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Laboratorio de Microbiología I

Docente: B.C. Pablo Argelio Sánchez González

Práctica No.4 Control del crecimiento microbiológico: Esterilización por calor húmedo,
efecto de agentes químicos sobre el crecimiento bacteriano y preparación de medios de
cultivo.

Objetivos:

 El alumno aprenderá la técnica para preparar medios de cultivo deshidratados en cajas


Petri.
 El alumno conocerá la técnica de esterilización por autoclave (calor húmedo).
 El alumno relacionará e interpretará el efecto de algunos agentes químicos sobre el
crecimiento bacteriano.

Introducción

En el proceso de esterilización se matan las bacterias, incluso aquellas que tienen esporas. En
cambio en la desinfección no mata las bacterias con esporas, esta consiste en eliminar
tópicamente los microorganismos por ejemplo: en la piel, en heridas, fómites e incluso un
quirófano o área de preparación de medios de cultivo de un laboratorio de microbiología.

La esterilización consiste en eliminar totalmente los microorganismos patógenos: bacterias con o


sin esporas, virus, hongos y protozoos. Se realiza mediante procedimientos físicos o químicos que
permiten destruir todas las formas vivas, donde de igual manera se realiza con los agentes
biocidas y bactericidas.

La esterilización con autoclave (calor húmedo), se lleva a cabo con humedad y calor eliminando
todo ser vegetativo. Se usa en todos los hospitales y laboratorios de microbiología. El aparato es
parecido a una olla de presión. Las condiciones para la esterilización deben ser a 15 libras (6.80kg)
de presión a 121°C por un periodo de 15 a 20 minutos, para procesos de inactivación el tiempo se
prolonga de 30 a 40 minutos, y con esas condiciones de temperatura y presión se elimina todo
microbio existente. La autoclave tiene una válvula de seguridad para que la presión no se exceda y
llegue a explotar, ese dispositivo nunca debe abrirse antes de que el manómetro se encuentre en
ceros, podría causar una explosión.

Fig.1.Esterilización y desinfección
en microbiología.

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Docente: B.C. Pablo Argelio Sánchez González
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Fig.2.Partes de un autoclave

Fig.3.Funcionamiento interno de
un autoclave.

Fig.4.Tipos de autoclave.

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Docente: B.C. Pablo Argelio Sánchez González
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La preparación de los medios de cultivo se hace de acuerdo a las condiciones de cada laboratorio
de microbiología. Los medios de cultivo para preparar y envasar en el laboratorio pueden venir
deshidratados en polvo, en gránulos o en pastillas para disolverlos en agua destilada. Para la
preparación se necesita un autoclave, balanza, agua destilada, espátula, calculadora, probeta,
cajas Petri, tubos de vidrio y un área sin corrientes de aire para poder envasarlos.
Para pesar los medios se deben seguir las indicaciones del fabricante, y se utiliza una regla de 3 de
acuerdo al volumen y la cantidad de cajas Petri que se van a utilizar.
Una vez pesado la cantidad de medio se agrega primero el agar pesado y después el agua, esto con
la finalidad de crear grumos y hacer más lento el proceso de disolución.
Posteriormente se deben llevar al autoclave, una vez finalizada la esterilización, se deben enfriar a
45°C para el vaciado (plaqueado) de los medios en las cajas Petri.
Se realiza un control de calidad dejándolos incubar de 18 horas, por cada caja que se contamine de
cada lote, se debe preparar nuevamente.

Fig.5.Diagrama
de flujo para la preparación de medios en tubo y en caja petri.

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Docente: B.C. Pablo Argelio Sánchez González
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Material y reactivos:
Agar mac conkey, Agar Mueller-Hinton, Biggy.
Matraces erlenmeyer 500 ml, probetas gradudadas de 100ml, espátulas de metal, vasos de
precipitado de 600ml, cajas petri de vidrio.
Paquetes de cajas petri desechables.
Papel aluminio, pipetas pasteur desechables.
Vasos de precipitado de 100ml.
Circulos de papel filtro, hisopos estériles.
Material por equipo: el indicado desde la sesión de encuadre.
Por grupo: Llevar un frasco pequeño de alcohol al 70°, agua oxigenada, merthiolate con tintura
(rojo), 1 frasco pequeño de solución microdyn (desinfectante).
Reactivos: cloro, violeta de genciana, fenol al 5%, benzal, microdacyn solución en spray (yo les
daré estos reactivos).
Pinzas de metal de su estuche de disección sin dientes
Autoclave

Procedimiento:
Explicación teorica por parte del docente acerca del uso y descripción del autoclave.
Preparación de los medios de cultivo: pesado, hidratación, esterilización y envasado de los medios.

Fig.
6.Diagrama para la preparación de los medios de cultivo en polvo.

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Docente: B.C. Pablo Argelio Sánchez González
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1. Efecto de agentes químicos sobre el crecimiento bacteriano:


2. Se llevará a cabo una metodología similar a la del antibiograma.
3. Describir macroscópicamente la morfología colonial de los cultivos y realizar la tinción
gram (para este paso no deben de tardar más de 10 minutos ¡!!!!alumn@s)
4. Posteriormente inocular las placas de MH con estría masiva, con una dilución al 0.5
macfarland del cultivo identificado.
5. Impregnar un disco de papel filtro estéril con cada una de las sustancias a estudiar,
colocarlos sobre el agar y presionar suavemente.
6. Por equipo usarán dos placas de MH, las sembrarán por estría masiva e inmediatamente
colocarán 4 discos impregnados con las sustancias químicas en cada una de ellas (flamear
las pinzas cada que se coloque un disco nuevo.
7. Incubar las placas a 37° por 18 horas a interpretar los halos de inhibición.
8. Se tomará la medida de 1.4 cm en cada halo de inhibición para los agentes químicos y
considerarlos como eficaces para la desinfección,(Interpretar los halos al día siguiente).

Fig.7.Estría masiva en caja petri.

Fig.8.Proc
edimiento del sembrado masivo y colocación de discos de papel filtro.

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Cuestionario:

1. Investiga que factores afectan la técnica de esterilización de los medios de cultivo en


polvo.

2. Investiga las condiciones y tiempo de duración de almacenamiento de medios de cultivo


preparados en caja Petri y en tubo.

3. Realiza un cuadro comparativo con 5 ventajas y 5 desventajas sobre el uso de medios ya


preparados con los medios deshidratados que se realizan de manera cotidiana.

4. Investiga la técnica y condiciones para preparar un medio enriquecido (agar sangre).

5. Investiga la clasificación en cuanto al nivel de desinfección de las sustancias químicas


utilizadas en la práctica.

6. Dibuja y explica el mecanismo de acción de cada uno de los desinfectantes empleados en


la práctica.

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