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Absorbancia

Factores que podrían afectar la absorción de la luz de una solución:

concentración,

solvente utilizado,

la distancia que viaja el rayo de luz

la característica de la cubeta.    

Para calcular la concentración de DNA o RNA en solución es necesario leer la

absorbancia de una dilución a un largo de onda de 260 nm (OD260).  Además, es
necesario conocer la siguiente información: 

50 µg/ml de DNA de doble hebra refleja un O.D. de 1 a 260 nm

37 µg/ml de DNA de hebra sencilla refleja un O.D. de 1 a 260 nm

40 µg/ml de RNA de hebra sencilla refleja un O.D. de 1 a 260 nm

Concentración La ecuación para determinar la concentración del DNA es:

Concentración de DNA (µg/ml) = (OD260) x (factor de dilución) x 50 µg de DNA/ml1
Unidad de OD260

Ejemplo: 

10 µl de DNA se obtienen de una muestra de DNA con un volumen total de 100 µl.

Los 10 µl de DNA se añaden en la cubeta junto a 390 µl de agua.

El OD260 obtenido es de Concentración de DNA (µg/ml) = (0.205) x (400) x 50 µg de

DNA/ml  = 410 µg/ml10       1 Unidad de OD260  

Para estimar la concentración TOTAL de DNA en la muestra multiplique la

concentración en µg/ml por el volumen de la muestra.     

410 µg  x  0.09 ml* = 36.9 µg /ml 

* Comenzamos con 100 µl de la muestra - 10 µl utilizados para la lectura de

absorbancia = 90 µl;

90 µl / 1x106 ul/ml =Factor de dilucion – da una idea de cuan concentrado o diliuido

esta una muestra

Se calcula como volumen final / volumen inicial o vol total / volumen diluido

Ejemplo:
Tomo 1 ul de A (muestra) y lo añado a 4 ul de B (diluyente) = 5/1: fd= 5

Tomo 2ul de A en 8 ul de B = 10/2 fd = 5

Tomo 5 ul de A y lo añado a 995 ul B: FD = 1000/5

9  Pureza: Abs260/Abs280 Además, es necesario estimar Abs a OD280.

La razón entre la lecturas de OD260/ OD280 es utilizado para estimar la pureza de los
ácidos nucleicos.Una preparación pura de DNA debe tener un radio OD260/ OD280 de
1.8 y el RNA un radio de 2.0.Un radio menor de 1.8 sugiere una extracción con fenol y
cloroformo para remover las proteínas que contaminan la muestra de DNA. Y mayor
de 1.8? Ejemplo: Si el OD260 de una muestra de DNA es de y el OD280 es de 0.114, el
radio OD260/ OD280 será de 1.8. ¡Un DNA puro!  

10  Materiales Agua Destilada Baño de Agua Cuvetas Plasticas

EspectrofotómetroEtanol 70%Etanol 95%MicrocentrífugaMicropipetas y puntasPapel
KimwipsVortex

11  Protocolo: Precipitación Etanólicas

1) Obtenga el microtubo que contiene el DNA con etanol al 95 %.  Centrifugue por 10
minutos a 12,000 rpm y descarte el sobrenadante.2)  Añada 300 µl de etanol al 70 %
frío y mezcle utilizando el vortex.3)  Centrifugue por 5 minutos a 12,000 rpm y descarte
el sobrenadante.4) Invierta el microtubo con la tapa abierta sobre papel toalla. Déjelo
reposar por 5 minutos.5)  Incube el microtubo (tapa abierta) por 10 minutos a 65 ºC.
Asegúrese de remover todo el etanol.6)  Añada µl de agua destilada previamente
esterilizada. La cantidad de agua va a depender del precipitado presente en el
microtubo.7) Incube el microtubo (tapa cerrada) por 5-30 minutos en un baño de
María a 65 ºC. Asegúrese de que el DNA se encuentra resuspendido completamente
antes de proseguir.

12  Concentración y Pureza
1) Añada 1000 µl de agua destilada y previamente esterilizada a una cuveta plástica
para espectrofotómetro. Este será su blanco.2)  En otra cuveta de plástico, mezcle 10
µl de la solución de DNA (paso A-7) y 990 µl de agua destilada previamente
esterilizada.3)  Utilice el blanco para calibrar el espectrofotómetro.4)  Coloque la
cuveta plástica del paso B-2 en el espectrofotómetro y obtenga las lecturas de
absorbancia a 260 nm y 280 nm.5)  Estime la concentración y pureza del DNA de su
muestra. 6)  Rotule correctamente su microtubo y guárdelo  a – 20 ºC hasta el próximo
laboratorio.

13  Cálculos y Preguntas Preguntas

Utilizando las fórmulas aprendidas en este módulo, estime la concentración y pureza
del DNA que se encuentra en solución.Preguntas ¿Cual es el rol del etanol en la
precipitación de los ácidos nucleicos? Explique su respuesta haciendo referencia a la
estructura y enlaces de las macromoléculas.Si el radio OD260/ OD280  de su muestra
es menor de 1.8, su muestra de DNA se encuentra contaminada con proteínas. ¿Qué
ocurrió en el procedimiento que afectó los resultados? ¿Qué debe hacer para mejorar
estos resultados?Como parte de su trabajo en un laboratorio, usted extrae DNA de un
organismo dado. Luego de precipitar el DNA usted debe estimar la concentración del
mismo. Cuando va a utilizar el espectrofotómetro se percata de que esta dañado.
¿Cómo usted puede estimar la concentración y pureza de su muestra de DNA?
Explique el método utilizado y por qué lo utiliza.¿Puede el DNA ser precipitado
utilizando isopropanol? De poder ser utilizado, mencione las ventajas y desventajas
que tiene el uso del mismo.5El DNA puede ser resuspendido con agua destilada o TE.
Mencione las ventajas y desventajas de utilizar agua destilada versus TE y lo
contrario.