TEMA 1: MÉTODOS DE ESTUDIO DE CÉLULAS Y TEJIDOS

1. Historia de la biología celular

Biología celular: Estudio o conocimiento de la célula. Evolucionó junto al microscopio debido al
tamaño de su objeto de estudio.

La historia de la biología celular empezó con la invención por Jansen (1590) o Galileo Galilei
(1610). En 1665, Robert Hooke consiguió ver “celdas” vacías en el corcho mediante un
microscopio compuesto y acuñó el término de célula. En 1674 aparece el microscopio simple
de Leeuwenhoek que le permitió ver células libres, núcleos, bacterias…

Durante los siglos XVIII y XIX se produjo una mejora lentes y microscopios:

• 1934. Microscopio contraste de fases por Zernike

• 1942. MET por Max Knoll y Ernst Ruska

• 1957. Microscopio Barrido Confocal por Minsky

• 1965. MEB

A principios del siglo XVIII aparece la teoría celular:

• 1838-1839. Schleiden y Schwann:

o Todos los organismos están compuestos de células

o Célula como unidad estructural y funcional

• 1855. Virchow

o Toda célula proviene de otra

2. Propiedades de las células

Las células pueden dividirse en procariotas y eucariotas:

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Las células tienen un pequeño tamaño y son transparentes, por lo que no son visibles al ojo
humano y se ha tenido que desarrollar aparatos para permitir verlas. Además son complejas y
organizadas, obtienen y utilizan energía y poseen un programa genético que les permite crecer
y se reproducirse. Producen llevar a cabo reacciones químicas autónomamente (metabolismo),
producen y reaccionan a estímulos, cambian de forma y se mueven, se autorregulan (necrosis
y apoptosis) y en última instancia evolucionan.

Debido a que son pequeñas, acuosas y de átomos ligeros, las células tienen bajo contrate y se
hace muy difícil verlas incluso al microscopio. Para ello, tendríamos que modificar la física del
microscopio o modificar el contraste de la muestra.

Existen diferentes tipos de microscopia:

• Óptica (MO)

o Campo claro

o Campo oscuro

o Contraste de fase

o Contraste interferencial o Nomarski

o Fluorescencia (MF)

o Barrido confocal (MBF)

• Electrónica (ME)

o Transmisión (MET)

o Barrido (MEB)

3. Microscopios ópticos
3.1 MO de campo claro
La luz atraviesa la muestra, llega a una lente y la vemos. El primer MO, que tenía dos lentes
conseguía un aumento de 50 (nivel suficiente para ver la pared celular). Después Hooke fue
capaz de hacer un Mo de una sola lente (lupa) que llegó a tener 200x.
El poder de resolución son los aumentos que es capaz de hacer el microscopio mientras que
el límite de resolución es la distancia mínima a la que dos puntos separados físicamente
nosotros los vemos separados. Estas propiedades se definen mediante la siguiente fórmula:

Límite resolución = 0.61λ /AN = 0.2 μm Luz blanca λ = 550 nm

AN = n ⋅ senα AN aceite = 1.5

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La apertura numérica (n) es el índice
de refracción y alfa es la mitad del
ángulo de la luz que recoge el objetivo.
El n máximo es de 1.515, que es el del
bálsamo de Canadá (la imagen no
sufre distorsión). El alfa tiene que ser
de 90º para que no haya difracción. El
límite de resolución para el MO es de
dos micras.

Si disminuimos lambda o aumentamos la apertura numérica (n) aumentamos el límite de

resolución. El espacio con objetivos de más aumentos es menor entre el objetivo y la muestra.
Para poder estudiar el material biológico hay que tratarlo con sustancias de contraste porque
el material de por si no se puede ver bien. El material utilizado puede ser material muerto pero
también material vivo cuando tiene algún pigmento natural como clorofilas o carotenoides
(tomates, etc o melanina en el caso de los melanocitos de la piel humana).

3.2 MO de campo oscuro

Menos utilizada que la anterior. Permite analizar
material vivo. Se obtiene campo oscuro ya que la
luz que llega es en oblicuo y no choca con la
muestra, el objetivo no la ve y se produce una
zona de sombra. Si choca con la célula, la luz se
dispersa un poco y se verá brillante
(normalmente se ve muy pronunciado justo el
borde de la celula).

La apertura numérica es de 1 y el poder de

resolución de 500-600 aumentos.

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3.3 Microscopía de contraste de fases
El material vivo dispersa poco la luz y produce un desfase de la longitud de onda de la luz de ¼
que nosotros no podemos distinguir. Para ello se introduce en un MO un plato o anillo de fase
que disminuye la intensidad y añade un desfase de ¼ de la longitud de onda de la luz que,
junto al cuarto anterior, suman un desfase de la longitud de onda de ½, que sí podemos ver.
Dentro de la célula hay poca variación de contraste y se ven pocos detalles (el lumen, la
envoltura nuclear y los nucléolos junto con la membrana celular es lo que más se ve).

3.4 Microscopía de contraste o interferencia diferencial

Se puede estudiar material vivo y grueso. Se utiliza principalmente para poder estudiar
embriología sin tener que seccionar el material (podemos ver como se dividen las células y la
evolución del embrión).
Se utiliza luz polarizada. Cada rayo luminoso se divide en dos rayos que viajan juntos hasta
llegar a la célula donde solo uno pasa por la misma; por tanto, ese rayo de luz tiene una
longitud de onda con un ¼ de retardo. Después la lente los junta y forma una imagen
ligeramente tridimensional. Además se consigue eliminar los halos brillantes.

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Si observamos en una imagen un halo brillante y fondo claro se trata de microscopía de
contraste de fases mientras que si tiene un halo y campo oscuro es microscopía de campo
oscuro.
Imagen A: Microscopio
óptico de campo claro.
Imagen B: Microscopio
óptico de campo oscuro.
Imagen C: microscopía de
contraste de fases.
Imagen D: DIC.

3.5 Microscopía de fluorescencia y epifluorescencia

El método general es la interacción de los
fluorocromos con la luz blanca. La parte de la
molécula responsable de la fluorescencia es el
fluoróforo. La luz incidente con diferentes
longitudes de onda y el filtro selecciona la
longitud de onda que excita al fluorocromo, esa
luz llega a la muestra, excita al fluorocromo y
emite luz de más longitud de onda y se recoge
por un filtro microscopía de fluorescencia.
Si la luz se toma por debajo es epifluorescencia
mientras que si se toma por arriba es el de
fluorescencia.
A los microscopios ópticos se le incorpora un
conjunto de filtros de excitación y barrera por
el q pasa la luz incidente, rebota en la muestra
y llega otra vez la muestra y por ultimo al
objetivo. Además incorpora una fuente de luz
diferente que puede emitir luces de onda de
diferentes longitudes.
Podemos combinar fluorocromos (más o
menos hasta 3 para que no se solapen y nos
confundamos), hacer colocalización. Al solapar dos imágenes pueden aparecer una
combinación de ambos fluorocromos que nos diga que están en el mismo lugar físico ambas
moléculas o procesos biológicos.

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Las limitaciones son:
• Podemos utilizar un limitado número de longitudes de ondas
• La emisión de fluorescencia dura muy poco tiempo y es bastante débil (la cámara que
la capta tiene que ser muy rápida para capturar y muy sensible ya que no podemos
hacer tiempo de exposición largos).
• Se pueden producir dos situaciones:
o El apagado: una molécula puede estar emitiendo fluorescencia pero hay otra
molécula en el mismo lugar que está emitiendo y enmascara” la otra reacción
(está ocurriendo un proceso que no vemos).
o Blanqueamiento: el fluorocromo se agota si se excita continuamente y si no
somos lo suficientemente rápidos capturando el resultado, el proceso ocurre y
no lo vemos.
Puede utilizarse esta técnica en MO de campo claro, MO de campo oscuro, contraste de fases,
DIC y confocal.

3.6 MBC
Es una microscopía entre óptico y electrónica.
El MBC nos permite trabajar con material vivo o
muerto, fino o grueso. En vez de luz utiliza laser y se
puede enfocar el laser en un plano determinado de la
estructura (por ejemplo, en una célula en un porta
pegada con 10 micras de diámetro podemos enfocar en
diferentes lugares y a diferente profundidad).
A diferencia que en el microscopio de fluorescencia
donde se excitan los fluorocromos y se recogen las
emisiones en todos los lugares de la célula, en este tipo
de microscopía podemos recoger la fluorescencia que
hay en lugares muy específicos (la micro 3,2 y no en la
3,3). De esta forma podemos hacer un barrido y estudiar por ejemplo una célula tomando
imágenes cada 10 micras y obtenemos una imagen en la que no se solapa todo lo que hay. Por
tanto el MBC tiene más nitidez y resolución que el de fluorescencia. Este microscopio tiene
una resolución a 0,1 micras y llega a los 15.000 aumentos.

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Ventajas:
• Podemos digitalizar la imagen y trabajar con ella con software y hacer una imagen 3D
superponiendo las imágenes recogidas a diferentes profundidades de la célula.
• La toma de información es muy rápida, por lo que podemos hacer un estudio cinético
para procesos muy cortos y rápidos.
• Cada vez que excitamos los fluorocromos lo hacemos a pequeña escala y más
sensiblemente que en la microscopía de fluorescencia por lo que podemos obtener
más imágenes de una misma muestra ("no se gasta el fluorocromo").

Las muestras pueden estar vivas o fijadas, enteras o en secciones gruesas y los protocolos a
seguir pueden ser de microscopía y de citometría. Los modos de recogida de imágenes pueden
ser: secciones ópticas individuales, serie Z en imágenes 3D o imágenes 4D.

4. Microscopios electrónicos
El funcionamiento es igual que el microscopio óptico pero el haz es de electrones en vez de luz.
El haz de electrones se conduce de igual forma por una serie de condensadores y objetivos
hasta la muestra.

4.1 Microscopio electrónico de transmisión

En el microscopio electrónico de transmisión los electrones
impactan en la muestra y se estudian los electrones
transmitidos. Esto se hace por medio de una película que se
coloca debajo de la muestra y es sensible a los electrones que
traspasan la muestra.

La resolución es de menos de 1nm y las muestras tienen que

estar muertas, tratadas y teñidas (ya que tienen que dispersar
mucho los electrones para poder verlas bien). Además, las
muestras tienen que ser muy finas para que los electrones
puedan atravesarla bien (menos de 4 micras).

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Las estructuras que no dispersan electrones se denominan
electronodensas y se observan más oscuras o negras.

4.2 Microscopio electrónico de barrido

Permite estudiar los haces de electrones retrodispersados y
por tanto analizar la superficie. Para que los electrones
choquen y reboten contra la muestra, hay que metalizarla
(generalmente añadiéndole oro). Este microscopio utiliza
lentes electromagnéticas para captar los electrones
rebotados.

Las muestras han de ser muertas, desecadas, estabilizadas y metalizadas pero a diferencia del
anterior microscopio no tienen que ser secciones finas y pueden estudiarse estructuras
completas de animales o incluso ejemplares completos (ojos de mosca, hormigas,
interacciones células cancerosas-NK, etc).

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Resumen: Comparativa MO y ME

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5. Técnicas para microscopía óptica
Conjunto de técnicas encaminadas a identificar, localizar y cuantificar una molécula o
estructura en un tejido (Histoquímica) o célula (Citoquímica). Pueden ser generales (detectar
la presencia de un grupo de moléculas (ej: azúcares) o de una enzima) o especiales (determinar
la presencia de una molécula concreta (ej: lactosa) o la actividad de una enzima). Dentro de
estas destacan:

• Enzimohistoquímica. La presencia de una enzima

• Inmunocitoquímica. Presencia de un antígeno
• Lectinohistoquímica. Presencia de un azúcar

Para llevar a cabo estas técnicas tenemos que tener en cuenta el material que estamos
tratando y qué queremos saber (destino u objetivo) y tenemos que tener en cuenta que puede
haber diferentes caminos para llegar hasta nuestro objetivo. Además, cada paso estará
influenciado por el anterior y el siguiente a la hora de diseñar una estrategia determinada.

Las técnicas de microscopía óptica tienen en cuenta la necesidad de aumentar el contraste del
material y por ello hace uso de colorantes. El procesado de las muestras consta de los
siguientes pasos:

5.1 Toma de muestras

Para obtener el material a estudiar, sacrificamos al animal, cortamos la planta o hacemos una
biopsia, etc. Este paso debe de ser rápido y a poder ser indoloro para el ser vivo. Las muestras
deben conservarse en condiciones óptimas (frio normalmente). En histología, las muestras
pueden haberse obtenido de:
a. Líquidos: se conservarán en frotis o impregnaciones
b. Órganos: se tomarán fragmentos de unos 0.5-1 cm para su estudio a MO y 1
mm3 para ME

5.2 Fijación
Este paso tiene como objetivo mantener la estructura estable y fijada en el órgano para evitar
la autolisis y que no haya procesos que alteren su estructura o ultraestructura. De no ser así,
veremos artefactos (algo que nosotros vemos que en realidad no tendría que estar ahí pero ha
aparecido durante el tratamiento de la muestra). Ej: podemos ver un coagulado de proteínas
solubles por acción de la temperatura.
Los fijadores tienen que tener las siguientes características:
• Poder de penetración. Es la capacidad del fijador de penetrar en la muestra.
Esto condicionará el tamaño de muestra que podemos estudiar (a más poder
de penetración, mayor tamaño podemos coger).
• Tiempo de fijación. Es el tiempo que tarda en penetrar el fijador en todo el
material de estudio. Se ve condicionada también por el poder de penetración
del fijador ya que si tiene un alto poder de penetración, menos tiempo
tendremos que tratar la muestra con el fijador.

Los fijadores tienen que actuar con rapidez para evitar autólisis, desintegración, etc.
Además, tiene como objetivo conservar los detalles estructurales, permitir o favorecer los
procedimientos necesarios posteriores, impedir la desaparición de los elementos solubles

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durante la fijación o después, no provocar o impedir la producción de estructuras artificiales
y no retraer excesivamente los tejidos ni volverlos quebradizos.
Otras técnicas de fijación, además de la inclusión (10-20 volúmenes durante 1-24 horas) son la
perfusión o la inyección por el torrente sanguíneo del fijador. Esta técnica asegura la
penetración del fijador.
El tipo de fijador que utilicemos puede afectar a los procedimientos siguientes (por ejemplo,
los alcoholes eliminan las grasas). Los principales tipos de fijadores son:

• Físicos

o Calor: Muy malo para histología pero muy utilizado en microbiología

o Frío y congelación: N2 líquido, CO 2. Endurece (se puede cortar bien por lo que
ya está fijado y endurecido), conserva antigenicidad (reacción Ag-Ac) y la
actividad enzimática.

• Químicos

o Aldehídos: Fijan muy bien proteínas ya que no desnaturalizan

(inmunocitoquímica), penetran bien pero lento. Formalina (4%, MO) y
glutaraldehído (2%, ME).

o Alcoholes: Fijan muy rápido pero no penetran bien, por lo que es utilizado para
tejidos líquidos o cultivos. Desnaturalizan, endurecen y disuelve lípidos.
Metanol, etanol al 96%.

o Ácidos: Buenos fijadores pero precipitan proteínas. Pícrico (citoplasma),

acético (ácidos nucleicos y glucoproteínas), ósmico (lípidos).

o Sales: Fijan bien proteínas y no las desnaturalizan. Dicromato/permanganato

potásico, tetraóxido de osmio, bicloruro mercurio.

Suelen usarse compuestos

• Bouin. Formaldehído-pícrico-acético.

• Carnoy. Etanol:Cloroformo:Acético (60:30:10)

• Zenker. Bicromato de potasio-bicloruro de mercurio-acético

Una vez pasado el tiempo de fijación hay que eliminarlos tras su acción para evitar
endurecimiento y se vuelva quebradizo y se fragmente al cortarlo.

5.3 Inclusión
Consiste en hacer un bloque con la muestra endurecida para el corte. Generalmente se utilizan
para el bloque resinas o parafinas, siempre material no hidrosoluble (las parafinas son las
más extendidas pero nos permiten tener una menor resolución que las resinas). Durante este
proceso sustituimos el agua de la muestra biológica por el líquido o material endurecedor pero
como no es hidrosoluble tendremos que hacer los siguientes pasos:

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 1. Deshidratación: Se elimina el agua de la
muestra mediante sucesivos baños en etanol
(50-70-80-90-96-absoluto) de 1-2 horas cada
uno. Es imprescindible tras la fijación con
etanol al 70% pero no con formol

2. Aclaramiento: Permite la impregnación con la

solución endurecedora, xiolo/xileno
generalmente pero también puede ser con
tolueno o cloroformo. Se hace en 2 tandas de
2 horas cada una.

3. Impregnación: Con parafina a 60ºC o resina. El

proceso dura varias horas.

4. Bloque. Formación del bloque de resina o

parafina con un molde.

5.4 Corte
El corte de las secciones de muestra pueden hacerse mediante:

• Mano alzada en histología vegetal

• Desvastado del bloque

• Microtomo: de parafina (3-10 µm) o por congelación (5-30

µm denominado criomicrotomo).

La sección puede pegarse al portaobjetos directamente (que se

puede despegar) o podemos poner poli-L-lisina o albúmina para
que se fije más fuertemente a la resina. Además, los cortes pueden
ser individuales o seriados. Si los cortes van a ser seriados (cortes
sucesivos de una muestra) nos podemos hacer una idea de cómo
es el órgano o tejido tridimensionalmente. También podemos
hacer estudio de un corte de cada tramo (1 de cada 20, 50, etc de
los seccionados de la muestra); no nos haremos una idea tan clara
pero más o menos sabremos cómo es.

5.5 Tinciones
Casi todas las técnicas de tinción utilizan colorantes naturales o artificiales para aumentar el
contraste de la muestra biológica. Esos colorantes deben ser hidrosolubles o el material debe
ir incluido en parafina.

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El proceso de tinción comprende las siguientes
etapas:

1. Desparafinación. Se elimina la parafina

del paso anterior

2. Hidratación de la muestra. En la muestra

se sustituye la parafina con agua (proceso
inverso al que hicimos durante la
inclusión.

3. Tinción propiamente dicha.

4. Montaje. Puede hacerse en un medio

hidrosoluble (glicerina), que durará unos
2 días o no hidrosoluble (DPX, etc) que
durará años. Para el montaje en medios
no solubles tendremos que deshidratar la
muestra y poner bálsamo de Canadá para
cubrirla, secamos y ponemos una resina
duradera.

Los tipos de tinciones más utilizados son:

• De rutina o no específicas. Las más utilizadas son la Hematoxilina-Eosina (H-E) en

histología, el Giemsa para frotis, etc. Los colorantes de rutina pueden clasificarse en:

o Colorantes ácidos: Se adhiere a estructuras con carga positiva o acidófilas

(mayoría citoplasma, citoesqueleto, etc). Ej: eosina

o Colorantes básicos: Se adhiere a estructuras con carga negativa o basófilas

(núcleo, nucléolo, matriz extracelular, etc.) Ej: hematoxilina

o Colorantes neutros o mixtos.

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• Tinciones especiales:

o Tinciones para el DNA.

! Reactivo de Feulgen. Tratamiento con HCl 1N (60ºC, 1-40 min). Los

ácidos nucleicos liberan las bases purínicas (A y G) y originan
aldehídos, los cuales son teñidos de rojo por el reactivo de Schiff
(fucsina básica decolorada).

! Verde metilo-pironina. El verde metilo tiñe el DNA de verde y la

pironina el RNA de rojo. Colorantes catiónicos que reaccionan
con los grupos fosfato.

o Tinciones para carbohidratos y mucopolisacáridos (mucinas)

! PAS (ácido peryódico de Schiff).Tinción de polisacáridos complejos

(glucógeno, almidón y celulosa) y mucopolisacáridos. El ácido
peryódico oxida los grupos OH a aldehídos que reaccionan con la
fucsina básica decolorada. Color rojo.

! Azul alcián. Tiñe glucosaminoglucanos ácidos. Medios de distinta

acidez. Azul pálido.

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o Tinciones para grasas o lípidos: Se disuelven en las grasas. Preferible la fijación
por congelación, los alcoholes del procesado disuelven las grasas del tejido

! Sudán. Pueden ser negros o rojos. Se disuelven en las grasas.

! Tetraóxido de ósmio. Además de teñir contrasta, usado en MET.

Negro.

! Rojo-O al aceite.

o Tinciones para tejido conectivo

! Fibras colágenas

• Tricrómico de Van Gieson: Se observan de color rojo.

• Tricrómico de Gomori: se observan de color rojo.

• Tricrómico de Masson: se observan de azul.

! Fibras elásticas:

• Método de Gomori: se tiñen de púrpura oscuro.

• Orceína: se tiñen de púrpura.

• Verhoeff: se tiñen de negro

! Fibras reticulares:

• Método de Gomori para la impregnación argéntica de la

reticulina: las fibras reticulares se observan negras.

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• Tinciones específicas

o Enzimohistoquímica. El objetivo es detectar la actividad de una enzima.

Para mantener la actividad de la enzima se ha de hacer una congelación
o fijación débil y el producto enzimático debe ser insoluble (MO),
fluorescente (MF y MBC) o electrodenso (MET). Para que se produzca
hay que mantener unas condiciones óptimas de trabajo para la enzima
(pH, temperatura, concentración, etc). Además se usa como colorante
de contraste la hematoxilina que no enmascare la reacción
enzimohistoquímica.

También utilizaremos controles con diferente concentración de sustrato

o sustratos no utilizados por la enzima o incluso inhibidores específicos
de la enzima (controles negativos).

o Inmunocitoquímica. Pone de manifiesto un antígeno en un tejido o célula

puesto que está basado en la reacción Ag-Ac específica. Los anticuerpos
pueden utilizarse tanto in vivo como in vitro tanto en material muerto (entero,
seccionado, etc) como en material vivo. De hecho, los anticuerpos se utilizan in
vivo en la práctica clínica para eliminar antígenos del cáncer por activación del
sistema inmune del paciente o en embarazos de mujeres Rh+ que portan fetos
Rh- (se bloquean los anticuerpos Rh- del feto).

Los anticuerpos pueden teñirse para visualizar esta reacción (MO) pero
también puede marcarse con compuestos fluorescentes (MF y MBC) o
eletronodensos (MET).

La reacción Ag-Ac es muy específica y existen anticuerpos que reconocen los

epítopos desnaturalizados en sus diferentes grados de desnaturalización. Por
ello debemos tener en cuenta cómo está la proteína (nativa, en una sección
fijada con un determinado fijador, cómo se ha tomado la muestra y cómo la
hemos tratado, etc).

Para mantener el antígeno reconocible normalmente se hace una

conservación por congelación o fijación débil. El fijador débil más utilizado es
el paraformaldehido en su versión pura o en su versión comercial (formalina).
La formalina es paraformaldehido con pequeñas trazas de alcoholes que son

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los que pueden dañar nuestro anticuerpo (por eso para este método suele
utilizarse el paraformaldehido puro para conservar intacto el epítopo a persa
de que nos dé una peor resolución que si utilizamos formalina o Bouin).

Los anticuerpos utilizados pueden ser monoclonales (provenir de un solo

linfocito y por tanto reaccionar frente a un solo epítopo) o policlonales
(reconocen diferentes epítopos). Normalmente el proceso que se sigue es:
inmunizamos el cuerpo de un animal (conejo) con antígenos y sus linfocitos
producen anticuerpos policlonales (actúan varios linfocitos diferentes) y por
tanto obtenemos un suero policlonal del que podemos seleccionar un linfocito
que produce un anticuerpo monoclonal. Se utilizan anticuerpos monoclonales
cuando necesitamos que la reacción sea específicamente con un epítopo ya
que las proteínas de la misma familia pueden compartir epítopos iguales y dar
falsos positivos. Por el contrario, los anticuerpos policlonales son menos
sensibles a variaciones en el tratamiento de la muestra como por ejemplo la
fijación, la muerte del organismo, etc. porque reconoce más epítopos que
pueden resistir más condiciones adversas o fijaciones.

Los controles de especificidad pueden hacerse mediante:

! Bloqueo. El tejido se incuba en una solución de bloqueo o se diluye el

anticuerpo en sustancias como la albúmina que entorpecen la unión
Ag-Ac.

! Preabsorción. El anticuerpo se pre-incuba con un antígeno y esa

mezcla se le añade al tejido. Si está el mismo antígeno en el tejido,
habrá un equilibrio entre la reacción Ac-Ag libre y Ac-Ag endógeno,
por lo que el antígeno queda unido y se revela. Por otro lado, si no se
encuentra el antígeno específico, el anticuerpo se une al antígeno libre
o soluble y al lavar solo encontraremos unión con el Ag libre. Este
método es el más exacto pero no siempre se dispone del antígeno
puro (sobre todo si tratamos con proteínas que están siendo
determinadas).

Para detectar la presencia de los antígenos hay que marcarlos. Esto se

puede hacer de dos formas:

! Directa. Se detecta la presencia de células productoras por ejemplo de

glucagón mediante el uso de anticuerpos monoclonales de conejo.

! Indirecta. Se utilizan anticuerpos secundarios que reconocen las IgG de

conejo, que deben estar en otras proteínas (cabra, cerdo, caballo, etc.)

Además el marcaje también puede ser simple, doble, triple, etc. El simple
se hace por marcaje con un antígeno mientras que el doble se hace por
marcaje de dos antígenos diferentes ya sea por método directo o indirecto

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 según la cantidad de antígeno de la que dispongamos (el método indirecto
nos amplifica la señal).

Lo más normal es que el marcaje de los anticuerpos sea por unión covalente o por
anticuerpos recombinantes que llevan peroxidasa y fosfatasa alcalina para su
detección al MO porque la adición de más o menos sustrato va a provocar la
producción de más o menos producto, que el insoluble y coloreado.

! Peroxidasa. La peroxidasa es una enzima “suicida” ya que se inactiva

por sustrato (aumenta su acción cuando hay más sustrato hasta
“acabarlo” y se desactiva). Esta enzima está presente en muchas
células pero en algunas es muy abundante (en células sanguíneas y en
concreto en células inmunitarias).

La dificultad en este caso es saber qué peroxidasa es endógena y cuál

es la añadida exógenamente por nosotros. Para ello, bloqueamos la
peroxidasa endógena añadiendo sustrato (peróxido) y dejamos un
periodo de incubación de unos 20 minutos normalmente con peróxido
rebajado en PBS. En el tejido inmunitario hay demasiada peroxidasa
por lo que tenemos que hacer varios baños de peróxido renovándolo o
diluyendo en metanol en vez de en PBS (hacemos una inhibición
doble: fijación con el metanol e inhibición por sustrato con el
peróxido).

Al añadir peróxido y actuar la enzima, se producen radicales libres que

intervienen en la siguiente sustrato (normalmente diaminobencilina)
produciendo un color violeta y además es un producto
electronodenso; se puede ver a MO (violeta) y a MET (mat.
electronodenso).

! Fosfatasa alcalina. También se puede bloquear y también se produce

endógenamente por las células del sistema inmune pero en menos
cantidad. No se inhibe por sustrato por lo que si no veo producto de
reacción puede que sea porque el antígeno no está o porque está en
pequeña cantidad (podemos seguir poniendo hasta que haya
reacción). A veces esta reacción se deja toda la noche (dejando
suficiente sustrato) para asegurarnos que si no aparece precipitado es
porque no hay antígeno con el que reaccionar.

! Fluorocromos. Los más utilizados son el FITC o la fitoeritrina (rojo).

Pueden utilizarse en sistemas de MF, MBC y citometría de flujo.

! Bolas de oro coloidal. Utilizado para el MET. Podemos utilizar

diferentes tamaños de bolas de oro (ej: 5nm y 20nm) para marcar
diferentes antígenos (ej: AgA marcado con bolas de 5nm y AgB
marcado con bolas de 20 nm).

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 ! Bolas magnéticas. Nos permite detectar las células y purificarlas.

! Proteína A. La proteína A es una proteína bacteriana que se une a

regiones FC de los anticuerpos que, al estar marcada, podemos
reconocer (doble marcaje: proteína A y Ac).

! Biotina.

Sistemas de amplificación de señal:

! PAP (peroxidasa-antiperoxidasa). El anticuerpo se le añade primero al

sistema PAP para que lo reconozca y se una a él. Este sistema lleva
peróxido, por lo que se une a la peroxidasa que lleva unido un
anticuerpo formando un complejo macromolecular de peroxidasas
encima del anticuerpo. Es el sistema que más amplifica y hace falta
muy poca cantidad de antígeno porque, con la misma especificidad
tenemos más amplificación de señal.

! ABC (avidina-biotina-peroxidasa)

! Streptavidina-peroxidasa

Marcaje simple. En la imagen de la derecha revelado con diaminobenzolina y tinción leve con
hematoxilina.

Marcaje doble. En la primera imagen, doble marcaje por peroxidasa y fosfatasa alcalina; las
siguientes dos imágenes (MF) son inmunomarcajes simple y doble.

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Gracias al marcaje doble podemos hacer estudios de colocalización, que nos muestran si dos
moléculas se encuentran en el mismo lugar físico de la célula. En el primer ejemplo podemos
ver como un antígeno (A) está marcado con un fluoróforo rojo y otro antígeno (B) está
marcado con verde; cuando ambos aparecen juntos se muestra un color amarillo. En la
segunda imagen podemos observar que hay también dos antígenos, uno rojo y otro verde y
una combinación de ambos fluoróforos da un color amarillo; en la imagen B podemos ver que
el antígeno de fluoróforo rojo está en el centro de donde aparece en el verde mientras que en
C es al revés (rojo alrededor del verde).

o Lectinohistoquímica. Las lectinas son utilizadas pa ra detectar la presencia de

azúcares, sobretodo glucoproteínas. Funcionan de la misma forma que los
anticuerpos (enzimohistoquímica). Las lectinas pueden ir también marcadas
con fluorocromos, biotina, oro, proteína A, etc. Usadas para MO, MF, MBC y
MET.

Las lectinas proceden de especies vegetales principalmente y reconocen

diferentes azúcares.

El procedimiento se muestra en el esquema de la izquierda y las imágenes

obtenidas son similares a las de la derecha.

La tinción WGA es utilizada para teñir N-acetil

glucosa. Esta aparece principalmente en la región
apical del intestino.

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o Hibridación in situ. La hibridación in situ se utiliza para detectar la presencia
de una secuencia genética utilizando una sonda. En este procedimiento ambas
moléculas complementarias hibridan y se detectan. Si se usa una sonda para
DNA se determina la presencia de una secuencia mientras que si se usa RNA se
detectan secuencias de DNA que se están expresando en ese momento y en
ese lugar (producción de RNAm). Por ejemplo, si se usa una sonda de DNA
para detectar glucagón, se expresará en todas las células porque todas tienen
esa secuencia mientras que se usa una sonda de RNA, sólo las células que
expresen el mensajero del glucagón (células del islote de Langerhans en el
páncreas endrocrino).

Estas sondas llevan marcados con disoxigenina o biotina los nucleótidos y,

gracias a sus respectivos sistemas de revelado, podemos detectar su
presencia. También se utilizan fluorocromos.

Este método consisten en

hacer una PCR en la que el
plásmido de la secuencia se
pone bajo un promotor y
después, in vivo, la DNA
polimerasa o la RNA
polimerasa generan un vector
son la sonda de DNA o RNA.
Esto se purifica y se incuba el
tejido con esta sonda marcada.

Esto nos sirve por ejemplo para

comprobar si hemos generado
células híbridas. Si hacemos
una célula hibrida en la que
queramos tomar un gen A de
una y otro B de otra, para ver si
en una determinada célula está
el gen B, ponemos una sonda
de DNA para el gen B, vemos
por una PCR si hay marcaje;
después repetimos el
procedimiento para el gen A.

Este método también nos

permite ver si una determinada
célula tiene una mutación y de
esa forma detectar células
tumorales.

21
 La PCR in situ nos permite hacer este
procedimiento con una sección de tejido en un
portaobjetos. Esta muestra la metemos en un
termociclador y ahí hacemos la PCR. Primero la
retrotranscriptasa pasará el RNAm a DNAc y la TAP
polimerasa y los nucleótidos marcados nos
permitirán hacer la PCR y ver si se expresan los
genes.

6. Técnicas para MF y MBC

Las técnicas para MF y MBC han tenido un gran desarrollo (se empezó con la utilización de
radioactividad, después se utilizó enzimas y ahora se utilizan fluorocromos). Los fluorocromos
sólo se unen a proteínas, ácidos nucleicos, orgánulos celulares, iones como el calcio o el
magnesio y metabolitos secundarios como el AMPc, GMP o calcio.

Estas técnicas son exclusivas de estos tipos de microscopía y pueden clasificarse en:

• Photobleacing o apagado.

o FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching – Recuperación de

fluorescencia después del apagado). Se selecciona una zona de la célula y se
hace un apagado; en esta zona después se recupera la fluorescencia. Permite
estudiar proteínas fluorescentes de forma natural (ej: GFP, que proviene de
medusas) pero también para generar proteínas recombinantes y detectarlas
cuando se sinteticen. Ej: Se produce un recombinante que genere glucagón y
se puede trazar donde se encuentra. Después podemos apagar esa zona en
concreto y ver la velocidad de síntesis y de transporte.

o FLIP (Fluorescence Loss In Photobleaching). En este caso es al revés y la

irradiación de una parte de la célula (ej: REr) produce una pérdida de
fluorescencia. Podemos utilizar esta técnica para estudiar el transporte de
sustancias: Hacemos un FLIP del REr e impedimos que todas las moléculas que
pasan por ahí tengan fluorescencia y por tanto podemos saber cuánto tardan
en acabarse ya que estamos bloqueando la síntesis.

22
 • Fluorocromos en tándem.

o FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer). En esta técnica estudiamos la

transferencia de energía por resonancia y así la interacción entre proteínas o
dominios proteicos. Las proteínas recombinantes pueden tener dos
fluorocromos diferentes alejados y cada uno puede tener una longitud de
excitación y emisión diferentes. La peculariedad es que el amarillo se excitará
por energía con una longitud de onda que interfiere con la de emisión del
fluorocromo azul. De esta forma, si excitamos al fluorocromo azul se recoge
luz azul y si excitamos al amarillo se recoge luz amarilla; si los dos dominios
interaccionasen (por las circunstancias de la célula, por la adición de calcio,
etc.), los dos fluorocromos estarán cerca y cuando excitemos en la longitud de
onda se excitará pero al emitir también excitará al amarillo por lo que veremos
amarillo (excitamos en la longitud de onda del azul pero vemos amarilla).

En la imagen C
podemos ver
como en la
primera fila no
hay interacción
entre los dos
fluoroforos pero sí
interacciona en la
fotografía de
abajo a la
derecha.

Sus aplicaciones son:

• Estudios de viabilidad. Colorantes vitales que marcan las células vivas o las muertas.
Proliferación, necrosis y
apoptosis

• Inmunofluorescencia

• Actividades enzimáticas

• Movilización de sustancias

• “Caged Photoactivable probes”.

Movilización Ca++, IP3, cAMP,
cGMP, ATP, NO. Grupos
nitrofenilo bloquean la
fluoresecencia, se activan por
UV

23
 • Colocalización, interacción entre proteínas….

Tenemos fluorocromos que no emiten fluorescencia hasta que no se activan. Si los

fotoactivamos con un láser una determinada sustancia en una parte de la célula, las sondas se
activan y emiten fluorescencia. Podemos seguir la evolución de la célula a lo largo del tiempo y
además cuantificar el proceso
(que nos permite observar si hay
diferencias en las condiciones de
nuestras muestras y el efecto de
una determinada sustancia (ej:
antibiótico) en nuestra muestra.

Las ventajas del uso del MBC son:

• Imagen en un plano, fluorescencia no difusa (más límite de resolución y más poder de

resolución).

• Obtención imágenes 2D, 3D (por superposición de imágenes) y 4D (superposición de

imágenes e imágenes a diferentes tiempos para ver la evolución del estado de la
célula).

• Secciones longitudinales (xy) y transversales (xz).

7. Técnicas para MET

El MET tiene más resolución y por tanto podemos ver todo en detalle pero necesitamos que se
mantengan las estructuras estables para que no haya artefactos por lo que tenemos que tener
muestras de menor tamaño (1 mm3) para que el fijador penetre más fácilmente. Normalmente
se hace una doble fijación con: glutaraldehido y PBS (con PBS para evitar cambios en la presión
osmótica) y tetraóxido de osmio para fijar los lípidos; además el tetraóxido de osmio es
material electronodenso, por lo que le da contraste.

El procesado de las muestras es similar a MO:

• Fijación con glutaraldehído al 2-4% en tampón

• Post-fijación con OsO4. Fija lípidos. Contrasta

• Deshidratación

• Aclaramiento

• Inclusión. Bloques resinas epoxi

• Corte

o Semifinos. 0,5-1 m. Tinción con azul toluidina

o Ultrafinos. 25-100 nm. Ultramicrotomo con cuchillas de vidrio o diamante

24
 • Preparación. Recogida de los cortes en rejillas de cobre, níquel.

• Contraste. Citrato de plomo y acetato de uranilo. En este método no se hace tinción.

Si tenemos una suspensión de células podremos hacer directamente un corte ultrafino ya que
las células están distribuidas al azar y podemos hacer un análisis en el que la muestra será lo
suficientemente representativa pero esto no ocurre en un tejido o un órgano ya que puede
que justo en ese fragmento no haya lo que queremos estudiar. Por ello, siempre tenemos que
empezar primero a hacer cortes semifinos y hacer tinciones con azul de toluidina (que
veremos a MO y son más rápidas) para después pasar a las secciones ultrafinas cuando veamos
que el fragmento tiene las estructuras que queremos estudiar.

Además, podemos hacer un corte individualizado o hacer cortes seriados para tener una mejor
idea del tejido.

Aplicaciones:

• Inmunocitoquímica. Anticuerpos marcados con oro coloidal (5-40 nm diámetro).

Doble, triple. Puede ser antes de la inclusión (pre-inclusión) o posterior (post-
inclusión). Uso de proteína A-oro

• Enzimohistoquímica, lectinohistoquímica, hibridación in situ, autoradiografía…

• Tinción negativa. Ácido fosfotúngstico rodea a la muestra, muy electronodenso.

Estudio de virus, complejos macromoleculares

El revelado no dará material coloreado ni fluorescente si no electronodenso por lo que

obtenemos.

En esta imagen podemos ver una

enzimohistoquímica y nos da otra información
diferente a la que podemos obtener con el MO como
por ejemplo saber dónde exactamente se encuentran
los antígenos (en los gránulos, en la periferia o en el
centro, dispersos por el citoplasma de la célula, en la
cara interna o externa de una membrana, etc.).

En la siguiente imagen podemos observar una

inmunocitoquímica en la que siempre tendremos
que poner contraste porque si no sólo veríamos la
reacción positiva pero no el contexto en el que se
encuentra (el lugar dentro de la célula, etc). Ese
contraste tiene que ser muy débil para no
enmascarar la reacción principal.

25
En la siguiente imagen vemos una tinción negativa en la
que se tiñe el entorno. Normalmente se utiliza esta técnica
para el estudio de virus y complejos macromoleculares de
una muestra en suspensión. Esta muestra en suspensión se
dispone sobre una película de carbono y es teñido con
ácido fosfatustico, molécula eletronodensa que tiñe todo
el fondo en oscuro pero no a los virus.

Por último observamos una imagen de una criofractura. En este

método lo que se hace es congelar la muestra y en condiciones
de vacío (criofractura en vacío) se le da un golpe con una
cuchilla. La muestra se rompe por los puntos de unión más
débiles (como por ejemplo la bicapa lipídica, en la unión de los
fosfolípidos, por lo que las proteínas se quedan unidas a una de
las bicapas). Después se hace un molde metalizado para generar
un relieve que se pueda visualizar a MET (podremos ver por
ejemplo los complejos proteicos de la envoltura nuclear como en
la imagen).

Para exagerar más este efecto fijamos el material en una

superficie y hacemos un metalizado mientras la superficie está
inclinada para obtener un ligero efecto tridimensional.

8. Técnicas para MEB

El procesado de las muestras sigue el siguiente patrón:

• Tamaño muy variable. De células a organismos completos. El MEB nos permite un

estudio tridimensional de una muestra de tamaño variable (hasta incluso organismos
completos) y por tanto habrá veces que no tengamos ni que cortar una parte de
muestra.

• Fijación con glutaraldehído al 2-4% en tampón.

• Deshidratación. Punto crítico: sustitución agua por CO2 líquido a alta presión (no por
etanol como en los casos anteriores), bajada de esta y el CO2 se vuelve gas otra vez
dejando la muestra vacía.

• Metalizado con metales muy conductores (oro, platino)

• Observación a MEB.

Las imágenes obtenidas pueden colorearse con software informático

distinguiendo los átomos que chocan con los electrones según los
espectros de emisión de los mismos. Esto nos permite saber por ejemplo
cuanto metal pesado (ej: cadmio) hay en una célula expuesta.

26
9. Citometría de flujo
El citómetro de flujo es un instrumento que sirve para analizar células en suspensión. Nos
permite cuantifica tamaño, complejidad y fluorescencia de las células que pasan, de una a una,
a través de un láser. Este aparato analiza miles de células /min y los datos obtenidos tienen un
gran valor estadístico porque nos dan una aproximación muy buena de las cualidades de las
células.

Las partes del citómetro de flujo son:

• Sistema fluídico. Sistema de presión fluidos parar tomar la muestra. Se introduce un

capilar en la muestra y se aspira la misma, que va hasta una cámara de flujo por la que
salen las células en suspensión en un flujo delgado y cubierta de flujo generado por el
equipo para asegurar que vayan las células de una en una.

• Sistema óptico similar al que vemos en el MF.

o Láser de 488 nm y/o 630 nm que bombardean la muestra y excita a los

fluorocromos, que se desvían al chocar contra las células de la suspensión.

o Detectores a distintos ángulos, distinta longitud de onda para captar todas las
radiaciones.

o Fotomultiplicadores. Permiten seleccionar la longitud de onda que queremos

ver y amplificar la señal y disminuir la señal que dan las células que no llevan
los fluorocromos pero que dispersan los rayos del láser (ej: luz visible que “se
cuela”, etc) y que crean ruido.

• Sistema eléctrico. Transforma las señales luminosas en digitales = Sistema informático

para guardar y analizar los datos.

Una vez tenemos los datos guardados en un archivo similar a una tabla de datos de excell,
podemos hacer estudios estadísticos. Generalmente se utilizan 10000 células para una
población homogénea (mínimo). Podemos representar uno o varios parámetros y el número
de eventos para cada valor del parámetro y hacer diferentes poblaciones de acuerdo con las
propiedades estudiadas (células con florocromos vs sin fluorocromos). Además, también
podemos saber qué células tienen los valores de un intervalo de un parámetro (ej de la imagen
A: intensidad de fluorescencia y la cantidad de fluorescencia en las células que nos dará la
cantidad de reacción en cada población celular).

27
También podemos representar dos parámetos en el mismo gráfico (imagen B y C). En las dos
gráficas de la imagen B podemos ver el número de eventos para dos fluorocromos: en la
primera hay dos opciones, que las células no tengan fluorescencia para ninguno de los dos
fluorocromos (4%) y por tanto que ahí no se produzca ninguna de las dos reacciones que
estamos estudiando, que la célula tenga fluorescencia roja pero no verde (4%) y por tanto que
sólo se esté produciendo la reacción marcada con el fluorocromo rojo, que la célula tenga solo
fluorescencia verde (40%) y por tanto solo se esté llevando a cabo la reacción marcada con
fluorocromo verde o que se dé fluorescencia doble en rojo y verde y que por tanto se estén
dando ambas reacciones
estudiadas.

Una vez analizado esto

podemos estudiar la
fluorescencia de las células
en relación a su tamaño
(imagen C). Estos datos los
podemos casar con los
datos obtenidos con el MO
y podemos saber a qué
población de células les
corresponde una mayor
fluorescencia y por tanto en
qué tipos celulares se lleva a
cabo más cantidad de reacción.

Por ejemplo podemos determinar diferentes niveles y características de las células

sanguíneas de una muestra. En una muestra de sangre humana analizada por citometría de
flujo en la figura adjunta podemos ver que hay poblaciones de leucocitos diferentes que
pueden ser más o menos homogéneas (más o menos del mismo tamaño y complejidad) que,
junto a las características vistas a MO, nos permiten relacionar tamaño y complejidad con cada
tipo celular (gráfica de arriba a la izquierda). Por un lado, los monocitos tienen mayor
superficie y gránulos y son más o menos el doble de grande que los más pequeños; los
granulocitos tienen más o menos el mismo tamaño que los monocitos pero con más superficie
(más gránulos, un núcleo más lobulado, etc) y por tanto tienen mayor complejidad.

Además, podemos saber también el porcentaje de células que pertenecen a cada región y por
tanto a cada tipo celular.

Una vez caracterizadas las células podemos saber la fluorescencia de cada población (gráfica
de arriba a la derecha) y por tanto revelar un proceso celular (que revelamos con el
fluorocromo verde).

28
Por último podemos ver como varía a lo largo del tiempo un parámetro como la fluorescencia
y hacer un overlay en el que se muestre una superposición de dos histogramas de muestras
diferentes para poder compararlas con facilidad.

Factores importantes a tener en cuenta a la hora de leer los datos obtenidos:

• Las células tienen que ir en suspensión. Si dos células pasan a la vez por el láser, las
lecturas se variarán pero si no tenemos “un ojo entrenado” no nos daremos cuenta.

• Los valores son SIEMPRE relativos

• Establecer el background o valores de fondo ya que cualquier célula, al excitarla,

produce un fluorescencia base (autofluorescencia) aunque no contenga el
fluorocromo. Esa señal luego se amplificará por lo que tenemos que ajustar el equipo
con una célula que nos aseguremos no tenga fluorescencia. Con estos valores haremos
una recta mínima de fluorescencia que se toma como referencia.

• Necesidad de calibración fotodetectores y fotomultiplicadores para comparar las

muestras entre experimentos.

• Compensación de fluorescencia. Si tenemos

diferentes fluorescencias puede haber
problemas de compensación ya que cada uno
tiene un espectro de emisión y de absorción
pero pueden solaparse y el equipo solo tiene
un filtro que detecta longitudes de onda. Por
ejemplo en este caso el fluorocromo verde y el
amarillo interaccionan y cuando estemos detectando las células con fluorocromo

29
 verde, puede que algunas de las detectadas como + no lo sean pero sí tengan el
fluorocromo amarillo, que emite a una longitud de onda que se superpone. Para evitar
esto, se le resta a cada fluorescencia los extremos que pueden solaparse con otras
fluorescencias que estemos usando o usar fluorocromos que tengan un espectro de
emisión alejado y no se solapen.

• No permite localizar una molécula en la célula.

Aplicaciones de la citometría de flujo:

• Determinación del tamaño de las células. Podemos saber el tamaño relativo o

aproximado de las células por comparación o bolitas de látex comerciales que tienen
tamaños conocidos (1 µm, 2 µm, etc). Con estas bolitas podemos hacer una recta
patrón que nos sirva para comparar nuestra muestra. Esto se puede hacer hasta
tamaños de 30 µm (la recta se descalibra). También se puede hacer con bolitas con
diferentes intensidades de fluorescencia.

• Determinación de la concentración de células. Con las mismas bolitas que en el

ejemplo anterior. Ponemos una cantidad de bolitas conocida en la muestra (ej:
1000/ml) y después contamos los “eventos” marcados (ej: 10000/ml; sabemos que
1000 de esos eventos son las bolitas, por lo que los otros 9000 eventos son células)

• Determinación de propiedades de un determinado número de células o de las células

“caídas” en cierto intervalo de tiempo. Esto nos sirve por ejemplo para comparar la
concentración de dos muestras diferentes, en las que ponemos a contar al citómetro
el número de células en un minuto y vemos qué cantidad de eventos tiene cada una.

• Marcaje con anticuerpos (fenotipado). Simple (un anticuerpo) o múltiple (varios

anticuerpos). Muy usado en diagnóstico e investigación (ej.cáncer). Podemos hacer
una pequeña localización, es decir, localizando el antígeno o el fenómeno que
queremos estudiar, pudiendo estar:
o En la superficie externa de la célula: Si se trabaja con la célula viva y se pone el
anticuerpo marcado que ira hacia el antígeno que está en la cara externa de la
membrana.
o Para proteínas intracelulares: Se debe fijar la célula permitiendo la entrada de
los anticuerpos a la célula.
• Proteínas de superficie. Células vivas

• Proteínas intracelulares. Permeabilizadas

• Estudio de permeabilidad de membrana. Uso colorantes vitales que penetran en

células vivas pero no en las muertas ya que no presentan metabolismo) ; son
moléculas fluorescentes de pequeño tamaño.

• Necrosis (IP), apoptosis (FDA, TUNEL, Anexina V, gel DNA…), proliferación-ciclo celular
(CFSE-vivas, IP-muertas). En la técnica FDA podemos ver resultados negativos (células
con la membrana integra pero muertas y por tanto en apoptosis) o positivo (muerte
por necrosis).

30
• Estudio potencial de membrana, pH intracelular

• Cuantificación y movilización de iones. Ca, Mg, Zn… Podemos ver las diferentes
cinéticas y valores relativos de diferentes muestras gracias a la cuantificación de la
movilización del calcio, uno de los primeros metabolitos activados en las reacciones
celulares.

• Actividades biológicas. Fagocitosis, citotoxicidad, producción de radicales libres,

reacciones enzimáticas…

o La fagocitosis es llevada a cabo especialmente por los macrófagos.

Generalmente la partícula a fagocitar puede marcarse con fluorescencia y
cuando el macrófago la incluye en el fagolisosoma podemos observar una
reacción positiva; podemos mediar además la cantidad de fluorescencia y
determinar la fluorescencia media y la cantidad de partículas fagocitadas en
cada macrófago (no tiene por qué haber una correlación positiva entre el
número de partículas y la fluorescencia media; puede haber un aumento de la
fagocitosis porque se hayan diferenciado más monocitos a macrófagos o por el
aumento del número de receptores que reconocen la partícula).

El quenching es el apagado de la fluorescencia de algunas partículas. La célula es

marcada como fagocítica cuando todavía no ha fagocitado la partícula (sólo ha emitido
los pseudópodos y está adherida a la misma). El quencher más utilizado es el azul
tripano; esta molécula llega a las partículas que se encuentren fuera de cualquier
célula y la rodea para enmascarar el falso positivo pero es incapaz de entrar dentro de
la célula (no produce falsos negativos). También puede utilizarse en estos casos una
bacteria que a pH fisiológico no tenga fluorescencia pero sí lo tenga a pH ácido de
manera que cuando entre al fagolisosoma (con pH ácido) emita fluorescencia; esta
técnica también eliminaría los falsos positivos.

o También se puede estudiar la producción de radicales libres. Lo más

normal es que se produzca H2O2 y O2., para los que existen diferentes
marcadores (el DCF-DA y el DHR123 son los más utilizados para el
peróxido de hidrógeno). Estos radicales libres difunden libremente en
la célula, y dado que los
marcadores se oxidan al
contacto con los mismos,
producen una
fluorescencia verde en su
presencia. En cuanto al
anión superóxido es
detectado por HE.

31
 Estas técnicas son muy sensibles puesto que los radicales libres son
muy inestables y son producidos en gran cantidad (especialmente
durante el estallido respiratorio en las células inmunitarias). El
aumento de los radicales libres de oxígeno determina la potencia del
estallido respiratorio (la célula puede incluso morir).

En condiciones normales los radicales libres de oxígeno se producen

en la mitocondria y es una marca de apoptosis (envejecimiento, estrés
por contaminación, etc)

• Citotoxidad mediada por células. Puede estudiarse también la respuesta de las células
NK para eliminar células tumorales o infectadas por virus ya que se empiezan a
secretar proteínas de apoptosis o necrosis (perforinas, proteasas, etc.) Si tenemos pre-
marcadas con fluorocromos
tanto la célula NK como la
cancerosa podremos ver la
eficacia de conjugación
(dobles positivos) y
cuantificarla y por tanto ver
si hay un defecto en la unión
o en el mecanismo de
eliminación de una célula NK.

También pueden marcarse todas las células diana de los leucocitos y los leucocitos
mismo y poner también yoduro de proridio, que nos marcará las células muertas y
podremos ver las células que han matado los leucocitos. En esta imagen se muestra las
células diana en rojo y en verde podemos ver la actividad caspasa que determina la
apoptosis de las células. De esta forma podemos cuantificar el número de células
afectadas y por qué
mecanismos se han
eliminado (en este
caso por apoptosis
ya que medimos la
actividad caspasa,
enzima
responsable de
este proceso)

• FACS (Flow Activated Cell Sorting). Permite separar poblaciones celulares. Al pasar
células por este citómetro, si cumplen las condiciones que se ponen que se desea
detectar (tamaño, complejidad o fluorescencia), se detectan y se emite una carga
eléctrica que hace que estas células se desvíen del flujo por acción de un electroimán y
se recogen las distintas poblaciones de células que se originan.

Lo más difícil de esta técnica es el calibrado del aparato ya que en cada una de las
gotas que se separe del flujo por acción de la carga eléctrica debe de ir una sola célula.

32
 Tras esto debemos comprobar la purificación (los niveles ideales están en más de un
95% de pureza para considerar los resultados una muestra pura).

• Hibridación y PCR in situ. Mediante la citogenética podemos lisar las células, purificar
sus cromosomas marcados previamente con dos tipos de fluorocromos que nos
marcan las uniones G-C y A-T respectivamente y así poder observar múltiples
poblaciones. Si analizamos y/o purificamos cada una de las poblaciones podemos
saber el cariotipo.

9.1 Citometría de imagen

Funciona como un citómetro de fluorescencia pero también podemos ver las células. Mientras
que en la citometría normal solo podemos diferenciar las células (su superficie o el interior de
las mismas) mediante microscopía de fluorescencia ahora acoplamos un objetivo al aparato
que nos permite ver una imagen de campo oscuro (ver la SSC), una de campo claro (FSQ)
además de 4 fluorocromos diferentes. El inconveniente es que la imagen no tiene mucho
aumento (sólo 60x).

Los datos que podemos obtener son similares a los siguientes:

En este gráfico podemos ver

cómo el contenido de DNA
durante la proliferación celular va
aumentando conforme la célula
se divide hasta que llega a la
telofase y la célula se escinde en
dos.

En esta otra imagen se ve la internalización (fagocitosis) de un fagocito a la izquierda y el

proceso de apoptosis a la derecha. En la imagen de la fagocitosis podemos ver como en el caso
de arriba hay solamente una adhesión de la célula fagocítica (que daría un falso positivo en la
citometría de flujo si no utilizamos quenchers) mientras que en la de abajo si se está
produciendo realmente la fagocitosis.

33
Por último en estas dos imágenes podemos ver el proceso de interacción celular a la izquierda
y la señalización celular.

10. Cultivos celulares

El cultivo en laboratorio de células, tejidos u órganos permite mantener sus propiedades

fisiológicas, bioquímicas y genéticas controladas y además permiten hacer estudios in vitro de
fenómenos in vivo y por tanto utilizarlos como alternativa al uso de animales.

Tipos de cultivo:

• Primarios: Se coge una célula, tejido u órgano de un animal y se pone en un cultivo y se

mantiene in vitro. Estas células tienen una vida finita, por lo que al ponerlo in vitro
llega un momento en el que mueren. Por lo que se está sacando continuamente
células, tejidos u órganos de un animal.

• Secundarios: Donde a partir de subcultivos sucesivos de un cultivo primario y los cuales

han logrado sobrevivir a muchos subcultivos. Estas células se están dividiendo de
forma infinita (líneas celulares).

Además también pueden clasificarse según sean histotípicos (puros) u organotípicos (con
poblaciones heterogéneas de células) y según se encuentren en monocapa o en suspensión.

Usos habituales

• Investigación: Para fisiología celular, toxicología, virología, desarrollo, cáncer,

inmunología, células madre, etc.

• Ingeniería: Regeneración de tejidos, como hueso, cartílago, piel, etc.

• Industria: Producción de anticuerpos, hormonas, enzimas, vacunas virales, etc.

34
Ventajas de su uso:

Estudio de células aisladas, purificadas, pudiendo saber su función concreta. Son fáciles de
manipular y se puede controlar las condiciones del medio. Permite el estudio con líneas
comerciales, pudiendo trabajar con el mismo material en todo el mundo si se desea. Se puede
trabajar a pequeña escala (con microvolumenes) o a gran escala (Grandes volúmenes). Permite
la posibilidad de mantenerlas indefinidamente congelada.

Desventajas:

A veces su comportamiento no es extrapolable al tejido u órgano por tener distinto entorno,

crecimiento, etc.

Equipamiento laboratorio de cultivos

Un laboratorio de cultivos debe tener:

• Un equipamiento estéril: Cabinas de flujo laminar (habitáculos que mantiene todo el

aire del interior estéril), autoclave, sistemas de filtración, etc.

• Incubadoras: Controlan temperatura, humedad y CO2.

• Centrifugas, frigoríficos, congeladores, etc.

• Depósito de nitrógeno líquido para congelación.

Microscopio de contraste de fases invertido. Esterilización

La esterilización es fundamental para mantener un cultivo “de lo que nosotros queremos” y no
de lo que haya en el ambiente y pueda crecer. La esterilización consiste en eliminar
contaminaciones de bacterias, levaduras, hongos, micoplasmas o virus del material.

La esterilización puede llevarse a cabo mediante diferentes métodos:

• Calor seco (160ºC, 2h). Material vidrio, de disección

• Autoclave (121ºC, 20 min). Material vidrio, tampones, soluciones, material disección,

plásticos resistentes (poli-propileno, vinilo, nylon, poli-carbonato, silicona)

• Radiación (principalmente g, también microondas, UV…). Para plásticos no resistentes,

superficies, geles…

• Química (etanol, hipoclorito sódico). Residuos biológicos, superficies, poco para

materiales

• Filtración (0,1-0.22 μm poro). Medios cultivo, soluciones termosensibles

Además también se tendrá que mantener un ambiente estéril durante el trabajo o la

manipulación del cultivo mediante:

35
 • Cabinas de flujo laminar (vertical u horizontal)

o Clase I. Se protege al manipulador

o Clase II. Se protege al manipulador y la muestra de trabajo

o Clase III. Idem a 2 pero agentes infecciosos de nivel 4

• Aseo y limpieza

o Del personal (bata, guantes..)

o De las superficies (etanol 70%, UV)

o De los recipientes. Flameo, dónde se toca, TAPONES

• Forma de trabajo: ordenada, controlada…

Condiciones físico-químicas
• Oxígeno: Cubierto por el aire en células, más difícil en cultivo de órganos

• Temperatura

o Mamíferos. 37ºC

o Aves. 39ºC

o Peces, reptiles y anfibios. 15-26ºC

o Insectos. 28ºC

• Osmolaridad: 260-320 mOsm/kg

• CO2. Producido por el metabolismo celular, es tóxico. Reacciona con el agua dando

carbonato y bajando el pH fisiológico 7’2-7’4. Se corrige con:

o Tampones. Bicarbonato (más usado y barato), HEPES, piruvato (aumento de la

producción CO2 y lo hace independiente del exterior)

o Con atmósfera rica en CO2 (5%). Uso de bicarbonato. Caro pero muy efectivo.
Altas densidades

36
Soporte de cultivo
El soporte utilizado para el cultivo puede ser frascos, botellas, tubos, placas, bien sea de vidrio
o de plástico, en función del cultivo.

• Vidrio. Barato, reutilizable y buena calidad óptica

• Plástico. Barata, no reutilizable. Generalmente poliestireno (es hidrofóbico y lo

necesitamos hidrofílico para que las células se le puedan unir; mediant radiación g,
también lo esteriliza)

• Soportes tridimensionales. Uso de colágenos, nylon, ácidos poli-L-láctico (PLA) o

polietilenglicólico (PGA). Para asemejar a tejidos

Las superficies de los soportes de cultivo han de ser tratadas en algunas ocasiones para que las
células puedan crecer con mayor facilidad:

• Condicionamiento. Uso de medios antiguos, suero… Factores que aumentan

adherencia

• Polímeros. Poli-D-lisina el más usado, aumenta cargas + y adherencia de las células

• Colágeno (o gelatina), laminina, fibronectina, proteoglucanos. Componentes de matriz

extracelular. Se pueden añadir solos o combinados, en redes o no

• Feeder layer. Algunas células tienen requerimiento muy específicos y quizás

desconocidos. Se cultiva primero una monocapa (se irradian para no crecer y aportan
anclaje, nutrientes y factores de crecimiento) y sobre éstas nuestras células

• Antiadhesivos. Uso de medios semisólidos o viscosos. Agar, agarosa o metilcelulosa.

Permiten mantener a la célula “estática” para luego poder rescatarla y clonarla

Medios de cultivo
Es específico para cada tipo celular. Es el medio que rodea y aporta todos los nutrientes a las
células. Debe permitir que la célula se comporte de forma similar a condiciones in vivo.
Contiene hidratos de carbono, ácidos grasos esenciales y otros lípidos:

• Aminoácidos:

o Esenciales + Arg, Tyr, Cys

o Glutamina (2mM). Usado como fuente de

energía (hasta 70%) y carbono en
condiciones in vitro ya que si no se llevaría a
cabo el ciclo TCA, en el que se necesitan
altas concentraciones de glucosa y se
produce lactato que tiene que ser
eliminado. La glutamina es muy inestable en
el medio (se oxida muy rápido con O 2 y la luz) por lo que se sustituye por

37
 glutamato o por glutamax (análogo sintético más caro que la glutamina) o se
cambia cada mes del cultivo.

• Vitaminas. Depende del medio y necesidades celulares

• Sales. Mantienen osmolaridad, regulan el pH. Na +, K+, Mg2+, Ca2+, Cl−,SO42−, PO43−, HCO3−

• Glucosa. Usada como fuente de energía. Sigue glucolísis originando piruvato (al ciclo
de Krebs) o derivándose a lactato (aumenta el pH)

• Ácidos grasos, hormonas, factores de crecimiento. Depende de tipo celular y

experimentación. Muchos de ellos aportados por el suero

Además contiene aditivos como:

• Suero fetal (cultivo indefinido) o adulto: Contiene factores de crecimiento, hormonas,

proteínas transportadores, etc. Normalmente de origen bovino, de caballo, humano,
etc. El suero fetal puede contener virus no analizados que nos infecten el cultivo.

Puede haber ciertas variaciones entre lotes ya que este suero se obtiene de animales,
en diferentes condiciones, etc. por lo que estas condiciones cambiantes pueden
afectar al crecimiento (puede haber variaciones de la concentración de hormonas,
etc). Además, el suero utilizado es de una especie distinta a la estudiada, por lo que va
a haber una respuesta inmunitaria que se tiene que eliminar por descomplementación
(incubar durante 30 minutos a 56ºC).

Tendremos que omitir esta clase de sueros si queremos saber qué hormona y a qué
concentración se produce en nuestro cultivo ya que si no no sabremos si la hormona
se produce en el cultivo o es la del suero añadido. En su lugar pondremos un suero
sintético al que le añadiremos lo que le vaya faltando.

• Antibióticos: Como la penicilina, estreptomicina que actúan inhibiendo el crecimiento

de bacterias, y anfotericina para evitar el crecimiento de hongos y levaduras.
Normalmente de amplio espectro.

• Reguladores de pH o indicadores de pH que nos indiquen si la célula se encuentra a pH

fisiológico (ej: Rojo neutro)

• Aditivos adicionales como: Piruvato, glucosa, glutamina, etc.

10.1 Obtención de un cultivo primario

Para la obtención de un cultivo primario se siguen los siguientes pasos:

• Explante o cultivo en masa. Se obtiene una muestra que puede ser más o menos
sólida y cuyas células hay que separar mediante métodos de:

38
 o Disgregación mecánica. Según la consistencia del explante o cultivo en masa
se hace una disgregación utilizando una pipeta (succionando ligeramente y
repetidamente), una aguja (rompiendo el tejido cuidadosamente) o con
tamices (similares a coladores)

o Disgregación enzimática. Se utilizan enzimas para separar cada uno de los

componentes del tejido: Tripsina, Colagenasa, Pronasa, Elastasa. Estas enzimas
se combinan con EDTA/EGTA

• Aislamiento/purificación de células. Gracias al aislamiento de las células de los tejidos

podremos saber cómo actúa cada una de las células del mismo. Lo más fácil pero que
casi nunca ocurre es que la célula que nos interesa aislar sea la única que se adhiera al
sustrato pero también se pueden utilizar otros métodos como:

o Clonación. Obtención una sola célula y posterior cultivo. Esa obtención puede
hacerse por:

o Método de diluciones seriadas (vamos haciendo diluciones seriadas hasta que

llegue un punto en que, por probabilidad, tendremos una sola célula en el
micropocillo. Tomamos esa única célula y seguimos el crecimiento y
obtenemos una población pura.

o Medios semisólidos (agar, agarosa, metilcelulosa). Tenemos las células en un

lugar lo suficientemente estáticas como para cortar el medio donde tenemos
una población que comprobamos a MO que sea un cultivo monoclonal y
cultivamos.

o Métodos selectivos. Ac, moléculas adhesión, antibióticos… o medios selectivos

que activen el crecimiento de las células que queremos estudiar que haya en la
muestra.

• Mediante centrifugación

o Por diferencia de densidad (centrifugación isopícnica). Gradientes contínuos o

discontíunos. Las células están en un medio de baja densidad y tienen alta
densidad por lo que bajan al fondo pero si se pone sobre una solución con
distinta densidad o mayor proporción de alguna de las poblaciones celulares;
cuando las células lleguen a una capa con una densidad mayor se depositaran
allí. El Percoll o Ficoll son los medios que se usan, para permitir el paso por
densidad de algunas células.

o Por tamaño y densidad (Elutriación).

• Métodos inmunológicos. Como Panning, MACS, FACS. Siempre que se tiene un

anticuerpo que reconozca de forma específica a un antígeno de una población celular
se puede usar para aislar esa población. El panning usa un soporte plástico en la que se
crea una fase solida donde se une un anticuerpo y se añade la suspensión celular,

39
dejamos que la célula se una al anticuerpo, tras ello se retira el sobrenadante y se
hacen varios lavados quedándonos con un grupo de células positivas y otras negativas.

Lo ideal es hacer una

selección negativa ya que si
no tendríamos que desligar
el anticuerpo del antígeno y
la reacción, al ser bastante
específica, es bastante difícil
de revertir.

El FACs consiste en la
utilización de dos
anticuerpos, uno primario y
otro secundario y después
hacer una selección mediante fluorocromos mientras que en el MACs el sistema es el
mismo (utilizamos dos anticuerpos, uno primario y otro secundario) pero la selección
se hace uniendo una bola magnética al anticuerpo secundario que después se atrae
utilizando un imán. Para eliminar la bola magnética se utiliza proteasas (proteólisis).

40
10.2 Morfología celular
Las células obtenidas en un cultivo pueden tener básicamente las siguientes morfologías:

• Linfoblástica. Células en suspensión más o menos esféricas.

• Fibroblástica. Células que crecen en monocapa con apariencia fusioforme

• Epitelial. Células con crecimiento monocapa que son cúbicas, con prolongaciones
cortas y anchas.

Esta morfología no hace referencia al origen y puede variar según estado del cultivo (edad,
confluencia, medio). Además se puede adaptar de monocapa a suspensión por inhibición del
fenómeno de adhesión (muy útil en la industria; uso en biorreactores).

10.3 Curva de crecimiento

Las curvas de crecimiento de los cultivos celulares, al igual que los cultivos bacterianos, tienen
un patrón básico en el que se diferencian las siguientes etapas:

• Fase de latencia (lag). Fijación al sustrato e inicio del ciclo celular

• Fase exponencial. Duplicación número de células cada 24 horas

• Fase de confluencia. Saturación cultivo, dejan de dividirse (monocapa: inhibición por

contacto; suspensión: consumo del medio)

• Fase de muerte. Si el cultivo se prolonga por demasiado tiempo, las células entran en
una fase de senescencia que termina con la muerte de las células en cultivo.

10.4 Subcultivo o pase

Una vez que todo el sustrato está cubierto por la subcapa de células, antes de que llegue la
senescencia se hace un pase o subcultivo. Para ello se cortan las células, se suspenden y se
diluye en medio líquido.

41
 • Si las células crecen en monocapa, se debe separar para ello se realiza:

o Un tratamiento mecánico.

o Si está muy unido se usa un tratamiento enzimático: Como tripsina más un

quemante de grasa como el EDTA.

Una vez que tenemos las células

se lavan, se limpian y se cuenta y
se observa su viabilidad, para
ello usamos una cámara de
Neubauer. Además lo que se
suele hacer es que al mismo
tiempo que se cuentan se puede
saber cuántas están vivas y
cuantas muertas, para ello se
marca con un colorante, que es
azul tripano que nos señala las
células vivas, viendo cuantas
están vivas y cuantas muertas.

Una de las cosas que se deben conocer es la curva de crecimiento (se debe saber cuánto tarda
en crecer la muestra) pudiendo programar los experimentos. Para ello se pone varias
diluciones de una suspensión celular, se ponen en cultivo y cada día se observa el número de
células por conteo con el microscopio o bien usando contadores automáticos o se puede hacer
un ensayo colorimétrico, de modo que marquen las células vivas.

También se puede añadir al medio del cultivo tripsina y suero antiguo con inhibidores del
crecimiento e incubarlos a temperatura baja durante la centrifugación para que no haya tanto
crecimiento.

10.5 Recuento y viabilidad

Son métodos rápidos y sencillos de uso rutinario

• Recuento:

o Contaje de células al microscopio. Cámara de Neubauer

o Contadores de células

o Recuentos indirectos. Rojo neutro, MTT, XTT, niveles AMPc, etc

• Viabilidad

o Basados en permeabilidad membrana. Azul tripano (microscopio), IP, etc.

o Según actividad metabólica. Rojo neutro, MTT, XTT, niveles AMPc, etc.

42
10.6 Contaminaciones
A la hora de hacer un cultivo celular, un factor bastante importante y limitante en el cultivo es
la contaminación. Generalmente es fácil de visualizar si es con bacterias, hongos o levaduras
por la turbidez, pH ácido o al microscopio contraste fases pero a veces no es tan obvio.

Las contaminaciones más comunes, además de las bacterianas son:

• Micoplasmas: Los micoplasmas son bacterias sin pared, de

menos de 1 μm. Afectan al crecimiento, proliferación, etc
Detección por PCR, ELISA, tinción Hoechst 33258. Curación con
gentamicina, kanamicina, tylosina, tiamulina, etc.

• Virus. Suelen proceder del medio, especialmente si contiene

suero y son difíciles de erradicar. Diagnóstico por ELISA,
inmunocitoquímica, PCR

• Contaminaciones cruzadas. Se produce una mezcla de líneas o

tipos celulares por mal manejo.

10.7 Congelación
El proceso de congelación permite guardar las células manteniendo su viabilidad. Lo
importante es que la congelación se produzca sin formar cristales de agua que rompan las
células. Para ellos se utiliza:

• Crioprotectores. Reducen la formación de cristales (DMSO al 10%, polivinilpirrolidona,

trealosa, etc.). Generalmente se combina con >50% suero. No deben ser tóxicos

• Descenso temperatura lentamente (1ºC/min). Isopropanol, metacrilato a -80ºC

Los cultivos se pueden guardar en nitrógeno líquido (-196ºC) y para que vuelvan a crecer se
tienen que descongelar de la siguiente forma: Se hace en baño de 37ºC rápido, se elimina el
crioprotector mediante centrifugación y se ponen las células en un cultivo. Para que vuelvan a
crecer con normalidad hay que esperar 10-15 días.

10.8 Aplicaciones de los cultivos celulares

Los cultivos celulares se utilizan para hacer estudios sobre:

• Función celular: Curva crecimiento, muerte celular (Apoptosis vs. Necrosis),

proliferación, parámetros celulares (enzimas, pH, potencial membrana, etc),
movilización de calcio, fagocitosis, producción radicales libres, células madre, cáncer

• Toxicidad celular: Contaminantes (Pb, Cd, etc), compuestos antitumorales ,

compuestos estrogénicos, cosmética

43
• Cultivo y diagnóstico viral:
Cultivo de virus, recuento
viral, diagnóstico viral,
producción vacunas
virales

• Anticuerpos
monoclonales:
Producción, identificación
y purificación

• Transfección: Función y
localización proteínas,
silenciamiento génico

• Terapia génica

• Toxicología. Permite conocer el número de células en una muestra tras proliferación o

muerte y por tanto podemos determinar las vivas o las muertas

¿Cómo determinarlo?

• Contando. No es un método válido para muchas muestras, heterogéneo, alto error

• Según actividad metabólica (vivas). Rojo neutro (lisosomas), formazanes como el

MTT ó XTT (mitocondria), cristal violeta, etc. Precipitados celulares que se
solubilizan y determinamos OD

• Liberación de contenido celular (muertas). LDH, compuestos radioactivos, etc

• Obtener la curva de crecimiento o de toxicidad. LC 50 in vitro alta correlación con in

vivo (si un compuesto es tóxico para la célula in vitro a una determinada
concentración, in vivo será también tóxico y además a una concentración más o
menos similar)

Podemos tomar placas multipocillo en las que hagamos cultivos con diluciones
seriadas de una sustancia pura, un extracto de una muestra de agua, tierra, etc. y
en uno de los pocillos ponemos una muestra sin tratar (control negativo). Cuantas
más células muertas haya en el pocillo, más tóxica es la concentración de
sustancia. Podemos contar las células muertas, pero es un proceso muy laborioso y
poco preciso, asi que podemos utilizar colorantes vitales (marcadores para
reacciones enzimáticas que solo se dan cuando la célula está viva).

Con estos datos podemos hacer un gráfico con la curva de viabilidad o el

porcentaje de células vivas (que descenderán conforme aumentemos la
concentración de la sustancia tóxica). A partir de la curva de viabilidad podemos
calcular el LC50 (concentración a la que el 50% de las células en el cultivo están
muertas). El LC50 de las células in vivo será el mismo que las del cultivo

44
• Ingenieria tisular. Cultivo de piel, epitelio intestinal, bronquial, renal, etc. Usamos
pocillos denominados “transwell” para el cultivo de alta densidad y polarizado y
exponemos a la sustancia a testar. Después evaluamos la integridad del epitelio

Con este método también se pueden estudiar las uniones intercelulares y al

sustrato (lámina basal in vivo) y las rutas paracelular o transcelular (paso de
sustancias, conductividad). Además también se pueden hacer estudios de
localización y colocalización con microscopía láser de barrido confocal. Las células
epiteliales tienen proteínas de unión por lo que todas las sustancias que lo quieran
atravesar tienen que pasar por la célula (vía traanscelular). En el epitelio sellado se
dispone una sustancia que podamos rastrear (ej: con un fluorocromo); cuando la
sustancia atraviese el tejido y llegue a la lámina de debajo del epitelio (medio de
cultivo) podremos estudiar si ha sufrido algún cambio, la velocidad de transporte,
si funcionan los antiinflamatorios contra la misma, etc. Ej: ponemos un fragmento
de epitelio con los macrófagos activados y lo tratamos con un fármaco
antiinflamatorio y vemos si hay una reducción de la activación de los macrófagos.

• Producción de anticuerpos. Se puede utilizar los cultivos celulares para producir

anticuerpos monoclonales o híbridos (hibridomas).

La formación de un hibridoma se lleva a cabo fusionando células de la línea

tumoral mieloma y esplenocitos de animal inmunizado; ambos tienen que ser
isogénicos (evitar rechazo y respuesta inmunitaria). Los hibridomas se cultivan en
medio selectivo HAT (Hipoxantina-Aminopterina- Timidina) para aislarse de forma
que:

o Mieloma + Aminopterina.
Mueren por no sisntetizar DNA
(dGTP ni dTTP)

o Los linfocitos mueren en unos

días en cultivo, sintetizan los
nucleótidos

o Las fusionadas mantienen síntesis de nucleótidos, vida infinita y

producción de Ac.

45
 Gracias a los hibridomas podemos hacer
cultivos celulares que vivan
indefinidamente y formen los anticuerpos
que a nosotros nos interesen. Los
hibridomas se pueden poner en un
multipocillo y algunos serán liberados al
sobrenadante. Después haremos un
fenotipado de cada sobrenadante y
haremos un cultivo de los hidridomas que
más anticuerpos que queremos nos
genere. Además podemos dejar que los
hibridomas crezcan y los diluimos 3 ciclos
para hacer un cultivo monoclonal que nos
produzca los anticuerpos deseados.

• Virología. Gracias a los cultivos celulares podemos tanto obtener virus como
usarlos en el diagnóstico viral en una célula
hospedadora de virus. Actualmente la
determinación de virus se hace por serotipado
(en una PCR se puede determinar la presencia de
5 virus a la vez) pero todo diagnóstico válido
tendrá que terminar con un cultivo celular (puede
que en una muestra haya un virus pero no
sabemos si está muerto o vivo).

Primero se hace un cultivo de células

monocapa de las células hospedadoras
del virus y se pone una célula que esté
posiblemente cargada de virus. Si la
célula en efecto está cargada de virus
explotará e infectará al resto por lo que
todas las células acabarán lisadas y
podremos hacer una aproximación de la
concentración de virus por ml de sangre
o gr de tejido que había en la muestra.

Después pondremos una célula en una placa multipocillo con diluciones seriadas
del virus y una control. En todo aquel pocillo en el que se produzca la infección las
células morirán. El cristal violeta detecta las células vivas en azul por lo que
podremos ver las calvas de
lisis y contarlas. Se calcula
con este dato el número de
ufo/ml de virus infectivos
(virus vivos con capacidad
de infectar esas células
concretas).

46
 En este ejemplo vemos que en la columna
con una dilución de 10 -6 hay 3 ufp infectadas
de 7. Además el control es negativo.

Podemos hacer también otro medida

denominada TCDI50 que nos determina el
número de virus que producen las calvas de
lisis de la mitad de las células del cultivo. Este
cálculo se hace mediante el método de Reed
y Muench, que nos dice que en este caso:

Si queremos purificar los virus en cultivos tendremos que hacerlo en cultivos

semisólidos para que los virus y las células no difundan. En la zona de un halo de
lisis recortamos y después lo cultivamos. Puesto que el halo de lisis puede deberse
a más de un virus infectivo, hacemos una re-purificación.

• Transfección. Se define transfección como la introducción de gen(es), mediante un

plásmido o virus, en una célula para que exprese dicha proteína. La sección del
genoma que determina dicha proteína ha sido determinada por PCR. El plásmido
se manipula con una bacteria que
seleccionamos (genes de resistencia a
antibióticos o de auxotrofía), cultivamos
(amplificamos el plásmido) y después
secuenciamos para comprobas que es el
mismo plásmido que hemos insertado y no
hay una mutación, que la inserción se ha
producido en fase, la dirección es correcta,
etc. Por ultimo transfectamos la célula, que
produce el RNAm que nos interesa y se
sintetiza la proteína de interés
(generalmente hay un sobre-expresamiento
de la proteína porque se inserta más de un
plásmido por genoma).

Hay diferentes tipos de transfección:

o In vivo o in vitro. In vivo normalmente se hacen estudios con gusanos o

plantas, que son sistemas con mucha biomasa que producen una gran
cantidad de proteína. Una vez hecha la transfección se purifica y se
comercializa la proteína. Ej: patata, alfalfa, etc. La producción in vitro es
menos comercial.

47
 o Transitoria o permanente. La expresión transitoria en células animales en
un cultivo puro dura aproximadamente 3 días mientras que en la
permanente hacemos una construcción que se inserte en el genoma del
organismo y se divide con las células, de forma que se “renueva” con cada
generación.

Usos o aplicaciones de la transfección:

o Expresión de proteínas para su purificación

o Estudio de promotores y elementos regulatorios

o Procesamiento del RNA, postraduccionales, etc.

o Localización, distribución e interacción de proteínas

o Terapia génica

o Generación vacunas, anticuerpos….

Factores que afectan a la eficacia de transfección:

o Tipo celular (líneas mejor que cultivos primarios, etc.)

o Estado del cultivo (fase exponencial al 60-70%)

o Medio de cultivo y aditivos

o Tipo de plásmido/virus

o Cantidad de DNA y transfectante (barrido de ratios)

o Calidad del DNA-transfectante

o Método de transfección

Métodos de transfección:

o Liposomas: Son de alta eficiencia y no es toxico.

o Fosfato de calcio: Es más simple y más económico pero peores.

o DEAE-dextrano: Igual que fosfato de calcio.

o Electroporacion: Se genera un pulso eléctrico que abre canales y entra el

material genético, es alta su eficiencia pero tiene baja supervivencia por lo
que no se usa mucho.

o Microinyeccion: Es muy laboriosa y muy cara pero muy efectiva.

o Biobalistica: Partículas de oro muy pequeñas que se recubren con el

material genético y se disparan desde una pistola al organismo o célula

48
 penetrando en la célula pero sin romperla, también es muy caro pero
presenta alta eficiencia.

o Uso de virus: Se usan virus atenuados pero sin embargo conseguir el virus
recombinante y atenuado, pero como actúan infectando muy fácilmente la
transfectancia es muy alta.

Elementos de un plásmido. Cuando se genera el plásmido presentara:

o Elementos que permitan su replicación tanto en eucariotas como en

procariotas.

o Un promotor de eucariotas
para que el gen se
transcriba y el promotor
puede ser constitutivo o
inducible (por la inducción
de la formación de algún
compuesto, aumento de
temperatura, etc.).

o Señales de poliadenilacion.

o Codones de inicio y stop.

o Proteínas nativas o bien proteínas marcadas por un tag.

o Marcadores de selección.

Una vez que se está creando el plásmido, se puede introducir los tag tanto en el
extremo carboxilo como el amino. Si se quiere estudiar la interacción entre 2
proteínas se puede transfectar con dos plásmidos distintos o bien con un plásmido
que genere las dos proteínas. Se utilizaran genes chivatos que nos permiten
evaluar la capacidad de transfixion o que nos permite visualizar la proteína
recombinante. Estos genes chivatos son:

o CAT: Nos permite clonar células que deriven todas de una positiva y por
tanto sean todas positivas.

o GAL: Se pone un sustrato que nos produce un producto que es un

precipitado de color azul.

o LUC: Usa la luciferina que emite fotones que se miden en un luminómetro.

Esto se usa mucho pues nos permite obtener un dato estadístico
directamente.

o GFP: Que nos permite estudiar la célula in vivo y sin ninguna manipulación,
por lo que mediante un microscopio de fluorescencia o barrido confocal o
citometría seguir estas células.

49
 o Detección de las proteínas expresadas. El tag lo bueno que tiene es que
hay anticuerpos contra todos los tag, de modo que nos permite distinguir
dentro de una célula que proteína es producida por la células de forma
endógena o bien producida por le plásmido. Este tag se puede:

- Poner en cualquier extremo.

- Se puede quitar tras la purificación.

- La detección necesita la muerte celular. GFP permite el

seguimiento in vivo.

- Pueden producir toxicidad celular.

- Pueden alterar la función de la proteína recombinante.

Permite favorecer la solubilidad de la proteína recombinante (para poder

posteriormente purificarla) también se puede usar para silenciar genes.

• Células madre. Las células madre son células no especializadas capaces de

replicarse y diferenciarse a cualquier tipo celular. Son las responsables de la
generación, regeneración y mantenimiento de todas las células. Se cultivan in vitro
como una línea celular (crecimiento infinito).

Usos de las células madre:

o Tratamiento de leucemias y linfomas

o Curar o reemplazar órganos. Regeneración ósea, miocárdica, neuronal….

o Estudios
farmacológicos
(drogas,
medicamentos)
en órganos o
tejidos obtenidos

Desventajas de su uso:

o Proliferación in vitro insuficiente

o Diferenciación a las células adecuadas

o Supervivencia en el enfermo receptor

o Integración en los tejidos

o Funcionamiento adecuado

o Inocuas, generación de cáncer

50
 • Silenciamiento o interferencia génica.
Introducción de ARN interferente solo o
en plásmidos de modo que la
transfección impide la traducción del
mRNA a proteína, por lo que no se
forma proteína y por tanto no hay
función, por lo que esta transfección se
puede usar como terapia génica. Se
puede usar un virus atenuado o un
plásmido que nos exprese un gen que
contrarresta una deficiencia enzimática,
hormona. Se puede hacer un
silenciamiento para un gen relacionado
con un tumor disminuyendo la
producción del tumor, etc.

11. Centrifugación diferencial

Gracias a la centrifugación diferencial se obtiene un homogenado, se lisan las células en un
tapón y se somete de forma secuencia a distintas velocidades y tiempos de centrifugación.
Obteniendo en la primera centrifugación los núcleos y sobrenadante, que se vuelve a
centrifugar y se obtiene mitocondrias, cloroplastos, lisosomas y peroxisomas, después se
vuelve a centrifugar el sobrenadante y se obtiene membrana plasmática, fracción
microsomal, etc. Tras ello se vuelve a centrifugar el sobrenadante obteniéndose las
subunidades ribosomales y pequeños poliribosomas y un sobrenadante que se vuelve a
centrifugar y nos da la parte soluble del citoplasma. Para cada fracción se hace una
reacción especifica de ese orgánulo de manera que sabemos así si la fracción es pura o no

51
 o cuando esta de contaminada con otras fracciones pues tenemos marcadores específicos
de cada estructura.

12. Otras técnicas

12.1 ELISA/EIA/RIA
Nos permite la detección de un antígeno o anticuerpo en una muestra. Se puede tener en la
fase solida, pegado al soporte o bien el anticuerpo o el antígeno. El revelado puede ser
colorimétrico, luminimétrico, fluorimétrico o radiactivo (se llama RIA). Hay distintos tipos, el
directo, el indirecto, sandwich o
competitivo (se tiene en la fase solida el
anticuerpo y se añade la muestra con el
antígeno a determinar y una fracción
conocida del mismo antígeno marcado,
por lo que compiten por unirse al
anticuerpo, una vez unido se lava y se
mide para ver la cantidad de antígeno, si
la muestra tiene poco antígeno, la
muestra tiene mucho antígeno marcado,
por lo que emite mucha señal. En este tipo
de Elisa a mayor cantidad de antígeno
mayor cantidad intensidad). No se puede
localizar el antígeno.

52
12.2 Western Blot
Se hace una electroforesis de proteínas, se transfieren todas a una membrana de nitrocelulosa
y se hace una inmunodetección en esa membrana. Nos permite ver una banda que es nuestra
proteína de estudio, mediante un anticuerpo. Nos permite detectar la presencia de una
proteína, en cierta medida si
secretaba o no la proteína,
determinar el tamaño pero no
nos permite localizarla. También
se puede modificar esta técnica
para ver si nuestra proteína de
estudio está libre o interactúa
con otra proteína (se hace un
gel nativo, de modo que si la
proteína interactúa con otra
proteína, al hacer electroforesis
correrá menos, viendo que tiene
un tamaño mayor, o que nos
indica que interacciona con otra
proteína.

53
 TEMA 2: RELACIONES DE LA CÉLULA CON SU ENTORNO

I. MEMBRANAS CELULARES: APROXIMACIONES METODOLÓGICAS

PARA SU ESTUDIO
1. Establecimiento del modelo de mosaico fluido
Pfeffer en 1887 intuyo que había una capa invisible alrededor de las células impermeable con
propiedades osmóticas. Más adelante, Overton determino la naturaleza lipídica de la capa
impermeable usando estudios de difusión a través de la membrana, lo que uso fue los pelos
radiculares de las raíces para estudiar como difundían las sustancias; observo que las
sustancias liposolubles eran más rápidas por lo que intuyo que la membrana tenía naturaleza
lipídica.

Laugmuir, en 1916, publico un estudio de la disposición de monocapas moleculares en relación

con el agua, esto posibilito más adelante entender mucho sobre la membrana plasmática, ya
que describió como se organizan los fosfolípidos sobre el agua (monocapa lipidica). Mas
delante, Gortel y Grendel determinaron que las membranas estaban constituidas por una
bicapa lipídica: extrajeron los lípidos de membrana de los eritrocitos y midieron la extensión
de estos fosfolípidos sobre el agua. Vieron que la extensión era justo el doble de una capa de
fosfolípidos, por lo que dijeron que se organizaba en una bicapa lipídica.

Cole, en 1932, dijo que las propiedades eléctricas de las células vivas no se ajustaban al
modelo de la bicapa lipídica. Danielli y Davson, en 1935 establecieron que además de
fosfolípidos, había proteínas asociadas a las cabezas hidrofílicas de los fosfolípidos. Más
adelante establecieron que debían existir poros que permitan el paso de moléculas. Hasta que
no se dispuso de ME no se pudo ver la estructura de la membrana: Modelo de "unidad de
membrana". La parte más electronodensa corresponde a las proteínas asociadas a las
cabezas hidrofílicas de los fosfolípidos y la menos electronodensa a los poros.

Singer y Nicolson descubrieron después, en 1972, que las proteínas atravesaban la membrana:
Modelo de "mosaico fluido", la membrana está formada por proteínas globulares antipáticas
parcialmente incrustadas en la matriz de fosfolípidos, que forman una doble capa fluida (los
fosfolípidos se pueden mover: lateralmente, flip-flop, difusión o rotación) discontinua.

1.1 La fluidez de la membrana

La fluidez de la membrana es la capacidad que tienen los lípidos de difundir en el plano de la
bicapa, depende de:

• La temperatura (influye en el estado físico de los lípidos, a baja temperatura menos

fluidez)
• El tipo de lípidos que la componen (ácidos grasos). Es importante especialmente la
longitud de la cadena (a menos longitud de la cadena mayor fluidez) y el grado de
saturación (a más saturación, menos fluidez y más viscosidad). La viscosidad es la
propiedad contraria.

54
 Las insaturaciones van a crear un bucle a nivel del doble enlace que dificulta el
empaquetamiento de las cadenas hidrocarbonadas en la bicapa.
• La presencia de colesterol debe mantenerse dentro de unos límites para que la
membrana sea funcional. El colesterol restringe los movimientos aleatorios de las
cabezas polares, por lo que confiere rigidez a la membrana. Además, también
interrumpe el empaquetamiento de las colas de las cadenas hidrocarbonadas a baja
temperatura e interfiere en la movilidad de las cadenas hidrocarbonadas a alta
temperatura por lo que aumenta el rango de temperatura a la cual la membrana
mantiene la organización y funcionalidad (estabiliza las membranas de células
animales).
El colesterol también desciende la permeabilidad de la membrana a moléculas
pequeñas solubles.

Es importante que la membrana sea fluida ya que permite interacciones transitorias dentro de
la membrana como por ejemplo:

• Difusión rápida de proteínas en el plano de la bicapa para la interacción entre células

(señalización celular)
• Ensamblaje de proteínas como las estructuras de unión, los complejos fotosintéticos,
etc.

Además, la fluidez de la membrana posibilita la fusión de las membranas, importante en el el

transporte vesicular y los procesos de renovación de membranas y es también indispensable
para procesos celulares elementales como el movimiento, crecimiento, división, etc.

2. Aportaciones posteriores al modelo de mosaico fluido

2.1. Estudios sobre la disposición de lípidos en la bicapa
La disposición de los lípidos en la
bicapa se estudia midiendo la
susceptibilidad de hidrolisis por
fosfolipasas añadidas al medio externo.
Aquellos lípidos de la bicapa que más
se hidrolizan son aquellos que están en
la hemimembrana externa ya que
están más expuestos que los que se
encuentran en la interna.

Se vio que los fosfolípidos se disponen en la membrana de forma asimétrica, esto se debe a
que se necesita una disposición funcional, al ser la disposición asimétrica, funcionalmente en
las hemimembranas tienen lugar procesos diferentes (especialización funcional). Ej: El
fosfatidilinositol de la cara citosólica se une al diacilglicerol en la membrana (con la activación
subsiguiente de la proteína quinasa C) y a los fosfoinositoles en el citosol (por medio de la
fosfolipasa C activada por estimulación hormonal y provoca una liberación de Ca+2 desde el
retículo plasmático); estas reacciones son una via de señalización. Otro ejemplo son los

55
glucolípidos de la cara exoplasmática que tienen funciones de glucalix (mediación de
interacciones con el entorno).

Otro motivo para la asimetría es la

formación de la curvatura de la
membrana: la fosfatidilcolina
tiene forma de cilindro mientras
que la fosfatidiletanolamina tiene
forma de cono; al asociarse esta
proteína con la bicapa se origina
una curvatura en la membrana, lo
que se puede aprovechar para dar
estructura.

¿Cómo se produce la asimetría?

Es resultado de la síntesis vectorial de los lípidos en el RE y su posterior transformación en el
aparato de Golgi (encargado de distribuir las diferentes proteínas a las otras membranas
celulares); también es resultado de la acción de las flipasas (que transfieren de forma selectiva
ciertos fosfolípidos específicos) y de la gemación y fusión de vesículas procedentes del aparato
de Golgi.

56
 2.2 Estudios de proteínas de membrana

I. Extracción/purificación de proteínas
Las proteínas periféricas se extraen con soluciones salinas concentradas que debilitan los
enlaces electrostáticos, sin embargo las transmembrana necesitan para ser solubilizadas o
extraídas separadas de los otros componentes de membrana detergentes. Estos detergentes
con
son pequeñas moléculas anfifílicas con extremos polares que pueden estar cargados (dodecil
sulfato sódico) o no (tritón), que se asocian a las proteínas a las que pueden quedar unidos
fosfolípidos.Los detergentes se unen a los fosfolipidos de la membrana y forman micelas.Tambien se unen a
las proteinas transmembrana,por lo que separan a éstas de la membrana.
Se puede hacer una separación en gel de poliacrilamida-SDS, se purifican y cristalizan para
observar su estructura (esquema de la izquierda) o reconstruir sistemas funcionales de
proteínas de membrana para estudiarlos como la bomba Na-K ATPasa (esquema de la
derecha).

II. Lateralidad y orientación de las proteínas en la bicapa

La tripsina hidroliza las proteínas, se aíslan y se
hace electroforesis en gel: viendo como varía
su movilidad se puede saber si tenían zonas
expuestas al exterior o no. Tendrán más peso
molecular las que menos se hayan movido y
conforme vayan siendo digeridas correrán más
en el gel.

Tras hidrolizar las proteinas con tripsina y obtenerlas las

sometemos a un proceso de electroforesis.Aquellas proteinas mas
grandes se quedaran arriba mientras las menos pesadas correran
mas en el gel.Teniendo en cuenta que en funcion de su peso una
proteina podra atravesar mas o menos la membrana,podremos ver
que proteina ocupa mas o menor porcion de la membrana
observando el gel. 57
III. Distribución de las proteínas integrales
Para estudiar la distribución de las proteínas integrales se usa la criofractura.

IV. Difusión de proteínas dentro de la membrana

Otra forma de estudiar las
proteínas es estudiando su
difusión en la membrana: se
evidencia la difusión lateral de las
proteínas fusionando células de
ratón y de humano, las proteínas
difunden y se mezclan. Para que
ambas células se fusiones hay
que añadir:

• Virus desactivados
• Propilenglicol
• Un pequeño choque
eléctrico

V. Cuantificación del movimiento dentro de la membrana de proteínas y lípidos específicos

(FRAP)
Se puede cuantificar el movimiento dentro de la membrana de proteínas y lípidos específicos
mediante la técnica de recuperación de la fluorescencia después de fotoblanqueamiento
(FRAP). Se usa un Ac contra las proteínas marcado con fluorescencia y con un láser potente se
irradia una zona de modo
que pierde la fluorescencia
y queda un parche blanco.
Si se deja recuperar un
tiempo se ve que se
recupera la fluorescencia
debido a la difusión de
moléculas fluorescentes de
las áreas vecinas. Se puede
medir la velocidad a la que
se recupera y el % de
recuperación. Conclusiones:

• Aplicado a fosfolípidos, el movimiento libre es de 0.5 micras, no difunden distancias

mayores.
• Hay agrupaciones de proteínas.
• Hay asociaciones de lípidos y proteinas que cuando se mueven lo hacen juntos.

58
Esto llevo a que apareciese un nuevo modelo: Simons y Meers en 1988 decían que había en la
membrana complejos de glucoesfingolipidos y colesterol empaquetados estrechamente y que
se comporta como unidades en la monocapa externa de la membrana. Este modelo
actualmente se ha modificado con el
concepto de balsas lipídicas o balsas de
membrana; las balsas lipídicas se
definen como micro dominios ligeros y
dinámicos, lo que hacen es restringir
determinados procesos a esa zona de la
membrana. Hay diversos tipos: balsas
planas y caveoladas.

Las balsas lipídicas planas son transitorias, ricas en esfingolipidos y colesterol. Son más viscosas
y menos fluidas que las regiones
colindantes. El grosor de la membrana
en esta región es mayor porque los
fosfolípidos están más compactados.
Funciona como plataforma flotante de
la membrana que se forma o
desaparece concentrando proteínas
especificas necesarias para
determinados procesos.

VI. Demostración de la agrupación de determinados lípidos y proteínas específicas en la

membrana
Para saber que proteínas
forman parte de las
balsas: experimento en los
que se estudia si 2
proteínas se asocian con
los glucoesfingolipidos. Se
hace mediante una
inmunocitoquímica: con
anticuerpos asociados a
un fluorocromo, a la vez
que se expone la membrana a la toxina del cólera marcada con otro fluorocromo. Si los Ac se
han unido a las moléculas se ven próximos, sino se diferencia la fluorescencia.

VII. Control de la movilidad de las proteínas de membrana

Estos estudios pueden hacerse de dos formas:

• Con experimentos de rastreo de proteínas individuales marcándolas con Ac que las

reconocen específicamente. Estos anticuerpos están marcados con partículas de oro,
de modo que se pueden seguir los movimientos mediante microscopia en vídeo con un
ordenador. En este ejemplo se encuentra que hay una proteína que tienen
movimiento aleatorio (A), otras que están inmovilizadas (B, D y F), otras que tienen un

59
 movimiento dirigido (c) y por ultimo hay proteínas (E) que tienen un movimiento
limitado por barreras (difunden pero no salen de una zona).

• Alterando proteínas genéticamente, se modifica la región citoplasmática o bien la que

sobresale al exterior. Se ve que las proteínas integrales sin la porción citoplasmática se
mueven distancias mayores que las que no están modificadas. Las que no tienen la
porción extracelular se mueven más rápido. Por tanto en la célula, tanto en el medio
intracelular como en el extracelular hay impedimentos para que las proteinas se
muevan.

• Otro tipo de estudio es con pinzas ópticas. Las pinzas ópticas nos permiten trabajar
con proteínas integrales marcadas con cuentas cubiertas de anticuerpo. Un rayo láser
agarra las cuentas mediante fuerzas ópticas y pueden arrastrar proteínas integrales. Al
alcanzar una barrera, las proteínas se sueltan y vuelven a su lugar. Se ha llegado a la
conclusión de que existen en la propia membrana barreras elasticas.

De modo que como resultado de los estudios se ve

que en la membrana hay mecanismos por los que se
confinan proteínas a determinadas reacciones. Para
ello la célula ensambla las proteínas para formar
agregados que no se muevan, por interacción con
agregados macromoleculares del exterior o del
interior, por interacción con otras proteínas de la
superficie de otras células, o bien mediante barreras
de difusión (zónulas occludens).

A parte de estas estructuras visibles al microscopio,

hay otras no visibles que impiden que las proteínas
difundan: hay elementos en el citosol tipo
citoesqueleto que anclan las proteínas.

VIII. Otros métodos de estudio

Otros métodos que se pueden utilizar son:

• Determinación de la conductividad mediante medidas del potencial de membrana de

las células
• Fraccionamiento celular y centrifugación diferencial. Nos permitirá obtener
microsomas y pequeñas vesículas. La separación en gradiente de densidad (densidad
de flotación) nos permite obtener vesículas COPII y COPI y hacer por tanto estudios de
composición y funcionales

60
 II. MATRIZ EXTRACELULAR
La organización macromolecular de la matriz
extracelular es la siguiente:

Consiste en una red tridimensional compuesta

de:

• Fibrillas de colágeno
• Eje protéico proteoglucano. Este a su
vez está formado por un eje protéico
del que salen radialmente hidratos de
carbono. El eje protéico está unido por
proteínas de unión al hialuronano
• Hialuronano

La matriz extracelular forma la lámina basal o

lámina externa (en su forma laminar) y aparece
en la base de las células epiteliales y rodea a las
células musculares lisas, a los adipocitos, las
células de Schwann, etc.

1. Matriz extracelular de células animales vs vegetales

La matriz extracelular de células animales es una red organizada de materiales extracelulares
sintetizados por las células a las que permanece asociada. Está formado por:

• Material fibroso: Resistente a fuerzas de tensión y elástico (fibras)

• Sustancia gelatinosa altamente hidratada (sustancia fundamental amorfa)

La matriz extracelular contribuye a la integración de las células que la sintetizan en tejidos y les
confiere propiedades fundamentales además de ayudar a coordinar las funciones celulares. La
matriz contribuye a que las células se integren entre sí para que actúen de forma cooperativa.

La matriz extracelular de las células vegetales es la pared celular. En estas células la matriz
extracelular está compuesta por:

• Microfibrillas de celulosa.
Son el componente
fibroso de esta matriz
• Glucoproteínas
estructurales (como las
extensinas y las lectinas),
enzimas y polisacáridos.
Son el componente
amorfo.

61
2. Componentes de la matriz extracelular de células animales
2.1 Componente fibroso
El componente fibroso de las células vegetales está formado colágeno y fibras elásticas. El
colágeno está formado por una triple hélice de tropocolageno, cada hélice es un péptido con
configuración de alfa hélice, el péptido es una secuencia repetitiva gly-pro-Y. En el centro de la
triple hélice están los protones con residuos de glicina (que si son reemplazados por grupos
mayores en mutaciones que reemplazan glicina por otro aminoácido se ve que se desestabiliza
la estructura del colágeno.

I. Síntesis del colágeno

Primero se sintetiza una cadena de pro-colágeno alfa en un compartimento del RE o del Golgi.
Después esta cadena se hidroxila en algunas prolinas y lisinas ya que la hidroxiprolina y la
hidroxilisina estabilizan la triple hélice formada por el tropocolágeno (por puentes de
hidrógeno intracatenarios). Esta hidroxilación es dependiente de vitamina C y su falta produce
una enfermedad denominada escorbuto. Después se produce una glicosilación (adición de
glucosa y galactosa) a algunas hidroxilisinas y las cadenas de pro-colágeno alga se
autoensamblan formando pro-tropocolágeno. El pro-tropocolágeno se secreta por medio de
una vesícula de secreción a la membrana plasmática donde la molécula de procolágeno se une
a propeptidos y se forma así la molécula de colágeno final

Tipos de colágenos
El colágeno puede ser principalmente de tres tipos:

• Fibrilar: forman fibrillas y son el

colágeno tipo I, II, III y V. Son
moléculas de colágeno formados
por una fibrilla de colágeno, esa
fibrilla se forma por
autoensamblado de las moléculas
de tropocolágeno de forma
organizada, dejando un espacio
de 67 nm entre una molécula y
otra que es la zona más
electronodensa (porque ahí se
disponen los metales pesados
que se usan en MET). Las fibrillas
se autoensamblan mediante
enlaces covalentes laterales a
través del residuo Lys,
estabilizando la unión de las
fibrillas. A su vez, las fibrillas se
asocian entre sí para formar fibras y estas para formar haces de fibras. Tienen un
diámetro de 20-100 nm.

62
• Colágeno asociado a fibrillas (colágeno tipo VI y IX): En el colágeno tipo VI de los
tendones, las fibrillas de colágeno tipo I se asocian al colágeno de forma no covalente
para formar fibras grandes. Se forman dímeros antiparalelos por uniones laterales.

En el colágeno tipo IX del cartílago en la unión de las fibrillas de colágeno tipo II hay
codos porque se interrumpe la triple hélice, se asocian lateralmente a las fibrillas y se
proyectan al exterior de la fibrillas impidiendo que se asocie a otras fibrillas para
formar fibras.

• Colágeno formador de láminas (IV): triple hélice con dominios terminales globulares.
Con discontinuidades, se dimeriza y tetrameriza formando un entramado que sea socia
con otras proteínas para formar la lámina basal o lamina externa.

63
II. Fibras elásticas
Las fibras elásticas están formadas por:

• Componente amorfo:
o Elastina: La elastina es una proteína altamente hidrofóbica rica en prolina y
glicina no glucosilada. Tiene segmentos hidrofóbicos (propiedades elásticas) y
segmentos en hélice alfa (con enlaces cruzados entre la desmosina e
isodesmosina que permiten que la elastina pueda estar distendida)
• Microfibrillas (Más cantidad y con un diámetro de 12 nm). Están compuestas por
fibrilinas (glucoproteínas fibrilares) y proteínas asociadas a microfibrillas (MAGP).

Síntesis de las fibras elásticas

La síntesis de las fibras elásticas comienza en el REr donde se sintetizan los tres componentes
de una fibra elástica: proelastina (que contiene desmoaina e isodesmosina), glucoproteínas
asociadas a las microfibrillas (MAGP) y las fibrilinas 1 y 2. Una vez sintetizadas van al aparato
de Golgi, donde se produce el empaquetado y secreción de la proelastina. Por ultimo en el
espacio extracelular se produce el coensamblaje de MAGP y tropoelastina para producir las
fibras elásticas inmaduras: La fibrilina 1 aporta un soporte estructural que soporta fuerzas
mientras que la fibrilina 2 regula el ensamblaje de la fibra elástica.

64
2.2 Sustancia fundamental amorfa
La sustancia fundamental amorfa está formada por proteoglucanos y glucoproteínas
estructurales.

I. Proteoglucanos
Los proteoglucanos están formados por glucosaminoglucanos (GAGs) y una proteína formando
un eje central unidos mediante enlaces covalentes. A su vez, los GAGs son polisacáridos
lineales de cadena larga formados por un aminoazucar y un ácido urónico.

Los GAGs tienen abundantes grupos sulfato y/o grupos carboxilo por lo que son polianiones
con alta capacidad de hidratación. En la matriz extracelular pueden encontrarse muchos tipos
de GAGs: ácido hialurónico, condroitín sulfato 4, dermatán-sulfato, heparán-sulfato, heparina
y queratán-sulfato son los más importantes.

El hialuronano o ácido urónico es un polisacárido con 25000 monómeros no sulfatado, por lo

que tiene gran volumen y aporta gran hidratación al tejido. El hialuronano crece en la
superficie celular gracias a un complejo enzimático integrado en la membrana plasmática de
las células de tejidos adultos. Genera espacios que posibilitan la migración de células y por
tanto es también muy importante durante el desarrollo embrionario. Puede unirse a proteínas
mediante uniones no covalentes y es degradado por la hialuronidasa.

Los principales tipos de proteoglucanos son: agrecanos, betaglicanos, decorin, perlecan,

sindecan-1 y dally.

65
Agregado de proteoglucanos
La imagen de la izquierda está obtenida a partir de una ME modificada de un proteoglucano.
En verde está el queratán-sulfato y en naranja condroitín-sulfato asociada al eje. Cada GAG
está unido por una proteína de unión al ácido hialurónico.
En la imagen de la derecha se observa un esquema de la composición de un agrecano. Los
agrecanos están formados por una molécula de hialuronano a la que se le une un GAG. Ese
GAG se une por medio de una proteína de unión por el dominio N-terminal de la proteína
núcleo de agrecano y a esa molécula se le unen por medio de uniones no covalentes múltiples
moléculas de queratán-sulfato (en menor proporción) y condroitín-sulfato (en mayor
proporción).

II. Glucoproteínas estructurales

Las glucoproteínas estructurales son glucoproteínas multiadhesivas que permiten la adhesión
entre las células y los componentes de la matriz extracelular y entre los componentes mismos
de la matriz extracelular permitiendo tener una organización de los componentes de la matriz.
Además tienen una importante función reguladora ya que contienen:
• Lugares de unión con otros componentes de la matriz extracelular
• Lugares de unión a receptores de la superficie celular
• Lugares de unión a moléculas señalizadoras extracelulares (ej: factores de crecimiento,
hormonas, etc.
Dos ejemplos son la tenascina y la entactina. La
tenascina guía los movimientos celulares, por lo
que es importante en los procesos de
desarrollo y regenerativos mientras que la
entactina (en el nidógeno) permite la adhesión
de la lámina y el colágeno.

66
3. Laminina
La laminina es la molécula organizadora primaria de la matriz laminar. Esta molécula está
formada por cadenas α y β unidas por puentes disulfuro; hay 5 tipos de cadenas α, 3 tipos de
cadenas β y 3 tipos de cadenas γ que combinadas dan un total de 45 isoformas (la cadena γ-1
es componente de la mayoría de heterotrímeros.

En la imagen de la izquierda se observa un esquema de una laminina mientras que a la derecha

podemos observar una imagen a MET con sombreado metálico de una molécula intacta y de
los dominios LG respectivamente.

Los dominios LG unen hidratos de carbono específicos de la superficie celular (sindecanos),

integrinas de determinados tipos y esteroides principalmente mediante uniones dependientes
de Ca+2. Los sindecanos son proteoglucanos de la membrana plasmática que participan en la
lesión de las mismas.

4. Fibronectina
La fibronectina es una
glicoproteína dimérica de la
matriz extracelular compuesta
por dos subunidades largas
unidas por puentes disulfuro en
el extremo carboxilo; cada una
de las subunidades tiene
dominios de unión a sí misma, a
colágeno, a células y a heparina
principalmente. En el dominio
de unión a células hay un
motivo de unión a integrna denominado RGC presente en desintegrinas de veneno de
Viperodae sp. (Las desintegrinas contienen dominios que se unen a integrinas u otras zonas
que reconozcan al dominio y evitan la coagulación y bloquean los puntos de unión a integrinas
para su ataque). Los dominios funcionales están separados por regiones polipeptídicas
flexibles que son módulos repetidos.

La fibronectina tiene dos formas, una soluble (circulante) y otra insoluble y su interconversión
depende de las necesidades de la célula en un determinado momento.

67
En la imagen de la derecha se observa una fibronectina a MET. Las flechas
rojas señalan los extremos C-terminal de las subunidades, que las
mantienen unidas.

La unión de la fibronectina a la integrina deja al descubierto lugares de

unión que provocan una tensión y por tanto el estiramiento de la
fibronectina que permite que se pueda asociar a otras moléculas para
formar fibrillas. Esta agregación
sólo se produce en respuesta a
una necesidad (un estímulo
mecánico produce la agregación
de la fibronectina).

5. Propiedades de la matriz extracelular

Las propiedades físicas de la matriz extracelular vienen definidas por los componentes que la
forman y su organización macromolecular y por tanto varían según el tipo de células a las que
la matriz está asociada.

La matriz extracelular es dinámica, presenta variaciones en el espacio y en el tiempo. Sus

componentes son móviles en el espacio ya que las fibras pueden estirarse y contraerse en
respuesta a las fuerzas de tensión y sus componentes están sujetos a degradación y nueva
formación de forma continua: remodelación durante el desarrollo, renovación (degradación
lenta y continuada), restauración de lesiones (degradación rápida), procesos necesarios para
mantener la funcionalidad (migración, división).

Por todo ello, la síntesis de la matriz viene determinada por las células a las que está
asociada:

• Fibroblastos: matriz extracelular del conjuntivo

• Osteoblastos: matriz extracelular del tejido óseo (síntesis de colágeno I)
• Condroblastos: matriz extracelular del tejido conjuntivo (colágeno II)

La degradación de la matriz extracelular la llevan a cabo:

• Metaloproteinasas de la matriz (MMP). Enzimas dependientes de Zn y Ca+2.

• Serinas proteasas. Residuos Ser en lugar activo.

La actuación localizada de estas enzimas (cerca de las células que las producen) da lugar a una
degradación por lugares específicos. Ej: colagenasas ancladas a la membrana plasmática
encargadas de la preservación de la integridad de la matriz.

Es necesario un control preciso de estas moléculas mediante:

• Activación local. Se secreta un precursor inactivo que es activado por proteasas

locales. Ej: Plasminógeno que es activado por tPA (activador de plasminógeno de tipo
tisular) y pasa a plasmina, una serina proteasa encargada de la disolución de los
coágulos.

68
• Confinamiento por receptores de la superficie celular. La proteasa unida a su receptor
en frente de avance de
células migratorias. El uPA
(activador de
plasminógeno de tipo
uroquinasa) favorece la
metástasis de algunas
células cancerosas.
En este ejemplo vemos
como las proteasas tienen
que unirse a la superficie
celular para facilitar la
migración a través de la
matriz
• Secreción de inhibidores como por ejemplo inhibidores tisulares de metaloproteinasas
(TIMP) y serpinas (inhibidores de serina proteasa) que bloquean la unión específica a la
enzima. Son secretados por células en la periferia de lugares de degradación como
protección de regiones de la matriz no implicadas directamente en el proceso o
protección de proteínas de superficie celular necesarias para la adhesión o la
migración.
La sobreexposición experimental a TIMP inhibe la migración de algunos tipos celulares.

69
 III. ADHESIÓN Y COMUNICACIÓN CELULAR
2. Adhesiones intercelulares
2.5 Uniones comunicantes
Las uniones comunicantes se encargan de comunicar células vecinas:

I. Uniones tipo GAP

Las uniones tipo GAP son características de células animales y median el acoplamiento
eléctrico y metabólico de células vecinas. Ej: Miocitos que forman el miocardio y tiene que
hacer un movimiento coordinado. En la imagen de la izquierda es la unión con MET
longitudinalmente y en la de la derecha, se observa la membrana con la unión GAP y está
hecha con el método de criofractura.

La unión GAP está formada por conexinas (21 diferentes en humanos) que son proteínas con 4
hélices transmembrana que se unen formando un conexón por combinaciones de 6. Los
conexones de dos células adyacentes están enfrentados formando un canal. Los genes que
determinan los conexones están codificados por genes distintos y expresados en tejidos
distintos.

Los conexones son proteínas transmembrana que se abren y se cierran por cambios
conformacionales. Una unión GAP está formada por la unión de los conexones de las dos
membranas.

Como hay variedad de conexinas y se agrupan, pueden formarme conexones heteroméricos o

homoméricos y los de las dos membranas pueden ser iguales (homoméricos) o diferentes
(heteroméricos).

En invertebrados hay unas proteínas

denominadas inexinas que forman estructuras
similares a los conexones pero que no se sabe
cómo influyen en la unión celular.

Unión GAP son agrupaciones de número

variable de conexones y le dan cierta
permeabilidad a la célula. Esto se regula por la
apertura/cierre de los canales. Si
experimentalmente se desciende el pH y se
aumenta la concentración de calcio en el
citosol, se observó que hay una disminución
reversible de la permeabilidad celular. Esto se
observó gracias a la inyección de Lucifer en
neuronas de retina de conejo: El lucifer no
pasa a las neuronas adyacentes si se las trata

70
con dopamina ya que las las uniones GAP se han cerrado y no permite el paso a las demás.

Las uniones GAP son estructuras dinámicas que se encuentran en continuo ensamblaje,
desensamblaje o remodelación (dentro de la unión GAP hay un
recambio de conexones, es decir, los conexones de una célula
y de otra se pueden intercambiar o mezclar). Esto se confirmó
gracias al estudio de células transfectadas con conexinas con
una secuencia tag de unión irreversible a un colorante vital
fluorescente capaz de atravesar la membrana de celulas vivas y
unirse a las conexinas (fluorescencia = reacción positiva (+) a la
presencia de conexinas). El proceso seguido para conseguir
esto fue:

1. Adición de fluorescencia verde

2. Lavado y mantenimiento en cultivo de 4 a 8 horas
3. Adición de fluorescente rojo
4. Lavado y fijación
El fluorescente verde se adhiere a las conexinas que ya había
formadas en el momento de su adición y las rojas se unen
después a las conexinas que se han formado después; conclusión de los datos obtenidos:
vemos que desaparecen conexones por el centro y se forman nuevos por la periferia.

II. Plasmodesmos
Los plasmodesmos comunican células
vegetales con pared primaria. Una vez
las células empiezan a formar pared
secundaria se forman punteaduras.
Permiten el paso de molecuñas de
teoricamente entre 1-40 KDa.

Los plasmodesmos tienen un

desmotúbulo en el centro que procede
de la fusión de RE y gracias a él se forma
una varilla central. En el centro hay un
canal que comunica ambos citoplasmas.
Además hay conexiones entre proteínas integrales de la membrana con puentes proteicos
(radios) dejando microcanales a través de las cuales pasan las moléculas.

La naturaleza exacta de esas proteínas globulares no

está totalmente claro: Con inmufluorescencia se ha
visto que hay actina, miosinas, calreticulina, centrina,
proteína quinasa dependiente de calcio, etc. El
desmotúbulo estabiliza la estructura e imita el lumen.
El tamaño de las moléculas que pueden pasar a través
de los plasmodesmos determina el límite de exclusión
por el tamaño que a su vez va a determinar la
permeabilidad de la pared. El límite de exclusión por el

71
tamaño puede ser aumentado por algunas proteínas mediante la unión a determinados
ligandos. Además, en la apertura de los plasmodesmos también intervienen:

• Los niveles citoplasmáticos de Ca +2 que regulan la permeabilidad de los plasmodesmos

• La actina F. La despolimerización de la actina F produce una dilatación de los
plasmodesmos
• La miosina-ATPasas. La inhibición de la miosina-ATPasas produce la constricción del
cuello de los plasmodesmos
• ATP. El agotamiento del ATP produce la apertura de los plasmodesmos.
Los plasmodesmos son estructuras contráctiles dependientes de ATP y reguladas por la
concentración de Ca. El modelo que se postula para la estructura de los plasmodesmos es el
siguiente: Uniendo la actina con la membrana está la miosina VIII, especifica de plantas, que
forman dímeros (a diferencia de la miosina I que formaba monómeros).

3.3 Interacciones célula-matriz

Las interacciones célula-matriz integran el ambiente extracelular e intracelular y pueden estar
mediadas por integrinas o por proteoglucanos transmembrana.

I. Mediadas por integrinas

Las integrinas son hetodímeros formados por subunidades alfa y beta unidas no
covalentemente (18 subunidades alfa y 9 subunidades beta diferentes) en forma de barril beta,
por lo que hay 24 integrinas diferentes (solo hay ciertas combinaciones). Se unen a los
siguientes ligandos:

• Dominio RGC fibronectina

• Dominio LC laminina
• Proteínas séricas
• CAMs. Median las adhesiones célula-célula en células sanguíneas
• Componentes de la matríz extracelular (CME). Estas integrinas se denominan
receptores de CME.

Las integrinas median uniones de baja afinidad que implican un elevado número de moléculas
(son uniones similares a un velcro, muchas uniones débiles que forman una unión fuerte). Se
unen a la parte externa de la membrana.

72
Las integrinas tienen una distribución específica en el organismo y la mayoría de las células
presentan varias integrinas, siendo la mayor parte de las integrinas expresadas en varios tipos
celulares distintos.

Las integrinas se anclan en la matriz extracelular a los microfilamentos de actina y a los

filamentos intermedios. En el ejemplo de la derecha, la integrina α6β4, específica de los
hemidesmosomas, anclan los epitelios a la lámina basal; a la izquierda, las uniones focales que
se dan en los fibroblastos.

Las integrinas tienen lugares de unión a cationes divalentes (Ca+2, Mg+2) en la región
extracelular de ambas subunidades, lo que influencia en afinidad y especificidad de unión de
las integrinas a sus ligandos. Los lugares de unión a proteínas intracitoplasmáticas (talina) se
encuentran en un dominio intracitoplasmático.

La integrina está inactiva y se activa ante un determinado evento dentro o

fuera de la célula que produce cambios conformacionales de dominios
intracitoplasmáticos o extracelulares (las señales se transmiten a través
de la membrana en ambos sentidos), se separan las colas
intracitoplasmaticas y se pueden unir con gran afinidad al ligando por
ambos extremos.

73
La imagen que se muestra fue tomada a ME. En la izquierda, la
conformación de integrina inactiva y a la derecha activa; esto se
consigue porque se ponen proteínas purificadas en la izquierda sin
contacto con moléculas con dominios de unión a integrinas y en la
derecha sí que se ponen los dominios de unión. Después las proteínas son fijadas y las de la
derecha se activan cuando se unen al ligando.

Las señales que transmiten las integrinas pueden ir de

dentro a fuera o viceversa.

Activación de dentro a fuera: La unión de dominios

intracelulares a talina produce una separación de las
colas intracitoplasmáticas. Esto provoca una
activación e incremento de afinidad por el ligando de
dominio extracelular, que produce una agregación de
integrinas activadas que a su vez van a provocar una
interacción fuerte de la superficie celular y los
ligandos extracelulares.

Activación de fuera hacia dentro: La unión de ligando en un dominio extracelular de la

integrina va a producir un cambio conformacional del dominio intracelular e interacción con
proteínas citolasmáticas; esto va a provoar que por un lado se ensamblen los microfilamentos
de actina y por otro se activen las vías de señalización intracelular. Ej: Activación de la
proteína-tirosina quinasa no receptoras (FAK – “Focal adhesión kinase”).

La unión de la integrina con CME hace que FAK se autofosforile hace que se fosforile también
por Src y permite la interacción con moléculas señalizadoras y se lleva la señal al núcleo para
activar/inhibir la transducción de determinadas señales.

Las integrinas están implicadas

tanto en el control del
comportamiento celular como en
el control de la proliferación y
supervivencia celulares, como por
ejemplo con la dependencia de
anclaje. Se denomina
dependencia de anclaje a la
dependencia que tienen las
células de tener un anclaje a la

74
hora de crecer para detectar las condiciones del medio circundante. Para que la célula
prolifere necesita estar en el ambiente adecuado y lo detecta vía anclaje por integrinas. Las
integrinas acoplan el conocimiento ambiental a la célula para determinar si puede proliferar o
tiene que morir. En cultivo si el material de matriz extracelular se pone en un punto, se muere
mientras que si se pone en varios lugares de unión al sustrato sobrevive (no es por la
comunicación en sí si no que hay que tener varios lugares de unión para que la célula reciba
información de diferentes partes del medio).

Interacción con otras vías de señalización

La activación de las integrinas puede llevar a la interacción con otras vías de
señalización como por ejemplo:

• Activación de dentro a fuera originada por la llegada de una señal extracelular

• Activación de integrinas por su unión a CEM puede influir en la recepción de
señales por otras vías

La talina al unirse a la porción intracitopasmatica de la subunidad β de la integrina

hace que se una al ligando. Una activación de fuera a dentro puede iniciar una señal
activando por ejemplo a Ras y haciendo que haya una cascada de fosforilaciones que
provocan una reacción en el interior celular.

Interacciones célula-célula mediadas por integrinas

Un ejemplo de las interacciones célula-célula mediada por integrinas es la inflamación o
infección. Los leucocitos están “descansando” cuando el endotelio es activado por el facotres
activador de las plaquetas y los leucocitos van adhiriéndose y rodando por el endotelio de los
vasos sanguíneos. Después los leucocitos se activan y PAF activa las integrinas, que producen
una extravasación de los leucocitos. Por último se produce una adhesión firme vía integrina-
ICAM.

75
Los sindecanos son una familia de proteoglucanos integrales de membrana con tres dominios:

• Extracelular: Tienen cadenas de heparán-sulfato asociadas a componentes de la matriz

extracelular y lugares de unión a otros sindecanos.
• Transmembrana
• Intracelular: Tienen unas regiones variables (que determinan la unión específica a
determinadas proteínas de transducción de señales como Rho o FAK) y regiones
constantes con lugares de unión a dominios PDZ, actina, etc.

Los distintos patrones selectivos de

expresión en distintos tipos celulares
van a determinar la modulación de
adhesión y movilidad celular.

76
 TEMA 3: CITOESQUELETO: ARQUITECTURA Y MOTILIDAD
CELULAR
1. Citoesqueleto
El citoesqueleto es una red compleja de filamentos protéicos responsable de la
citoarquitectura y la motilidad celular ya que se encarga del soporte estructural de la célula, la
organización del contenido celular, la motilidad de la célula misma en su conjunto (migración,
etc) y de sus componentes y también está implicado en la transducción de señales
extracelulares.

Los componentes del citoesqueleto son, de más delgados a más gruesos lo siguientes:

• Filamentos de actina. Estructura fibrilar. Diámetro de 7 nm. Está compuesto

fundamentalmente de actina y proteínas asociadas a esta.
• Filamentos intermedios. Estructura también fibrilar pero de 10 nm de diámetro. Están
formados por diversos tipos de proteínas.
• Microtubulos. Estructura tubular (de centro hueco). Diámetro de 22-25 nm. Están
compuestos de tubulina y proteínas asociadas que pueden ser de dos tipos: inestables
y estables. Las proteínas estables a su vez pueden formar estructuras complejas como
centriolos, cilios y flagelos.

1.1 Métodos de estudio del citoesqueleto

Los métodos de estudio más utilizados son:

• Congelación-grabado profundo. El procedimiento a seguir es el siguiente:

o Tratado con detergente. Se trata las células
con detergente para romper la membrana
celular.
o Congelación, fractura y sublimación del
hielo superficial (criofractura)
o Sombreado metálico
o Observación a MET de alto voltaje (mayor
resolución que el MET convencional)

77
 • Tinción negativa. En este caso estamos viendo los microtúbulos con
el método de tinción negativa. El procedimiento es tratar el
material sin cortar con ácido fosfatungstico, de forma que el
contorno de las estructuras sea muy denso a los electrones y
aparezca más teñido que el interior de la misma.

• Microscopía de fluorescencia con

inmunocitoquímica (inmunofluorescencia). Esta
técnica nos permite saber la localización de una
determinada molécula. Si en vez de verlo a
microscopio de fluorescencia lo vemos con el
microscopio láser confocal podremos ver imágenes
más nítidas. Durante el procedimiento se hace una
microinyección de componentes marcados con
fluorocromo en células vivas después se hace una
videomicroscopía de alta resolución que nos permite
ver la dinámica de formación en este caso de los
microfilamentos de actina. La captación de imagen
por video e intensificación mediante procesamiento
de la imagen por ordenador nos permite ver
imágenes dinámicas.
Los componentes marcados con fluorescencia de la
última imagen son construcciones de ADN que
incluyen un gen aislado de una medusa que codifica
proteína verde fluorescente (GFP) en el gen que
codifica una proteína determinada. En el caso de los
microtúbulos de actina, lo que se marca
radioactivamente es la cinesina.
El movimiento de la cinesina
(proteína motora) a lo largo del
microtúbulo se puede ver por
este método. Podemos ver como la cinesina se va acercando al extremo positivo.
Cuando se traduce el transgen GFP, la proteína GFP que produce la fluorescencia roja
va incorporada en todas las células vivas (colorante vital).

2. Microfilamentos de actina
Los microfilamentos de actina aparecen en todas las células eucariotas y son microfilamentos
flexibles y generalmente asociados entre sí.

2.1 Componentes y dinámica de formación

Los microfilamentos de actina están formados principalmente por actina, la proteína más
abundante en las células eucariotas. Esta proteína está altamente conservada y tiene tres
isoformas:

• Isoformas α en células musculares

• Isoformas β,γ en células no musculares
Además puede encontrarse como actina G (globular) o actina F (filamentosa). La actina tiene 4
subdominios que forman 4 lóbulos que al combinarse producen dos lugares de unión, uno

78
para el ATP y otro para el Mg*2. La actina filamentosa es un polímero de actina G en el que
todos los monómeros tienen la misma orientación pero están girados 166º con respectos al
anterior, lo que forma un filamento en α hélice y hace que tenga polaridad estructural (un
extremo + y un extremo -).

La formación de los microfilamentos de actina in vitro comprende diferentes etapas:

1. Nucleación. Es el comienzo de la formación de los microfilamentos. Se produce por la

unión de dos o tres monómeros con la orientación adecuada, lo que provoca la
aparición de un núcleo estable. Este proceso es lento in vitro por lo que es la etapa
limitante de formación de microfilamentos en condiciones in vitro.
2. Elongación del microfilamento. Se produce por la adición de monómeros a los
extremos (proceso rápido in vitro). Se ha visto que para que haya elongación in vitro
tiene que añadirse sales de magnesio, potasio o sodio a las soluciones de actina G para
que esta polimerice y forme actina F. Así mismo, una disminución de la fuerza iónica
de la solución produce una despolimerización de la actina F.
3. Estado estacionario. El microfilamento no crece pero se produce un recambio de
monómeros: Hay un equilibrio dinámico ActinaG-ATP / ActinaF-ADP. El recambio de
monómeros se produce por polimerización (Agregación de monómeros por ambos
extremos) y despolimerización (Desensamblaje de monómeros en ambos extremos).

Los monómeros de actina libre se unen a ATP (ActinaG-ATP) para incorporarse al filamento.
Una vez incorporado, el ATP se hidroliza, lo que
produce un cambio conformacional que lleva a
reducir la fuerza de las fuerzas de unión entre los
monómeros y a que haya una polaridad funcional
del microfilamento.

79
En las imágenes se observan dos microfilamentos de actina. En la primera, el microfilamento
está decorado con dominios S1 de miosina, lo que le confiere una orientación particular
mientras que en la segunda podemos ver el crecimiento del microfilamento más acusado por
la derecha que por la izquierda, lo que se debe a la polaridad funcional del microfilamento
mismo.

Algunos ejemplos de drogas que afectan experimentalmente la formación de los

microfilamentos de actina son:

• Citocalasina: Inhibe la polimerización (casquete en extremo +)

• Faloidina: Inhibe la despolimerización (se une a filamentos y los estabiliza)
• Latrunculina: Se une a subunidades e impide su polimerización
• Suinholida: Fragmenta filamentos

2.2 Configuración de los microfilamentos de actina en la célula

El 50% de la actina se encuentra
despolimerizada en células no musculares,
lo que es una concentración elevada en
comparación con la concentración crítica
in vitro. Esto se produce por el recambio
rotatorio de los filamentos en estado
estacionario, que es un sistema dinámico
preparado para responder a señales
rápidamente y por estabilización
específica se unen a proteínas de unión a actina.

La dinámica de polimerización y la configuración de los microfilamentos de actina en la

célula dependen de las proteínas de unión a actina.

Las proteínas que regulan la formación de los microfilamentos son:

• Proteínas que nuclean los microfilamentos de actina. Es un centro organizador de

microtúbulos. Algunos ejemplos son:
o Forminas. Familia de proteínas diméricas con centros de unión a actina G en
cada subunidad. La nucleación se
da a partir de dos monómeros
que generan filamentos lineales.
Esta proteína permanece asociada
al extremo + del microfilamento
en formación permitiendo el
crecimiento.

80
 o Complejo ARP (Proteínas Asociadas a Actina). Se unen al microfilamento de
actina en formación en el extremo - y genera filamentos ramificados. La
nucleación más eficiente se produce cuando el complejo está unido
lateralmente al microfilamento de actina formando ramificaciones en ángulo
de 70º (Actividad regulada por moléculas señalizadoras intracelulares o
asociadas a la cara citoplasmática de la membrana celular (Rho, de la familia
de Ras))

El complejo ARP está muy conservado a lo largo de la evolución ya que dirige

formación de microfiolamentos de
actina; En levaduras hay una red
cortical de microfilamentos y en
las células vegetales en la
superficie aparecen formas
complejas en algunos tipos
celulares (ej: epidermis de la hoja
de maíz).
• Proteínas de unión a actina G. Se encargan de la polimerización/despolimerización de
filamentos de actina. Los ejemplos más importantes son:
o Timosinas. Permiten la unión a actinaG-ATP y evita
su incorporación al filamento. Son proteínas
secuestradoras de monómeros que estabilizan
reserva de monómeros
o Profilina. Permiten la unión a actinaG-ADP en lugar
opuesto a lugar de unión con ATP y permite
también la fosforilación de ADP y por tanto la
incorporación a microfilamento por el extremo +
pero no por el extremo -.
Se une a proteínas con dominios ricos en prolina en
localizaciones definidas de la célula y a lípidos de
membrana (inositolfosfato) en la hemimembrana
interna, lo que permite una polimerización local de microfilamentos de actina.

81
• Proteínas fragmentadoras. Las proteínas fragmentadoras permiten la unión a actina-F
ya que promueven un cambio conformacional que produce una rotura de enlaces.
Estas proteínas se unen a PIP2 y se impide fijación a microfilamentos de actina
mientras que la hidrólisis de PIP2 lleva a la liberación de proteínas fragmentadoras. Un
ejemplo son:
o Gelsolina. Actúa a grandes concentraciones de Ca+2.. Esta proteína fracciona
los microfilamentos y se une al extremo + promoviendo la polimerización e
impidiendo la despolimerización.
o Cofilinas. Los compuestos activos son Cofilina/ADF (acting depolymerizing
factor) y Depactina. Permiten la unión al filamento y aumento de tasa de
disociación de actina y además puede mantenerse unidos a monómero
impidiendo su reincomporación al filamento, lo que produce unos cambios
dinámicos de estructura de microfilamentos. Estos cambios dinámicos
permiten procesos como la locomoción, fagocitosis .
• Proteínas bloqueadoras de extremo. Los ejemplos más importantes de estas proteínas
son: proteínas de coronación (cap-Z) y tropomodulina. La proteína de coronación es
una caperuza que se une al extremo + y es inhibida por PIP2 y se regula por las mismas
vias que cofilina y proflina. Por otra parte, la tropomodulina se une en el extremo - y es
estimulada por tropomiosina. Estas dos proteínas en su conjunto estabilizan los
filamentos de actina, especialmente en el músculo.

82
Por otro lado, las proteínas que regulan la organización de los microfilamentos son proteínas
que asocian microfilamentos gracias a tener dos o más lugares de unión a actina. Las proteínas
reguladoras de la organización de los microfilamentos más importantes son:

• Proteínas de unión a la membrana plasmática. Espectrina (tetrámero) y vinculina. La

espectrina tiene dos dominios de unión a actina y dos dominios similares a lugares de
unión de Ca de calmodulina.
• Proteínas formadoras de mallas. Filamin (dímeros), que tiene dos dominios de unión a
actina.
• Proteínas formadoras de haces. Son por ejemplo las fimbrinas (monómeros con dos
dominios de unión a actina y uno similar a lugares de unión de Ca de calmodulina.
También la villina y la
alfa-actinina, que son
dímeros que forman
haces contráctiles y
que tienen dos
dominios de unión a
actina y dos dominios
similares a lugares de
unión de Ca+2 de calmodulina.
La configuración de los microfilamentos le confiere las propiedades físicas y mecánicas al
citosol de las células de las que son parte. Las mallas están formadas por microfilamentos
largos y rígidos que forma un
gel elástico tridimensional que
resiste las presiones
mecánicas locales; por el
contrario, los filamentos
fragmentados van a formar
una consistencia sol, más
fluida.

Las proteínas motoras

asociadas a filamentos son
proteínas de la superfamilia
de las miosinas y permiten el
movimiento hacia el
extremo +. Estas proteínas
tienen al menos un dominio
motor (cabeza) y una cadena
reguladora (ligera), pero
pueden tener mayor
número de subunidades. Los
dominios motores primero
se unen al ATP y después se
hidrolizan, produciendo un cambio conformacional que deja libre el lugar de unión a actina.

83
La activación de la miosina II se hace por fosforilación de las cadenas ligeras. En el musculo liso
la contracción es similar al de las células no musculares excepto porque MLCK se activa por
fosforilación por la calmodulina unida a Ca (miosina regulada por Ca indirectamente y por
MLCK directamente). Por otro lado, la contracción de fibras de estrés se regula gracias a que
una señal externa activa Rho, que activa a ROCK por fosforilación. ROCK es la enzima
encargada de fosforilar la cadena ligera reguladora de miosina e inhibe a la fosfatasa de la
cadena ligera de miosina, que se hidroliza para inactivarse.

2.3 Organización y función en la célula de los microfilamentos de actina

La organización y función es diferente en las células musculares, que forman un aparato
contráctil estable que no aparece en las células no musculares.

• Corteza celular: Red tridimensional debajo de la membrana plasmática. Está unida a la

membrana plasmática por proteínas periféricas o asociadas a la cara
intracitoplasmática como por ejemplo vinculina, anquirina, espectrina en los
eritrocitos, fodrina en otras células y distrofina en músculo y proteínas de la familia
ERM (erzina, radixina y moesina).

84
 La corteza celular es la responsable de la conformación y propiedades mecánicas de la
superficie celular de las microvellosidades, filopodios y lamelipodios y las
invaginaciones fagocíticas en macrófagos:
o Sostén estructural y mantenimiento de la forma
o Resistencia mecánica
o Modificación de la forma celular
o Locomoción celular
Responde por tanto a señales extracelulares.
• Eje de microvellosidades y estereocilios y velo terminal. Las microvellosidades y
estereocilios son estructuras rígidas relativamente permanentes formadas por haces
de actina (que forman el esqueleto interno), villina y fimbrina (que estabilizan los
haces) y miosina I y calmodulina (que forman la unión a la membrana). La fodrina por
otro lado forma la unión de los haces de filamentos entre sí y a la membrana.

El velo terminal
está en los
estereocilios y
tienen una
organización
similar a la
anterior pero
varían algunas
proteínas de
unión a actina.

• Haces de microfilamentos de actina contráctiles en células no musculares. Estos haces

están formados a su vez por:
o Fibras de estrés. Son haces de microfilamentos de actina contráctiles
estabilizados por α-actinina que anclan las células a la matriz extracelular por
medio de uniones focales (entre la vinculina talina y las integrinas) y ejercen
tensión sobre las células vecinas por medio de las zónulas adherens (entre las
cateninas y cadherinas).
o Anillo contráctil en citocinesis de células
animales. La inactivación de MPF lleva a
la activación de Rho A (proteína G) que
lleva a la formación de una estructura
transitoria de filamentos de actina y
miosina II con α-actinina unida a la
membrana plasmática, el anillo
contráctil. El deslizamiento de los
filamentos de miosina II provoca la
contracción del anillo y el
estrangulamiento del citoplasma y por
tanto la separación de las células hijas.

85
• Papel del citoesqueleto de actina en la modificación de la forma y locomoción celular.
El citoesqueleto de actina permite el movimiento de la superficie celular durante la
fagocitosis y endocitosis y el crecimiento axinal así como el desplazamiento de amebas
y macrofagos (lamelipodios y filopodios). Esto se hace mediante la polimerización-
despolimerización de la actina y por la acción de la proteína motora miosina II; el
deslizamiento de filamentos de miosina sobre filamentos de actina va a producir una
contracción.
o Deslizamiento celular sobre un sustrato. La polimerización en el extremo más
forma una protusión de la membrana, que lleva a la formación de un nuevo
contacto confocal y la contracción en la parte posterior van a producir el
movimiento.

• Implicación de microfilamentos de actina en transporte de componentes celulares. En

el transporte de componentes celulares destacan:
o Miosinas no convencionales. Producen el desplazamiento de vesículas en
relación con el microfilamento.
o Miosina I. Implicada en el desplazamiento de microfilamento en relación con la
membrana.
o Misiona V. Implicada en el movimiento de los filamentos en relación con
vesículas.

• Implicación del citoesqueleto de actina en la transducción de señales. Las señales

extracelulares van a provocar la activación de receptores de superficie ligados a
proteína-quinasa de la familia Ras-GDP. Las proteínas de la familia de Ras-GDP cuando
hay señal extracelular van a pasar a Ras-GTP y van a activar a proteínas Ras, Cdc42 y

86
Rho. Por un lado las proteínas Rac y Cdc42 son dianas asociadas al complejo Arp2/3
(WASP) que están implicados en la polimerización de actina bajo la membrana y por
tanto en la formación de los lamelipodios y filopodios. Por otro lado, Rho va a activar a
la formina y a ROCK (proteína quinasa de serina/treonina que favorece la formación de
la miosina) y ambas van a llevar al ensamblaje de las fibras de estrés y adhesiones
celulares y a la citocinesis.
Un ejemplo sería la aparición de factores de crecimiento o polipéptidos bacterianos,
que llevarían a una reorganización del citoesqueleto de actina por movimiento y
extensión y retracción de axones durante el desarrollo del sistema nervioso y la
activación de vías de señalización de las MAP quinasas que van a llevar a cambios en la
expresión génica y otras actividades celulares.

El unión del ligando al receptor va a llevar a la activación de Cdc-42, que con una
proteína adaptadora WASP activa al complejo Arp2/3 que polimeriza la actina bajo la
membrana plasmática formando una malla.

87
 • Vías de transducción de
señales en la organización del
citoesqueleto de actina y
locomoción de la célula. La
microinyección de Rac, Rho o
Cdc42 a fibroblasto se ha visto
que tiene un efecto sobre la
formación de filopodios,
lamelipodios y adhesiones
focales y fibras de estrés.
• Unión de microfilamentos de actina a membrana plasmática mediante proteína de la
familia ERM en respuesta a señal. La proteína ERM está en conformación inactiva y
cuando se reciben señales se produce una fosforilación o unión de PIP2 que cambian la
conformación de ERM a activa. La ERM mediante cross-linking se va a unir a actina por
el dominio de
unión a la actina
y al receptor de
ácido hialurónico
(que se
encuentra en
una proteína
transmembrana
como el CD44)
por el dominio
de unión a la membrana.

3. Microtúbulos
Los microtubulos están compuestos por tubulinas α y β, que son proteínas globulares con lugar
de unión a GTP que forman heterodímeros (4x8 nm) (protofilamentos) que se unen en grupos
de 13 con la misma orientación para formar un microtúbulo (por lo que el microtúbulo tiene
polaridad estructural). Cada protofilamento está desplazado con respecto al contiguo y forma
una imagen en espiral. La unión a GTP/GDP en la tubulina β va a ser la que determine la
formación del microtubulo ya que la unión de la tubulina α con el GDP es irreversible.

Los microtúbulos tienen polaridad estructural y funcional.

3.1 Dinámica de formación de los microtúbulos

El ensamblaje de los microtúbulos in vitro se ha visto que tiene 3 etapas:

• Nucleación. Formación de un núcleo o pequeño fragmento inicial. Consiste en el

ensamblaje de los protofilamento y el ensamblaje de una hoja y cierre (asociación de
protofilamentos). Se ha observado que es un proceso lento y que requiere de altas
concentraciones de tubulina en condiciones in vitro.
• Elongación del microtúbulo. Adición rápida de heterodímeros a los extremos.
• Estado estacionario. Equilibrio dinámico entre heterodímeros libres y polimerizados.

88
El ensamblaje de los heterodímeros requiere su unión a GTP. El GTP se hidroliza a GDP poco
después de su incorporación al microtúbulo, produciendo un cambio de conformación y una
unión de heterodímeros más débil; los microtúbulos son más inestables por ese extremo
(extremo -) y polimerizan más rápido por el extremo contrario (extremo +) y por tanto tienen
polarización funcional.

La polimerización de los microtúbulos depende de la temperatura como se ha visto en

experimentos de dinámica de formación de microtúbulos. Esta información se utiliza para
estudiar cómo es la dinámica de formación de los heterodímeros.

En esta tabla se citan algunos

fármacos utilizados contra el
cáncer que bloquean la mitosis y
evitan que las células cancerosas
se dividan.

3.2 Formación y organización de microtúbulos en la célula

La nucleación requiere un centro organizador de microtúbulos (MTOC). El MTOC es un
complejo de anillo de γ-tubulina formado por una plantilla anular de γ-tubulina y proteínas
accesorias (pericentrina). En células animales forma el centrosoma (con centriolos
normalmente) mientras que en las células vegetales forma un material similar a este en la
superficie celular y en los poros celulares.

Según las imágenes obtenidas

por inmunocitoquímica con
anticuerpos contra γ-tubulina
(rojo) o XGRIP109 (amarillo)
conjugados con oro se ha hecho
un modelo en el que cada subcomplejo está formado por γ-tubulina y proteínas accesorias
(pericentrina) dentro del anillo de γ-tubulina.

En la célula existe un equilibrio dinámico entre

heterodímeros libres y polimerizados. Los microtúbulos se
encuentran en la célula en inestabilidad dinámica:
Extremos (-) estabilizados por su asociación con el

89
centrosoma, que sirve de lugar de despolimerización. Además cada microtúbulo crece a partir
del centrosoma o se retrae de forma independiente formando microtúbulos con crecimiento
rápido y microtúbulos en retracción.

Los microtúbulos están continuamente creciendo y retrayéndose individualmente (no depende

de concentración de tubulina). El casquete evita que se desprendan los heterodímeros a GTP,
que son más estables que los unidos a GDP. La adición es tan rápida que no da tiempo a que se
hidrolice el GTP y se provocaría el desprendimiento de los heterodímeros.

3.3 Proteínas asociadas a microtúbulos (MAPS)

Las MAPs cásicias forman una unión lateral al microtúbulo
(5-20% del microtúbulo) y lo estabilizan. Tienen 3 lugares
de unión a tubulinas (región básica) y un brazo flexible
(región ácida) que se une a los componentes celulares. La
función de las MAPs es estabilizar a los microtúbulos
evitando su desensamblaje y mediar en la interacción de
los microtúbulos entre sí y con otros componentes celulares.

A la izquierda imágenes a ME en las que

vemos los brazos de la MAP saliendo de
los microtúbulos.

Abajo imágenes a ME de microtúbulos

ensamblados in vitro con y sin MAP.

La longitud del brazo determina la distancia de empaquetamiento.

90
Un aumento en las concentraciones de Tau va a
llevar a la formación de nudos neurofibrilares en
neuronas de afectados de Alzheimer ya que Tau
fosforilada en exceso es incapaz de unirse a los
microtúbulos.

La regulación de la actividad de MAPs lleva a la regulación de la fosforilación/desfosforilación

de determinados residuos de aminoácidos y la fosforilación impide su unión al microtúbulo. La
ciclina B/CDK1 va a llevar a la fosforilación de MAP4 y por tanto a la desestabilización de los
microtúbulos previa a la formación del huso mitótico (los microtubulos durante esta fase son
más inestables que los de interfase y por tanto sus cambios tienen que ser mucho más
rápidos).

Las MAPs que actúan en extremos (+) de los microtúbulos (junto con TIP) intervienen en el
posicionamiento de microtúbulos, la unión a componentes celulares (membranas) y la
regulación de crecimiento/acortamiento de
microtúbulos. Se estudiaron las MAPs de
Xenopus (son proteínas homólogas en
organismos desde levaduras hasta humanos) y
se vio que la unión de XMAP215 lleva a la
estabilización de los microtubulos mientras
que la unión de catastrofina (quinasina 13)
induce la despolimerización ya que se une a
los protofilamentos, los separa y produce la
despolimerización de los microtubulos.

Otras MAPs desestabilizadoras son por ejemplo:

• Catanina
fragmenta
microtúbulos y los
libera del COMT
con gasto de ATP
• Estatmina (Op18)
unión a dímeros de
tubulina y evita
polimerización

91
3.4 Proteínas motoras de microtúbulos
• Quinesinas/cinesinas. Superfamilia de proteínas relacionadas con cinesina (KRP)
formada por 14 familias. Las cinesinas están formadas por una cabeza (dominio motor)
conservado y una cola (unión a carga que puede ser un microtúbulo, orgánulo con
membrana, cromosoma) variable.

92
 La energía de la unión e hidrólisis del ATP provocan un cambio conformacional que
llevan al movimiento en una parte de la molécula, movimiento sobre el microtúbulo en
dirección al extremo +. La cabeza posterior está unida fuertemente a tubulina por
medio del ATP mientras que la cabeza directora está unida débilmente a la tubulina
por medio de ADP; la separación de la cabeza poterior por la hidrolisis del ATP de la
tubulina lleva a un intercambio de ADP por ATP en la cabeza anterior y por tanto a un
cambio conformacional en el cuello que provoca un impulso de la cabeza posterior
hacia delante.

• Dineinas. Las dineinas son proteínas multiméricas muy grandes formadas por cadenas
pesadas, cuello y cadenas ligeras que se mueven hacia el extremo -. Las dineinas
citosólicas se unen a la
dinactina, un complejo
protéico de unión a carga
(vesículas, cromosomas).
Glued contiene motivo
presente en CLIP70 (proteína
asociada a microtúbulos que
establece uniones cruzadas
entre éstos y vesículas
endocíticas).
Dineina flagelar/axonemal: Dienina c de flagelo de alga verde unicelular. Tiene una
cabeza motora con siete dominios que forman el anillo y un tallo que se une a
microtúbulo. La cabeza tiene un dominio ATPasa y un dominio C terminal que hace
que con la hidrolisis de ATP la cabeza rote, se cambie la posición del tallo con respecto
al microtúbulo y hace que este cambie de posición. En la imagen de la derecha (MET y
sombreado). Vemos cómo cambia la posición del microtúbulo.

93
3.5 Funciones de los microtúbulos
• Transporte de componentes celulares: Asociados a proteínas motoras forman “railes”
para transporte de componentes celulares. Para estudiar el transporte anterógrado se
utiliza la quinesina (motor a +) y para el transporte retrógrado la dineina (motor a -).
El transporte de moléculas se
estudia por el transporte axónico
(modelo). En la imagen de la
derecha se observa como en los
ganglios de las raíces dorsales se
ponen aminoácidos marcados,
esperan diferentes tiempos y se
estudia la velocidad de
transmisión, etc. En la imagen de la
derecha se observa una fotografía
de ME de grabado profundo de
este proceso.
• Establecimiento y mantenimiento de citoarquitectura: La estabilización selectiva de
microtúbulos se lleva a
cabo por la unión del
extremo + a las
proteínas asociadas y de
estas a los componentes
celulares; esta última
unión impide la despolarización.
El patrón de formación de microtúbulos
hace que la célula adquiera polaridad ya que
las proteínas que estabilizan los
microtúbulos se unen al extremo + y se
impide la despolimerización en ese extremo.
Esto es también indispensable para la
formación de axones y dendritas.

94
• Organización del contenido celular: Determina la posición de orgánulos con
membrana asociados a proteínas motoras (dineínas en
el caso del Complejo de Golgi y quinesinas en el RE y
los lisosomas.
En este experimento con células endoteliales in vitro
podemos observar la importancia de las proteínas
asociadas a proteínas motoras en la posición de los
orgánulos de la membrana. El Golgi está por toda la
periferia del citoplasma en condiciones normales
(arriba) con los microtúbulos polimerizados mientras
que si le aplicamos un tratamiento con nocodazol
(abajo), los microtúbulos se despolimerizan.

Los orgánulos pueden unirse a las siguientes proteínas:

o Mitocondrias: Pueden asociarse a los dos tipos de motores (dineinas o
cinesinas citosólicas) pero para viajar en dirección + siempre tienen que
asociarse a cinesinas (y para viajar en sentido – a la dineina).
o Lisosomas: Viajan en dirección + unidos a cinesinas.
o Endosomas: Viajan en dirección - unidos a dineinas
o Vesículas secretoras: Viajan en dirección + unidas a cinesinas y en dirección –
unidas a dineinas
o Gránulo pigmentado: Viajan en dirección + unidas a cinesinas y en dirección –
unidas a
dineinas.
o RE y Golgi:
Viajan en
dirección +
unidas a
cinesinas y en
dirección –
unidas a
dineinas.

• Dirigen síntesis de microfibrillas de celulosa en células vegetales: El complejo

enzimático celulosa sintasa se desplaza a lo largo de microtúbulos. Los microtúbulos
dirigen la dirección de síntesis y determinan la orientación de las microfibrillas.

95
• Movimiento de cilios y flagelos: En la figura adjunta (Tinción negativa) se representan
dos dobletes de un axonema que están sin unir por tratamiento con una proteasa. Los
brazos se desplazan uno sobre toro porque no están unidos pero en el exonema los
dobletes están unidos y al desplazarse la dineina hacia el extremo - se dobla,
provocando una curvatura que hace que se mueva el flagelo o la estructura de
movimiento.

En esta figura se muestra un

esquema de una sección
transversal del axonema. En la
periferia doblete (en el
centriolo es un triplete) salen
brazos externos de dineina de
cada doblete y a parte la
nexina une a cada uno con el
diplete central.

• Segregación de los cromosomas hijos en la mitosis. La segregación de los

cromosomas hijos en la
mitosis se produce gracias
al huso acromático o
mitótico que a su vez se
forma gracias a la
polimerización-
despolimerización por
proteínas motoras.
La formación del huso se da durante la profase cuando KinC (motor a (-)) produce un
alineamiento de los microtúbulos y se produce despuñes un movimiento dirigido hacia
los extremos – que producen la separación del cromosoma por la fuerza de empuje en
las zonas de solapamiento y las fuerzas de estiramiento en los asteres. La unión de
microtúbulos al cinetocoro se produce durante la prometafase ya que se produce una
despolarización lenta en el polo negativo de ambos cromosomas y la adición rápida de
subunidades de tubulina en uno de los cromosomas hijos y pérdida rápida en el otro.

96
Cromosomas en tensión en placa metafásica:

Migración de cromosomas:

97
4. Filamentos intermedios
Los filamentos intermedios son cilindros macizos flexibles más estables y resistentes que los
microtúbulos y microfilamentos y ofrecen gran resistencia a la tensión.

Los filamentos intermedios tienen subunidades de la superfamilia de las proteínas

filamentosas distribuidas en dos tipos de dominios, el dominio central α-helicoidal conservado
y los dominios terminales globulares variables. Ambos tipos de dominios tienen distintas
secuencias y peso molecular.

Los filamentos intermedios pueden agruparse en 4 clases:

• Citoplasmáticos: En vertebrados, nemátodos y moluscos (no en todos los tipos

celulares)
o Queratinas: Se encuentran en el epitelio.
o Vimentina y proteínas relacionadas: En el tejido conectivo, células musculares
y células de la neuroglia
o Neurofilamentos: En las neuronas
• Nucleares: Son láminas nucleares que se encuentran por tanto en todas las células
nucleadas.

4.1 Dinámica de formación

Ensamblaje y desensamblaje de filamentos intermedios

Hay dos modelos propuestos para el ensamblaje-desensamblaje de los filamentos intermedios.
En ambos modelos el polipéptido se une formando dímeros uniéndose en el mismo sentido (N
terminal con N-terminal y C-terminal con C-terminal). La unión lateral antiparalela y
escalonada de estos dímeros en tetrámeros que se agrupan en grupos de 13 para formar
protofilamentos en sentido inverso o asociación termino-terminal y laterolateral (N-terminal
con C-terminal del otro tetrámero). Los protofilamentos a su vez se agrupan en grupos de 8
protofilamentos entrelazados (4 protofibrillas). En total los filamentos intermedios son 32
hélices enrolladas unidas por interacciones hidrofóbicas fuertes deformables y difíciles de
romper que se unen terminoterminalmente para formar un tetrámero largo.
Las diferencias entre
ambos modelos vienen
porque en el de la
izquierda primero el
tetrámero crece a lo
largo y después se unen
de 8 en 8 mientras que
en el de la derecha
primero se unen en
grupos de 8 que
funcionan como
unidades y después
esas unidades van
creciendo en longitud.
Es este último el que
está tomando fuerza
últimamente.

98
La subunidad soluble forma el tetrámero, que a su vez está formado por filamentos
homopoliméricos (formados por las mismas proteínas) y por filamentos heteropoliméricos
(formados por distintas proteínas de la misma clase). Las subunidades suelen estar casi en su
totalidad ensambladas y la fosforilación de los péptidos produce su desensamblaje (láminas
nucleares y vimentina).

La polimerización no requiere unión a nucleótidos. Esto se demostró mediante la

microinyección de subunidades marcadas a células vivas (epiteliales y neuronas) en las que no
se les dotaba de nucleótidos y se vio una incorporación rápida a filamentos
intermedios preexistentes (comportamiento dinámico). Si tenemos células
marcadas con anticuerpos contra biotina a los 60 minutos de microinyección de
queratina tipo 1 marcada con biotina a células epiteliales cultivadas (imagen de la
izquierda) y células marcadas con anticuerpos contra queratina en la misma
célula (doble inmunofluorescencia) (imagen de la derecha) podemos ver como la
incorporación a los filamentos existentes en sitios a todo lo largo, no en los
extremos. La biotina
forma filamentos
cortos y se incorporan
en determinados sitios
a lo largo del
filamento, no en los
extremos como en los
microfilamentos por
ejemplo.

4.2 Tipos, localización y función de los filamentos intermedios

• Queratinas: Hay dos tipos de queratinas, las ácidas y las básicas.
Estos dos tipos de queratinas forman heterodímeros (queratina ácida + queratina
básica) formando por tanto filamentos heteropoliméricos, por lo que es común la
expresión de una combinación característica de queratinas
ácidas y básicas en cada tipo de epitelio (que se denominan en
general tonofilamentos).
Las queratinas en el citoplasma se encuentran formando una
red alrededor del núcleo y en el citoplasma así como en la
unión a desmosomas y hemidesmosomas.
Las funciones de las queratinas son:
o Andamiaje para la organización y mantenimiento de la estructura celular
o Absorben tensión mecánica aplicada por el ambiente extracelular. Distribuyen
el efecto de las fuerzas locales y así evitan ruptura de la membrana
Estudios de
deleción génica
en ratones
demostraron
que la carencia
de K14 produce
una enfermedad
ampollar de la
piel.

99
 • Vimentinas y proteínas relacionadas (Tipo III): Pueden formar homopolímeros o
heteropolímeros.
o Vimentina. Proteína muy conservada a lo largo de la evolución que se
encuentra en células de origen mesenquimático (Células de los tejidos
conjuntivos y células musculares). Se localiza alrededor del núcleo y su función
es mantener la localización del núcleo, sostener las membranas y asociarse a
microtúbulos.
o Desmina. En células musculares.
Tiene una distribución compleja
(Disposición alrededor del
sarcomero, lo que estabiliza el
aparato muscular de la fibra
contráctil). Es la encargada de la
organización del aparato
contráctil y por tanto de la
integración funcional de las
células musculares.
o Proteína ácida fibrilar glial (Gliofilamentos). En astrocitos y células de
Schwann forman haces compactos.
o Neurofilamentos. Heteropolímeros formados por 3 péptidos: NF-L, NF-M y NF-
H que se encuentran solo en neuronas.
Su distribución en el citoplasma depende de la parte de la neurona donde
esté: malla en el pericarion y haces paralelos longitudinales en los axones y
dendritas. Sus funciones principales son la de sostén y mantenimiento de la
forma en el pericarion y determinan el grosor del axón en las prolongaciones
de la célula, que está directamente relacionado con la velocidad de
transmisión del impulso.
o Láminas nucleares. Láminas nucleares A,
B y C que forman homopolímeros. Las
láminas nucleares están formadas por
dímeros que se unen formando
tetrámeros que vuelven a unirse para
formar filamentos que después a su vez
forman una malla. Se puede decir que las
láminas nucleares son una red de fibras
de 50-80nm de espesor que está
asociada a la membrana nuclear interna
y a la cromatina.

4.3 Proteínas asociadas a filamentos intermedios (PAFI)

Las PAFI son proteínas que unen filamentos intermedios entre sí o con otras estructuras y por
tanto son responsables de la organización de citoesqueleto de filamentos intermedios. Estas
proteínas pueden dividirse en:

• Inespecíficas: Familia de plaquinas. Lugar de unión para un filamento intermedio en un

extremo y sitio de unión a otro filamento intermedio, a un microfilamento, un
microtúbulo o la membrana plasmática en el otro extremo. Ejemplos: plectinas (unen
filamentos intermedios a integrinas y por tanto median la unión entre el citoesuqeleto
a la matriz extracelular por hemidesmosomas) y desmoplaquinas (unión filamentos
intermedios y cadherinas).

100
 Mutaciones en el gen de la plectina se han demostrado que provocan epidermólisis
bullosa, distrofia muscular y neurodegeneración ya que hay una alteración del
entrecruzamiento esencial para superar estrés mecánico de las células.
• Asociadas a uno o dos tipos de filamentos intermedios: intervienen en la formación
de haces como por ejemplo la epinemina (que se une a la vimentina) y la filagrina (que
se une a queratinas) o en la unión de desmina a la membrana plasmática (paranemina
y anquirina).
En la imagen se observa el citoesqueleto
de un fibroblasto conseguido siguiendo
los siguientes métodos:
1. Tratamiento con detergente
2. Eliminación de microfilamentos de
actina
3. Fijación química/congelación
4. Inmunocitoquímica
5. Deshidratación y secado al punto
crítico
6. Sombreado y réplica con MET de
alto voltaje
7. Coloración con técnica digital

101
 TEMA 4: LA CONVERSIÓN ENERGÉTICA EN LA CÉLULA:
MITOCONDRIAS Y CLOROPLASTOS. PEROXISOMAS
1. Evolución de mitocrondrias y cloroplastos
Se ha demostrado que las mitocondrias y cloroplastos son una evolución a partir de bacterias
arcaicas aerobias en
endosimbiosis con
eucariota primitivo
(hospedador). La
mitocondria proviene
de una bacteria aerobia
mientras que los
cloroplastos provienen
de una cianobacteria.

Las evidencias son:

• Contienen ADN bicatenario cerrado como las bacterias

• Tienen doble membrana, las membranas de las bacterias hospedadora y la de la
internalizada
• Poseen ATP sintetasa en la membrana interna
• Difosfatidilglicerol (cardiolipina) en membrana interna importante en mantenimiento
de las membranas y en el metabolismo de mitocondrias

2. La respiración aeróbica en la célula

La mitocondria genera el ATP usado en la mayor parte de actividades celulares que requieren
energía. Hay muchos estudios centrados en metabolismo energético, sobre todo a nivel
molecular.

102
Pero las mitocondrias también están implicadas en otras actividades como por ejemplo:

• Síntesis de sustancias : Aminoácidos y grupos hemo de citocromo c y hemoglobina

• Reguladoras, junto con RE de la concentración de Ca +2 del citosol. Un aumento de la
concentración de Ca+2 provoca la captación por transportador en membrana interna.
La entrada masiva y acumulación prolongada de Ca +2 provoca la apertura de poros de
transición de permeabilidad en la membrana interna hinchamiento y rotura de la
membrana externa y liberación de factores pro-apoptóticos al citosol.
• Implicación en apoptosis

2.1 La mitocondria: nuevos enfoques

Los avances en las herramientas de experimentación han permitido abordar a las mitocondrias
desde diferentes enfoques:

• Nivel ultraestructural. Reconstrucciones tridimensionales a partir de secciones

seriadas (A) y mediante
tomografía electrónica
(B) han permitido
desvelar la
comunicación de las
crestas con el espacio
intermembrana
mediante aberturas
tubulares estrechas.
Además se han podido describir 3 dominios de la membrana interna:
o Dominio CM (↑): proteínas implicadas en fosforilación oxidativa
principalmente, síntesis proteica y transporte de proteínas codificadas por
mtDNA
o Dominio IBM (↑): enriquecido en proteínas implicadas en fusión mitocondrial
y en el transporte de proteínas codificadas en el núcleo
o Dominio CJ (↑ cristae junction): Forma las barreras a la difusión que regulan la
distribución de componentes entre los subcompartimientos mitocondriales
por lo que podrían regular la entrada y salida de ADP o protones.
En estos estudios se ha visto que la formación de oligómeros de F1F0-ATPsintasa está
implicada en mantenimiento de la estructura de las crestas. La disrupción
experimental del agrupamiento (La liberación de la ATP sintasa en moléculas
individuales) no compromete la actividad enzimática pero si conlleva una
desorganización de la membrana interna (figuras concéntricas). La proteína FCJ1 de
levadura regula la morfología de las crestas por interacción con subunidades de F1F0-
ATP y la formación de oligómeros y la mitofilina (ortólogo en mamíferos de la FCJ1)
Necesaria para mantenimiento de las crestas.
• Nivel estructural. Marcaje fluorescente dentro de
células vivas y observación mediante microscopio
láser confocal han permitido descubrir que las
mitocondrias son orgánulos muy dinámicos que
están continuamente cambiando de forma y
organización.
Células transfectadas con proteínas mitocondriales
fluorescentes han desvelado que hay cambio de
forma y organización dependiendo de los
requerimientos de las células.

103
 La fusión y fisión (división) de las
mitocondrias determinan la
forma cantidad, longitud y grado
de interconexión:
o Predominio de Fusión:
alargadas e
interconectadas
o Predominio de Fisión:
más numerosas,
pequeñas y separadas

Hay mutaciones en los genes que codifican los componentes de la maquinaria de

fusión mitocondrial que se han demostrado que son las causantes de algunos tipos de
Neuropatía de Charcot-Marie-Tooth. Además fallos en dinámica mitocondrial
enfermedades neurodegenerativas (Parkinson, Alzheimer).

I. Fusión y fisión mitocondrial

• Fusión: Han de fusionarse 4 membranas de forma coordinada manteniendo los
compartimientos. No se sabe exactamente cómo funciona pero se ha visto que
intervienen:
o GTPasas similares a dinamina: Dirigen la fusión secuencial. Homólogos en
levaduras y humanos; en mamíferos Mitofisina (Mfn) 1 y Mfn 2 median fusión
de membrana externa y Opa 1 media fusión de membrana interna. Ugo 1 de
levadura es requerida para fusión de la membrana interna y la membrana
externa (paso de entremezcla de lípidos)
o Lípidos de membrana como cardiolipina (difosfatidilglicerol)
o Posfolipasa D mitocondrial hidroliza cardiolipina después de unión de las dos
membranas opuestas
• Fisión: Inducción por contacto con finos túbulos del RE, que envuelven a la
mitocondria y marcan la zona por donde se van a unir.
La fisión está mediada por una gran GTPasa similar a dinamina (Dnm1/DRP1) reclutada
desde el citosol hacia lugares discretos de la superficie de la mitocondria que provoca
su autoensamblado para formar estructuras helicoidales que se cree que estrangulan a
la mitocondria.

También se han visto implicados procesos de ubiquitinación, fosforilación y

nitrosilación de Dnm1/DRP1 las proteínas auxiliares.
La fisión está relacionada con la apoptosis ya que la fisión es requerida para la
secreción de citocromo c durante la apoptosis y los factores proapoptóticos parecen
promover la fisión mitocondrial

104
II. Control de calidad de las mitocondrias
Las mitocondrias van a controlar su calidad mediante:
• La aparición de mitocondrias muy fragmentadas va a llevar a la inactivación de la
maquinaria implicada en fusión de mitocondrias
• La disfunción mitocondrial va a provocar un aislamiento y degradación de mitocondria
entera mediante mitofagia (proceso de autofagia específica de orgánulo).
La mitofagia en mamíferos depende de DRP1, que requiere factores específicos como
NIX, y Parkinson (proteínas implicadas en la enfermedad de Parkinson) y también se ha
visto una posible implicación de un defecto en mitofagia en esta enfermedad.
• Daño severo e irreversible en las mitocondrias puede iniciar la muerte celular
programada

III. Relación de las mitocondrias con otros componentes celulares

La mitocondrias tienen relación con:

• Gotas lipídicas, que son fuente de ácidos grasos para oxidar

• Retículo endoplasmático (RE). El 20% de la superficie de las mitocondrias está en
contacto con el RE
(MAMs, mitochondria
associated
membranes); forman
los complejos
macromoleculares
mantienen las dos
membranas a una
distancia de 10-25nm.

Los MAMs tienen un

papel crítico en la
homeostasis del
calcio, señalización y
regulación de la
muerte por apoptosis
e importación de
fosfolípidos a la
mitocondria.

2.2 La biogénesis de las mitocondrias

Las mitocondrias se forman a partir de mitocondrias preexistentes y está regulada
primariamente vía control transcripcional por el genoma nuclear y el genoma mitocondrial. La
mayoría de los constituyentes son importados desde el citosol por lo que va a ser muy
importante la importación de proteínas.

105
Una vez los componentes son importados de las mitocondrias, las proteínas de la matriz tienen
una señal en N-terminal a eliminar mientras que las proteínas de las membranas externa e
interna tienen una señal interna que permanece.
Los fosfolípidos también se importan. La fosfatidilcolina y fosfatidilserina en retículo
endoplasmático y transferidos a la membrana mitocondrial externa; en este proceso tiene un
papel crucial los MAMs (mitochondria associated membranes).
En la mitocondria se produce la descarboxilación de fosfatidilserina a fosfatidiletanolamina y
se forma la cardiolipina (bisfosfatidilglicerol) a partir de fosfolípidos importados.

2.3 La biogénesis de los peroxisomas

El peroxisoma es el principal lugar de oxidación de ácidos grasos en la mayoría de tipos celular.
Si la molécula tiene más de 20 CH2 se oxida en el peroxisoma mientras que si tiene menos,
entre 10 y 20, se oxidan en los peroxisomas o en las mitocondrias. Esta oxidación no está
acoplada a la formación de ATP, por lo que produce calor.

La biosíntesis de los peroxisomas empiezan con la síntesis de proteínas en ribosomas del

citosol, que se incorporan a peroxisomas pre-existentes o recien formados. Estas proteínas
tienen que tener una secuencia señal específica en C-terminal (Ser-Lys-Leu) cerca del N-
terminal.

106
El precursor de membrana del peroxisoma procede del RE por gemación con algunas proteínas
específicas en la membrana forma un peroxisoma fantasma (vacío) gracias a proteínas de la
membrana del peroxisoma Pex19, Pex3 y Pex16. Este peroxisoma fantasma forma un
peroxisoma maduro (que contiene catalasa) gracias a PTS1 y 2 y Pex5, Pex7, Pex14, Pex10,
Pex2 y Pex12. Este peroxisoma maduro puede seguir creciendo hast dividirse gracias a la
acción de Pex1.

Las proteínas Pex son proteínas que permiten la biogénesis de los peroxisomas por la hidrólisis
de ATP. Hay 23 tipos de proteínas Pex.

3. Cloroplastos y fotosíntesis
Reacciones fotosintéticas de transferencia de electrones
(reacciones de la fase lumínica).
Energía lumínica activa un electrón de la clorofila que produce un
desplazamiento a través de cadena de oxidación de la membrana
tilacoidal. Esto permite la formación de gradiente electroquímico de
protones y ello la síntesis de ATP en el estroma que junto a los
electrones de alta energía y H+cedidos al NADP+, que pasa a NADPH,
permite la fijación del CO2 y la formación de carbohidratos. Estas
reacciones se denomina reacciones de fijación del carbono
(reacciones de la fase oscura).
Los cloroplastos están implicados en otras funciones:
• Biosíntesis de ácidos grasos de la célula y algunos
aminoácidos
• Reducción de nitritos a amoniaco: Formación del nitrógeno
necesario para la síntesis de aminoácidos y nucleótidos.

I. Distribución de complejos multiproteicos en membranas de tilacoides

107
II. Fijación del CO2 y respiración
Cuando la concentración de CO2 aumenta, la enzima Rubisco reacciona con CO2 mientras que
cuando la concentración de CO 2 disminuye la Rubisco reacciona con O2 (condiciones secas y
calurosas)

III. Fijación de CO2 en plantas C4

108
3.1 Biogénesis de los cloroplastos
La biogénesis de los cloroplastos comienza también con la importación de proteínas al
cloroplasto. Estas proteínas tienen una secuencia N-terminal anfifílica de cloroplasto que se
elimina. Esta imporación se hace gracias a la hidrólisis de GTP y de ATP para impulsar el
transporte a través de la doble membrana.
Las proteínas de membrana del tilacoide tienen una segunda secuencia señal, de tilacoide, que
se descubre al eliminar la secuencia señal de cloroplasto.

I. Vías distintas según los translocadores de proteínas implicados y la fuente de

energía necesaria

109
 TEMA 5: EL NÚCLEO CELULAR
El núcleo celular es el orgánulo/compartimiento celular que contiene el genoma celular. Es el
centro de control celular ya que es donde tiene lugar de replicación del ADN, transcripción y
procesamiento del ARN.

1. Envoltura nuclear
La envoltura nuclear es una barrera selectiva que separa dos compartimientos
metabólicamente independientes, el núcleo y el citoplasma y media el tráfico selectivo de
proteínas y ARN entre núcleo y citoplasma por medio de los poros nucleares.

Además la envoltura nuclear es una doble membrana en relación con RE.

• La membrana externa continúa con la del retículo endoplasmático:
o Ribosomas en cara citoplasmática
o Composición similar a la membrana del retículo endoplasmático. Proteína
integral específica (nesprina)
• Espacio intermembrana (cisterna perinuclear de 25 a 40 nm)
• Membrana interna: Proteínas específicas de unión a lámina nuclear y a cromatina

1.1 La lámina nuclear

La lámina nuclear es una red fibrosa de 15-80 nm que da soporte estructural al núcleo. Está
formada por láminas (proteínas de los filamentos intermedios):

• Laminas A y C productos alternativos del mismo gen. Se

encuentran en tejidos adultos.
• Láminas B (B1 y B2) codificadas por genes diferentes. Se
encuentran en tejidos adultos y embrionarios.

Estas láminas forman dímeros de láminas B intercalados con dímeros

de láminas A-C que se disponen formando una red cuadrangular que
es la lámina nuclear como se observa en la imagen (obtenida por
congelación-grabado profundo).

Contribuye a la organización de la cromatina y guía sus interacciones

con la envoltura nuclear.

110
I. Interconexiones de la lámina nuclear con la envoltura nuclear y la cromatina

La lámina nuclear y la envoltura nuclear y la cromatina están unidas principalmente por las
proteínas:

• LAPs Proteínas asociadas a lámina nuclear (varias isoformas)

• HP1 y BAF Proteínas asociadas a cromatina
• LBR Receptor de la lámina B

Está unión se produce por medio del Complejo de unión de nucleoesqueleto y citoesqueleto
(LINC), un entramado nucleoesquelético que se encarga del posicionamiento del núcleo.

Complejo lámina nuclear-membrana nuclear interna:

Implicado en:

• Soporte mecánico del núcleo

• Organización de la cromatina
• Transcripción, síntesis de ADN
• Diferenciación celular
• Migración celular
• Transducción de señales
• Progresión del ciclo celular

Mutaciones en láminas, proteínas de la

membrana nuclear interna o proteínas
asociadas producen síndromes o
enfermedades congénitas que afectan a varios
tejidos (distrofia muscular, progeria de
Huchtinson-Gilford, HGPS).

111
Los poros nucleares forman el complejo del poro, unas nucleoporinas con simetría octogonal
encargadas de:
• Difusión de metabolitos y proteínas pequeñas (60kDa)
• Transporte selectivo de macromoléculas del núcleo al
citoplasma y viceversa como por ejemplo:
o Proteínas
o ARN y ribonucleoproteínas
o Hormonas esteroideas

2. Organización del material genético

El cromosoma es la unidad estructural diferenciada encargada de la replicación y segregación
de material genético. Está formado por una molécula de ADN con secuencias:

• Origen de replicación del ADN

• Centrómero: Cinetocoro (complejo de proteínas)
• Telómeros: Secuencias repetidas en los extremos que permiten replicación eficiente
de los extremos y evitan que el extremo se confunda con molécula de DNA rota.

Los cromosomas están condensados (humano 2 metros de ADN en 5-10 μm) ya que se
produce una asociación con proteínas que lo pliegan y empaquetan, lo que permite distinguir:

• Cromosomas interfásicos: formada por cromatina (ADN) asociado a proteínas.

Regiones descondensadas para permitir transcripción, replicación y reparación de
ADN.
• Cromosomas mitóticos: cromosomas de DNA supercondensados

Las proteínas asociadas a DNA en los cromosomas pueden ser:

• Histonas: Alto contenido en aminoácidos básicos (lisina y arginina). Permiten la

formación de los nucleosomas por la unión de 8 histonas (4 pares de histonas) + 146
bases de DNA. Las 8 histonas que forman los nucleosomas son: 2H2A, 2H2B, 2H3 y
2H4.

112
 • Proteínas cromosómicas no histonas.

I. Ensamblaje del octámero de histonas al ADN

El octámero de histonas se
empieza a ensamblar en dos
partes. Por un lado se forman dos
dímeros H3-H4, que se unen para
formar un tetrámero H3-H4 que
se une al DNA. De forma paralela
se unen las histonas H2A y H2B y
forman un dímero H2A-H2B; dos
de estos dímeros se unen al
tetrámero H3-H4 unido al DNA y
se forma así el octámero de
histonas unido al DNA.

Estos octámeros unidos al DNA

forman los nucleosomas, que se
unen por medio del DNA
espaciador o conector para
formar la fibra nucleosómica (al
ME en la imagen). La fibra
nucleosómica es el nivel menor
de organización cromosómica.

En la unión de la histona H1
espaciadora al DNA es importante
que la cola C-terminal quede
fuera de la célula para unirse después al DNA. LA cola C-terminal es importante para la unión
de alta afinidad de la H1.

113
2.1 Cromatina interfásica
La cromatina interfásica es una
fibra cromatínica de 30nm de
diámetro. Hay dos modelos de
cromatina interfásica:

• Modelo de plegamiento en zig-zag (tetranucleosoma): obtenido a partir de imágenes

de cristalografía de rayos X. Son grupos de nucleosomas en zig-zag y están formados
por grupos de 4 nucleosomas.

• Modelo de estructura en solenoide con nucleosomas intercalados a partir de

imágenes de microscopía crioelectrónica de alta resolución. Las lechas indican el
movimiento de los nucleosomas.

No está claro qué modelo es el correcto porque salen los dos por dos técnicas diferentes.

114
Las interacciones entre las colas de las histonas del nucleosoma y la asociación de histonas H1
al ADN espaciador contribuyen al empaquetamiento de nucleosomas en la fibra de 30nm.

El cromosoma humano con estructura de fibra de 30 nm tiene 0,1 cm formando un

empaquetamiento de orden mayor. Este es fluido cambia en respuesta a necesidades de la
célula (accesibilidad del ADN). Es el modelo de organización del cromosoma humano en
interfase.
El modelo de organización del cromosoma humano en interfase determina que la fibra de
30nm tiene un dominio en bucle de 50.000-200.000 pares de nucleótidos; este es un lazo con
elevado nivel de
expresión génica y la fibra
de 30nm se une al
esqueleto del cromosoma
(proteínas no histónicas)
denominadas cohesinas.

La cohesina mantiene unidas las

cromátidas hermanas tras la
replicación.

2.2 Cromosoma mitótico

El cromosoma mitótico es el nivel más compactado del cromosoma. Estos crosomas tienen
protuberancias que son dominios en forma de bucle.
En las imágenes se observa a la izquierda la imagen de la superficie del cromosoma mitótico
(las dos cromátidas) por MEB. A la derecha imagen de los cromosomas a ME tras la eliminación
de histonas por soluciones salinas suaves que nos permiten ver el esqueleto proteico del que
salen lazos de DNA

115
El armazón protéico está formado por proteínas
de alta movilidad (HMG). Como la condensina,
que es muy similar a la cohesina y es la
encargada de condensar el DNA. Está en el
armazón en el centro de los cromosomas.

En la imagen de la derecha se observa la

identificación inmunocitoquímica de
condensinas en cromosomas mitóticos arriba y
MET con marcado con Ac para condensina y oro
abajo.
Modelo de compactación de una cromátida por condensinas:

I. Condensación y compactación del cromosoma mitótico

En interfase las cromátidas hermanas están unidas por cohesina y cuando hay señales de
mitosis, la condensina va formando los lazos y las cohesinas van desapareciendo. Al final en el
cromosoma metafásico, las cohesinas solo están en los centrómeros y las condensinas están
por todo el cromosoma.
Como muestra la imagen de abajo a la derecha, el cromosoma metafásico tiene en su
centrómero:
• Cromatina que contiene histona H3 normal que está dimetilada en la lisina 4 y
cromatina que contiene una variante específica de la histona H3 del centrómero
• La cohesina que une el centrómero de las cromáticas hermanas
• Las placas cinetocóricas interna y externa
• Microtúbulos
• Heterocromatina pericéntrica

116
3. Cromatina, transcripción génica y epigenética
Las diferentes formas de la cromatina son:
• Heterocromatina:
Cromatina
condensada en la
que los genes están
reprimidos y que
por medio de
activadores pasan a
eucromatina.
• Eucromatina: Se
descompacta la
heteromromatina y
la polimerasa tiene
acceso a los genes y se activa la transcripcion.
• Heterocromatina constitutiva: La heterocromatina constitutiva está condensada
permanentemente (10% del genoma). Se encuentra en zonas específicas de los
cromosomas, especialmente en centrómeros y telómeros y determinadas zonas de los
cromosomas.
• Heterocromatina facultativa: Inactivación específica en el tiempo y en ciertos tipos de
células diferenciadas.
Según el tipo celular, la distribución de la cromatina es diferente e incluso pueden permitir su
identificación a MO (ej: célula plasmática tiene el núcleo en rueda de carro). Cada tipo celular
expresa los genes necesarios para realizar su función a pesar de tener todo el material
genético igual.
Todas las células de un organismo tienen la misma información genética ya que tienen genes
que codifican todas las proteínas necesarias para el organismo. Cada célula utiliza sólo una
parte de la información, la necesaria para el mantenimiento del fenotipo celular. Si se produce
la expresión de parte de los genes: ¿Cómo reconoce cada linaje celular qué secuencias de
ADN debe expresar? ¿Cómo transmite esa información a sus descendientes? Lo hace por
factores del ambiente (núcleo, citoplasma o entorno celular) que promueven o inhiben la

117
expresión de un fragmento de ADN (gen) y son heredables. Se denomina a esots factores,
factores epigenéticos.
¿Cómo modulan los factores epigenéticos la función génica? Mediante la transmisión del
patrón de actividad transcripcional de un tipo celular determinado a la descendencia, que
son marcas reversibles y heredables.

I. Modificaciones reversibles de las histonas

Las colas N-t de histonas del nucleosoma permiten la acetilación y metilación de lisinas y la
fosforilación de serinas (ubiquitinación de algunas lisinas). Dependiendo de las variaciones de
las colas de las histonas se establece el patrón de transcripcion.

II. Núcleo globular del nucleosoma

Se producen mediante reclutamiento de enzimas, como acetil- y metiltransferasas de la
histonas/desacetilasas y desmetilasas de histona, hacia zonas específicas de la cromatina, en
momentos concretos. La modificación de Histonas provoca la atracción de proteínas
específicas hacia la región de cromatina modificada que determinan cuándo y cómo se
expresan los genes.

118
Esto produce un código de histonas, que son marcajes dinámicos que determinan cómo y
cuándo es accesible el DNA empaquetado en los nucleosomas. Estos códigos de histonas
atraen complejos de proteínas que ejecutan funciones determinadas en el momento concreto.
Ej: Modificaciones y “significado” en
la histona H3. La trimetilación de
una lisina produce un reclutamiento
de la H1, que lleva a la formación de
heterocromatina; esta
heterocromatina lleva a la expresión
del gen. Después se produce un
silenciamiento de genes por la
inactivación del cromosoma X por
ejemplo.

III. Inserción de variantes de histonas (formas alternativas de H2A y H3) en lugares

específicos
En cromatina ya formada se
produce un intercambio de
histonas catalizado por
complejos remodeladores
de cromatina dependientes
de ATP en coordinación con
chaperonas de histonas.

Esto va a dar lugar a una estructura de algunas variantes de histona en relación con la histona
mayoritaria a la que sustituyen.

119
IV. Heredabilidad del patrón de compactación de la cromatina
• Mecanismo de herencia de las modoficaciones de las histonas. Las modificaciones de
las histonas de la cromatina parental determinan las modificaciones de las histonas
sintetizadas de novo en la cromatina hija.
Los complejos de lectura escritura tienen:
o Proteína lectora de códigos: reconoce la marca en la histona
o Enzima modificadora de histonas: modifica las histonas del mimo modo
Las células almacenan una
memoria de su historia
reciente del desarrollo. Las
células de diferentes linajes
se pueden especializar
mediante cambios en la
accesibilidad y en la
respuesta a la lectura de
muchos genes.

• Mecanismo de herencia de las variantes de histonas insertadas (heterocromatina

centromérica). Es la cromatina encargada de reclutar las proteínas del centrómero. Las
hebras se quedan los mismos tipos de histonas que tenían formando los cinetocoros la
"hebra madre”.

4. Organización interna del núcleo

El núcleo es una estructura interna que organiza el material genético y localiza las funciones
nucleares.

• Los cromosomas interfásicos ocupan regiones definidas

en el núcleo. Cromosomas homólogos se localizan en
lugares distintos. En la imagen se observa FISH utilizando
diferentes fluorocromos para cada cromosoma.

120
 • La actividad transcripcional de un gen se
correlaciona con su posición. Los genes con
transcripción muy elevada cambian de posición;
los genes se mueven a determinadas zonas que
tienen unos entornos bioquímicos que van a
favorecer la replicación, la traducción, etc.
En la imagen de la derecha, arriba, se observa la
actividad transcripcional con fluorescencia.

1. La localización de procesos nucleares se produce en regiones

concretas del núcleo
Las regiones funcionales se disponen en entornos bioquímicos que facilitan determinados
procesos a las que se desplazan las porciones de los cromosomas que tienen que seguir esos
procesos.

I. Modelo propuesto de regiones funcionales

La asociación de RNA y/proteínas produce
estructuras tipo gel altamente porosas que
son lugares de unión para otras proteínas y
moléculas de RNA implicadas en
determinados procesos nucleares. Estas áreas
de organización que catalizan determinadas
reacciones en el subcompartimiento van a
determinar la compartimientalización del
núcleo.
Los lugares de replicación de ADN se pueden
localizar gracias a la bromodesoxiuridina,
que se incorpora en lugar de timidina y se
detecta mediante anticuerpos.

121
2. Cuerpos nucleares
Los cuerpos nucleares son dominios del núcleo donde se llevan a cabo determinados procesos
específicos dentro del mismo. Están formados por:
• Cuerpos de Cajal: contienen coilina y son lugares de ensamblaje de snRNP
• Cuerpos Géminis de Cajal (GEMS) o gránulos pericromatínicos rodeados de un halo
claro (40nm). Se encargan de:
o Modificación de snoRNA y snRNA y ensamblaje con sus proteínas para formar
snRNP
o Separación tras el “splicing” y reciclado de snRNP
• Gránulos intercromatínicos o motas nucleares entre masas de eucromatina (20-
25nm): Son almacenes de ribonucleoproteínas snRNP maduras y otros componentes
de corte y empalme de ARNm.
• Cuerpo PML: es una acumulación de factores de transcripción, proteínas
modificadoras de cromatina y enzimas reparadoras de ADN
• Fibrillas pericromatínicas: se encuentra en la periferia de heterocromatina. Son
lugares de transcripción y maduración de pre-mRNA
• Nucléolo: lugar donde se produce la síntesis de ARNr y producción de ribosomas

En estas imágenes se observa:

a) Fibrilarina
Componente de
varias snoRNP en
nucleolos y cuerpos
accesorios de Cajal

b) Proteína implicada
en maduración del
pre-NRAm en motas
nucleares

d) Coilina en cuerpos
accesorios de Cajal

Se observa además diferentes entornos y una cierta compartimentalización según los

diferentes procesos que se llevan a cabo en el núcleo. No hay membrana pero hay
regionalización.

I. Estructuras subnucleares

122
5. El nucléolo.
Lugar de transcripción y procesamiento de
RNAr y ensamblaje de ribosomas. Su tamaño y
número depende de la actividad y necesidad de
ribosomas.
Su función es la transcripción, procesamiento y
ensamblaje de RNA no codificadores por lo que
hay una gran variedad de complejos
ribonucleoprotéicos como por ejemplo la
telomerasa.

El nucléolo está formado por:

• Componente fibrilar denso (DFC) o pars fibrosa. Son fibrillas de ribonucleoproteínas
de 8-10 nm (transcritos de ARNr recién formados por el RNA pre-mensajero
• Componente granular (G). Son acumulaciones ribonucleoproteínas de 25 nm
(subunidades ribosomales en formación)
• Centro fibrilar (FC) o pars amorfa. Son fibrillas de 7-9 nm, contiene DNA que codifica
los RNAr y RNAt (organizador nucleolar) y RNA. Forma el centro organizador nucleolar
aunque a veces no aparece

Resumen esquemático de la función del nucléolo

123
 TEMA 6: SECRECIÓN E INCORPORACIÓN DE MOLÉCULAS

1. Introducción
En 2013 los investigadores James Rothman, Randy Schekman y Thomas Südhof recibieron el
nobel de medicina por sus descubrimientos sobre la maquinaria que regula el tráfico vesicular,
un sistema de transporte principal en nuestras células.

“The cell is always speaking—the secret is to learn its language“- Andrew S. Bajer (Biólogo
celular)

Miles de reacciones químicas ocurren a la vez en una célula y a veces son incluso,
contradictorias. Para ello tienen que desarrollar varias estrategias para aislar y organizar las
funciones celulares:

• agrupar distintas enzimas con funciones similares en complejos grandes. Por ej.
Síntesis de ADN, ARN y proteínas
• confinar los distintos procesos y sus proteínas en compartimentos delimitados por
membrana = orgánulos

Cada compartimento tiene un conjunto único de proteínas que han de ir desde donde se
sintetizan (el citosol; pueden terminar de sintetizarse en el REr) hasta el compartimento
destino (donde se usarán) por lo que se necesita una distribución de proteínas concreta.

¿Cómo se comunican unos compartimentos con otros? Por medio de vesículas y transporte
vesicular. ¿Quién guía las vesículas? ¿Quién mantiene a los orgánulos en su sitio? Los
microtúbulos del citoesqueleto.

La ruta vesicular es el camino que siguen las moléculas por los diferentes orgánulos y, entre
ellos, van englobadas en vesículas. Hay dos grandes rutas vesiculares:

• Secreción: desde el retículo endoplasmático (en contacto con la envoltura celuar)

hasta la membrana plasmática: ruta exportadora o secretora.
• Degradación: desde la membrana plasmática hasta los lisosomas (que degradan
proteínas): ruta de importación o endocítica.

Casi todos los orgánulos están comunicados entre sí por lo que hay muchas más rutas.

124
2. Sistema de endomembranas
Los compartimentos celulares que forman el sistema
de endomembranas son el retículo endoplasmático,
el complejo de Golgi, los lisosomas o vacuolas en las
células vegetales y los endosomas.

Este transporte sale incluso de la célula (exocitosis) y

para meter proteínas en la célula (endocitosis). La
función de cada orgánulo es:

El retículo liso detoxifica (ej: metales pesados, alcohol, etc.), secuestra calcio (mensajero 2º). El
AG modifica proteínas y lípidos (normalmente glucosila) y el lisosoma se ocupa de la
degradación proteíca.

Volúmenes ocupados por los

orgánulos de membrana en un
hepatocito:

Podemos observar que hay

gran cantidad de mitocondrias
porque tienen que sintetizar
toda la energía de la célula.
Podriamos pensar que el
núcleo sería más grande de lo
que en realidad es (6% del
volumen)

125
3. Vía biosintética, secretora y endocítica
Hay una gran ruta que empieza en REr y va a Golgi, donde se centralizan todas. Hay una vía
secretora regulada donde influyen receptores de la membrana (ej: tiroides, con T3 y T4, que la
sacan de las células cuando hay señal) y otra constitutiva (ej:
formación de MP). También hay vía de incorporación que se
encarga de incorporar material extracelular por receptores.

Orgánulos rodeados de membrana en ocasiones doble

membrana (núcleo, mitocondria), pero al margen de tráfico
vesicular están sintetizados por ribosomas, libres en el citosol
a diferencia de los orgánulos implicados en el transporte
vesicular están sintetizados por ribosomas unidos a REr.

Si se pregunta cuál es la ruta mayoritaria o por defecto, la

respuesta es la ruta secretora por transporte vesicular.

4. Tráfico
intracelular de
proteínas
Distribución de las proteínas:
La mayoría se sintetizan en el

126
citosol y de allí van a distintos orgánulos

4.1 Transporte al núcleo: a través de los poros nucleares

El complejo de poro nuclear es una barrera selectiva que:

• permite el paso de proteínas pequeñas (< 15 Kda, p.ej. histonas) por difusión pasiva
• bloquea al paso de proteínas grandes: necesitan transporte activo y selectivo
• permite el paso de proteínas completamente plegadas

4.2 Transporte a través de las membranas

Las señales de distribución son un conjunto de pocos aminoácidos con secuencias conservadas
entre los organismos. Unas veces se eliminan tras entrar al orgánulo pero otras veces no se
eliminan. Ejemplos:

127
 • Peroxisoma: Este orgánulo no tiene DNA y todas las proteínas tienen que pasar por la
ruta vesicular. La localización de la señal en la proteína se encuentra en el extremo C-
terminal. No se elimina la señal tras entrar en el orgánulo y la señal suele ser Ser-Lys-
Leu en el extremo C-terminal.
• Mitocondria: La localización de la señal está en el extremo N-terminal y la señal sí se
elimina tras entrar en el orgánulo. La señal son 3-5 residuos Arg o Lys no consecutivos,
generalmente en combinación con Ser y The y sin residuos ácidos (Arg, Glu).
Hay cuatro posibles destinos mitocondriales:
o Membrana mitocondrial externa (mme)
o Espacio intermembrana
o Membrana mitocondrial interna (mmi)
o Matriz mitocondrial

5. Transporte intracelular de vesículas

Cualquier proteína que vaya a ser exportada debe estar apropiadamente plegada. Las que no
lo están son eliminadas.

Podemos ver desde donde a donde va una proteína haciéndolo como se hacía antes (aa
marcados radioactivamente) o por fluorescencia de la proteína que queremos ver y una que
sólo se encuentre en el orgánulo al que nosotros queramos ver si va.

5.1 Transporte del RE al Golgi

El destino moyoritario de las moléculas sintetizadas en el RE es el lado cis del AG. Se exportan
desde regiones especializadas del RE denominadas zonas de transición o dominios de
exportación reticular, cuyas membranas carecen de ribosomas.

COPI y COPII son cubiertas proteicas en la cara citosólica

de las membranas que se encargan de formar las
vesículas y seleccionar las moléculas que transportan.

RE y AG están comunicados mediante vesículas. ERGIC

es un compartimento intermedio entre los dos
orgánulos. El compartimento ERGIC durante el camino
hacia el AG madura: modificación de las moléculas de su
membrana permite la asociación de otras proteínas
citosólicas que forman una cubierta denominada COPI.

Función de COPI: Es una vía de reciclado. Forma

vesículas y selecciona moléculas que se devolverán al RE:
son moléculas “residentes” en el RE y que por tanto no
son marcadas y se pueden ir "sin querer" al Golgi y después se tiene que devolver al RE.

Las vesículas recubiertas con COPII se liberan desde las membranas del retículo, que pierden
su cubierta y se fusionan entre sí para formar un compartimento intermedio (transportador
túbulo vesicular o ERGIC - (endoplasmic reticulum Golgi intermediate compartment)). Este

128
tráfico vesicular es dirigido por los
microtúbulos hacia el lado cis del
aparato de Golgi, con el que se
fusionará.

COPI actúa en el compartimento

ERGIC y lado cis del aparato de
Golgi, mientras COPII lo hace en el
retículo endoplasmático.

En la formación de las vesículas o de los compartimentos tubulares participan al menos tres

proteínas citosólicas que forman conjuntamente un polímero denominado COPII. Éstas se
ensamblan en la superficie citosólica de las membranas de la zona de transición del retículo.

Las proteínas que forman COPII parecen realizar dos funciones:

1. cooperan en la formación de las vesículas creando tensiones y pliegues en la

membrana.
2. seleccionan algunas proteínas que han de ser incluidas en las vesículas porque en su
membrana hay receptores para esas proteínas.

En el esquema de la derecha podemos ver dos hipótesis de como se hace el transporte de

vesículas en el Golgi. El Golgi es muy dinámico y no podemos todavía saber cual es la acertada.

5.2 Recuperación de proteínas del retículo

Son pocos aa pero que pueden determinar las proteínas de un orgánulo tan importante como
el RE.

Las mitocondrias, los cloroplastos y los peroxisomas están fuera de la ruta vesicular.

129
5.3 Transporte del aparato de Golgi a…

5.4 Tráfico vesicular

Del Golgi pueden ir proteínas hasta la MP directamente... Endosomas temprano, tardio (similar
a cuerpo multivesicular ahora) y lisosoma componen la otra ruta.

130
5.5 Vesículas
I. Estructura de la cubierta de clatrina
La molécula se dobla hacia dentro y es lo que la hace tan selectiva. Las vesículas no son todas
igual de grandes.

La unión de proteínas consume energía y se hace por medio de un complejo dinámico

adaptador. Las cisternas recubiertas de clatrina tienen una especie de pie o cuello que la
separa de la
membrana y una

131
vez que está suficientemente separado se separa por la hidrólisis de GTP y se pierde ese pie.

II. Formación de las vesículas

El proceso de formación vesicular supone una serie de pasos antes de que sus moléculas
formen parte de la vesícula (modificado de Weinberg y Drubin 2012).

Se empieza con una proteína y luego se unen proteínas que llevan la carga y curvan la
envoltura y finalmente...

III. Fusión de las vesículas con la membrana

El proceso de fusión vesicular supone una serie de pasos antes de que sus moléculas formen
parte del compartimento diana (Modificado de Weinberg y Drubin 2012)

Hay proteínas SNARE que reconocen a las proteínas que van en la vesícula (v) o (t) si es la del
órgano diana a la que va. La vesícula se une a la membrana (proceso que no se sabe cómo se
lleva a cabo pero sí se sabe qué hace falta una subida de calcio)

IV. Vesículas: Resumen de formación y

fusión

132
Maquinaria que regula el tráfico vesicular: vesículas cubiertas de proteínas (clatrina, COPI o
COPII), SNAREs
y Rabs, los
cuales guían la
orientación, la
dirección, el
reconocimient
o y la fusión de
las vesículas con su compartimento receptor.

V. Disociación de componentes
de las vesículas
Disociación del acoplamiento
SNARE. Proteínas
accesorias/Complejo NSF+ ATP.

(SNARE: Soluble
N‐ethylmaleimide‐sensitive factor
attachment protein receptor y NSF:
N-ethylmaleimide sesitive factor)

5.6 Implicación de los fosfolípidos de membrana en vesículas

133
Los fosfolípidos de membrana también participan en la formación de vesículas cubiertas de
transporte. Identidad superficial del compartimento en la ruta biosintética - secretora y
endocítica. En el esquema de la derecha el fosfatidilinositol (PI)

Ciclos rápidos de fosforilación y desfosforilación (PIP quinasas) del azúcar en posiciones 3´,4´y
5´ en la superficie de la membrana son reconocibles por dominios proteicos

6. Procesos de incorporación. Endocitosis, fagocitosis, pinocitosis

Las células utilizan la endocitosis para:

• la absorción de nutrientes
• regulación de los receptores del factor de crecimiento
• regulador maestro de los circuitos de señalización

Tipos de endocitosis: todos basados en la formación de vesículas

intracelulares siguientes invaginación de la membrana plasmática
o ruffling dando lugar a
vesículas más grandes:

134
 • fagocitosis : captación de partículas grandes tales
como bacterias (mayores de 0,5 micras)
• endocitosis mediada por receptor: está regulada y
hay de diversos tipos
• pinocitosis : internalización de líquido

6.1 Endocitosis
Estructura: Vesícula esférica (Ø 400nm) con extensiones
tubulares (Ø 60nm) e invaginaciones que dan lugar a
vesículas intraluminales (Ø 50-80 nm)

Contiene:

• PIPs
• Proteínas Rab
• Proteínas SNARE
• Bomba de H+ ATP-asa

Tipos:

• Endosoma Temprano (EE): Periférico, pH 6,2. Cuerpo multivesicular con carácter

clasificador
• Endosoma de reciclaje (ERC): Fusión de túbulos, pH 6,7
• Endosoma Tardío (LE): Centrales, perinucleares, pH 5,3

Funciones: Relación con el tránsito de todas las moléculas en el sistema de endomembranas

(endocitosis o autofagia y sintetizadas/exocitosis).

• Clasificación del material que entra por endocitosis.

• Disociación de complejos Receptor-Ligando.
• Dirección al:

135
 o Golgi TGN (transporte retrógrado)
o M
e
m
b
r
a
n
a

P
lasmática (reciclaje)
o Lisosomas (degradación)

I. Dinámica de la endocitosis
Topología de la membrana plasmática.

Microdominios lipídicos rafts: Balsas de membrana (10-200nm):

• Contienen complejos glicoesfingolípidos-colesterol compactos en la monocapa exterior

• Contiene fosfolípidos con ácidos grasos largos y saturados

• Reclutan e incluyen proteínas específicas:

o Proteínas unidas a la cara exoplasmática (fuera). Con anclajes

glicosilfosfatidilinositol (GIP)

o Proteínas unidas a la cara citoplasmática (dentro)

! Por unión a grupos mirístico y palmítico: flotilinas y caveolinas

! Por acilación: Src-tirosina quinasa

! Unidas al colesterol: caveolinas (en horquilla)

! Unidas a fosfolípidos: anexinas

! Proteínas G

• Reclutamiento de proteínas al raft basado en interacciones lípido-lípido y

lípido-proteína

Función: Compartimentar la membrana para distintos procesos (señalización, tráfico de

membranas, polaridad celular) a través del cambio de la composición proteica.

136
! Membrana plasmática:
PI(4,5)P2
! Endocitosis: clatrina
+AP2+dinamina.
! TGN, gránulos de secreción y
vesículas sinápticas: PI(4)P
! Endosomas temprano: PI(3)P
! Endosoma tardío: PI(3,5)P2

137
Durante los últimos 20 años se han descrito varios mecanismos

138
6.2 Fagocitosis

I. Biogénesis de fagolisosomas
Eliminar/Procesar y presentar (antígenos)

Caracterización de la membrana del fagosoma maduro

• Microdominios de membrana raft (balsas):

o Especialización funcional
o Regulación espacial de las funciones
o Transferencia:
MP → Fagosoma I → Endosoma →
Fagolisosoma

139
Fagosomas iniciales: Pool de raft por fusión de membranas de otros orgánulos

Fagosomas maduros: Proteínas: Flotillin-1, actina, αβproteínas G. Rab7, bomba de protones

V-ATPasa

6.3 Pinocitosis
Factores:

• Modificación estructural en la membrana

• Dinámica basada en balsas lipídicas
• Dependiente/independiente de una cubierta proteica
• Mecanismo de escisión (dinamina)

Mecanismo: Captura de fluidos y macromoléculas del medio extracelular con formación de

vesículas de pinocitosis

6.4 Endocitosis por caveolas

Las caveolas son invaginaciones de la MP (Ø 60-80nm) en filas ordenadas, con forma de frasco
(MET) y con aspecto de repollo (MEB). Están presentes en células musculares, fibroblastos,
adipocitos y especialmente en las células endoteliales (transcitosis).

140
6.5 Localización intracelular de los fosfoinositoles (PIP)

6.6 En los lisosomas convergen diferentes rutas del tráfico intracelular

En los lisosomas convergen diferentes rutas
del tráfico intercelular. Según la procedencia
del material puede ser:

• Biogénesis de los lisosomas. Participa:

Endosoma
• Digestión intracelular:
o Heterofagia: Digestión de
material externo. Endocitosis.
Defensa, procesamiento de
hormonas o reabsorción. Participan: Fagosoma (Heterofagosoma), vesículas de
pinocitosis y endosomas
o Autofagia: Eliminación de partes obsoletas/dañadas/extra de la propia célula
(renovación/protección). Regulación de la secreción. Participan: autofagosoma
lisosoma y endosoma. Da como resultado un cuerpo residual y gránulos de
lipofuscina (envejecimiento celular)

141
I. Autofagia

Implicaciones homeostáticas/terapéuticas:

• Es importante para la supervivencia celular en los tejidos cuyas células no se dividen

después de la diferenciación (hígado, cerebro y músculo).
• En condiciones de enfermedad:
o Respuesta inmunitaria: Aporta material antigénico al organismo.
o Cáncer: es una ruta supresora de tumores (las proteínas que estimulan la
autofagia tienen la propiedad de inhibir tumores).
o Neurodegeneración: Eliminar agregados proteicos y proteínas mutadas
(Alzheimer, Parkinson familiar).
• Envejecimiento: Acumulación de proteínas y orgánulos dañados.

Estados desencadenantes:

• Privación de nutrientes
(hígado-ayuno)
• Falta de factores de crecimiento
• Estrés del retículo
endoplasmático (RE)
• Estrés metabólico
• Infección microbiana
• Enfermedad por acumulación de
proteínas

Requerimientos: Regulación fina del proceso basada en una amplia maquinaria de proteínas
Atg (codificadas por genes ATG, autophagy-related genes)

142
Etapas de la autofagia

Tipos de autofagia

Biogénesis de los autofagosomas

5 estadios: Inducción, expansión, formación de la vesícula, fusión con el endosoma/lisosoma y

degradación.

143
144
7. Procesos de secreción: Exocitosis
Se define exocitosis como el movimiento de proteínas en la ruta de secreción.

8. Digestión intracelular: Heterofagia y autofagia

Los lisosomas son orgánulos donde se produce degradación de moléculas.

La degradación es llevada a cabo por enzimas denominadas hidrolasas ácidas que tienen una
alta actividad a pH ácido. Estos enzimas llegan a los lisosomas desde el TGN, con los
endosomas tardíos siendo un paso intermedio.

Hay tres vías para llegar a los endosomas:

1. Endocítica: endosomas tempranos, cuerpos multivesiculares, endosomas tardíos y

lisosomas
2. Fagocitosis: fagosomas y fusión con los endosomas.
3. Autofagia: orgánulos o contenido citosólico son englobados en vesículas o
autofagosomas que se fusionan con los lisosomas.

Los lisosomas pueden, bajo ciertas circunstancias, liberar su contenido al exterior celular por
exocitosis.

145
8.1 Lisosomas

I. Ruta de las hidrolasas ácidas

Las hidrolasas ácidas se sintetizan en el RE (1),
se trasladan hasta el AG donde se le añade un
grupo fosfato a un residuo de manosa (2). En el
TGN esta man-6-fosfato es reconocida por
receptores específicos (3), receptor- hidrolasa
son englobados en vesículas (3) y transportados
hasta los cuerpos multivesiculares y endosomas
tardíos.

En estos orgánulos hay una acidez mayor que

hace que la hidrolasa se desligue de su ligando
(4). El receptor es devuelto al TGN en vesículas
de reciclado (5).

II. Biogénesis de lisosomas

146
 Immunocytochemistry/ Immunofluorescence
- LAMP1 antibody [H4A3] - Lysosome Marker
(ab25630)
III. Tipos de lisosomas

147
9. Otros tráficos vesiculares
En algunos tipos celulares existe una ruta vesicular adicional denominada transcitosis: las
moléculas unidas a receptor que llegan a los endosomas tempranos no se desligan de su
receptor ambos, receptor y ligando, son de nuevo empaquetados en otras vesículas para ser
transportadas a otros lugares de la membrana citoplasmática allí se fusionan y liberan su
contenido al espacio extracelular.

Esta ruta suele darse en las células polarizadas como las epiteliales. Las moléculas viajan desde
la membrana apical hasta la basal o lateral de la célula donde se fusionan y liberan su
contenido.

Ejemplo: mecanismo
de incorporación de
hierro en el
organismo (va
asociado a
transferrina).

148
Algunos tipos celulares (ej. células
hematopoyéticas, linfocitos, células
dendríticas, enterocitos, mastocitos y las
células tumorales, realizan un tipo de
tráfico vesicular un tanto extraño.

Los cuerpos multivesiculares, en vez de

convertirse en lisosomas, se fusionan con
la membrana plasmática liberando sus
vesículas internas (de 30 a 60 nm de
diámetro) al espacio extracelular. Estas
vesículas son exosomas y poseen una
composición molecular distinta a otros compartimentos intracelulares, por ejemplo poseen
mucho colesterol y esfingomielina.

Se han encontrado en todos los fluidos (sangre, saliva, orina, leche materna o líquido
cefalorraquídeo) y tienen un tremendo potencial para el desarrollo de marcadores biológicos
de enfermedades.

Muchas compañías biomédicas están invirtiendo en el desarrollo de métodos de diagnóstico

basados en exosomas, para enfermedades como cáncer, enfermedades neurodegenerativas,
tuberculososis y HIV entre otras.

I. Exomas

El interior de estas vesículas contiene

lípidos, ARN mensajero y proteínas
específicas que son transportadas de unas
células a otras.

149
This schematic showing the
composition of a typical exosome is
based on data from 15 proteomic
analyses carried out on exosomes
purified from cultured cells and from
biological fluids.

10. Rutas en células vegetales. Vacuolas

Las células vegetales tienen una ruta vesicular similar a la
de las células animales, con algunas diferencias.

Las vacuolas son orgánulos destacados de la ruta vesicular

de las células vegetales. Existen unos compartimentos
propios de las células vegetales denominados
compartimentos prevacuolares.

Los compartimentos prevacuolares (PVC) pueden recibir

vesículas desde el retículo endoplasmático y desde el
aparato de Golgi, siendo el paso previo a las vacuolas. La endocitosis y la exocitosis tienen
menor importancia en las células vegetales adultas que en las células animales.

10.1 Vacuolas
Las vacuolas son orgánulos delimitados por una
membrana (tonoplasto). Poseen distintas funciones:
digestión, almacenamiento, mantenimiento de la presión
hídrica, etcétera) Pueden tener varias formas y tamaños.

Hay dos grandes categorías de vacuolas:

• Las vacuolas líticas son equivalentes a lisosomas

de las células animales. Degradan materiales de
desecho.
• Las de almacenamiento son importantes durante
la germinación de semillas o para la respuesta de
los vegetales a señales ambientales.

Aunque funcionalmente distintas, pueden fusionarse y

formar una gran vacuola central. Esto ocurre en las células
adultas modificando así las rutas de tráfico vesicular.

150
Sólo las vacuolas líticas son como los lisosomas (vacuola vegetal no es sinónimo de lisosoma
pero vacuola lítica sí que es sinónimo de lisosoma).

Al igual que en las células animales, el retículo endoplasmático es el lugar de síntesis de nuevas
proteínas, lípidos y algunos azúcares que entran en la ruta vesicular.

En el retículo se dan también procesos de control de calidad de las proteínas sintetizadas.

Estas moléculas viajarán hacia el aparato de Golgi englobadas en vesículas.

Existe un proceso de transporte de reciclaje desde el aparato de Golgi hasta el retículo

endoplasmático. Esta comunicación bidireccional tiene características diferentes en las células
vegetales puesto que ambos orgánulos se encuentran muy próximos y hay dos modelos
propuestos para el paso de moléculas entre ambos: mediado por vesículas o mediante la
formación de puentes tubulares pasajeros entre ellos que permiten una comunicación directa.

No existe un aparato de Golgi centralizado como ocurre en las células animales sino varios
dispersos por la célula.

Además de hacia el aparato de Golgi, el retículo endoplasmático puede enviar vesículas

directamente hacia las vacuolas. Esta ruta se ha
demostrado porque en algunas vacuolas de
almacenamiento la mayoría de las proteínas no
están glucosidadas. Esta comunicación es indirecta
puesto que las vesículas del retículo
endoplasmático se fusionan con un compartimento
denominado prevacuolar desde el que se originan
vesículas que se fusionarán con las vacuolas de
almacenamiento.

Existen indicios de que existe una vía directa desde

el retículo endoplasmático hasta la membrana
plasmática, aunque no está completamente demostrado.

Las vías por defecto son las que llevan:

• desde el retículo endoplasmático al aparato de Golgi

• desde el compartimento prevacuolar al aparato de Golgi (es de reciclado)
• desde el Golgi a la membrana plasmática (renovación de la membrana)

Las proteínas destinadas a las vesículas (de almacenamiento o líticas) necesitan señales que las
etiqueten hacia sus destinos, pero las que van a la membrana no necesitan señal y no se
conoce el mecanismo por el cual son empaquetadas hacia la membrana.

Las vesículas de endocitosis se fusionan con:

• el compartimento prevacuolar
• el aparato de Golgi o
• las vacuolas.

151
La endocitosis en plantas es poco conocida y parece que su importancia es menor que en los
animales.

No existe una caracterización clara de los endosomas tempranos y el reciclado de membrana

es poco conocido, aunque parecen existir
múltiples vías que involucrarían a los endosomas
tempranos, como ocurre en las células animales.

Se cree de la existencia de al menos dos tipos de

endosomas:

• endosomas tempranos (próximos a las

membranas celulares) e involucrados en
el reciclado de la membrana
• cuerpos multivesiculares, pasos previos
en la ruta hacia las vacuolas
degradativas.

Las células vegetales no poseen lisosomas, pero

sí procesos degradativos que se dan en vacuolas
digestivas.

En plantas existe otro compartimento membranoso que es pasajero y que se forma durante la
división celular. Se denomina placa celular y posteriormente se transformará en el
fragmoplasto.

El fragmoplasto es la estructura a partir de la cual se formarán las membranas plasmáticas de

dos células durante la citocinesis y también formará la lámina media de la pared celular que las
separará. Su creación está condicionada por la actuación del citoesqueleto, el cual dirige las
vesículas que previenen desde el aparato de Golgi hasta la placa celular, donde se fusionan
para formar el fragmoplasto.

Ésta es la ruta vesicular por defecto cuando la célula se está dividiendo.

152
 TEMA 7: EL CICLO CELULAR Y SU REGULACIÓN

1. El ciclo celular: visión general

Etapas de la vida de una célula:

• Proliferación: Producción de células por división. Se produce especialmente durante el

desarrollo embrionario y para reponer pérdidas (lesión, envejecimiento, muerte)
• Crecimiento: Se produce antes de la división: duplicar contenido una vez formadas:
tamaño y composición del tipo celular. Depende de factores de crecimiento
extracelulares que estimulan la síntesis e inhiben la degradación
• Diferenciación: Aumenta la complejidad y la diversidad. La especialización lleva los
tejidos hasta órganos. Disminuye la proliferación
• Envejecimiento: Con el paso del tiempo y múltiples divisiones
• Muerte programada: apoptosis
A nivel histórico,
los principales
eventos en la
Biología celular
han sido los
reflejados en el
esquema adjunto.
Podemos ver que
algunos de ellos
implican
descubrimiento
del ciclo celular.

Uno de los más importantes fue la proposición de la Teoría Celular en 1838 por Shleiden y
Schwann. Estos investigadores propusieron la Teoría Celular que dice:
1. Todos los organismos son células o están constituidos por células
2. Las unidades reproductoras, los gametos y esporas, también son células
3. Las células no se crean de nuevo, toda célula proviene siempre de otra célula
4. Existen seres unicelulares y seres pluricelulares.
A vista de esta teoría podríamos pensar: ¿Cómo logran las células duplicar su contenido?
¿Cómo logran dividirlo en dos? ¿Cómo regulan y coordinan ambos procesos?
Ciclo celular: es la secuencia cíclica de procesos en la vida de una célula eucariota que
conserva la capacidad de dividirse. El lapso de tiempo requerido para completar un ciclo
celular es el tiempo de regeneración.
La frecuencia y duración del ciclo celular depende de la
estirpe celular. Ejemplos: Neutrófilos 6‐7 h circulando
y 4 días en un tejido; Eritrocitos 120 días y Neurona,
miocardiocito 50 ‐ 100 años
Las células pueden estar en estado de:
• división = fase M (mitosis+ citocinesis)
• no división = interfase
• El estado o etapa G (crecimiento)
• Etapa S (síntesis)

153
Todas las células tienen la capacidad de dividirse para dar lugar a otras semejantes a ellas. Sin
embargo, en un organismo pluricelular esta capacidad está controlada por señales químicas
que regulan la división, el crecimiento y la muerte de las células. Estas señales químicas son:
• Mitógenos: Inducen la división celular.
• Factores de crecimiento: Estimulan el aumento de tamaño celular mediante síntesis
de proteínas.
• Factores de supervivencia: Evitan la muerte programada de las células (apoptosis).
• Factores supresores: Detienen el crecimiento celular o inducen la muerte celular
programada.
Las células que están en el ciclo (proliferantes) o en G0 (quiescentes).

Las células pueden estar en distintas fases:

1. Crecimiento celular y funcionamiento “normal” (periodo G1). La célula pasa en esta fase un
tiempo indefinido.
Es el estado en el que se encuentran las células que no se dividen, aunque en ese caso se
denomina G0.
2. Duplicación del material genético (periodo S). Es necesaria para poder repartirlo entre las
células hijas.
3. Control de que el material genético se ha copiado correctamente (fase G2)
4. Reparto del material genético (mitosis).
5. División de citoplasma y orgánulos (citocinesis).

154
A finales de los 80 los procesos moleculares que regulan lo más importante en una célula, la
replicación y la segregación de los cromosomas, son iguales en todas las células eucariotas.
Participan proteinquinasas heterodiméricas que poseen:
• una subunidad reguladora : ciclina
• una subunidad catalizadora : quinasa dependiente de ciclinas
La existencia de puntos de control del ciclo celular permiten que todo el proceso tenga lugar
cuando la célula está totalmente preparada. Las células mantienen su tamaño durante
generaciones, lo cual indica que existe un control fino del metabolismo celular para adecuar el
crecimiento a la división.

2. Cómo se ha estudiado el ciclo celular

Al principio el ciclo celular solo se podía estudiar al microscopio óptico, por lo que solo podían
estudiar la fase M que es lo que se puede ver. Por tanto se podían estudiar por medio de:

• Criterios morfológicos: la fase M

• Criterios bioquímicos y genéticos: el resto

Además se empezó estudiando en levaduras, invertebrados y otros organismos. En levaduras

se empezó a estudiar los genes del ciclo de división celular (cdc) en genoteca de mutantes en
levaduras. En este experimento dieron con mutante en el CDC28 que producía que todas las
células paralizaran la división.
Además las levaduras eran
sensibles a temperatura y esos
CDC28 se conseguía pararlos
con un aumento de
temperatura. Esos CDC28
paraban el ciclo celular en un
mismo punto (start) a partir
del cual hagamos lo que
hagamos, se duplica (punto de
no retorno).

La división de todas las células ha de ser finamente regulada y coordinada con el crecimiento
celular y con la replicación del DNA, para asegurar la formación de una progenie de células que
contengan sus genomas completos. En las células eucariotas, la progresión a lo largo del ciclo
celular la controla una serie de proteína quinasas que se han conservado desde las levaduras
hasta los mamíferos. En los eucariotas superiores, esta maquinaria del ciclo celular a su vez
está regulada por los factores de crecimiento que controlan la proliferación celular, lo que
permite coordinar la división de las células individuales con las necesidades del organismo
como un todo. No debe extrañar que las alteraciones en la regulación del ciclo celular sean una
causa frecuente de la proliferación anormal de las células cancerosas; por tanto, los estudios
acerca del ciclo celular y del cáncer se han solapado, de igual manera que están relacionados
los estudios acerca del cáncer y de las vías de señalización celular.

155
These experiments were carried out in 1970
in cultured mammalian cells. (A) The results
show that S‐phase cytoplasm contains
factors that drive a G1 nucleus directly into
DNA synthesis. (B) A G2 nucleus, having
already replicated its DNA, is refractory to
these factors. (C)
Fusion of a G2 cell with a G1 cell does not
drive the G1 nucleus into DNA synthesis,
indicating that the cytoplasmic factors for
DNA replication that were present in the S‐
phase cell disappear when the cell moves
from S phase into G2. (Adapted from R.T. Johnson and P.N. Rao, Nature 226:717–722, 1970.)
Hay factores en el citoplasma que controlan las fases S y M
En estos experimentos se mide la cantidad de ADN en una
célula y se vio que la degradación de proteínas es un proceso
irreversible. Esto asegura la progresión del ciclo en un solo
sentido.

Por estudios bioquímicos se han estudiado huevos y embriones tempranos de anfibios e

invertebrados marinos

156
Para que MPF aumente es necesario sintetizar proteínas nuevas. Se sintetizan de modo
constante pero desaparecen súbitamente y se denominan ciclinas.

Además, todos los ARNm necesarios para la división celular están en los huevos no fertilizados
por lo que si ponemos un núcleo de espermatozoides y extractos de huevos no fertilizados,
¿qué pasará?

3. Ciclo en levaduras. Control

La división celular se produce en G1.

Factores de apareamiento: Si
hay paran el ciclo para que a
la levadura le dé tiempo a
fusionar el material genético
porque será bueno para la
especie.
Paran el ciclo asexual para
poder entrar en el sexual.
Este paso se hace entre G2 y
M (igual que los ovocitos de
eucariotas)
Regulación en el paso de G2 a M. Se supervisan: nutrientes y crecimiento (en animales esta
regulación la tienen los oocitos)

157
4. Ciclo en células eucariotas embrionarias
Es muy distinto del ciclo celular de las células adultas. Las células embrionarias iniciales se
dividen sin aumentar de tamaño a diferencia de las adultas (independientemente de la
especie). Además, su
ciclo solo tiene 2 fases
(S y M, síntesis y
división) y por tanto es
más rápido (en vez de
24 h. aproximadamente
duran 30 min).

5. Control del ciclo en eucariotas

El control del ciclo en eucariotas es por quinasas y por factores de crecimiento.
En etapas concretas del ciclo, las células comprueba si todo va bien. Si no es así, el ciclo se
detiene.
• Regulación en G1: punto de restricción. La regulación se hace por factores de
crecimiento extracelulares. Una vez que se inicia el ciclo estos factores NO hacen falta.

Si no hay factores de crecimiento no lo supera pero si hay lo supera y una vez pase ese punto
de control, podemos eliminarlos y seguirá dividiéndose.
Los factores de crecimiento permiten que se pase el punto de restricción y se sinteticen
ciclinas, que son las encargadas del progreso del mismo.
Los factores de crecimiento pueden ser sintetizados por otras células.

La mayoría de las células de un organismo pluricelular se encuentran habitualmente en un

estado no proliferativo llamado G0. En algunas células ese estado es irreversible, y no pueden
volver a dividirse: neuronas, músculo esquelético... Otras células pueden empezar a dividirse
cuando reciben del exterior los estímulos adecuados.
Las células también pueden morir de forma programada si reciben el estímulo
correspondiente.

158
5.1 Paso de G1 a S
El punto R regula el paso de la fase G1 a la fase S; este momento la célula
decide si entra o no en la siguiente fase tras evaluar si hay algún daño en
el ADN, si el tamaño celular es el adecuado para dar lugar a dos células
hijas y, en conclusión, si tiene la capacidad suficiente para completar el
ciclo.
Si la evaluación es negativa la célula determinara el proceso y entra en la
fase Go. Las células especializadas se encuentran indefinidamente en este
estado ya que ha perdido su capacidad mitótica. Otros tipos de células
pueden retornar a la fase G1 si es estimulado por algún agente mitógeno.

5.2 Puntos de control del ciclo celular de daños al ADN

Los puntos de control del ciclo celular
de daños al DNA son:
1. Paso de G0 a G1: comienzo de la
proliferación
2. De G1 a S: comienzo de la replicación
3. Paso de G2 a M: inicio de la mitosis
4. Paso de metafase a anafase. Esto es
lo que la célula controla

5.3 Activación de proteínas quinasas por ADN dañado

Se activan unas quinasas por la unión de quinasas al punto dañado del DNA y estas activan a
otras protein‐quinasas. Después se une p53 al DNA dañado (aumentos de p53 indican cáncer),
p53 se fosforila y se para el ciclo.

159
5.4 El ADN se ha de replicar una vez en cada ciclo
Una proteína (MCM) en G1 tiene la capacidad de unirse al DNA y al complejo del origen de la
replicación (ORC), el DNA se abre las dos hebras y no se puede unir a una hebra de DNA hasta
que no haya acabado el ciclo por lo que el DNA solo se replica una vez.

Las MCM sólo se activan (fosforilan) cuando la célula pasa a S.

Checkpoint: Point in the eucaryotic

cell‐division cycle where progress
through the cycle can be halted until
conditions are suitable for the cell to
proceed to the next stage.

5.5 Paso de G2 a M
La ciclina y su cdk se uenne, se pasa el checkpoint, la
ciclina se degrada y se genera más cdk... La unión de las
ciclinas y su cdk estimula la rotura de la envuelta celular,
la condensación de los cromosomas, la formación de la
placa mitótica y la degradación de proteínas diana por
cascadas de fosforilaciones /desfosforilaciones.

160
5.6 Ciclos de fosforilaciones‐‐desfosforilaciones
Ejemplo del paso a M: con 3 fosforilaciones y uniendo ciclinas se regula el ciclo además de por
uniones con ciclina, fosfato, etc.

Hay 4 mecanismos de regulación para el ciclo

celular:

• Asociación con ciclinas

• Fosforilación activadora de la treonina
próxima a la posición 160
• Fosforilación inhibidora de la treonina 14 y
de la tirosona 15
• Asociación con inhibidores de Cdk (CKI’s)

Hay aproximadamente 1000 proteínas están implicadas en la regulación del ciclo celular. Los
picos máximos de las ciclinas coinciden con ciertas fases; además algunas tienen una curva
más amplia que otras.

161
Por otra proteína: Rb.

Si el DNA está dañado, el p53 aumenta y se sintetiza una

proteína nueva p21 que inhibe el ciclo celular y la replicación del
DNA. Es una regulación clave del p53.

162
El MPF es el heterodímero más
importante y sus funciones son:

• Condensación de la cromatina:
Fosforilación de las condensinas
• Rotura de la envuelta nuclear:
Fosforilación de las láminas
• Fragmentación del Golgi y del RE:
Fosforilación de GM130
• Formación del huso mitótico:
Inestabilidad de los microtúbulos

Factor citostático: detiene la mitosis

Muchos tratamientos contra el cáncer son también citoestáticos. Se unen 2 proteínas que
controlan el huso: Mad y Bub. Este complejo inhibe al complejo promotor de la anafase. El
complejo promotor de la anafase controla:

• Degradación de Pds1: La degradación de Pds1 estimula la activación Esp1, que produce

una degradación de la cohesina Scc1 que produce la separación de las cromáticas
hermanas puesta en marcha de la anafase.
• Degradación de la ciclina B: La degradación de la ciclina B produce una inactivación del
MPF y la salida de la mitosis y la citocinesis.

163
Cuando se ha dividido el
núcleo hay que dividir el
citoplasma. La célula
pone un anillo contráctil
que va estrangulando a
la célula madre hasta
romper la célula.

Algunos ensayo hechos con oocitos: El factor de crecimiento para el oocito es su hormona, la
progesterona y se detiene en G2.

164
La célula nunca pierde en la
primera división el MPF porque
si no tardaría mucho más.

Resumen de los principales eventos del ciclo y etapa en la que ocurre y el control de la
proliferación celular.

165
6. Control del ciclo en células vegetales
En plantas son las mismas
fases. Las células de las
plantas son muy variadas
(diferente velocidad,
algunas paran en
determinada fase, etc.)
pero en general son igual
que las vistas. Lo
diferente son las
hormonas: citoquinina,
aumento de azúcares,
etc. Van a tener un gran
control por parte de
factores externos.

7. Defectos en el ciclo. Cáncer

Cáncer: toda alteración genética en las
células. Una sola mutación del DNA no
genera cáncer, es una acumulación que
provoca que la regulación del ciclo celular
no sea adecuada. El cáncer es una
enfermedad producida por cambios en la
conducta de las células, provocada por
modificaciones en la información genética
subyacente de las mismas.

La alteración o pérdida de mecanismos de regulación celular se puede producir en:

• el ciclo celular (división)
• el crecimiento
• el comportamiento
Hay cruces de información para crecer, no morir y morir.
Las células cancerosas: se dividen de manera continua e incontrolada y se propagan por el
cuerpo, interfiriendo con las funciones de los tejidos y órganos sanos.
Se caracteriza a nivel celular y molecular
El estudio de las células cancerosas ayuda a comprender el funcionamiento de células
normales.
El ciclo celular es un
conjunto ordenado de
eventos que culmina con
el crecimiento de la
célula y su división en dos
células hijas.

166
Los puntos de revisión son puntos que detectan una sola lesión en una molécula de DNA de la
célula y es suficiente para que el ciclo se detenga. El DNA más dañado de lo que puede
repararse es la apoptosis.

Hay dos tipos de mutaciones que influyen en el cáncer:

• proto‐oncogenes: si se activan oncogenes,
que promueven el crecimiento
• genes supresores de tumores = restringen el
crecimiento
Influyen en:
• el ciclo celular
• la apoptosis
• la reparación del ADN dañado
Estas mutaciones suelen ocurrir en células somáticas
(no pasan a la siguiente generación). Una sola no
produce cáncer, son un conjunto de ellas. Un clon de
células alteradas produce un tumor.

167
7.1 Tipo de tumores
Un tumor es una proliferación anormal de las células, que puede
ser benigno o maligno. Un tumor benigno, como las verrugas
comunes de la piel, permanece confinado en su localización
original, sin invadir el tejido sano adyacente ni propagarse a
lugares distantes del cuerpo. Sin embargo, un tumor maligno es
capaz de invadir el tejido normal adyacente y de propagarse por el
cuerpo mediante los sistemas circulatorio o linfático (metástasis).
Solo a los tumores malignos se les denomina propiamente como
cánceres, y es su capacidad para invadir y dar lugar a la metástasis
lo que convierte al cáncer en algo tan peligroso. Mientras que los
tumores benignos pueden eliminarse mediante cirugía, la difusión
de los tumores malignos a lugares del cuerpo distantes los suele
hacer resistentes a este tratamiento local.
Los tumores benignos son un problema si se segregan muchas
sustancias o si están en sitios peligrosos (suelen tener cápsula
fibrosa). Los tumores malignos crecen muy rápido y mueren
menos de lo normal.

Los tumores malignos o cánceres se clasifican de acuerdo al origen del tejido embrionario del
que deriva:
• Carcinoma. Tumoración que se origina en tejidos endodérmicos o ectodérmicos, como
la piel o el revestimiento epitelial de los órganos y glándulas internas. La mayor parte
de los cánceres de colon, mama, próstata y pulmón corresponden a este tipo.
• Las leucemias y los linfomas son tumores malignos de las células hematopoyéticas de
la médula ósea. Las leucemias proliferan como células independientes, en tanto que
los linfomas tienden a crecer como masas tumorales.
• Los sarcomas son malformaciones menos frecuentes, derivan de tejidos conjuntivos
mesodérmicos, como hueso, grasa y cartílago

En un tumor hay células que tienen la habilidad de dividirse incontroladamente y da lugar a

células blasto tumorales (es parecido a las células hematopoyéticas)

168
7.2 Etapas de la carciogénesis
En primer lugar se produce una fase
de iniciación, resultado de la
aplicación de una “dosis” única y
baja de un carcinógeno, el cual
produce una alteración estructural
en el DNA que conlleva la activación
de un oncogén o la inactivación de
un gen supresor. Es un proceso
irreversible y con memoria.
Una segunda fase de promoción que
no requiere necesariamente la
exposición al agente carcinógeno
pero sí a un segundo agente
denominado promotor. Existe dosis umbral y respuesta máxima. Se caracteriza por la
expansión de la población iniciada y es reversible. Se desencadena por estímulo de receptores
de membrana.
Finalmente en una tercera etapa de progresión tumoral, la neoplasia ya establecida adquiere
propiedades que conllevan mayor malignidad, como la capacidad de diseminas a distancia o la
resistencia a fármacos, probablemente por acumulación de nuevas mutaciones en el DNA
celular.

Por otro lado, las etapas de las metástasis pueden

dividirse en:
1. Invasión: degradan la lámina basal
2. Angiogénesis (más de 2mm)

169
La angiogénesis consiste en un proceso complejo que tiene
como consecuencia la aparición y crecimiento de nuevos vasos
sanguíneos a partir de la mediación de numerosos
componentes y factores celulares. Durante el desarrollo
tumoral es un proceso indispensable, pues promueve la
formación de una red vascular que irriga las células cancerosas.
El factor pro‐angiogénico dominante es VEGF‐A.
Cuando baja la tensión de oxígeno, en ese momento se
estabiliza el factor inducible por hipoxia (HIF‐α), que se une al
elemento de respuesta a hipoxia (HRE) en el promotor de
VEGF‐A, incrementando la tasa de transcripción. Este factor se
secreta y viaja hasta las células endoteliales vasculares, donde
se puede unir a dos receptores tirosina kinasa diferentes,
VEGFR‐1 y VEGFR‐2 (Figura 4). La actividad de VEGFR‐2 es la
que realmente desencadena la cascada de señalización que
dará lugar al proceso angiogénico.

La unión de VEGF‐A al receptor VEGFR‐2 causa

su dimerización y autofosforilación en los
residuos de tirosina. La actividad de la cascada
intracelular de señalización da lugar a
diferentes procesos, entre los que son
importantes la proliferación, migración,
supervivencia e incremento de la
permeabilidad. Son muchas las proteínas que
se unen a los residuos de tirosina del receptor
VEGFR‐2 mediante los dominios SH2, cuya
activación mediante fosforilación acaba
desencadenando los procesos denominados
anteriormente. Diferentes vías dan lugar al
proceso angiogénico.

7.3 Propiedades de las células tumorales

Los cambios más destacables de una célula cancerosa (con respecto a una normal):
• En el núcleo: dotación cromosómica aberrante
(aneuploidía)
• En el citoplasma: cambios en el citoesqueleto
(reducido y desorganizado) fig 16.5 karp
• En la superficie celular (aumento o disminución de
componentes):
o proteínas alteradas
o pueden aparecer nuevas proteínas (son
antígenos asociados al tumor)
o son menos adherentes (facilidad para
metástasis)
o cambian sus uniones con las células vecinas
o no tienen inhibición por contacto

170
En cultivo: no requieren la presencia de suero, pueden crecer suspendidas (sin adherirse al
sustrato) y proliferan sin necesidad de factores de crecimiento. Se dividen más rápidamente y
son “aparentemente” inmortales.
Las células más peligrosas son móviles, invasivas, se agregan y se deforman.
Propiedades básicas de una célula cancerosa:
• Pérdida de la capacidad de una célula para generar su propia división.
• Pérdida del control del crecimiento
• No solo ignoran las señales que inhiben el crecimiento sino que prosiguen su
crecimiento en ausencia de señales estimulantes.
• Pueden proliferar en ausencia de suero.
• Son inmortales puesto que no detienen su división para envejecer por la presencia de
telomerasa
• Tiene muchas veces complementos cromosómicos muy anormales (aneuploidía)
• Casi nunca inducen a
apoptosis
• Dependen de muchas vías
metabólicas anaerobias como
glucolisis y fermentación
Requerimientos para que hay
malignidad:
• Pérdida de determinados
controles de proliferación
• Al menos 7 mutaciones
• Cambios histológicos
• Invasión de tejidos y
metátasis.
Actualmente se sabe que el sistema inmune es capaz de reconocer determinados antígenos
tumorales y a veces responde frente a ellos.
Esta misma falta de respuesta a señales externas es la razón de que las células cancerosas
constituyan una amenaza dentro del cuerpo.

171
Las células en cultivo se pueden transformar en tumorales.

7.4 Alteraciones genéticas. Oncogenes y genes supresores de tumores

Los genes supresores de tumores son un freno celular que codifica proteínas que restringen el
crecimiento celular y por tanto la prevención a la transformación maligna y ayudan a mantener
la estabilidad genética. Por el contrario los oncogenes son los aceleradores que codifican
proteínas y promueven la pérdida del control y del crecimiento y por tanto la conversión a su
estado maligno.
El cáncer se debe a las alteraciones en determinados genes reguladores que controlan la
proliferación, la diferenciación y la supervivencia celular. Los estudios sobre los virus tumorales
revelaron que unos genes específicos (denominados oncogenes) eran capaces de inducir la
transformación celular, lo que proporcionó una primera aproximación a las bases moleculares
del cáncer. Sin embargo, la mayoría de los cánceres humanos (aproximadamente el 80%) no
son inducidos por virus y surgen debido a otras causas como la radiación y los carcinógenos
químicos. Por lo tanto, para una comprensión completa del cáncer ha sido fundamental que
los estudios sobre los oncogenes víricos condujeran a la identificación de los oncogenes
celulares, que están implicados en el desarrollo de aquellos canceres no inducidos por virus. El
nexo entre los oncogenes víricos y los celulares lo proporcionaron los estudios sobre los
retrovirus altamente oncogénicos.
Los oncogenes codifican proteínas que promueven la pérdida de control del crecimiento y la
conversión de una célula a un estado maligno. Se han identificado casi 100 oncogenes
diferentes, muchos de ellos incluidos como parte del genoma de virus RNA tumorales, pero
sólo en una docena de ellos se ha demostrado un papel en la carcinogénesis humana. El
oncogén implicado con mayor frecuencia en los tumores humanos es ras, que codifica una
proteína (Ras).

172
La activación de los oncogenes celulares solo representa uno de los dos tipos de alteraciones
genéticas implicadas en el desarrollo del tumor; la otra es la inactivación de los genes
supresores de tumores. Los oncogenes causan la proliferación anormal de las células debido a
alteraciones genéticas que incrementan la expresión génica o producen la actividad
incontrolada de las proteínas codificadas por los oncogenes. Los genes supresores de tumores
representan un mecanismo opuesto de control del crecimiento celular, normalmente
inhibiendo la proliferación celular y el desarrollo del tumor. En muchos tumores, estos genes
están ausentes o inactivados, por lo que no intervienen reguladores negativos de la
proliferación celular, lo que contribuye a la proliferación anormal de las células tumorales.
Los genes supresores de tumores (GST) confieren protección a las células que tienen integro el
complemento de GST mientras que producen células cancerosas cuando ocurre una périda de
la función de uno o más GST. Casi todas las proteínas que codifican GST actúan como
reguladores negativos de la proliferación tumoral.
Los niveles de p53 están incrementados en células dañadas. Esto otorga tiempo para reparar el
DNA por bloqueo del ciclo celular. Una mutación de la p53 es la mutación más frecuente que
condice al cáncer. Un caso extremo de esto es el síndrome de Li Fraumeni dónde un defecto
genético en la p53 conduce a una alta frecuencia de cáncer en los individuos afectados.
Los protooncogenes codifican proteínas que tienen varias funciones en las actividades
normales de la célula. Los genes pueden convertirse en oncogenes (activarse) al mutar,
duplicarse una o más veces o por nuevo ordenamiento cromosómico que mueva una
secuencia de DNA distante en el genoma hasta quedar próxima al gen.
La carcinogenia es un proceso de múltiples pasos por una progresión de alteraciones
permanente en una línea de células que ocurre en el transcurso de muchas divisiones y que
requiere años para completarse.

173
7.5 Virus tumorales
Los miembros de seis familias de virus animales son denominados virus tumorales. Estos son
capaces de causar cáncer directamente tanto en animales de experimentación como en
humanos.

Si la célula deja que se replique el virus, pervive (permisiva) y el

virus sigue expandiéndose. Otras son células que resisten a que
el virus se replique (no permisiva) porque empiezan a
fragmentar su material genético. Cuando tiene los fragmentos
cortos, es fácil que el núcleo incorpore ese material genético en
su DNA y les falta muy poco para ser cancerosas (transformadas).
El virus casi siempre gana sea como sea la célula.

La leucemia es el bloqueo de la diferenciación de los eritrocitos.

174
175
7.6 Factores que desencadenan el cáncer
Los factores que desencadenan el cáncer pueden dividirse en:
• Intrínsecos (genéticos)
• Extrínsecos (químicos, físicos y ambientales). A mayor edad más probabilidad de
acumular mutaciones. El envejecimiento y los ROS pueden originar mutaciones

Resumen de los factores que desencadenan el cáncer:

176
7.7 Avances recientes en la investigación
El cáncer es un área de investigación prioritaria. Se ha invertido mucho dinero sobre todo en la
prevención y detección precoz, en realizar un diagnóstico molecular (cada persona tenga un
tratamiento personalizado) y en el propio tratamiento en sí (nuevos tratamiento con menos
efectos secundarios).
Aplicaciones de la biología molecular para la prevención y tratamiento del cáncer:
Se ha aprendido mucho acerca de los defectos moleculares responsables del desarrollo de
muchos cánceres humanos. Sin embargo, el cáncer es algo más que un tema de interés
científico. Es una enfermedad terrible que causa la muerte de cerca de uno de cada cuatro
americanos. Por lo tanto, aplicar nuestro conocimiento del cáncer para mejorar la prevención
y el tratamiento del mismo representa un reto fundamental en la caracterización de la biología
molecular del cáncer comienzan a contribuir al desarrollo de nuevos abordajes en la
prevención y tratamiento, lo que en último término permitirá hacer frente a la enfermedad de
una manera adecuada.
La biología molecular ha permitido: Prevención y detección precoz, diagnóstico molecular y
tratamiento.

La endocitosis
alterada es una
característica
emergente de las
células cancerosas.
La endocitosis
alterada empieza a
producir una
alteración de la
polaridad y puede
empezar por
receptores
celulares y
terminar por
consumir la lámina
basal, el
citoesqueleto de
las células
epiteliales, etc.

Los nanobots son el futuro de la medicina, de acuerdo con muchos futuristas y personas en el
campo de la medicina. Investigadores de la Universidad de California Davis Cáncer Center han
descubierto que los nanobots podrían ser utilizados para atacar células cancerosas, sin dañar
las que están bien, con esta práctica las células malas de los individuos morirían y se
regenerarían nuevas.
Google trabaja en una pastilla para
detectar cáncer. La empresa anunció
que trabaja en la elaboración de una
píldora que contiene partículas
microscópicas que pueden viajar por
el flujo sanguíneo y buscar células
malignas.

177
 TEMA 8: MUERTE CELULAR

1. Introducción
Después de unas 50 divisiones las células pierden esta capacidad de división pero ¿Cómo
saben que se tienen que retirar? La muerte celular programada es un destino celular y las
células que nunca mueren pueden matarnos, a nivel celular es esencial para modelar nuestros
tejidos y órganos.

El funcionamiento normal de un organismo pluricelular puede requerir, en ciertas ocasiones, la

muerte de algunas de sus células como un mecanismo más que contribuya a mantener su
homeostasis. Por ejemplo: elimina células dañadas para que no perjudiquen al resto es
imprescindible para que prosiga el propio desarrollo del individuo (metamorfosis de los
insectos). Las células poseen, en su programación genética, mecanismos que dan lugar a su
propia desaparición mediante lo que se ha dado en llamar muerte celular programada.

Nuestras células no viven aisladas ya que deben recibir señales de su entorno: señales de
supervivencia.

Las señales de supervivencia activan

receptores que a su vez activan la
transcripción de un regulador que activa
la síntesis de las proteínas de la familia
Bcl2 que bloquean la apoptosis.

178
 Otra de las señales de
supervivencia celular es el
complejo Bad. Bad defosforilado
promueve la apoptosis mientras
que cuando está fosforilado se
inactiva y activa una proteína
llamada Bcl2, que bloquea la
apoptosis.

Los factores de crecimiento extracelulares activan unas vías de

señalización intracelular que llevan al aumento de la síntesis protéica y
la parada de la degradación de las mismas, lo que lleva a un aumento
del crecimiento celular.

Se denomina equilibrio celular al equilibrio entre

proliferación, diferenciación, senescencia y muerte
celular por apoptosis (programada) o necrosis
(accidental).

La mitosis crea las células y la apoptosis las mata: si se desajustan podrían matar al organismo;
para evitarlo, muere la célula. Son procesos opuestos que en equilibrio mantienen nuestra
salud y nos “rejuvenecen”. Sin apoptosis, se acumularían probablemente dos toneladas de
médula ósea y de ganglios linfáticos y 16 km de intestino, en un humano a la edad de 80 años.

2. Tipos de muerte celular

Los principales tipos de muertes celulares son:

• Mitoptosis: catástrofe mitótica. Mitosis aberrantes. Células con puntos de control

defectuosos
• Pyroptosis: muerte celular no apoptótica pro-inflamatoria mediada por la activación
de caspasa-1.

179
 • Paraptosis: muerte celular muy lenta caracterizada por una vacuolización extensiva e
hinchazón progresiva de mitocondrias y RE.
• Entosis: ocurre en celulas epiteliales de mamiferos que se han desprendido de la
matríz extracelular
• Necrosis: Se caracteriza porque la célula mantiene la turgencia de ella y sus orgánulos.
o Se degrada la membrana plasmática.
o El contenido celular sale a su entorno (autolisis)
o Se induce inflamación de los tejidos circundantes
o Hay desnaturalización proteica (tarda horas).
o Es identificada por tumefacción de células y orgánulos o la ruptura de
membranas con derrame de contenido intracelular.
o Por lo general, resulta de una deficiencia metabólica con rápido agotamiento
de ATP.
o Es considerada una forma accidental de muerte celular se produce en
respuesta a la hipoxia aguda o lesión
• Apoptosis: Forma de muerte celular, que está regulada genéticamente. Cuando una
célula muere por apoptosis, empaqueta su contenido citoplasmático, lo que evita que
se produzca la respuesta inflamatoria característica de la muerte accidental o necrosis.

En la imagen siguiente se hace una comparativa de la apoptosis y la necrosis:

180
3. Cómo se ha estudiado
3.1 Apoptosis en el nemátodo Caenorhabditis elegans
Para el desarrollo de un adulto se generan 1.090 cells, de las cuales 131 mueren antes de
acabar el desarrollo del animal.

Los nemátodos mutados en CED-3 no tienen apoptosis, lo

que permitió descubrir la familia de las caspasas
(proteasas de cisteína). Se identificaron dos genes
necesarios para la apoptosis, uno que protege genes
necesarios para
deshacerse de
las células
muertas.

Luego se comprobó en humanos y se demostró que la

apoptosis tiene regulación génica. Las vías apoptóticas
están conservadas evolutivamente con tres
componentes principales:

• proteínas reguladoras
• adaptador de proteínas
• proteasas llamadas caspasas efectoras en los
vertebrados

Proteínas que son blanco de las caspasas:

• proteínas quinasas: FAK: inhibe la adhesión celular; las células pierden el contacto con
las vecinas; se encojen
• láminas: se desarma la lámina nuclear, el núcleo encoje
• citoesqueleto: FI, actina, tubulina, gelsolina se alteran, cambia la forma celular
• endonucleasa: DNAasa activada por caspasa (CAD): si se activa va del citoplasma al
núcleo y fragmenta el ADN

4. Apoptosis
4.1. Factores que promueven la apoptosis
Los factores que promueven la apoptosis pueden ser de dos tipos:

• Estímulos internos (la vía intrínseca):

o daños irreparables en ADN
o aumento de Ca citosólico
o estrés en el R endoplasmático

181
 o aumento de la concentración de ROS
• Estímulos externos (la vía extrínseca ) (ej. ciertas citocinas)

Factores que determinan la vía de muerte:

• Estadio del ciclo celular

• Tipo y magnitud de estímulo apoptótico
• En células inmune, estadio de activación celular
• Múltiples estímulos activan las diferentes vías
apoptóticas

El aumento de la concentración intracelular del calcio

también induce la apoptosis mediante la activación
directa de las caspasas (proteasas) y el aumento de la
permeabilidad mitocondrial.

4.2. Vía intrínseca

El citocromo C se encuentra en el espacio intermembrana de las mitocondrias por lo que su
liberación al citosol viene dada
por la creación de un poro en las
membranas de las mismas (por
proteínas de la familia de las
Bcl2). El citocromo c en el citosol
activa el proteosoma, que a su
vez activa la pro-caspasa
iniciadora 9.

182
4.3. Vía extrínseca
La vía extrínseca viene determinada por la interacción receptor-ligando entre receptores como
Fas y receptor de TNF con factores externos a la célula. Estas interacciones provocan que las
proteínas adaptadoras activen las caspasas iniciadoras, punto donde la vía intrínseca y
extrínseca convergen.

Los mecanismos de apoptosis se dividen en dos vías que llegan a un punto final de activación
de las caspasas (proteasas que rompen el citoesqueleto). Este mecanismo tiene diferentes
fases:

1. Fase de iniciación: Se activan las caspasas. Son diferentes en la vía intracelular y

extracelular
2. Fase de ejecución: Muerte celular

183
4.4. Características de las células apoptóticas
La desaparición de las células de la muerte celular programada está marcada por una
secuencia bien definida de cambios morfológicos: apoptosis ("dejar a" o "caerse", como las
hojas de un árbol).

Acontecimientos durante la apoptosis:

• activación de un conjunto de genes

• actuación de numerosas
enzimas: endonucleasas,
hidrolasas y proteasas
• compactación total de la
célula (incluyendo el núcleo)
• fragmentación (disección de
la cromatina en trozos y del
citoplasma)
• rápida fagocitosis por parte
de las células del sistema inmunitario

Los componentes intracelulares no se liberan en el medio extracelular en los que podrían

tener efectos nocivos sobre las células vecinas.

184
4.5. Control molecular de la apoptosis
La activación de los receptores para la muerte celular inician una vía de señalización
intracelular que lleva a la apoptosis por la formación de un complejo señalizador inductor de
muerte que incluye una procaspasa (8 o 10).

I. La apoptosis durante el desarrollo embrionario

Imprescindible para la formación de los organismos ya que modela tejidos y órganos.

Elimina las células innecesarias o superfluas. Ejemplos: las colas embrionarias, el tejido
interdigital en la formación de los dedos, las neuronas que sobran para establecer las sinapsis
oportunas (evita conexiones inútiles), genera conductos, orificios, cavidades…

Elimina los linfocitos T que reaccionan con el propio organismo (selección positiva y negativa).

185
II. La apoptosis en el organismo adulto
En un organismo adulto mueren al día de 1010 a 1014 células y ayuda a conservar la
homeostasis. La apoptosis es imprescindible para el recambio y renovación de tejidos, o la
destrucción de la células que pueden presentar una amenaza para el organismo.

Elimina células:

• con daño genómico

• innecesarias (linfocitos que ya han actuado)
• enfermas (Alzheimer, Parkinson, a veces también las sanas)

Nuestra salud depende de un buen uso de la apoptosis. La alteración de la apoptosis conlleva

enfermedades graves:

1. Si no mata las células que debe. Por ejemplo, cáncer

2. Si mata células sin deber. Por ejemplo, diabetes tipo 1

Las funciones de la apoptosis en un organismo son por tanto:

• Mantención de un número constante de células mediante la eliminación en tejidos

sujetos a recambios celulares, hígado, médula ósea y mucosa del tracto digestivo
(“mantener la homeostasis”).
• Eliminación de células potencialmente pelligrosas que pueden desarrollar un proceso
maligno.
• Función inmune:
o En infecciones virales, las células infectadas son eliminadas para evitar la
propagación de la infección
o La eliminación de los linfocitos reactivos, NK eliminan limitando o regulando
de este modo fisiológicamente la respuesta inmune
• Remodelación de tejidos embionarios y organogénesis.

Las células que mueren por apoptosis son las células formadas en exceso, las infectadas por
virus o las defectuosas y/o alteradas.

186
III. El control molecular de la apoptosis
Una vez activado, proteasas apoptóticas
escinden sustratos intracelulares específicos que
conducen a la desaparición de una célula.
Proteínas adaptadoras (por ejemplo, Apaf-1),
que obligan a ambas proteínas reguladoras y las
caspasas, son necesarios para la activación de la
caspasa.

Las proteínas reguladoras Pro-apoptóticas (por

ejemplo, Bax, Bad) promueven la activación de
caspasa y los reguladores anti-apoptóticas (por
ejemplo, Bcl-2) suprimen la activación.
Interacciones directas entre proteínas pro-
apoptóticas y anti-apoptóticas conducen a la muerte celular en ausencia de factores tróficos.
La unión de factores tróficos extracelulares puede desencadenar cambios en estas
interacciones, lo que resulta en la supervivencia celular.

La familia de Bcl-2 contiene tanto proteínas pro-apoptóticas y anti-apoptóticas; todas son de

un solo paso transmembrana y participar en las interacciones proteína-proteína. Bcl-2
moléculas pueden controlar la liberación de citocromo c de la mitocondria, lo que provoca la
muerte celular.

Los genes implicados en el control de la muerte celular codifican proteínas con tres funciones
distintas:

• Se requieren proteínas "Killer" para iniciar el proceso de apoptosis.

• proteínas "destrucción" hacen cosas como digerir el ADN en una célula que muere.
• Se requieren proteínas “para engullir" para la fagocitosis de la célula muerta por otra
célula (esto es parte de la decisión final de morir).

187
188
189
190
 TEMA 9: SENESCENCIA, DIFERENCIACIÓN Y DETERMINACIÓN
CELULAR
1. Introducción
La actividad génica en las células de un organismo es variada. Tipos de genes:

• de mantenimiento: si se activan en todos los tipos celulares

• de funciones de lujo: se expresan de forma diferencial. Sólo en un tipo de célula

En células diferenciadas el genoma permanece constante: Experimentos en rana y ratones

La evolución de los organismos

pluricelulares lleva consigo diversidad
de tipos celulares encargados de la:
coordinación de su producción,
regulación de tamaño y número,
organización en tejidos y eliminación
de células dañadas/viejas. Las señales
entre las células son más importantes
en pluri‐ que en unicelulares. El
desarrollo de los organismos depende
de patrones específicos de divisiones
celulares.

191
Clonación de animales: Si hay diferencias entre las
células es porque expresan genes diferentes.

Los núcleos y los citoplasmas son interdependientes

• Uno no sobrevive sin la presencia del otro: Células adheridas + citocalasina B: el

citoplasto vive muy poco tiempo. La citocalasina B va a desorganizar el citoesqueleto y
la célula pierde su forma y se
despega del medio si se adhieren.
Se separa el citoplasma (citoplasto)
y los núcleos (carioplasto) y no
sobrevive ninguna de los dos
porque se necesitan para vivir.
• Experimentos de fusión celular:
Eritrocitos de pollo + células HeLa.
Con un virus se fusionan dos células
y se preguntaron si la célula tomaría
solo uno, los dos o ninguno; las
células resultantes toma los dos
núcleos, los sincroniza en el ciclo
celular y se divide formando un
híbrido (Ac monoclonales actúan de
esta forma).
Las células HeLa son células tumoreales que intentaron hacer una fusión con
eritrocitos, una célula madura que siendo de pollo tienen núcleo ‐> el núcleo del
eritrocito no lee ARN ni nada pero gracias a la fusión de la célula tumoral se permite
que se dividan porque se sincronizan los dos núcleos.
El resultado de la fusión de las dos células no es solo viable si no que se sincronizan los
núcleos.

El control de la actividad génica ocurre a varios niveles; el más importante es a nivel

transcripcional.

El citoplasma tiene componentes que regulan la expresión génica.

192
2. Diferenciación celular de embriones
Si el citoplasma de un huevo se distribuye de
forma diferente entre las células hijas se
comenzarían a ver diferencias entre ellas: así
aparecen las primeras diferencias en las
células de embriones.

El cigoto es una célula particular desde el

punto de vista de su ciclo vital: es una célula
totipotente, porque va a dar lugar a todos los
tipos celulares del organismo, pero que no puede
autorenovarse, ya que su división da lugar a dos
células diferentes a ella.

Los productos de las primeras divisiones del

cigoto son igualmente células totipotentes: las
ocho primeras células formadas en el desarrollo
embrionario del ratón tienen capacidad para
generar, cada una de ellas, un ratón completo si
son separadas de forma natural (gemelos
monocigóticos) o artificial.

A partir de 16 células el embrión las comunica todas con uniones comunicantes y las
periféricas se enlazan por uniones oclusivas: Mórula.

En etapas primitivas las células se diferencian según sus posiciones en la mórula ya que
influyen sustancias difusibles = morfógenos, que producen distinta respuesta según la
concentración que les llega (ocurre en las trompas de Falopio)

Los valores posicionales de las células embrionarias crean las bases para la aparición de
fenómenos inductivos.

Una vez que la mórula desarrolla una cavidad interna, el embrión ha logrado un nuevo hito del
desarrollo, un blastocisto, que consta de:

• macizo celular interno: da lugar al

embrión (células madre embrionarias)
• trofoblasto:
o ectodermo
o mesodermo
o endodermo

Las células que recubren el perímetro del embrión, denominadas células trofoblásticas,
ayudarán a formar la placenta. Estas células aportan agua, minerales y aminoácidos desde el
entorno fuera del embrión, rico en nutrientes, al interior de la cavidad del blastocisto donde
pueden llegar a las células de la masa celular interna.

193
Grupos de células se ubican en diferentes emplazamientos corporales. En un embrión
trilaminar unas células influyen sobre las vecinas. Ej. Dorsalina, neurogenina. El plan corporal
se establece muy pronto en los embriones. Al comienzo del mesodermo: los ejes cefalocaudal,
dorsoventral, mediolateral.

Actualmente se les da
gran importancia a las
uniones entre las
células. Con ello la
célula tiene
información de dónde
están el resto de las
células y cuantas más
uniones tenga on el
resto, más se va
especializando y se va
polarizando cada vez
más (uniones laterales, zonas apicales
que se quedan sin unirse, etc).

Se cree que las células huevo reparten

asimétricamente moléculas =
determinantes citoplasmáticos. Los
oocitos acumulan sustancias para ser
usadas en el desarrollo incipiente del
nuevo individuo.

El embrión plano pasa a cuerpo cilíndrico. Se forma el tubo neural y comienza la

metamerización. Comienzan los esbozos de los diferentes tejidos de todos los órganos
corporales. El primer sistema que aparece es el cardiocirculatorio (para que lleguen hormonas
a todas las células). Tras las inducciones por morfógenos siguen las causadas por hormonas
(entre tejidos distantes).

194
3. Estirpes o linajes celulares
Las células primero adquieren el compromiso de cambiar = determinación. Después de un
periodo de latencia lo hacen = se diferencian.

Cuanto menos diferenciada está una célula

mayor es su potencialidad evolutiva.

Cuando una célula alcanza su grado máximo de

diferenciación, su potencialidad desaparece.
Las células adultas del organismo son el
producto de una línea ininterrumpida de
divisiones celulares que las relaciona
directamente con el cigoto a través de una
serie de células que son sus "antepasadas" y
que constituyen su estirpe celular. Lo controlan
factores intrínsecos y extrínsecos (señales
célula‐célula y ambiente).

Ejemplo de determinación y
diferenciación celular: Miogénesis.

De epitelio tiene que pasar a célula

muscular y le van llegando factores
de diferenciación hasta llegar a la
formación de la célula muscular
madura. Por medio de esto se va a ir
regulando la lectura de los genes de
las diferentes estirpes.

Las células producidas a partir de células

madre pueden ser muy diferentes a la
célula madre. La célula madre va
perdiendo potencial de dividirse y se va
especializando.

195
Hay células que se desdiferencian y se multiplican pero siempre lo hacen en el sentido de su
linaje celular (no en el de otro). Los estadios de diferenciación se mantienen estables. No
cambian ni artificialmente (memoria celular). La memoria celular la heredan las células hijas.
Esto es muy conocido en el caso de los linfocitos del SI pero esto se mantiene en células de
otros tejidos.

El establecimiento de un plan corporal es el resultado de decisiones escalonadas tomadas por

una serie de genes:

• De la polaridad de la célula huevo

• Segmentarios
• Homeóticos
• Rectores (los que participan en la formación del plan corporal)

Muchos linajes celulares tienen

células intermedias (progenitoras o
precursoras, tienen factores de
transcripción específicos).

La presencia en el entorno de las células precursoras de factores de crecimiento hace que

éstas sigan procesos de división asimétrica, dando lugar a células más diferenciadas que sus
progenitoras. El proceso puede ser complejo, incluyendo la intervención de diferentes
combinaciones de estas sustancias que dan lugar a la aparición de diferentes tipos celulares
para cada combinación de factores. Un ejemplo típico es la hematopoyesis.

196
En las células no totipotentes no se
expresa la telomerasa, por lo que los
telómeros van reduciendo su tamaño.
Cuando alcanzan un tamaño crítico
(unos 4‐6 Kb frente a una longitud
normal de 10‐15 Kb) la célula deja de
replicarse y adquiere características
morfológicas y fisiológicas diferentes.
Ha alcanzado el periodo de
senescencia.

La senescencia celular se refiere a la respuesta de las células, mitóticamente competentes

(células no diferenciadas terminalmente y que por lo tanto tienen la capacidad de dividirse)
frente a estímulos que
tienen la
potencialidad de
causar
transformaciones
neoplásicas y está
dada, entre otros
aspectos, en una
parada de su crecimiento.

4.2 Fenotipo de la célula senescente

La célula senescente se caracteriza por:

• Aumento del tamaño de la célula, algunas veces hasta el doble del tamaño original
• Aumento del producto de cambios en el compartimento lisosomal, que aumenta de
tamaño lo que incrementa los niveles enzimáticos (β‐galactosidasa)
• Expresión de inhibidores quinasas ciclin‐dependientes (Cdki) son caoaces de activar
procesos de senescencia sin activar la respuesta de daño genético común al proceso
• El DNA de las células senescentes también presenta alteraciones en la cromatina, esto
hace que refuercen la
senescencia

En G0 el sistema de control del

ciclo se encuentra en gran
medida desmantelado, por
desaparición de muchas Cdk y
ciclinas.

198
4.3 Modos de llegar a la senescencia
Los principales modos de llegar a
la senescencia son:

• erosión de los telómeros

(replicativa)
• por ambiente
desfavorable
• por daños en la
cromatina
• inducida por oncogenes
• prematura (inducida por
estrés oxidativo,
radiaciones…)

I. Senescencia inducida por oncogenes

La activación de oncogenes (RAS y MYC) es un
reto para las vías de control de errores.
Señalizado un crecimiento inadecuado, la
maquinaria de los puntos de control puede en
última instancia forzar a la célula a salir del
ciclo celular via inhibidor CDK4 INK4A y el
inhibidor de MDM2 ARF. Por ejemplo, la
activación del oncogén RAS lleva a la
activación de la traducción de INK4A, que
bloquea la hiperfosforilación (P) de RB
mediada por ciclina D‐CDK4 y provoca la
senescencia celular. La activación constitutiva
de MYC alternativamente induce a ARF, que
bloquea la actividad del inhibidor de p53, MDM2 y por tanto activa p53. Los mecanismos que
determinan si se va a activar las vías apoptóticas o las de senescencia se conocen muy poco. La
observación de que la inducción primaria de p53 por medio de MYC provica apoptosis puede
ser debida a la represión de los potenciales mecanismos de control de fallos. Por ejemplo, MYC
se ha visto que aumenta proporcionalmente su acitivdad CDK4. La señalización por RAS puede
influir también en la vía ARF‐p53, que
promueve la apoptosis así como refuerza la
senescencia celular.

La tumorigénesis descansa en el fallo de

esos mecanismos de control de fallos.

Potencial de la senescencia celular para ser

utilizado como diana para la terapia contra
el cáncer.

199
Damage to cells within tissues can result in several
outcomes. Of course, the damage may be
completely repaired, restoring the cell and tissue to
its pre‐damaged state. Excessive or irreparable
damage, however, can cause cell death (apoptosis),
senescence or an oncogenic mutation. The division
of a neighbouring cell, or a stem or progenitor cell,
usually replaces apoptotic cells. Cell division,
however, increases the risk of fixing DNA damage
as an oncogenic mutation, leaving the tissue with
pre‐malignant or potentially malignant cells. Senescent cells, by contrast, may not be readily
replaced; in any case, their number can increase with age. Senescent cells secrete various
factors that can alter or inhibit the ability of neighbouring cells to function, resulting in
dysfunctional cells. They can also stimulate the proliferation and malignant progression of
nearby premalignant cells. Therefore, an accumulation of senescent cells can both compromise
normal tissue function and facilitate cancer progression.

II. La senescencia en el desarrollo embrionario

En contra de lo que se pensaba hasta ahora la senescencia celular es un proceso crucial en el
desarrollo del embrión.

SINC ‐ 14 noviembre 2013: Los autores han descrito por primera vez que este estado no está
relacionado exclusivamente con la proliferación de tumores o el estrés.

La senescencia es un estado en que las células limitan su proliferación en respuesta al estrés.

Este estado celular se ha asociado históricamente a envejecimiento y a diversas patologías.

“Nuestro trabajo demuestra que en el embrión, las células senescentes son necesarias y,
mediante su habitual función secretora, dirigen el crecimiento y el patrón de los tejidos”.
Controla el desarrollo de las extremidades y del sistema nervioso.

"La senescencia se ocupa de apagar las células que ya no son necesarias, una especie de
proceso de reciclaje”

El envejecimiento es en última instancia un fenómeno de los organismos intactos, sin

embargo, es el resultado de reacciones bioquímicas, respuestas celulares y acciones de genes
que pueden tener diferentes efectos en diferentes tejidos de organismos multicelulares.

La abundancia de células senescentes en los tejidos de mamíferos es un signo de

envejecimiento.

200
 TEMA 10: LAS CÉLULAS MADRE
Las células son elementos estructurales ¿qué hace posible que se constituyan en organismos?

Las células se organizan en tejidos y éstos en órganos

¿Cómo se forma un organismo multicelular a partir de un óvulo? Desarrollo: Una célula huevo
se divide muchas veces hasta dar lugar a un organismo con 1014 células, todas con el mismo
genoma pero especializadas de diferente manera:

Cada tipo celular: expresa grupos diferentes de genes se organiza en forma de precisos
patrones tridimensionales

Un organismo puede ser muy complejo, pero se forma por un repertorio limitado de
actividades celulares.

Las células:
1. Se diferencian mediante la activación o inactivación de la producción de grupos
concretos de proteínas
2. Producen señales que influyen en las células vecinas
3. Responden a señales enviadas por las células que la rodean
4. Recuerdan los efectos de las señales recibidas con anterioridad
5. Se especializan de acuerdo con las características que adoptan
El desafío es entender la secuencia completa de eventos entrelazados que ocurren para el
desarrollo de un organismo.
Las mismas actividades básicas que se combinan y crean un organismo durante su desarrollo
continúan en funcionamiento en un individuo adulto.
En un adulto se producen constantemente nuevas células de acuerdo a unos patrones precisos
y controlados.
Los tejidos son combinaciones organizadas de muchos tipos celulares que deben mantener
sus diferencias, aún a pesar de vivir en el mismo ambiente.
Todos tienen en común la necesidad de:
• resistencia mecánica (la da el conectivo)
• aporte de nutrientes (la da la sangre)
• control nervioso (inervación)
• defensa (células móviles del sistema inmunitario)
Esto lo pueden conseguir durante el desarrollo gracias a células que se forman fuera de esos
tejidos y los invaden, o de forma continua durante toda la vida.
Además, las células mueren y se renuevan de forma permanente.
El tejido ha de mantenerse siempre bien aun a pesar de la reposición de sus células. Factores
principales que contribuyen a la estabilidad estructural de los tejidos:
1. Comunicación celular: cada célula controla su entorno, interpreta las señales, se
adapta a ellas. Ello hace que se formen células nuevas sólo cuando son necesarias. Ej:
Células de la médula ósea se siguen dividiendo mientras haya hueco.
2. Adhesión intercelular selectiva: mediante uniones homófilas (entre células iguales), o
con la matríz o con ciertos tipos de células. La unión selectiva impide la combinación
caótica de las células de un tejido.
3. Memoria celular: los patrones de expresión de genes del desarrollo embrionario se
mantienen durante toda la vida (esto preserva la diversidad de los tipos celulares).

201
Los diferentes tejidos se renuevan a distinta velocidad centro del mismo órgano algunas veces.
Existen mecanismos de control que mantienen el equilibrio entre la producción y la pérdida
celular (a nivel tisular también).

1. Definiciones
Las células de un organismo (también las de un tejido) se pueden clasificar en tres tipos:
• Las células madre son totipotentes son capaces de autorrenovarse indefinidamente y
de dar lugar a la formación de células de diferentes tipos si reciben los estímulos
adecuados.
• Las células precursoras (o proliferativas), tienen carácter pluripotente. Pueden dar
lugar a otras similares a ellas mismas, pero esta capacidad de renovación es solo
temporal. También son capaces de dar lugar a algunos tipos celulares diferentes a ellas
mismas, aunque solo a unas cuantas estirpes distintas. Ej: células precursoras de cada
tejido concreto.
• Las células diferenciadas solo pueden dividirse un número limitado de veces y son
unipotentes, porque solo dan lugar a un tipo celular, a células de la misma estirpe
celular.
Las células madre producen un aporte continuo de células de diferenciación terminal.
Una célula madre de un tejido puede dar lugar a varios tipos de células diferenciadas
Cuando una célula madre se divide puede:
• quedar como célula madre (si están en los tejidos están especializadas)
• ingresar en una vía que la llevará a la diferenciación
Normalmente cada vez que una célula madre se divide da lugar a célula madre y célula de otro
tipo ya que si no nos quedaríamos sin células madres.

2. Tipos de células madres

Las células adultas del organismo son el resultado de una serie ininterrumpida de divisiones
celulares que las relaciona directamente con el cigoto a través de una serie de células que son
sus "antepasadas" y que constituyen su estirpe celular.
El cigoto es una célula particular (por su ciclo vital). Es una célula totipotente (da lugar a todos
los tipos celulares del organismo) que no puede autorenovarse, ya que su división da lugar a
dos células diferentes a ella.

202
3. Células madre embrionarias
Los productos de las primeras divisiones del cigoto son igualmente células totipotentes: las
ocho primeras células formadas en el desarrollo embrionario tienen capacidad para generar,
cada una de ellas, un organismo completo si son separadas de forma natural (gemelos
monocigóticos) o artificial. Este tipo de células reciben el nombre de células madre
embrionarias (embryonic stem cells, ESC).
Se caracterizan por mantener permanentemente su capacidad de autorenovación (mediante
divisiones celulares simétricas) y por poder originar todos los tipos celulares del organismo, en
presencia de los factores de crecimiento y diferenciación adecuados.
Cuando el embrión de ratón sufre una división más (en el estadio de 16 células), se pierde esa
totipotencia absoluta, de modo que la separación de los elementos ya no permite generar
embriones completos. Se habla entonces de células madres de potencial restringido.
Las células madre embrionarias se obtienen de un embrión humano de cuatro o cinco días de
edad, es decir en la fase de su desarrollo llamada blastocisto. Los embriones generalmente se
crean mediante fertilización in vitro (varios óvulos son fertilizados).

Células madre fetales: Son células de tipo

primitivo que se encuentran en los órganos
de los fetos. La clasificación de las células
madre fetales no está clara.

Al poder convertirse en cualquier tipo de célula son apropiadas para

la terapia genética, así como la ingeniería de tejidos para trasplantes
y la sustitución de las células enfermas.
El valor terapéutico de las células madre totipotentes puede ser
enorme. La aplicación más importante de las células madre
embrionarias es la medicina regenerativa, la posibilidad de la
autorregeneración de tejidos y órganos lesionados.
Al aprender sobre el proceso de división, podemos averiguar lo que
funciona mal en los estados de una enfermedad y luego investigar
las formas de prevenir la producción de células enfermas y su
división.

203
Clonación terapeútica: El paciente necesita células madre, se coge
células de su cuerpo (normalmente piel), se toma el núcleo y se le pone
a un oocito. El núcleo aporta el DNA y el oocito divide, por lo que se
obtiene un blastocito con la misma carga genética que el paciente del
que se toman células madre.

Hay algunas células más sensibles que no pueden crecer bien in vitro por lo que primero se
cultivan fibroblastos para que produzcan las sustancias que necesitan estas en el medio.

204
Células madre de potencial restringido: pluripotentes inducidas (induced pluripotent stem cells,
iPS). Se pueden usar para:
• obtener grandes cantidades de algún tipo celular
• probar fármacos
• estudiar genomas de pacientes con enfermedad genética y
• estudiar la enfermedad
• probar fármacos

4. Células madre adultas

Generan células sanas y viables para fines de trasplante.
Un caso de éxito son los trasplantes de piel.
Al paciente se le toman células y por medio de virus se le
introducen genes que les proporcionen más potencial de
división. Inconvenientes: los virus pueden hacer cosas
que nosotros no queramos.
Inconvenientes actuales: lento crecimiento de las
células a pesar de que podemos obtener bastante
número de ellas.
Actualmente tienen más aplicación las células madre de
adultos.

205
Los tejidos donde primero se vio que había células madres son:
• intestino (base del epitelio intestinal). Estas células del epitelio las podemos distinguir
siguiendo las mitosis y dan lugar a diferentes tipos celulares (células caliciformes,
enterocitos, etc.) por lo que es pluripotente.
• epidermis (en el estrato basal).

Hematopoyesis: Fue el primer caso en el

que se dieron cuenta de que a partir de
un tipo de célula madre (células madre
hematopoyéticas) que dan lugar a las
células de la sangre que son muy
diferente.

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La investigación en células madre adultas comenzó hace unos 60 años. Los investigadores
descubrieron que la médula ósea contenía al menos dos tipos de células madre: las llamadas
células madre hematopoyéticas, que dan lugar a todos los tipos de células sanguíneas del
cuerpo y las células madre mesenquimales, que fueron descubiertas unos años más tarde.
Estas células madre no hematopoyéticas constituyen una pequeña proporción de la población
de células del estroma de la médula ósea y pueden generar hueso, cartílago y grasa. Son las
células que apoyan la formación de sangre y tejido conectivo fibroso.
En la década de 1960, en 2 regiones del cerebro de ratas se vio que habían células en división
que daban lugar a células nerviosas. No fue hasta la década de 1990 cuando los científicos
coincidieron en que el cerebro adulto contiene células madre que son capaces de generar los
tres principales tipos de células del cerebro: astrocitos, oligodendrocitos y neuronas (que son
células madre pluripotentes del cerebro).

¿Qué pruebas se utilizan para la identificación de las células madre adultas?

• Identificar a las células en un tejido vivo con marcadores moleculares y luego
determinar los tipos de células especializadas que generan.
• Eliminar las células de un animal vivo, etiquetarlos en el cultivo celular, y trasplantarlas
de nuevo en otro animal para determinar si las células reemplazan su tejido de origen.
Es importante destacar que se debe demostrar que una sola célula madre adulta puede
generar una línea de células genéticamente idénticas, que luego da lugar a todos los tipos
adecuados de células diferenciadas del tejido. Para confirmar experimentalmente que una
célula madre adulta es de hecho un supuesto de células madre, los científicos tienden a tratar
de demostrar o bien que la célula puede dar lugar a que estas células sean genéticamente
idénticas o que una población purificada de estas células madre pueden repoblar candidatos o
reformar el tejido después del trasplante en un animal.
Han sido identificadas en muchos órganos y tejidos: cerebro, médula ósea, sangre, vasos
sanguíneos, músculo esquelético, piel, dientes, corazón, intestino, hígado, ovarios y testículos.
En muchos tejidos, la evidencia actual sugiere que algunos tipos de células madre son los
pericitos (células que hay junto con las células endoteliales en los capilares y que se encargan
de regular el diámetro de la luz capilar).
Se cree que residen en una zona específica de cada tejido (llamado un nicho de células
madre). El nicho de células madre son zonas con un microambiente adecuado para las células
madre.
Las células madre pueden permanecer en reposo (no se dividen) durante largos períodos de
tiempo hasta que se activan por una necesidad normal de más células para mantener los
tejidos, o por una enfermedad o lesión de los tejidos.
Típicamente, hay un número muy pequeño de células madre en cada tejido, y una vez
eliminado del cuerpo, su capacidad para dividir es limitado, por lo que la generación de
grandes cantidades de células madre es difícil. Se trabaja para obtener grandes cantidades de
células madre adultas en cultivo y manipularlas para generar tipos específicos de células para
que puedan ser utilizados para tratar la lesiones o enfermedades. Ejemplos de tratamientos
potenciales: regeneración ósea, células productoras de insulina para la diabetes tipo 1,
reparación del miocardio.
La investigación sobre células madre adultas ha generado una gran expectación. Los científicos
han encontrado células madre adultas en muchos tejidos más de lo que alguna vez pensaron
posible.

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Origen de los diferentes tipos de células madre disponibles.

5. Obtención de células madre en humanos adultos

Existen tres métodos de obtención:
• Aspiración: se recolectan células madre hematopoyéticas de la médula ósea roja. Se
logra a través de la perforación del hueso, y luego se inserta una aguja que absorbe
una cantidad promedio de entre 70-80 ml de médula.
• Aféresis: proceso de recolección de células madre a partir de sangre, que es separada
por centrifugación en sus distintos componentes según su densidad en un lapso de
tiempo de entre 45-60 minutos. El componente elegido es recogido progresivamente
en una bolsa y las células restantes se devuelven al donante.
• Recolección de sangre del cordón umbilical: Después de nacer el bebé, se punza la
vena del cordón umbilical y se puede recolectar unos 25ml de sangre muy rica en
células madre.

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Otros tipos: Células madre amnióticas. Las células madre multipotenciales también se
encuentran en el líquido amniótico. Estas células madre amnióticas son muy activas. Pueden
diferenciarse en células de la línea adipogénica, osteogénica, miogénica, endotelial hepática, y
también las líneas neuronales.
Una vez recogidas se almacenan a -196 °C. Suele usarse nitrógeno líquido (así las células
bloquean todas sus funciones temporalmente para poder conservarlas durante años). Luego se
pueden descongelar y lograr que sean viables.
Resumen de la obtención de células madre.

Controlamos mejor las células madre de los adultos o reprogramadas por nosotros.

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6. Aplicaciones de las células madre
Uso de las células madres del cordón umbilical en la medicina contemporánea
• Regeneración de tejidos
• Regeneración del cartílago que forma el disco intervertebral
• Regeneración y creación de órganos sencillos
• Reconstrucción de vasos sanguíneos
• Creación y regeneración de células sanguíneas
• Combatir la arterosclerosis
• Evitar la osteoporosis
• Regeneración de médula (no se obtiene aun grandes resultados)
Los científicos se han propuesto que con estas células se podría:
• Curar la diabetes mellitus tipo 1 y 2
• Curar la leucemia
• Evitar el alzhéimer
• Prevenir o tratar el síndrome de Down
• Curar la miopía
• Sanar las partes afectadas tras un infarto al miocardio
• Reponer malformaciones congénitas leves
• Regeneración de cualquier tejido u órgano
• Regeneración de células nerviosas (aún falta mucho de investigar debido a su falta de
división mitótica)
• Creación de cartílagos y médula por completo
• Tratar enfermedades congénitas

Regeneración a partir de las células madre:

Desde 1998, se han introducido células madre
en zonas del cuerpo que han sido afectadas por
el medio externo, como en el caso de pacientes
con quemaduras.

Construcción de una Neo‐Vejiga. Hay múltiples enfermedades que pueden estar afectando a
diferentes órganos, como por ejemplo el cáncer de
vejiga.
Se extrajeron células madres localizadas en las
paredes internas y externas de la vejiga de un perro
(sólo de la mitad de la vejiga sana ya que la otra mitad
estaba con cáncer.) Cultivaron durante 7 días células
madre de la vejiga de aquel perro, que fueron

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colocadas en un tejido de poliéster con forma de vejiga, la cual nutrió a estas células como se
observa en la imagen.
Se fue creando una capa celular sobre el poliéster, al inicio no muy estable. Los científicos
esperaron unos días más hasta que fue más firme e intervinieron al perro. La vejiga cancerosa
fue reemplazada por la creada. La cirugía fue un éxito, la neo-vejiga funcionaba
perfectamente, después de 3 meses los polímeros habían desaparecido y la neo-vejiga
constaba de vasos sanguíneos y algunas inervaciones.
Los tratamientos con células madre adultas se han utilizado con éxito durante muchos años
para tratar la leucemia y enfermedades relacionadas con los huesos. Las células madre adultas
también se utilizan en la medicina veterinaria para el tratamiento de lesiones de tendones y
ligamentos.

7. Problemas de las células madre

Los mayores problemas de la utilización de las células madre son:
• Diferenciación en el tiempo y en el espacio
• Inducción de la expresión
génica para la
diferenciación tisular
específica
• Anidación de esas células
en el objetivo tisular “diana
Ej: con Dolly les pasó que
obtuvieron un clon que se murió de
vieja prematuramente porque
venía de un animal viejo (tiempo).
En un tejido de un organismo vivo
no podemos poner un armazón de
biopolímeros que haga que las
células madre crezcan con una
determinada forma.

8. Las células madre en los vegetales

Una de las principales diferencias entre animales y plantas reside en los procesos de formación
de órganos. Al contrario que en los animales, la organogénesis vegetal constituye un proceso
postembrionario que se prolonga durante toda la vida.
El crecimiento y desarrollo de una
planta se deben a la actividad de los
meristemos, grupos de células desde
los que se organiza la generación de
los diferentes tejidos. Los meristemos
poseen células análogas a las células
madre animales.
El equilibrio en los nichos de células
madre vegetales depende de una
serie de bucles génicos que se
autorregulan. Estos pueden originar
un crecimiento continuo, como
ocurre con las hojas, u otro que
acaba con la formación del órgano,
como la flor.

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Las células madre de animales y plantas parecen utilizar estrategias semejantes para resolver
problemas biológicos similares. Sin embargo, la evolución parece haber hallado diferentes
mecanismos moleculares para regular su funcionamiento.

La medusa Turritopsis nutricula es inmortal: Es la única forma de vida conocida que ha

desarrollado la habilidad de volver a un estado de pólipo, por un proceso de transformación
específico que requiere la presencia de ciertos tipos de células.
Toda la vida depende de un equilibrio relativamente sensible desarrollado durante la
evolución como resultado de la suma de las actividades de un conjunto de células.

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