TRANSFORMACIÓN GENÉTICA DE ALFALFA POR BOMBARDEO CON

MICROPROYECTILES.
Julio Ciancio; Raúl D. Rios; Andrea Ferri*; Cristina Gómez;Fernando Ardila; Pascual Franzone.
Instituto de Genética “Ewald A. Favret” (IGEAF), CICVyA, CNIA, INTA, Castelar, Argentina. *Universidad Nacional de Luján, Argentina.
E-mail: rrios@cnia.inta.gov.ar

Introducción Resultados

La transformación genética de alfalfa (Medicago sativa L.) vía Agrobacterium tumefaciens es un
procedimiento experimental bien establecido. Por el contrario, existen escasos antecedentes en la
obtención de plantas transgénicas de esta especie mediante bombardeo con microproyectiles (Pereira
y Erickson, 1995). La puesta a punto de esta metodolog ía en alfalfa es de interés ya que la misma tiene
la ventaja de no requerir vectores de transformaci ón complejos, aspecto relevante en investigaciones
en las cuales se trabaja con varias construcciones g énicas diferentes.
Se bombardearon 1852 embriones som áticos con el plásmido pHP 23 de los que se obtuvieron 52 plantas.
Estas plantas derivaron de los 3 genotipos de alfalfa utilizados en el proyecto y corresponden a, por lo
menos, 20 eventos de transformaci ón independientes. La presencia del transgen npt II fue detectada en 38
de las 39 plantas analizadas (Figura 2). Además, se analiz ó por PCR la progenie, obtenida por
autofecundación, de 2 plantas transgénicas, observándose segregación mendeliana del transgen npt II
(Tabla 1).
Estos experimentos demuestran la factibilidad de obtener, con una eficiencia razonable, plantas
transgénicas de alfalfa por bombardeo con microproyectiles.

Objetivo Figura 2. Análisis por PCR de plantas transgénicas utilizando primers específicos para el gen npt II

Obtención de plantas transgénicas de alfalfa mediante bombardeo con microproyectiles . 343 pb

std
plantas plantas transgénicas plantas transgénicas

m
Materiales y Métodos madres

i
Tabla 1. Análisis estadístico de la segregación del transgen en la progenie autofecunda de 2 plantas
Como blanco de bombardeo se utilizaron embriones som áticos al estado torpedo, del clon C2-4,

x
transgénicas
provisto por el Dr. McKersie (Universidad de Guelph, Canadá) y 2 clones obtenidos en el IGEAF.
Todos los clones mencionados tienen buen comportamiento in vitro, es decir alto porcentaje de
regeneración y una gran multiplicidad (número de embriones som áticos por callo).
Los experimentos de transformaci ón se realizaron utilizando un acelerador de microproyectiles de tipo número
Particle Inflow Gun . Para experimentos de expresi ón transitoria se utiliz ó un plásmido portador del gen de plantas
plantas PCR para npt II segregación P
χ2
marcador visualizable gus A (Figura 1). Para la obtención de plantas transgénicas se utiliz ó el
plásmido pHP 23 portador del gen seleccionable en planta npt II que confiere resistencia a kanamicina. de la
Las condiciones del bombardeo fueron las descriptas por Maíz y col. (1995). Las partículas se progenie positivas negativas 1gl
prepararon según Spangenberg y col. (1995). El material bombardeado fué transferido para inducción
de callos a medio SHK (Shetty y McKersie, 1993) con 2 mg/l de 2,4-D, 0,2 mg/l de kinetina, 25 mg/l de T706 42 39 3 15:1 0.06 0,75
kanamicina. Los cultivos se incubaron a 25°C, con 16 horas de fotoperíodo y fueron repicados a
intervalos de 1 semana durante 60 días. Para obtener embriones som áticos, los callos se transfirieron T725 38 30 8 3:1 0.32 0,5
a medio Boi2Y (Bingham y col., 1975) sin hormonas y con kanamicina. Los embriones somáticos
formados se transfierieron al medio MS a mitad de concentraci ón salina con 20 g/l de sacarosa, donde
se desarrolla ron plantas.
Las plantas obtenidas de los experimentos de transformaci ón fueron analizadas por PCR. Para ello se Perspectiva
utilizaron primers que permiten la amplificación de un fragmento interno del gen npt II y como control
de amplificaci ón, primers para el gen de tubulinas .
Este proyecto contempla la realización de las siguientes actividades:
§Análisis de las plantas transgénicas obtenidas mediante la técnica de Southern.
§Transformación genética utilizando 2 plásmidos en forma simultánea, uno portador del gen marcador
Figura 1. Control de transformación por expresión transitoria. seleccionable y otro portador de un gen de interés.
Tinción histoquímica de células de embrión somático que expresan el gen marcador visualizable gus A

Bibliografía
Bingham, E., Hurley, L., Kaatz, D. y Saunders, J. (1975). Breeding alfalfa which regenerates from callus in
tissue culture. Crop Sci. 15: 719-720.
Maíz, E.; Rios, R.; Gómez, C. y Franzone, P. (1995). Alfalfa (Medicago sativa) somatic embryos are suitable
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Pereira, L. y Erickson , L. (1995). Stable transformation of alfalfa M
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Shetty , K. y McKersie , B. (1993). Proline, thioproline and potassium mediated stimulation of somatic
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Financiado por: INTA y CONICET PIP # 4416 Spangenberg, G., Wang, Z., Wu, X., Nagel, J, Iglesias, V. y Potrykus , I. (1995). Transgenic tall fescue
(Festuca arundinacea) and red fescue (F. rubra) plants from microprojectile bombardment of embryogenic
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