Química Biológica

Trabajo Práctico 6

Cromatografía en columna
Tamiz molecular

Balbuena, Juan Manuel

Watanabe, Bernardo
- Grupo 4 -

Segundo Cuatrimestre 2008

Facultad de Ciencias
Exactas y Naturales
Universidad de Buenos Aires
 Balbuena, J. M.; Watanabe, B.

Objetivos
Objetivos

Comprender la técnica de cromatografía de tamiz molecular y utilizarla con el

fin de desalar la fracción precipitada durante la purificación de la enzima ALA-D.

Calibrar una columna de Sephadex G-25 y graficar perfiles de elución

aproximados.

Introducción

La cromatografía es una técnica que permite la separación de moléculas diferentes

presentes en una misma muestra. El método está basado en la circulación de una fase
móvil (que arrastra a la mezcla de compuestos a separar), a través de una fase estacionaria.
Dependiendo de la afinidad relativa que por ambas fases tengan los distintos compuestos
presentes en la mezcla resultará su separación.
La cromatografía de exclusión molecular (a menudo también llamada filtración en gel o
de tamiz molecular
molecular)
ar es una de las técnicas más sencillas de las empleadas en la separación
de proteínas y ácidos nucleicos. Este tipo de cromatografía se realiza en columnas
cilíndricas rellenas con algunos de los geles que se fabrican con este fín y que pueden ser de
varios tipos: dextranos con enlaces cruzados (sephadex), agarosa (sepharose, Bio-gel A),
poliacrilamida (Bio-gel B), etc. Todos estos geles (fase estacionaria) se hallan constituidos
por gránulos (partículas) de un material esponjoso hidratado, que contiene poros con un
tamaño de diámetro determinado.
Cuando se hace pasar una mezcla de moléculas de distinto tamaño, a través de una
columna de filtración en gel; aquellas moléculas con un tamaño mayor que el diámetro de
los poros de las partículas, sólo podrán moverse en su camino, a través de la fase
estacionaria, en el espacio que queda entre las partículas; y por lo tanto, no se verán
retrasadas en su descenso. En cambio aquellas moléculas capaces de penetrar en las
partículas se verán retrasadas por la fase estacionaria; en mayor medida, cuanto menor sea
su tamaño. Por lo tanto, las moléculas eluyen en este tipo de cromatografía por orden
decreciente de tamaño molecular.

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Figura 1. Esquema del mecanismo de la cromatografía de tamiz molecular.

Las mallas del gel permiten la entrada selectiva de las partículas de menor masa
molecular. De ahí que las partículas de mayor peso molecular salgan primero.

Figura 2. Croquis amplificado de la malla de gel de la columna.

Se denomina Vt (volumen total) al volumen que ocupa la columna. Vt se puede escribir

como la suma de 3 contribuciones: Vt = Vo + Vg + Vi. Vo es el volumen muerto, es el
volumen de fase móvil necesario para que eluyan todas las moléculas de tamaño mayor al
de las partículas del gel. Vg es el volumen de la matriz del gel. Vi es el volumen interno, es el
volumen ocupado por las partículas del gel. A continuación se presenta una figura en la que
se representan Vo y Vt

Vt Vt-Vo Vo
Figura 3. Representación grafica de Vo, Vt-Vo y Vt.

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Estos volúmenes son parámetros de la columna de gel y por lo tanto deben ser
conocidos para una correcta utilización de la técnica. Para ello, se calibra la columna de la
siguiente manera:

a) Determinación de Vo. Se hace pasar por la columna un compuesto de alto peso

molecular, que exceda el tamaño de las partículas del gel y se determina el volumen de
elución para el cual se observa la máxima concentración del compuesto, que será igual a
Vo. En este trabajo se empleó a tal fin Blue-dextran (azul).
b) Determinación de Vt. Se hace pasar por la columna una sustancia cuyo tamaño sea
tal que quede retenida dentro de las partículas del gel y se determina el volumen de elución
para el cual se observa la máxima concentración del compuesto, que será igual a Vt. En este
trabajo se empleó a tal fin CoCl2 (rosado).

APLICACIONES
A) Cambios de buffers. Después de cromatografías de intercambio iónico, afinidad o de
interacción hidrofóbica.
B) Desalado. Proteínas, polisacáridos, polipéptidos etc. Pueden ser desalados antes de
ser concentrados o liofilizados.
C) Eliminación de fenol de las preparaciones de ácidos nucléicos.
D) Eliminación de compuestos de bajo peso molecular marcados. I125, FITC de las
soluciones de marcaje de proteínas.
E) Para reacciones entre macromoléculas y reactivos de bajo peso molecular.
F) Eliminación de productos, cofactores, inhibidores, etc. De las enzimas.
G) Purificación de macromoléculas.
H) Determinación del peso molecular de las proteínas.

Desarrollo experimental y Resultados

Resultados

Reactivos

Blue-Dextran
Solución buffer fosfato de sodio 50 mM
Solución de cloruro de cobalto (II) CoCl2
Solución de cloruro de bario BaCl
Reactivo de Bradford

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Materiales

Columna de cromatografía
Caja de cristalización
Material común de laboratorio

Procedimiento
Determinación de parámetros de la columna

La fase estacionaria empleada en este trabajo es Sephadex G-25, y su rango de

separación es de 5000 a 70000 Da, es decir que las sustancias de peso molecular menor a
5000 Da eluyen a V = Vt y las sustancias de peso molecular mayor a 70000 Da eluyen a V =
Vo. Las sustancias de peso intermedio se separan de acuerdo a sus distintos tamaños.
Las dimensiones de la columna:
altura: (16.8 ± 0.2) cm
diámetro: (0.8 ± 0.2) cm
volumen: (8 ± 4) cm3
Para calibrar la columna de Sephadex G-25 a utilizar se corrió una mezcla de Blue-
Dextran y CoCl2. Estas dos sustancias son coloreadas, lo que permitió detectar visualmente
los parámetros Vo y Vt. A continuación se presenta el perfil de elución aproximado.

0,6
Intensidad del color unidades arbitratias

0,4

0,2

0,0

0 2 4 6 8
volumen de eluyente (ml)

Figura 4. Calibración de la columna. Perfil de Elución de la mezcla Blue-Dextran-CoCl2. El primer pico

se observa a V = 2.9 mL, mientras que el segundo se obtiene a V = 5.4 mL.

A partir del perfil de elución obtenido pueden determinarse los parámetros Vt = 5.4 mL
y Vo = 2.9 mL.

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Desalado de la fracción precipitada con sulfato de amonio, (NH4)2SO4

Una vez calibrada la columna, se procedió al desalado de la enzima ALA-D purificada.

Se trabajó de manera similar al caso anterior, al confeccionar el perfil de elución se utilizó el
método de Bradford para identificar la proteína en las fracciones recolectadas, mientras que
el anión sulfato se identificó utilizando BaCl2: en aquellas fracciones en las que había SO42-
se formaba un precipitado blanco de BaSO4.
A continuación se presenta el perfil de elución aproximado.

0,6
Intensidad del color unidades arbitratias

0,4

0,2

0,0

0 2 4
volumen de eluyente (ml)

Figura 5. Perfil de elución de la mezcla ALA-D – (NH4)2SO4. El pico corresponde a las fracciones que
dieron positivo con el método de Bradford, mientras que se omitió el pico de la sal ya que este dio
positivo en todas las fracciones.

Volumen de elución de ALA-D = 2.9 mL.

Discusión y conclusiones

En la primera parte del trabajo se logró establecer los parámetros de la columna

utilizada. Experimentalmente se observó que las manchas correspondientes a los
indicadores difundían mucho a lo largo de la columna. En los gráficos, esto se refleja en el
ancho de banda de cada señal. Este aspecto puede ser mejorado hallando una óptima
configuración de corrida (desde naturaleza del gel y del buffer hasta el alto y diámetro de la
columna).
Cabe destacar que el Vt hallado difiere del calculado a partir de las dimensiones de la
columna. A pesar de que el valor calculado contiene en su intervalo al determinado con el
CoCl2, el método geométrico se descarta en primer lugar por ser poco preciso y por suponer
que la columna es homogénea a lo largo.
En la segunda parte obtuvimos el volumen de elución de la enzima. El mismo se hallaba
entre Vo y Vt hallados anteriormente. Por lo que se infiere que ALA-D presenta un PM entre
5 y 70 kDa.

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La guía indica utilizar BaCl2 para detectar los sulfatos del (NH4)2SO4 como BaSO4,
precipitado blanco. En la práctica, esto no fue posible dado que todas las fracciones
colectadas presentaban una turbidez blanca con el agregado de BaCl2. Frente a este hecho,
se probó agregar bario a la solución buffer. Esta solución también formó el precipitado por lo
que se dedujo que los fosfatos (y/o sus ácidos conjugados) forman un compuesto blanco e
insoluble.
La separación de ALA-D y (NH4)2SO4 no pudo ser observada. Sin embargo, los resultados
para Blue-Dextran y CoCl2 indicarían que el proceso fue posible y que la fracción obtenida ha
sido purificada de la sal empleada durante la precipitación.

Bibliografía

Guía de trabajos prácticos de la materia.

http://webpages.ull.es/users/bioquibi/practicas/6.pdf

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