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I4- Fisiopato 29.1

BIOLOGÍA DE SISTEMAS EN ONCOLOGÍA

DR. ALEJANDRO CORVALÁN

TRANSCRIPCIÓN: Nicolás Hermosilla, Carlos Villafranca

REVISIÓN: Diego Reyes

Las células normales presentan, por lo general, múltiples vías metabólicas, con lo
que adquieren un dinamismo característico. En el caso de la célula neoplásica, esos
procesos múltiples se reducen, se minimizan y tienen lo que se llama adicción a un
solo mecanismo, por lo tanto se simplifica.

El cáncer es un modelo simplificado de la complejidad de un proceso normal, usa generalmente un

mecanismo sobre todo, pero que aun así es muy complejo.

Cuando una célula se enferma, comienza a usar un solo mecanismo, que es la base de la enfermedad, y no
se puede cambiar el mecanismo por drogas o intervenciones. A esto se le llama adicción y es importante
como concepto porque hoy en día existe este esquema que muestra posibles terapias que se están
desarrollando en la medida que se conozca la vía metabólica que utiliza determinado cáncer.

La prueba más evidente de que el fenómeno de adición existe es que cuando uno usa determinadas
terapias la célula tumoral genera resistencia al tratamiento, intentando mantener su vía y no hay
posibilidad que la cambie.

Cada uno de estos elementos en particular, como se estudian, es lo que se denomina genética por una
definición operacional, se analiza un gen a la vez. Y la visión global es una que viene una maquina, toma
una malla, y toma todo los genes que puede pescar en esta laguna, y después los empieza a mirar en su
conjunto y como están interactuando entre ellos, en el fondo estudia el sistema y no sus particularidades.
Esto último tiene el nombre de genómica.

Lo que ocurre al final es que estos dos sistemas conversan, porque el sistema se monta sobre
particularidades específicas, como el cáncer, que no son reversibles ni acumulables. Existen varias
alternativas de cómo estudiar la biología del sistema, y básicamente se puede separar en estudios DNA-
based (estructura del DNA), RNA-based (estructura del RNA) y protein-based (estructura proteica)1; a esto
se le llama métodos de alto rendimiento. Y precisamente hacen eso, estudian miles de datos a la vez, miles
de expresiones génicas. Los estudios relacionados con el RNA tienen que ver con la expresión génica,
material genético en activa traducción; a diferencia del DNA, que es lo que la célula contiene en su material
genético pero que no necesariamente está activo. Los análisis de proteínas miden las funciones directas,
son mucho más específicos pero mucho más complejos, porque las proteínas son muy variables.

1Los métodos más utilizados en el caso del DNA son: hibridación genómica comparativa y FISH. Para el
RNA: Análisis seriado de la expresión de genes (SAGE) y microarreglos de cDNA. Por último, para el
caso del análisis proteico: microarreglos tisulares (TMA) y estudios de proteómica.

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Métodos de análisis de expresión masiva

Serial Analysis of Gene Expression (SAGE)

Se basa en el análisis de secuencias, por ejemplo, se toma

una célula de tumor, se disgrega su RNA y aquí con unas
series de procesos bioquímicos se corta y se secuencia.
Aquí se ve todo lo que el tumor tiene, con respecto a sus
secuencias, sin sesgos previos. En la actualidad hay
métodos más modernos que este, pero el concepto es que
se ven secuencias, cuántas veces tengo este gen expresado
versus otros. Como es un método de secuencias, la
principal característica es que es un método abierto, no se
quiere determinar si esta en algún tejido específico tejido,
simplemente se quiere saber qué genes tiene.

cDNA microarray

En este método se utilizan copias del DNA (cDNA) cuya

característica principal es su estabilidad en
comparación con las hebras originales. A diferencia del
método anterior, los fragmentos que se han aislado se
hibridan contra una plataforma que le ofrece ciertos
genes en particular. Lo segundo importante es que
estas moléculas son marcadas con un marcador
fluorescente rojo y verde, produciendo una especie de
competencia. Por ende, la señal que tengo es una señal
indirecta de la hibridación. Lo que se tiene es la
cantidad de luz que se produce a partir de la
hibridación. Ahora, la gran diferencia con SAGE está en
los costos; detectar la totalidad de las secuencias es
muy caro y esto repercute en que el cDNA microarray, por ser un método cerrado, sea el método más
popular por tener un menor costo. A pesar de lo anterior, la tendencia es que cada vez se están usando
más métodos abiertos que cerrados.
La interpretación del cDNA microarray es que donde no hubo hibridación da tonalidad verde (low); amarillo
indica que hay equivalencia entre que se hibrida o no (equal), y rojo que sí hibrida, por ende hay gran
cantidad de ese gen (high).
El microarray se pasa por un scanner, el cual le asigna un número a la intensidad de color. Entonces, los
rojos son los números altos, los verdes números bajos, los negros son equivalentes y los blancos o grises
son los que no se pueden leer. El mayor número de puntitos significa mayor expresión de genes
particulares que estaban en ese tumor. Esto se pasa por análisis computacionales porque no se puede
analizar con estadística convencionales. Para analizar los datos entregados por el cDNA microarray
realizado, se pueden utilizar tres métodos: Hierarchical Cluster Analysis (HCL), Significance Analysis for
Microarrays (SAM) y Significant Pathways (Biological Process involved).

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Hierarchival Cluster Analysis

En HCL se definen 3 cosas: dependiendo de la manera en que uno mira las diferencias de señal se
denominan Single Linkage, Average Linkage y Complete Linkage. El resultado final del clúster depende del
análisis que uno haga. Es un análisis intuitivo, requiere saber qué es lo que se está analizando y la pregunta
que se realiza al respecto de eso, no es una estadística que uno mira en una tabla. El análisis que uno haga
depende de lo que se quiera encontrar. A modo de ejemplo, Simple Linkage se basa en que se tiene un
tumor A y un tumor B con distintos niveles de expresión, y se toman los niveles más cercanos de los dos
tumores. Average Linkage toma los niveles medios de los dos tumores y Complete Linkage toma los
distantes. Son aproximaciones matemáticas, y eso se traduce en que generan diferentes dendrogramas2.
En la práctica lo que se usa mas es Average Linkage porque refleja una globalidad. Lo más importante
entonces es que es un análisis intuitivo de comparación. Hay un ejemplo en el que se genera una
clasificación molecular del cáncer de mama en que los tumores se clasifican en base a su expresión de
genes.
Los clúster son métodos de visualización, hipótesis, generador de hipótesis y selección de distintos genes
para futuras consideraciones. Y lo otro importante es que en el clúster la visualización no es única, de
hecho en software que se usan se utilizan distintos algoritmos y se van sacando distintas conclusiones, y de
esas conclusiones finalmente se saca el algoritmo con el cual uno hace el análisis.

En resumen:
 "Clustering" es una herramienta de exploración para observar las asociaciones dentro de los datos de
expresión génica
 Los dendrogramas nos permiten visualizar los datos de expresión génica.
 Estos métodos permiten generar hipótesis acerca de las relaciones entre los genes y las clases.
 Se debe utilizar estos métodos para nuevas consideraciones sobre la visualización, generación de hipótesis
y selección de genes.
 No se debe utilizar estos métodos de forma inferencial.
 No existe una medida de la "fuerza de la evidencia" o de la "fuerza de la estructura del clustering"
proporcionada.
 HCL permite contar con una imagen de la que se pueden hacer muchas/ninguna conclusión.
 El uso de arreglos de análisis de clústeres organiza muestras y los genes en grupos basados en sus niveles
de expresión.
 Esta disposición se determina puramente por la distancia medida entre las muestras y los genes.

 Las disposiciones son sensibles a la elección de la distancia

o Outliers
o Distancia poco especifica.
 En HCL, la visualización del dendrograma no es única:
o El hecho de que dos muestras estén situadas una junto a la otra, no significa que son similares
o Se requiere mayor escrutinio de interpretar el dendrograma que es generalmente otorgado.

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es un tipo de representación gráfica o diagrama de datos en forma de árbol (Dendro=árbol) que organiza
los datos en subcategorías que se van dividiendo en otros hasta llegar al nivel de detalle deseado
(asemejándose a las ramas de un árbol que se van dividiendo en otras sucesivamente).

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Significance Analysis for Microarrays (SAM)

Esto es lo más importante, es una

propuesta de que cosas serían necesarias
considerar en la investigación.
Básicamente, el análisis de la expresión
genómica tiene una gran herramienta de
screening, donde se analiza una gran
cantidad de personas y distintos valores
del resultado del microarray para cada una
de ellas.

Posteriormente, SAM detecta cuáles son

los genes que hacen los dendogramas del
problema planteado. Se realiza un estudio
completo de los dendogramas y se va a
ver qué genes son los responsables de que
tengan distinta tonalidad en el
microarreglo que se está analizando. Y esto se hace con esta herramienta que es una prueba T que en el
fondo va colocando y sacando grupos de genes. En el gráfico se ven 100 genes en la izquierda y 100 genes
en la derecha. Aquí están todos los genes analizados. La línea que se observa son los puntos que se
consideran significativos, por lo tanto está diciendo que ahí hay un grupo de genes que marcan el grupo de
la izquierda (verde), y un grupo de genes que están acá que marcan el grupo de la derecha (rojo). En el
fondo, se menciona cuáles son los genes que componen cada dendograma, y esto se hace con el SAM, que
consiste en que se cargan todos los genes y el sistema va colocando y sacando grupos y ve si el
dendograma se mantiene. En el análisis se pueden utilizar distintas pruebas estadísticas para obtener su
valor p, pero lo importante es que cada uno de estos puntos es el pilar sobre el cual se construye el
dendograma.

Significant Pathways (Biological Process involved)

Desde SAM, se obtiene una lista de genes y se quiere determinar lo que hacen estos genes, si son
relevantes con cáncer o no son relevantes, por ejemplo. Para eso existen los estudios relacionados con los
procesos biológicos. Por ejemplo, en el caso del cáncer, si se detecta bcl-2, el cual bloquea la apoptosis,
esta herramienta permite decir que otros genes asociados a bcl-2 están en los datos que se están
recogiendo, porque lo que se busca en la práctica es si efectivamente hay un bloqueo de la apoptosis, el
cual es un mecanismo de cáncer.

Entonces este análisis es como lo macro, el resultado de la presencia de los genes obtenidos en los datos.
SAM se dedica a c pilares y quiénes son sus vecinos . Estos
programas de análisis que se han visto son cada vez más específicos y sus resultados se pueden reproducir
en 6 días.

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Esto es una publicación del 2011 que en el

fondo separa el cáncer en seis grandes vías
metabólicas producto de estos análisis
genómicos, a saber: resistencia a la muerte
celular, proliferación, evasión de supresores
del crecimiento, invasión y metástasis,
inmortalidad celular y angiogénesis. Esto se
vislumbra como fenómeno neoplásico y es la
traducción de un proceso biológico, pero en la
práctica ahora se puede sistematizar, a partir
de una globalidad representada en estas seis
grandes características.

Ahora se mostrará un ejemplo de cómo esta mirada amplia termina siendo una cosa bastante simple. Esta
es un publicación del 87 sobre el gen HER-23, y el mérito que tiene, es que es el inicio de la oncología
molecular, porque antes del 87 el gen se estudiaba en virus en animales en experimentación. Y esta es la
primera evidencia en que se muestra que si uno estudia la sobrevida en los que tienen este gen
amplificado, los pacientes mueren mucho más temprano que los que no tienen el gen amplificado.

Lo que se está mostrando es que cuando este gen

esta amplificado, los pacientes mueren antes que
cuando este gen no lo está. Este gen está colocado
como receptor de membrana y señaliza hacia dentro
de la célula. Esto se puede ver con una tinción
inmunohistoquímica lo que se ve en la imagen como
un anillo fuera de la célula, porque en la membrana
no se encuentran 4 o 5 receptores, sino que 200.000.
Entonces lo único que hace la célula es señalizar a
través de estos para producir proliferación celular.
Por lo tanto, es significante en la historia natural de
esta enfermedad.

Ahora si uno hace un microarray de esto uno piensa que son tumores completamente distintos (siendo
más maligno el con HER-2). Al analizar el microarray positivo se ve que de este genoma completo, que son
aproximadamente 20.000 genes, solo 5000 participan y solo 40 genes están sobreregulados y 219 genes

3ElHER2, conocido también como ErbB2 y designado como cúmulo de diferenciación CD340 y p185, es
un protooncogén localizado en el brazo grande del cromosoma 17, concretamente en la región 17q21.1.
Codifica para una glicoproteína de 185 kDa con actividad tirosina quinasa en su dominio intracitosólico. Se
trata de un receptor para el factor de crecimiento de tipo endodérmico humano. Es clave para el
crecimiento y la división normal de las células, por lo que su expresión anormal está vinculada a procesos
cancerosos. Se ha convertido en un importante marcador y diana de tratamiento oncogénico, especialmente
del cáncer de mama.

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están con baja expresión. Esto nos dice que tan solo el 5% de los 5000 genes involucrados marcan toda la
diferencia. Entonces de toda esta diversidad de genes, se reduce a pocos los que realmente cumplen un rol
en esta patología.

En general lo que ha ocurrido con todos estos análisis de genómica es que se encuentran genes que a nadie
se le habría ocurrido estudiar, y han aparecido genes que son relevantes, pero como no habían aparecido
antes no se podía hacer investigación sobre ellos, ya que siempre hay que tener una hipótesis para la
investigación en base a un estudio previo. Por lo tanto, es una gran herramienta para descubrir genes
relevantes en cáncer y que finalmente son pocos. De esta manera, la genómica ayuda a dirigir la genética.

Otra cosa que no es menor es que en los canceres predominan genes que se apagan, contrario a lo que uno
podría pensar. Por lo tanto, la biología funcionaria con más mecanismos represivos que proactivos.
Entonces, la pérdida de estos genes represores hace que se genere este caos biológico.

Acá tenemos otro ejemplo ya más aplicado, es un perfil de datos de pronóstico, la selección fue la
siguiente:

 Selección de 98 cáncer de mama primarios

o 34 pacientes desarrollaron metástasis a distancia dentro de 5 años.
o 44 pacientes continuaron libres de enfermedad después de 5 años.
o 18 pacientes con mutación en la línea germinal BRCA1.
o 2 pacientes con mutación en la línea germinal BRCA2.

Lo que se detectó finalmente fue:

 “ DNA-
o 231 genes fueron asociados con la evolución de la enfermedad.
o 70 genes altamente relacionados con el pronóstico.

Al ver los análisis de los clúster lo importante es que existe un grupo de genes asociados al evento
metastásico. Al hacer el examen de significancia del microarray se ve la relación entre la metástasis y los
genes sobre-expresados. El punto es que esto se hizo inicialmente con un grupo de 30-40 personas y luego
se hizo en un grupo de 295 y básicamente mostro lo mismo el grupo chico que el grupo grande. Lo
importante es cuando quisieron comparar con todos los pronósticos conocidos de cáncer de mama, el
perfil genético resulto ser mucho mejor predictor de que va a ocurrir un evento de metástasis. Y vale la
pena mencionar que eran tumores que estaban guardados y que tenían un seguimiento, o sea que los
tumores nacieron malos, no se hicieron malos. Todos estos eran tumores al momento del diagnóstico, los
congelaron y 8 años después lo estudiaron, y vieron que había pacientes que habían andado bien y otros
que habían andado mal, pero ellos los estaban estudiando en el tiempo del diagnóstico. Esto nos dice que
el tumor ya tenía la capacidad de hacer metástasis, la cual no lo había hecho porque todavía era un tumor
pequeño. Este concepto de que el tumor nace malo es nuevo, y esto es interesante porque esto es una
evidencia clínica que genera una pregunta biológica: la historia natural de la enfermedad puede decir que
estos tumores tienen un componente biológico intrínsecamente metastásico.

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Ahora lo que se muestra acá es lo mismo,

pero llevado a 14 genes. Primero estábamos
hablando de un perfil de 70 genes y luego se
realiza el análisis de estos 14, o sea este
reduccionismo se puede hacer también
clínicamente. El concepto de los perfiles
permite ver un bosque pero reconocer
cuales son los arboles centrales.

Entonces, estos casos donde se revisan 14

genes son los mismos 295 casos del estudio
anterior lo que demuestra que uno lo puede
reducir a 14 genes y hacer un PCR gen
especifico y puede determinar el pronóstico. Estos hoy en día son 2 tipos de ensayos clínicos el primero
conocido como mamaprint y el otro como oncotype, los cuales son dos aproximaciones genéticas que se
usan para predecir pronóstico e indicar quimioterapia.

Ahora para terminar, cuando uno va a validar estos datos de microarray se

hacen generalmente pocos casos y son datos de hibridación de una señal
indirecta por reconocimiento de una sonda de un RNA que estaba en un
pedazo del tumor. Entonces, uno requiere validarlos y para hacer esto se
toman cortes de los tumores y se puede hacer una reacción histoquímica o
de RNA en cada uno de ellos, por lo que habría que hacer muchos casos,
puesto que son muchos cortes. Entonces, una forma de realizar la
validación de estos descubrimiento es a través de los tissue microarrays
(TMA), los cuales consisten en que cada uno de estos tejidos se les toma un
muestra y se les hace una biopsia, se generan cortes laminares y se ordenan
en una colección de todos los tumores que uno estaba mirando
individualmente. Y estos se ven así y cada circulito corresponde a un
distinto tejido.

Entonces, como en el ejemplo, uno tiene 30 casos en una lámina y cada caso está hecho en triplicado por si
un corte falla. De esta manera, cada vez que yo coloco una gota de un reactivo para ver si hay presencia de
una proteína sobre-expresada como lo mostraba el microarray, lo analizo en triplicado y en 30 casos
distintos a la vez y eso permite tener consistencia y ahorrar tiempo.

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Aquí se muestra un ejemplo de lo que se tiene en el

laboratorio de cáncer gástrico, 305 muestras de
tejidos de los cuales 75 son una muestra de mucosa
no tumoral, mucosa sintomática 70 y mucosa
asintomática 65. Todas estas en 8 láminas, lo que
permite teñir y analizar en un día todo este
material. Esta es la forma de validar los datos que se
descubren en la genómica, con pequeños grupos de
muestras.

Y por último esta es una investigación la

cual fue muy exitosa, donde se descubrió
un gen llamado p73 que tiene que ver
con las gastritis que precede la aparición
de cáncer. El gen p73 estaría
sobreexpresado en el cáncer gástrico.

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