PRÁCTICA 3

AISLAMINTO E IDENTIFICACIÓN DE Staphylococcus aureus

COAGULASA POSITIVO

Keila Cáceres Mora, Marly León Peñaloza, Nicolás Gutiérrez Gómez, Felipe Jaimes
Patiño

Ingeniería Agroindustrial

Departamento de Ciencias Agrarias y del Ambiente

Universidad Francisco de Paula Santander

RESUMEN

Los cocos Gram positivos y en especial Staphylococcus aereus son los microorganismos
más aislados de cualquier muestra clínica con excepción de las enterobacterias, la segunda
causa de infecciones intrahospitalarias (nosocomiales), y una de las causas más comunes de
intoxicación alimentaria. Según la novena edición del manual de Bergey de Bacteriología
Sistemática Staphylococcus spp se ubica dentro de su propia familia Staphylococcaceae.
El género Staphylococcus se compone actualmente de 33 especies, de las cuales 17 pueden
asociarse al hombre, de estas Staphylococcus aereus es una potencialmente patógena que
al desarrollarse puede producir una “toxina” que es la causa de una intoxicación.

En el presente trabajo se determina la presencia de Staphylococcus aereus, mohos y

levaduras en una muestra de queso tratado del municipio de Bochalema Norte De
Santander, en el estudio a realizar se determinaron diluciones de 10−1, 10−2 y 10−3 en agua
de peptona con la muestra analizar, las diluciones 10−2 y 10−3 se agregaron a sus
respectivas placas a partir de agar Baird Parker (BP) y agar de papa y dextrosa (PDA) con
siembra en placa superficie en los agares Baird Parker por duplicado de cada una y siembra
en placa profunda en los agares de papa y dextrosa. Al realizar los procesos se tuvo que
hacer el recuento de unidades formadoras de colonias (UFC) de cada una de las placas y
estas mostraron resultados diferentes.

Palabras clave: Colonias, dilución, Staphylococcus aereus, Baird Parker, mohos y

levaduras.

ABSTRACT

Gram-positive coconuts and especially Staphylococcus aereus are the most isolated
microorganisms of any clinical specimen with the exception of enterobacteria, the second
cause of in-hospital (nosocomial) infections, and one of the most common causes of food
poisoning. According to the ninth edition of Bergey's manual of Systematic Bacteriology
Staphylococcus spp is located within its own family Staphylococcaceae. The genus
Staphylococcus is currently composed of 33 species, of which 17 can be associated with
man, of which Staphylococcus aereus is a potentially pathogenic which when developed
can produce a "toxin" which is the cause of intoxication.

In the present work the presence of Staphylococcus aereus, moulds and yeasts is
determined in a sample of cheese treated in the municipality of Bochalema Norte De
Santander, in the study to be carried out dilutions of 10-1, 10-2 and 10-3 were determined in
peptone water with the sample analyzed, dilutions 10-2 and 10-3 were added to their
respective plates from Baird Parker agar (BP) and potato agar and dextrose (PDA) with
surface plate seeding on Baird Parker agars in duplicate of each and deep plate seeding on
potato agars and dextrose. When performing the processes, it was necessary to count the
colony forming units (CFU) of each of the plates and these showed different results.

Keywords: Colonies, dilution, Staphylococcus aereus, Baird Parker, molds and yeasts.
INTRODUCCIÓN
Los estafilococos son ubicuos y se
encuentran generalmente en la piel y las
mucosas nasales del hombre y otros
animales, S. aereus puede distinguirse de
Micrococcus por su capacidad
facultativa, resistente a la lisozima,
sensible a la lisostafina y porque su pared
contiene ácidos teicoicos. S. aereus es un
coco Gram positivo no esporulado,
inmóvil de 0,8 a 1 micra de diámetro, que
se divide en varios planos formando
agrupaciones en forma de racimos en
medios sólidos y pares, individuales o
cadenas cortas en medios líquidos, que
prefieren las condiciones aeróbicas más
que las anaeróbicas. Poseen una enzima –
lactamasa lo que les confiere la
resistencia a los antibióticos como la
penicilina y algunos de sus derivados. En
el laboratorio las colonias crecen lisas,
convexas, resplandecientes y de borde
entero, presentan pigmento que puede ser
variable de naranja a amarillo y de allí su
denominación de coco dorado (aereus). El
crecimiento sobre medios de cultivos es
abundante, y en caldo de cultivo se
manifiesta por la turbidez del caldo que
más adelante se aclara observándose en el
fondo del tubo un tubo un sedimento fino
suspendido o una película que forma un
anillo en la superficie del líquido.
Staphylococcus se puede encontrar en a)
medio ambiente como puede ser: aire,
polvo, superficies en donde se manejan
alimentos, agua, agua residual, b) en
alimentos: por ejemplo los que presentan
un alto contenido proteico, como puede
ser la leche y derivados lácteos, también
se desarrolla en aquellos alimentos que
presentan altas concentraciones de sal,
uno de ellos sería el jamón; otro factor
importante en los alimentos es el pH, así
tenemos en el caso de la mayonesa, ésta
tiene un pH lo suficientemente bajo para
inhibir el desarrollo de S. aureus, sin
embargo, al diluirse y neutralizarse en
una ensalada por ejemplo, el pH asciende
lo suficiente como para permitir el
desarrollo de este microorganismo
enterotoxigénico y finalmente c) también
se puede localizar en personas y animales.
Estos últimos, los animales y las personas
son los principales reservorios de estos
microorganismos.
Los alimentos perecederos tales como
carnes crudas y procesadas, ensaladas,
productos de pastelería, como pasteles
rellenos con crema, pies de crema,
coberturas de chocolate, leche y sus
derivados, rellenos para sándwiches y
papas, son los más comúnmente
asociados con intoxicaciones Se comienza usando la paleta para
estafilocóccicas. cortar 10 g de queso de hoja y pesarlos
y disolverla en 90 mL de agua de
La especie aureus, es la considerada
patógena dentro del género peptona al 0,1% de esta manera
Staphylococcus y está comúnmente obtenemos la concentración 10−1 ,
asociado a casos de artritis, osteomielitis, Como lo muestra la imagen número 1.
meningitis, neumonía y en algunos casos
puede llegar a ocasionar pérdida del
conocimiento. Las cepas de este
microorganismo que producen enzimas
extracelulares y toxinas, son las más
importantes por ser causante de
intoxicaciones alimentarias.

MATERIALES Y MÉTODOS

 Agar Baird Parker (BP)

 Agar papa y dextrosa (PDA) Imagen Número 1.
 Frascos de dilución con capacidad
de 250 ml que contengan 90 ó 99 Luego agitamos suavemente la mezcla
ml de agua peptonada 0.1% de la cual tomamos 1 mL y
 Pipetas de 1 ml estériles adicionamos en un tubo de cultivo que
 Pipetas de 10 ml estériles
contiene 9 mL de agua de peptona,
 Cajas de Petri estériles
 Tubos de ensayo agitamos y de esta manera obtenemos
 Mechero la concentración 10-2.
 Gradilla
 Hisopos
 Queso de hoja
 Paleta esteril

Para realizar el procedimiento se inicia

con preparar todos los mesones,
desinfectándolos con su respectivo
sistema de desinfección. El siguiente
paso es organizar el material de Imagen Número 2.
trabajo en el mesón del laboratorio
para poder dar inicio al procedimiento. Repetimos el paso anterior, pero en
este caso con la diferencia que en
lugar de sacar 1 mL de la primera
concentración lo tomamos de la
segunda presente en el tubo de cultivo
para así formar la dilución 10−3 .

Imagen Numero 4.

Imagen Número 3.

Después de tener dicha concentración

se procede hacer una siembra en placa
superficie por duplicado a partir del
agar BP .

Después se procede hacer la siembra

en placa superficie empezando con
agar BP a 10-2, como lo muestra la
imagen número 4 y 5.
Imagen Numero 5.

Seguidamente procedemos hacer la

siembra placa profunda con agar PDA
con 10-2 como lo muestra la imagen
número 6.
Imagen Numero 6.

Seguidamente procedemos hacer la

siembra en placa superficie con agar
BP con 10-3 como lo muestra la
imagen número 7 y 8.

Imagen Numero 8.

Seguidamente procedemos hacer la

siembra en placa profunda con agar
PDA con 10-3 como lo muestra la
imagen número 9 y 10.
Imagen Numero 7.

Imagen Numero 9.
 El rango total de patógenos está
entre 20-200.

10-2 =45 y 61
4500+6100
10-2 = =53 00
2

10-3=144 y 196
1 44000+196000
10-3 = =1700 00
2

170000
Imagen Numero 10. =32,07 igual o mayor a 2
5300
Después se mezcló inmediatamente las
cajas con el medio, de acuerdo con los
movimientos de las agujas del reloj, 5 3x102 ufc/ml
mínimo 5 veces. Se realiza el recuento de mohos y
Se prosiguió a incubar a 37°C durante levaduras con una incubación de 5 a 7
24 horas para Staphylococcus aereus días, los datos de colonias encontradas
con BP y en el caso del agar PDA son las siguientes:
(mohos y levaduras) se incubo de 3 a 5 Cajas con concentración 10-3
días. Primera: 32 colonias
RESULTADOS Segunda: 28 colonias

En el caso de los Staphylococcus Cajas con concentración 10-2

aereus se realiza el recuento con una Primera: 83 colonias
incubación de 24 horas, los datos de Segunda: 76 colonias
colonias encontradas son las
PDA el rango esta 10-100 para
siguientes:
mohos y levaduras.
Cajas con concentración 10-3
10-2 = 83 y 76
Primera: 45 colonias
Segunda: 61 colonias 8300+7600
10-2 = =7950
2
Cajas con concentración 10-2
Primera: 144 colonias 10-3=32 y 28
Segunda: 196 colonias 32000+28000
10-3 = =30000
2
30000 Imagen Numero 13.
=3.77 igual o mayor a 2
7950
En la dilución de 10−2 y 10−3 de agar
PDA pudimos realizar la siembra de
79x102 ufc/ml acuerdo a los pasos dados por nuestro
docente y obtuvimos un resultado
DISCUSIÓN DE RESULTADOS esperado de un crecimiento de
colonias dando como resultado 79x102
En la dilución de 10−2 y 10−3 de agar
ufc/ml, obteniendo como evidencia las
SPC pudimos realizar la siembra de
siguientes imágenes 14,15 y 16.
acuerdo a los pasos dados por nuestro
docente y obtuvimos un resultado
esperado de un crecimiento de
colonias dando como resultado 75x102
ufc/ml , obteniendo como evidencia
las siguientes imágenes 12 y 13.

Imagen Numero 14.

Imagen Numero 12.

Imagen Numero 15.

 Dilución del alimento
http://depa.fquim.unam.mx/amyd/arch
ivero/TecnicBasic-
Diluciones_6526.pdf
Agua peptonada
https://www.lifeder.com/agua-
peptonada/
Imagen Numero 16. Agar plate count
CONCLUSION http://f-soria.es/Inform_soria/Difco
%20Fichas%20tecnicas/PLACAS
Mediante la siembra en placa por %20DIFCO%20Y
profundidad se cuantifica el número %20CROMOGENICAS%20BD/FT
de microorganismos viables en una %20PLATE%20COUNT
muestra en relación a las colonias que %20AGAR.pdf
forma (ufc) y este valor es útil para ANEXOS
determinar si un alimento o bebida es
apta para el consumo humano. Agua peptonada

BIBLIOGRAFIA Es un medio de enriquecimiento

Aljewicz, M., Cichosz, G., Nalepa, B.,
& Bielecka, M. (2016). The effect of
milk fat substitution with palm fat on
lactic acid bacteria counts in cheese-
like products. LWT - Food Science
and Technology, 66, 348–354.
https://doi.org/https://doi.org/10.1016/
j.lwt.2015.10.042
Diduch, M., Polkowska, Ż., &
Namieśnik, J. (2016). The role of
heterotrophic plate count bacteria in
bottled water quality assessment.
Food Control, 61, 188–195.
https://doi.org/https://doi.org/10.1016/
j.foodcont.2015.09.024
líquido, no selectivo, utilizado
principalmente como diluyente de
muestras de alimentos u otros
materiales. Este medio desde el punto
de vista químico es muy simple,
contiene peptona de carne, cloruro de
sodio y agua.
Fundamento: Las peptonas
proporcionan los nutrientes requeridos
para el desarrollo bacteriano,
especialmente nitrógeno y
aminoácidos de cadena corta, mientras
que el cloruro de sodio mantiene el
equilibrio osmótico. Además, el medio
permite dispersar, homogeneizar y
reparar las células bacterianas que han
sido dañadas por sometimiento a
procesos industriales.
Agar papa dextrosa
El agar papa dextrosa es un medio de
cultivo sólido, no selectivo. En él
pueden crecer especies bacterianas y
fungicidas, pero su uso está indicado
especialmente para el aislamiento de
hongos filamentoso y levaduras.
También es conocido como medio
PDA por la expresión en inglés Potato
Dextrose Agar.
Fundamento: El agar papa dextrosa
es un medio de cultivo que aporta los
elementos nutricionales necesarios
para el desarrollo de hongos
filamentosos y levaduras. La
combinación de la infusión de papa
con la glucosa proporciona la fuente
de energía perfecta para que exista un
crecimiento satisfactorio de los
hongos. Mientras que el agar es quien
brinda la consistencia al medio. El
medio por sí solo no inhibe el
crecimiento de las bacterias, por tanto,
es un medio no selectivo. Para hacerlo
selectivo necesita el agregado de
sustancias inhibidoras como el ácido
tartárico o los antibióticos.
Agar plate count
El plate count agar o agar de recuento
de bacterias es un agar listo para usar
para una detección cuantitativa rápida
y segura de microorganismos en la
industria de alimentos y bebidas. El
medio se conoce también como agar
de triptona glucosa levadura, agar de
recuento de bacterias o agar de
caseína-peptona dextrosa levadura, y
cumple las especificaciones de la
Asociación Americana de Salud
Pública (APHA) y la norma ISO
4833.
Fundamento: La productividad de
este medio, está basada en el alto
contenido nutricional de sus
componentes, que permite el
desarrollo de las bacterias presentes en
la muestra.
Dilución de un alimento sólido y
líquido
Alimentos originalmente líquidos o
licuables y congelados:
Fundir por completo en baño de agua
entre 40 y 45°C en un tiempo máximo
de 15 minutos y homogenizar agitando
vigorosamente.
Agitar la muestra manualmente en un
arco de 30 cm., con 25 movimientos
de arriba abajo, efectuados en un
tiempo de 7 segundos.
En condiciones asépticas, tomar 10.0
mL de la muestra y diluir con 90.0 mL
del diluyente el cual debe encontrarse
a una temperatura similar a ésta,
evitando el contacto entre la pipeta y
el diluyente.
Muestras sólidas o semisólidas:
Pesar una cantidad de 10.0 g de la
muestra por analizar en un recipiente o
bolsa plástica estéril de tamaño
adecuado.
Adicionar un volumen de 90.0 mL del
diluyente, según sea el caso, llevado a
una temperatura similar a la de la
muestra.
Operar la licuadora o el
homogeneizador peristáltico de 1 a 2
minutos hasta obtener una suspensión
completa y homogénea, según se
indique en la técnica correspondiente
para cada alimento. Aún en los
equipos más lentos, el tiempo de
homogenización debe ser < 2.5
minutos.
Permitir que las partículas grandes se
sedimenten, y transferir la cantidad
deseada (alícuota), tomando ésta de las
capas superiores de la suspensión.