BIOLOGÍA MOLECULAR

INGENIERÍA BIOQUÍMICA
SÉPTIMO NIVEL

Patricio Orozco Freire

MSc Plant Genetic Manipulation

Septiembre 2017 – Marzo 2018

 Fundamentos de biología molecular
 La biología molecular CONTEMPORÁNEA se encarga principalmente de la
comprensión de los MECANISMOS RESPONSABLES DE LA TRANSMISIÓN Y
EXPRESIÓN DE LA INFORMACIÓN GENÉTICA – ESTRUCTURA Y FUNCIÓN
CELULARES

 El GENOTIPO va a ser responsable de todas las características FENOTÍPICAS

 El mecanismo molecular en los diferentes organismos puede ser muy similar,

razón por la cual muchos investigadores han tomado a organismos menos
complejos como BACTERIAS como un MODELO para estudiar la biología
molecular.

 Como por ejemplo los mecanismos moleculares similares son comunes tanto
en E. coli como en el organismo humano.
AVANCES EN BIOLOGÍA MOLECULAR
 Los avances iniciales en biología molecular se lograron aprovechando el
RÁPIDO CRECIMIENTO Y LA FACILIDAD DE MANIPULACIÓN DEL GENOMA
de bacterias sencillas como E. coli, y sus virus.

 Posteriormente, el aparecimiento de las tecnologías de ADN

recombinante permitió establecer los PRINCIPIOS FUNDAMENTALES
(DOGMA CENTRAL DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR)

 Los experimentos se realizaron desde organismos PROCARIOTAS a

EUCARIOTAS.

 ADN recombinante ha permitido el AISLAMIENTO y CARACTERIZACIÓN

de genes eucarióticos individuales, hasta SECUENCIAS COMPLETAS de
genomas de animales, plantas superiores y humanos.
1. HERENCIA, GENES Y ADN
 La propiedad fundamental de los seres vivos es su capacidad de
REPRODUCIRSE. Todos los organismos HEREDAN de sus progenitores la
información genética que especifican su ESTRUCTURA Y FUNCIÓN.

 Todas las CÉLULAS provienen de otras CÉLULAS PREEXISTENTES, por lo

que el material genético ha de ser replicado y transferido del
PROGENITOR a la CÉLULA HIJA en cada DIVISIÓN CELULAR.

 EL MODO POR EL CUAL LA INFORMACIÓN GENÉTICA ES REPLICADA Y

TRANSMITIDA DE CÉLULA A CÉLULA Y DE UN ORGANISMO A OTRO,
REPRESENTA LA CUESTIÓN CENTRAL DE LA BIOLOGÍA??????
 DOGMA CENTRAL DE LA
BIOLOGÍA MOLECULAR

“ La elucidación de los MECANISMOS de transmisión genética y la identificación

del ADN como el material genético fueron los DESCUBRIMIENTOS que
constituyen los CIMIENTOS de nuestro entendimiento actual de la BIOLOGÍA a
nivel MOLECULAR”
Genes y Cromosomas
 Los principios genéticos clásicos fueron deducidos por Gregor Mendel
en 1865, realizando experimentos con guisantes

 Se estudio rasgos como color y forma de la semilla y fue capaz de

deducir las REGLAS GENERALES PARA SU TRANSMISIÓN

 Interpretó correctamente los patrones de herencia observados

asumiendo que cada rasgo está determinado por un par de factores
heredados, conocidos actualmente como GENES

 De cada progenitor se hereda una copia del gen llamada ALELO,

especificando cada rasgo.
Herencia de genes dominantes y recesivos
Cruce de guisantes Semillas verdes vs amarillas
Analizando F1
• Alelo DOMINANTE: Y
• Alelo RECESIVO: y
• El GENÓTIPO (composición genética de los guisantes): Yy
• El FENOTIPO (apariencia física): amarillo

• “ Los descubrimientos de Mendel fueron ignorados hasta 1900,

cuando se reconoció la importancia y se los planteó como LEYES ”

• Poco después se propuso la importancia de los CROMOSOMAS como

los portadores de genes, al evidenciar que la mayoría de plantas
superiores y animales son DIPLOIDES, es decir contienen dos copias de
cada cromosoma.
Células germinales
 En el caso de células germinales, espermatozoide y óvulo, la herencia
es diferente a través de un tipo característico de división celular
llamada MEIOSIS, en el cual un único cromosoma de cada par se
transmite a cada célula hija.

 Por lo tanto el espermatozoide y el óvulo son HAPLIODES, dado que

contienen una copia de cada cromosoma.

 La unión de estas dos células haploides (fertilización) da lugar a la

formación de una nueva célula diploide con un cromosoma heredado
de cada padre, masculino y femenino.

 Conclusión: los genes son transportados por los cromosomas por su

semejante comportamiento.
Cromosomas durante la meiosis y fertilización
Conocimiento de mutaciones
 Los fundamentos de las MUTACIONES, LIGAMIENTO GENÉTICO Y LAS
RELACIONES ENTRE GENES Y CROMOSOMAS fueron en su mayoría
descubierto realizando experimentos en el organismo modelo: mosca
de la fruta, Drosophila melanogaster

 Drosophila se mantiene con facilidad en el laboratorio y se reproduce

cada dos semanas, lo cual es una considerable ventaja para la
experimentación

 Se realizan análisis genéticos del desarrollo y la diferenciación.

Segregación
 A principios de este siglo se identificaron una serie de alteraciones
genéticas denominadas MUTACIONES en Drosophila, afectando a
características fácilmente observables como el color de los ojos o la
forma de las alas.

 Los experimentos de cruzamiento indicaron que algunos de los genes

responsables de estos rasgos se heredan de forma independiente
entre ellos, sugiriendo que estos genes se localizan en diferentes
cromosomas que se segregan INDEPENDIENTEMENTE durante la
meiosis
Segregación y ligamiento genético
Ligamiento
 Otros genes por otro lado se heredan juntos como características
emparejadas. Dichos genes se dicen que están LIGADOS ENTRE SÍ en
tal virtud de estar localizados en el mismo cromosoma

 El número de grupos de genes ligados es el mismo que el número de

cromosomas (cuatro en Drosophila)

 “ En 1915 se habían definido y mapeado casi 100 genes en cuatro

cromosomas de Drosophila, dando lugar a una aceptación general de
la base cromosómica de la herencia ”
Genes y enzimas FENILCETONURIA

 Los primeros estudios genéticos se centraron en la IDENTIFICACIÓN Y

LOCALIZACIÓN CROMOSÓMICA de los genes que controlan características
fácilmente observables como el color de los ojos.

 Sin embargo el modo como los genes producían los fenotipos observados era
desconocido

 La primera observación llegó en 1909, cuando se evidenció que le

enfermedad hereditaria humana FENILCETONURIA, resultaba de un defecto
genético en el metabolismo del aminoácido FENILALANINA.

 Surgió la hipótesis de que el defecto aparecía por la deficiencia de la enzima

necesaria para catalizar alguna reacción metabólica implicada en el
metabolismo del aminoácido

 “LLEVANDO A LA CONCLUSIÓN DE QUE LOS GENES ESPECIFICAN LA SÍNTESIS

DE ENZIMAS”
 George Beadle y Edward Tatum (1941) experimentaron con el hongo
Neurospora crassa

 Neurospora crassa crece normalmente en medios de cultivo básicos

con sal, glucosa y biotina; los enriquecidos se suplementan con
vitaminas, aminoácidos, purinas y pirimidinas.

 Aislaron cepas MUTANTES que solo crecían en medios enriquecidos

pero NO en básicos.

 Se encontró que cada mutante requería un suplemento nutricional

específico, como un AA especial para crecer

 “ Cada mutación determinaba una deficiencia en una ruta metabólica

específica ”

 CADA GEN CODIFICA LA ESTRUCTURA DE UNA CADENA

POLIPEPTÍDICA
Identificación del ADN como material genético
 Lo anteriormente explicado NO APORTO PER SE una explicación molecular de
lo que es un gen??

 Equívocamente en un inicio se pensó que los GENES ERAN PROTEÍNAS

 La primera evidencia que llevo a pensar que el ADN es el material genético

llego de estudios en bacterias, específicamente en la que causa NEUMONÍA --
Pneumococcus

 Pneumococcus con cápsula de POLISACÁRIDO (protege del ataque del

sistema inmune del huésped), ASPECTO LISO EN EL MEDIO DE CULTIVO –
GENOTIPO L
 CAUSAN LA MUERTE INOCULADAS EN EL RATÓN

 CEPAS MUTANTES SIN CÁPSULA, ASPECTO RUGOSO EN EL MEDIO DE

CULTIVO – GENOTIPO R
 NO CAUSAN LA MUERTE INOCULADAS EN EL RATÓN
Experimento de Griffith
 En 1928:

 RATONES --- CEPAS R + L (INACTIVADAS CON CALOR) ANIMACIÓN

4.1
 DESARROLLARON NEUMONÍA

 PRODUCÍAN LA MUERTE DEL RATÓN

 “PRINCIPIO TRANSFORMADOR O TRANSFORMANTE”

 TRANSFORMACIÓN GENÉTICA DE BACTERIA R A L

 https://www.youtube.com/watch?v=XSiJtjus4FY
Transformación genética
 1944 Oswald Avery, Colin MacLeod y Maclyn McCarty establecieron
que el principio transformador era el ADN purificándolo de
extractos bacterianos y demostrando que su actividad
enzimática desaparece tras la DIGESTIÓN ENZIMÁTICA
DEL ADN y NO tras la digestión enzimática de las
PROTEÍNAS
ANIMACIÓN
4.2
Conclusión
 Estos estudios no fueron aceptados inmediatamente

 Confirmados con experimentos con virus bacterianos:

BACTERIÓFAGOS

 Cuando un virus infectaba una célula era preciso que el ADN viral
penetrara a la célula (pero NO LAS PROTEÍNAS) para que el virus se
replicará
Pregunta en clase:
HEMOGLOBINURIA
• https://www.youtube.com/watch?v=BKNpL2tG614
Estructura del ADN
 1953.- Watson & Crick: propusieron
la estructura tridimensional del
ADN, que ha sido la base de la
biología molecular actual.

 Descripción de Linus Pauling de los

puentes de H y del α-hélice
(proteínas).

 Maurice Wilkins y Rosalind Franklin

Estudios de cristalografía por
refracción de rayos X.
Cristalografía por refracción de
rayos X

VIDEO
Datos más precisos del ADN
 No todo fue perfecto: en la publicación inicial de
W&C asumieron que tanto A-T y C-G estaban
asociados por medio de 2 puentes de hidrógeno.

 “ Erwin Chargaff encontró que la cantidad de

adenina era siempre equivalente a la de timina; y
que la cantidad de guanina era siempre
equivalente a la de citosina ”
Replicación del ADN
• Se propuso que las dos hebras de la molécula del ADN se podrían
separar y servir como MOLDES para la síntesis de las nuevas hebras
complementarias, cuya secuencia sería dictada por la especificidad en
el APAREAMIENTO de las bases.

• El proceso se denomina REPLICACIÓN SEMICONSERVATIVA porque

una hebra de ADN progenitor se conserva en cada una de las dos
moléculas hijas de ADN.

 1958: Meselson y Stahl confirmaron la teoría, en el cual el ADN fue

marcado con isótopos que alteraron su densidad.
Experimento Replicación
semiconservativa
El fondo de la replicación
 La capacidad del ADN para servir de molde para su propia replicación
fue establecida más adelante con la demostración de que una enzima
purificada de E. coli, la ADN POLIMERASA podía catalizar la replicación
del ADN in vitro.

 La ADN polimerasa era capaz de dirigir la incorporación de nucleótidos

en una molécula del ADN complementaria.
2. EXPRESIÓN DE LA INFORMACIÓN
GENÉTICA
 La identificación del ADN como material genético y la elucidación de su
estructura revelaron que la información genética se especifica por el
orden de sus 4 bases

 Las proteínas por otro lado son polímeros de 20 aminoácidos, cuya

secuencia determina su orden y función.

 En 1957: se estableció la primera relación directa entre una mutación

y la alteración de la secuencia de aminoácidos. Se descubrió que los
pacientes con una enfermedad hereditaria llamada ANEMÍA DE
CÉLULAS FALCIFORMES, poseen moléculas de hemoglobina que
difieren de las normales en una sola sustitución de un aminoácido.
ANEMIA FALCIFORME

VER VIDEO
Colinealidad de genes y proteínas
 El orden de los nucleótidos en el ADN especificaba el orden
de los aminoácidos en las proteínas.

 Las MUTACIONES correspondían con alteraciones en la

secuencia de ADN. Estos cambios producirán los cambios
correspondientes en la secuencia de aminoácidos de la
proteína codificada por el gen.

 Se pudo determinar este concepto gracias a experimentos

realizados en E.coli, que al igual que con Neurospora fueron
aisladas cepas mutantes con problemas nutricionales.
(deficiencia en AA)
Charles Yanofsky
 Aisló y mapeo mutaciones múltiples en el mismo gen que
codifica una enzima necesaria para la síntesis del AA
triptófano.

 El análisis de la enzima mutante determinó que la posición

relativa de los AA alterados eran las mismas que de las
mutaciones correspondientes.

 “Por lo tanto la secuencia de AA en la proteína es colineal

con la secuencia de bases nitrogenadas del gen”
Figura 4.8
Papel del ARN mensajero
 Aunque la secuencia de nucleótidos del ADN parecía especificar el
orden de los AA en las proteínas, ESO NO SIGNIFICABA
necesariamente que el ADN dirigiera por si mismo la síntesis de
proteínas .

 De hecho, no parecía ser el caso ya que el ADN se encontraba en el

núcleo mientas que las proteínas se sintetizaban en el citoplasma
(ribosomas).

 ¿Qué molécula era la encargada de llevar la

información genética del ADN hacia los ribosomas?
 El ARN parecía ser un buen candidato debido a la similitud con la
estructura del ADN. Sugiriendo que el ADN podía ser sintetizado
a partir de un molde de ADN.

 Comentar de las diferencias entre ADN y ARN.

 A pesar de las diferencias el apareamiento entre las bases no

cambia, justificando la síntesis de ARN a través del molde ADN.

 Además, dado que el ARN se encuentra PRIMARIAMENTE EN EL

CITOPLASMA, parecía un intermediario lógico para transmitir la
información genética.

 GENERANDO EL DOGMA CENTRAL DE LA BIOLOGÍA

MOLECULAR
ANIMACIÓN 4.3
Síntesis de ARN
a partir de ADN
Sidney Brenner, Francois Jacob,
Matthew Meselson
 E. coli infectados con el bacteriófago T4.

 La síntesis de ARN de E.coli se interrumpe por la infección del T4.

 El ARN del T4 ingresa a la bacteria y en el ribosoma en vez de

sintetizarse proteínas bacterianas se sintetizan proteínas víricas

 Las moléculas de ARN que sirven como molde para la síntesis de

proteínas en los ribosomas son conocidas como ARN
MENSAJERO (ARNm). Que son transcritos por una enzima ARN
polimerasa, que cataliza la síntesis de ARN a partir de un molde
de ADN.
Otros tipos de ARN
 A parte del ARNm, existen otras moléculas de ARN que
son importantes durante la síntesis proteica.

 ARN ribosómico (ARNr).- es un componente de los

ribosomas.

 ARN de transferencia (ARNt).- funciona como una

molécula adaptadora que alinea los aminoácidos a lo
largo del molde del ARNm.
Código genético
 ¿Cómo se traduce la secuencia de nucleótidos del
ARNm a la secuencia de AA de una proteína?

 Problemas:
 1. los AA no se relacionan estructuralmente con las
bases de los ácidos nucleicos (químicamente no
relacionadas)

 El apareamiento complementario directo entre las

bases del ARNm y los AA durante la incorporación de
estos a las proteínas parecía imposible
 Esta cuestión se aclaró con el descubrimiento de que
los ARNt sirven de adaptadores entre los AA y el
ARNm durante la traducción.

 Explicar en figura: enzimas

ARNt
 Problemas:
 2. determinación de un código genético

 ¿Cómo se podía transferir la información contenida en

una secuencia nucleotídica de 4 elementos a la
secuencia de 20 AA distintos que componen las
proteínas?
Cálculo matemático
 Dado que cuatro nucleótidos deben codificar 20 aminoácidos,
son precisos al menos tres nucleótidos para codificar cada
aminoácido.

 Tomados individualmente, los cuatro nucleótidos sólo pueden

codificar cuatro aminoácidos, y tomados en parejas cuatro
nucleótidos sólo codifican dieciséis (42) aminoácidos.

 Sin embargo, tomados de tres en tres cuatro nucleótidos podrían

codificar 64 (43) aminoácidos distintos —más que suficiente para
los 20 aminoácidos existentes en las proteínas.
Bacteriófago T4 y su gen rll
 La evidencia experimental directa se obtuvo en estudios con el
bacteriófago T4, portador de mutaciones en un gen conocido
llamado rll.

 Los fagos con mutaciones en este gen forman placas

anormalmente grandes, que son fácilmente distinguibles de las
formadas por fagos del tipo salvaje.

 Por lo tanto, fue sencillo aislar y mapear un cierto número de

estas mutaciones en el gen rll, lo cual llevó al establecimiento de
un detallado mapa genético de este locus.
 El estudio de las recombinaciones entre mutantes del gen rll que
surgieron por adiciones o deleciones de nucleótidos confirmaron
que:

ANIMACIÓN 4.4
 El desciframiento del código genético se convirtió en un problema de
asignar tripletes de nucleótidos a sus correspondientes aminoácidos.

 La aproximación al problema consistió en el uso de sistemas in vitro

que realizaran síntesis proteínica (traducción in vitro).

 Se sabía que los extractos celulares que contienen ribosomas,

aminoácidos, ARNt y las enzimas responsables de unir a los
aminoácidos con su correspondiente ARNt (amino acil-ARNt
sintetasas) son capaces de catalizar la incorporación de aminoacidos a
las proteínas.

 ARNm sintético de secuencia conocida.

Marshal Nirenberg y Heinrich Matthaei
 Consistió en la traducción in
vitro de un polímero de ARN
que únicamente contenía
uracilo.

 Experimentos similares:
polímeros de ARN compuestos
de un único nucleótido
establecieron que AAA codifica
la lisina y CCC codifica la prolina
El código genético
64 posibles tripletes

Llamados

CODONES

DE PARO:
UAA, UAG y UGA

DE INICIACIÓN:
AUG – METIONINA

DEGENERADO

APOYA LA EVOLUCIÓN
Virus de ARN y transcripción inversa
• Muchos virus contienen ARN en vez de ADN como material genético, lo cual
implica la existencia de otros modos de transferencia de información.

• Los genomas de ARN fueron descubiertos en primer lugar en virus vegetales,

muchos de los cuales se componen únicamente de ARN y proteínas.

• En los años 50 se obtuvo evidencia directa de que el ARN actúa como

material genético por medio de experimentos que demostraron que el ARN
purificado del virus del mosaico del tabaco podía infectar nuevas células,
dando lugar a una progenie de virus infectivos.

• Bacteriófagos ARN de E. coli. Estos virus codifican una enzima específica que
cataliza la síntesis de ARN a partir de un molde de ARN

• Ejemplo son: poliovirus o virus de la influenza humana.

Los virus ARN tumorogénicos
 Son los causantes de cáncer en animales infectados.

 A pesar de tener ARN genómico en las partículas virales, Howard

Temin en los 60s indico que requerían de la síntesis de ADN en las
células infectadas para completar su ciclo.

 RETROVIRUS pasan de ARN a ADN (provirus de ADN).

 Supone una inversión en el DOGMA CENTRAL DE LA BM.

 1970: Temin y Baltimore descubrieron la ENZIMA (transcriptasa

inversa) que cataliza este proceso inverso. Y nace como tal la
TRANSCRIPCIÓN INVERSA
Importancia de la Transcripción Inversa
 1. Replicación de los retrovirus

 2. frecuentemente es responsable de la transposición de secuencias de

ADN de una localización cromosómica a otra. De hecho, la secuencia
del genoma humano ha revelado que aproximadamente el 40% del
ADN genómico humano deriva de la transcripción inversa.

 3. Transcriptasas inversas se utilizan experimentalmente para generar

copias de ADN a partir de una molécula de ARN. El uso de la
transcriptasa inversa ha permitido el estudio del ARNm de células
eucariotas por medio de los métodos moleculares de manipulación
del ADN utilizados actualmente