas en el medio LB.

Los estudios de identificación microbiana del MIS y el análisis de rRNA de 16S mostraron que nuestro
aislado bacteriano de aguas residuales era A. punctata (datos no mostrados). Fig. 2 representa el árbol
filogenético con valores de la correa de arranque. La búsqueda BLAST muestra un 99% de similitud con
la cepa A. punctata. La secuencia rRNA 16S fue presentada a Genbank (número de adhesión GQ401237)
y el organismo fue nombrado A. punctata VITSCA01

Pruebas antimicrobianas Las propiedades antimicrobianas de los SNP frente al aislado A. punctata se
investigaron mediante ensayo de difusión de disco, método de difusión de agar well diffusion, método
de recuento de placas de dilución y estudios de cinética de crecimiento. El disco impregnado con Snps
en la placa de cultivo A. punctata no dio zona de inhibición. Tampoco se observó zona de inhibición en el
método de difusión de agar well (fig. 3). En la prueba de difusión de disco, E. coli 13534, E. coli 25922 y
M. luteus (aislado clínico) mostraron una pequeña inhibición a 50 µg/disco. Sin embargo, S. aureus
25923 dio una zona de inhibición a 100 µg/disco.

En el método de difusión de agar bien, se observó la zona de inhibición en todos los organismos de
control a 100 y 200 µg (fig. 3). En ambos experimentos se utilizaron tres medios de agar diferentes (agar
Muller Hinton, agar Nutrient y agar LB). No hubo diferencias en la actividad de los Snps observados en
todos los medios examinados. El estudio de Ruparelia et al. [15] ha demostrado que un disco
impregnado con Snps esféricos mostró una gran zona de inhibición para E. coli, S. aureus y Bacillus
subtilis.

El estudio con Snps esféricos en el rango de tamaño de 10 a 100 nm de diámetro exhibió una excelente
actividad antibacteriana contra las bacterias S. aureus, B. cereus, E. coli y Pseudomonas aeruginosa, con
el método de difusión de agar well, y se observaron zonas de limpieza alrededor de los agujeros con
crecimiento de bacterias [16].

A. punctata mostró tolerancia al nitrato de plata en concentraciones de 100, 250 y 500 µg/ml. Se
observó una zona estrecha a 500 µg/ml que medía aproximadamente 1 mm de diámetro (no se
muestra). Esto indica que A. punctata fue resistente a 100 y 250 µg/ml de plata y mostró la
menor resistencia a 500 µg/ml. Los estudios demostraron que el mecanismo de resistencia está
mediado por plásmidos [20-22].
Cuando las nanopartículas estaban presentes en la superficie de las placas de agar nutriente,
podrían inhibir más completamente el crecimiento bacteriano en comparación con el caldo
líquido. El crecimiento de A. punctata en placas de agar suplementadas con diferentes
concentraciones de Snps no se encontró diferente en comparación con la placa de control. Los
recuentos bacterianos observados (error estándar medio) en las placas de agar fueron 84.6 0.8,
84.8 0.9, 83.3 0.8, 84.8 0.6, 84.3 0.9 y 83.5 0.8 para control, 10, 25, 50, 100 y 200 µg de Snps,
respectivamente (no mostrado).
Fig. 4 muestra las curvas de crecimiento bacteriano de las concentraciones de Snps. En
comparación con el control, no se observó inhibición del crecimiento en todas las
concentraciones de Snps ensayadas. El presente estudio con cepas de control positivo mostró
una gran reducción en el crecimiento de la bacteria (fig. 5), similar a los estudios de Sondi y
Salopek-Sondi [23]. Fig. 6 muestra la interacción de A. punctata con Snps. La mayoría de los
estudios informaron de la inhibición del crecimiento bacteriano por nanopartículas a varias
concentraciones óptimas [15, 23-25].
El uso excesivo de nanopartículas en productos de consumo y su lavado en sistemas de
alcantarillado podría inducir resistencia a las cepas ambientales [26]. En la dispersión, una
cantidad sustancial de iones de plata fue rápidamente liberado de Snps en el medio LB. A 100
µg/ml de Snps, se liberaron 1,4 0,002 µg/ml de iones de plata, y 200 µg/ml de Snps liberaron 2,9
0,01 µg/ml de iones de plata en el medio LB. Para evaluar el efecto tóxico de los iones de plata
liberados durante la dispersión de Snps, el medio LB fue centrifugado a 15.000 g durante 30 min
después de la dispersión. Los Snps se establecen y los iones de plata permanecen en el medio.
Los estudios de cinética de crecimiento de A. punctata no mostraron ninguna reducción del
crecimiento.
en el medio anterior. A. punctata no puede ser afectado por estos iones de plata debido a su
naturaleza resistente antes mencionado. Los estudios de cinética de crecimiento con E. coli
(ATCC 13534, ATCC 25922), S. aureus (ATCC 25923) y M. luteus (aislado clínico) mostraron sólo
una reducción de crecimiento insignificante. Esto sugiere que podría haber algún otro
mecanismo detrás de la acción de los SNP. La liberación de iones de plata de Snps puede variar
dependiendo del medio utilizado para la dispersión.
Morones et al. [25] informaron que los mecanismos bactericidas de los SNP y los iones de plata
son claramente diferentes. Para el tratamiento con nitrato de plata, se formó una región central
de bajo peso molecular dentro de las células como mecanismo de defensa, mientras que para el
tratamiento con nanopartículas no se observó tal fenómeno, aunque se encontró que las
nanopartículas penetraban la pared celular [23].
Papel del EPS en el mecanismo de defensa Los resultados de la cuantificación del EPS mostraron
que la cantidad de EPS presente en el sobrenadante tras la interacción con SNP fue menor (82,3
0,9 µg/ml) en comparación con la cantidad de EPS extraída antes de la interacción (113,7 0,6
µg/ml). Se observó una reducción de la cantidad de EPS en el sobrenadante después de la
interacción Snps-sobrenadante. Este resultado sugiere que el EPS podría haber recubierto los
SNP durante la interacción.
El perfil espectral FTIR obtenido en la región 1000- 1200 cm-1 reflejó principalmente la
absorción de azúcares presentes en el EPS. Los estudios mostraron que la espectroscopia FTIR
proporciona un medio rápido y fácil para indicar la naturaleza de los principales componentes
de A. punctata EPS (Fig. 7a). Los tres picos cerca de 1000-1200 cm-1 indican que el polisacárido
era α-piranosa. Después de la interacción de los Snps con el sobrenadante del cultivo de A.
punctata, el espectro FTIR coincidió con todos los valores máximos del EPS extraído (Fig. 7b). El
recubrimiento con EPS durante la interacción de Snps con el sobrenadante de cultivo bacteriano
se confirmó mediante la evaluación del valor pico de FTIR en ambos casos.
Se encontraron grupos hidroxilo, carboxilo, carbonilo y amina en los espectros FTIR de EPS. Los
espectros FTIR de EPS secretados por E. coli (ATCC 13534, ATCC 25922) y S. aureus fueron
completamente diferentes de los de la prueba.

Los SNP de metal noble exhiben propiedades ópticas únicas y sintonizables, debido a su
resonancia de plasma superficial (SPR) que depende de la forma, tamaño y distribución de
tamaño de las nanopartículas. Cuando los SNP se interactuaron con EPS extraídos del
sobrenadante de cultivo de A. punctata, el análisis espectrofotométrico visible UV dio un pico a
394 nm para los SNP. Por otra parte, el valor máximo de λ para la dispersión SNP no fraccionada
se observó a 425 nm. Se observó una disminución de la absorbancia a 425 nm cuando se
interactuó con EPS. Después de la interacción con EPS, se observó un cambio de pico (cambio
azul). Esto podría deberse a la acción repelente de Epscapped Snps. La ruptura de los
aglomerados/flocs resultaría en un cambio azul. El desplazamiento azul (hacia la longitud de
onda inferior) en el valor máximo λ tras la interacción con EPS demostró que la forma de las
nanopartículas no sufrió modificaciones distintas. El desplazamiento azul indica que la
disminución de tamaño podría deberse al recubrimiento con EPS que impide una mayor
aglomeración de SNP.
El recubrimiento EPS fue confirmado por el análisis XRD. El estudio XRD corroboró la adsorción
de EPS en la superficie de nanopartículas; la cobertura fue tan fuerte que ninguna banda
característica de plata pudo ser revelada a través de XRD, mientras que los Snps fabricados
dieron seis picos en el análisis XRD. Ravindran et al. [27] informaron que, en el análisis de XRD,
los Snps que interactuaron con BSA no dieron el pico característico de plata, debido al
recubrimiento de Snps con BSA.

Ensayo de toxicidad de Snps recubiertos de EPS y no recubiertos (100 µg/ml) con cuatro cepas
diferentes, E. coli 13534, E. coli 25922, S. aureus 25923 y M. luteus (aislado clínico), mostró una
gran reducción en la tasa de crecimiento de estas bacterias cuando se tratan con nanopartículas
sin recubrimiento en comparación con el perfil de crecimiento de control (sin nanopartículas).
Pero no se observó mucha reducción cuando el medio de cultivo fue suplementado con Snps
recubiertos, indicando menor toxicidad (fig. 5).
La nanoplata puede comprometer el control de bacterias dañinas. Además de que puede afectar
a las bacterias beneficiosas presentes en el suelo y plantas de tratamiento de aguas residuales.
Este estudio confirmó que la liberación de nanopartículas en las aguas residuales de una planta
de tratamiento de aguas residuales no afectaría a todos los microbios beneficiosos implicados
en el proceso de tratamiento de aguas residuales. A. punctata podría proteger la supervivencia
de los microbios beneficiosos al proporcionar un EPS tapa a las nanopartículas. Por otra parte,
los SNP con EPS pueden utilizarse para aplicaciones comerciales, como la administración de
medicamentos y la biosensión.
Conclusiones A. punctata aislada de aguas residuales mostró tolerancia a Snps a las
concentraciones de ensayo de hasta 200 μg/ml. Los resultados de este estudio sugieren que,
cuando se cultivan en presencia de concentraciones crecientes de SNP, los aislamientos
ambientales pueden adquirir tolerancia/resistencia. Una de las implicaciones importantes de
nuestros hallazgos es que las predicciones futuras sobre la toxicidad ambiental de las
nanopartículas, especialmente para los microbios, deben tener en cuenta la posible adaptación
de las cepas ambientales a altas concentraciones de nanopartículas.
(detectado)

Conclusiones A. punctata aislada de aguas residuales mostró tolerancia a Snps a las

concentraciones de ensayo de hasta 200 μg/ml. Los resultados de este estudio sugieren que,
cuando se cultivan en presencia de concentraciones crecientes de SNP, los aislamientos
ambientales pueden adquirir tolerancia/resistencia. Una de las implicaciones importantes de
nuestros hallazgos es que las predicciones futuras sobre la toxicidad ambiental de las
nanopartículas, especialmente para los microbios, deben tener en cuenta la posible adaptación
de las cepas ambientales a altas concentraciones de nanopartículas